用雙指示線免疫層析半定量診斷促黃體生成素的方法
2024-01-20 04:39:15 4
專利名稱：用雙指示線免疫層析半定量診斷促黃體生成素的方法
技術領域：
本發明涉及一種生物工程技術領域的檢測方法，具體是一種用雙指示線免疫層析半定量診斷促黃體生成素的方法。
背景技術：
優生優育是計劃生育具體內涵的延伸，是新的歷史條件下對計劃生育的具體化體現。我國是人口大國，巨大的人口壓力會制約著社會的發展，所以做好優生優育既是提高人口素質的重要手段，也是制約人口發展的重要手段，對未來社會整個民資的發展有重要的作用。所以大家應該要堅持做好優生優育，為子孫後代的良性發展創造有利條件。那麼，在計劃生育時為了優生優育應該怎樣做呢？可以從優戀、優婚、優孕三個方面考慮。優戀指的是談婚論嫁之前，要注意了解對方及其家庭成員身體健康方面的信息。優婚是指在完全知情的情況下結婚，這一點就要依賴於婚前的體檢。優孕，就是在適宜的孕育年齡、最佳的受孕時機懷孕生子，這樣可以最大可能的避開對胎兒發育不良的不利因素。據調查，半數以上的青年夫婦結婚以後不採取避孕措施，往往在不知不覺中懷孕。由於事先毫無計劃和準備，結果有的發生了自然流產，有的感染了流感、風疹等病毒性疾病，有的使用了孕期應當禁用的藥物……可見，婚後注意避孕、實行有計劃的自主懷孕很有必要。促黃體生成素是由垂體前葉分泌的一種糖蛋白激素。在女性體內則主要是促進排卵的發生。促黃體生成激素(LH)是隨女性月經周期而含量呈周期性變化的激素，其作用是刺激卵巢內成熟卵子的釋放。通常在排卵前36 48小時左右突然大幅度上升，LH達到最高峰值後的12到18小時開始排卵，如未受孕LH迅速下降，重複下一周期。LH峰值後1_3 天時間內婦女最易受孕。因此對女體內LH的檢測常被用來判斷女性的排卵狀況。動態的監測掌握LH變化特點，確定LH的峰值及時間，從而可以更準確的預測與監測排卵情況，為臨床提供更準確的結果，指導育齡婦女選擇最佳受孕時機或指導安全期避孕。開發簡單、快速的促黃體生成素診斷方法具有十分重要的經濟價值和社會意義。免疫膠體金技術是20世紀70年代初期由Faulk和Taylor始創，最初用於免疫電鏡技術。膠體金標記技術是以膠體金作為示蹤標誌物或顯色劑，於抗原抗體反應的一種新型免疫標記技術，現在已成功用於電鏡、流式細胞儀、免疫印跡、蛋白染色、體外診斷製劑的製造等領域。目前金標記技術常與膜載體配合，形成特定的免疫檢測方式，如免疫滲濾試驗和免疫層析試驗等。免疫層析試紙條就是此技術用於體外快速診斷的一個重要發展方向， 是在現代單克隆抗體技術、膠體金免疫層析技術和新材料技術基礎上發展起來的新型檢測技術。近年來該技術發展迅速，已經在臨床診斷特別是床邊檢測(POCT)中得到了廣泛應用，如傳染病、早孕、癌症等的檢測。利用膠體金的檢測方法測定尿液中LH作為排卵的考察檢測，已被開發，其檢測下限為25mIU/ml。但是對於臨床上單獨使用25mIU/ml這一標準不能直接、快速區分排卵的強弱程度，所以開發能夠檢測LH 25 50mIU/ml這一 LH診斷灰區的半定量膠體金試紙也是十分必要的。目前國內外均無相關的試紙條出售。
發明內容
本發明的目的開發簡單、快速的測排卵方法具有十分重要的經濟價值和社會價值。本實驗採用膠體金免疫層析法，建立快速檢測LH的方法。並且能夠半定量檢測25mIU/ ml 50mIU/ml這一 LH灰區範圍。本發明是通過以下技術方案實現的採用檸檬酸三鈉還原法製備膠體金顆粒，標記β-LH抗體並均勻塗布於膠金墊上，作為示蹤標記物。在硝酸纖維素膜上，兩個不同濃度的α-LH抗體固定於兩個檢測線(即T線)，羊抗鼠二抗固定於質控線(即C線)。依次將樣本墊、膠金墊、硝酸纖維素膜和吸水濾紙組裝，剪成膠體金試紙並裝入檢測卡中。金標抗體與相應的抗原、抗體發生特異性結合被截留而顯色，根據T線、C線顯色與否來判斷陰陽性結果。本發明方法包括如下步驟一、膠體金溶液配製1.配製氯金酸溶液；2.配製2 %檸檬酸三鈉溶液；3.將0. 02%的氯金酸溶液加熱至沸騰，迅速加入2%的檸檬酸三鈉2mL ；4.溶液由淺藍色，深藍，再加熱出現酒紅色，繼續煮沸IOmin ；停止加熱，繼續攪拌至室溫。二、膠體金標記物的製備1.取兩個1. 5mL試管，分別加入ImL膠體金溶液；2.加入適量硼砂緩衝液把pH調整為8. 0 ；3.加入20 μ g/mL β -LH抗體，使其達到最小蛋白濃度，混勻，振蕩30min ；4.加入 20 μ L 的 10 % BSA,混勻，振蕩 30min ；5. 12000rpm離心5min，輕輕吸除上清；6.用ImL wash buffer溶液重懸浮鬆散的膠體金沉澱；7.重複5.步操作；8.重複6.步操作；9.重複5.步操作；10.用fix buffer配製在MOnm處OD (光密度)值為0. 5 1. 0的膠體金免疫複合物；11.玻璃纖維素膜點樣，形成膠金墊，真空凍幹3小時。三、在硝酸纖維素膜上劃線1. Tl線用濃度為0. 75mg/mL的a_LH抗體劃線，用於檢出25mIU/ml的LH ；2. T2線用濃度為0. 4mg/mL的α -LH抗體劃線，用於檢出50mIU/ml的LH ；3. C線用0. 75mg/mL羊抗鼠多克隆抗體劃線；4.將硝酸纖維素膜置於40°C烘箱乾燥3天。四、膠體金試紙條的組裝1.將樣品墊、膠金墊、NC膜和吸收墊4部分按順序組裝(見附圖1)；2.將其組裝好後用剪刀剪成4mm/條後進行檢測。五、檢測
試紙平放，將樣品加到檢測條的樣本墊上，由於毛細效應，液體的層析方向向前， 與固定在T線、C線上的物質發生結合被截留而顯色。5min後，根據T線、C線的顯色情況判定陰陽性結果。樣本中的LH含量和T線的顏色呈正相關，當LH含量達到25mIU/ ml ( < 50mIU/ml)時，Tl線顏色與質控線相當或強於質控線，而T2線顏色弱於質控線(見附圖2)；當LH含量達到50mIU/ml及以上時，T2線顏色與質控線相當或強於質控線，而Tl 線顏色強於質控線(見附圖3)；若樣本中沒有LH或LH含量較低< 25mIU/ml時，則兩條T 線不顯色或顏色均弱於C線，為陰性(見附圖4) ；T線和C線均不顯色則試紙條無效。本發明檢測對象單一且針對性強，準確率高。檢測速度快，所需時間短，只需5min， 不需經培訓的專業人員就可使用本發明方法來檢測，滿足醫院、門診、個人等快速、準確地檢測排卵狀況的要求，並且便於基層推廣和運用。
圖1為本發明實施例試紙條的圖示圖2為本發明實施例試紙條的陽性結果(50mIU/ml < LH水平彡25mIU/ml)圖3為本發明實施例試紙條的陽性結果(LH水平彡50mIU/ml)圖4為本發明實施例試紙條的陰性結果(LH水平< 25mIU/ml)
具體實施例方式下面結合附圖對本發明的實施例作詳細說明本實施例在以本發明技術方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發明的保護範圍不限於下述的實施例。下面實施例中，未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，或按照製造廠商所建議的條件。本實例先用2%的檸檬酸三鈉溶液製備20nm的金水，並標記β -LH抗體噴金標墊， α -LH抗體、羊抗鼠多克隆抗體分別包被至檢測線(Τ線)、質控線(C線)，然後組裝成試紙條，置37°C烘箱烘乾並裁成4mm/條，室溫乾燥保存備用。實施例1.準備α-LH抗體、β-LH抗體。並清洗實驗所需的玻璃器皿。2.膠體金的製備先將0. 02 %氯金酸溶液溶液加熱煮沸，迅速加入2 %的檸檬酸三鈉2mL ；溶液顏色由淺藍色變為深藍，繼續加熱出現酒紅色，繼續煮沸IOmin ；出現透明的酒紅色，停止加熱，繼續攪拌至室溫。這樣就製備了 20nm的膠體金溶液。然後用電鏡鏡檢， 確保製備的金顆粒儘量使其大小一致、均勻，顆粒直徑在20nm左右，否則重新製作。3.膠體金標記物的製備取兩個1. 5mL試管，分別加入ImL膠體金溶液；向其中加入適量硼砂緩衝液把pH 調整為8. 0 ；加入20μ g/mL β -LH抗體，使其達到最小蛋白濃度，混勻，于振蕩儀上快速振蕩30min ；加入20μ L的10% BSA，混勻，振蕩30min ；於離心機中12000rpm，離心5min，輕輕吸除上清；用ImL wash buffer溶液重懸浮鬆散的膠體金沉澱；於離心機中12000rpm， 離心5min，輕輕吸除上清；用ImL wash buffer溶液重懸浮鬆散的膠體金沉澱；於離心機中12000rpm，離心5min，輕輕吸除上清；用fix buffer配製在MOnm處OD (光密度)值為 0. 5 1. 0的膠體金免疫複合物；在玻璃纖維素膜上點樣，形成膠金墊，真空凍幹3小時。4.膠體金試紙條的組裝分別將0. 75mg/mL和0. 4mg/mL的α -LH抗體劃在硝酸纖維素膜的檢測線(Τ線) 上，將0.75mg/mL羊抗鼠多克隆抗體劃在質控線(C線)上。然後將硝酸纖維素膜置於烘箱中40°C乾燥3天。然後將各個部分按附圖1組裝成試紙條。5.膠體金試紙條的使用及結果判讀檢測前，先提取被檢者的尿液樣本。然後把試紙條試紙平放，將樣品加到檢測條的樣本墊上，由於毛細效應，液體的層析方向向前，與固定在T線、C線上的物質發生結合被截留而顯色。5min後，根據T線、C 線的顯色情況判定陰陽性結果。樣本中的LH含量和T線的顏色呈正相關，當LH含量達到 25mIU/ml ( < 50mIU/ml)時，Tl線顏色與質控線相當或強於質控線，而T2線顏色弱於質控線(見附圖2)；當LH含量達到50mIU/ml及以上時，T2線顏色與質控線相當或強於質控線， 而Tl線顏色強於質控線(見附圖3)；若樣本中沒有LH或LH含量較低<25mIU/ml時，則兩條T線不顯色或顏色均弱於C線，為陰性(見附圖4) ；T線和C線均不顯色則試紙條無效。實施例可直接檢測樣品中的LH，使用方法不需要專業培訓，操作方便、快速，5min 即可獲得結果，可達到快速、簡便、及時地檢測LH的目的。
權利要求
1.一種用雙指示線免疫層析半定量診斷促黃體生成素的方法，其特徵在於，採用檸檬酸三鈉還原法製備膠體金顆粒，標記β -LH抗體並均勻塗布於膠體金墊上，作為示蹤標記物。在硝酸纖維素膜上，兩個不同濃度的α-LH抗體固定於兩個檢測線(即T線)，羊抗鼠二抗固定於質控線(即C線)。依次將樣本墊、膠金墊、硝酸纖維素膜和吸水濾紙組裝，剪成膠體金試紙並裝入檢測卡中。金標抗體與相應的抗原、抗體發生特異性結合被截留而顯色， 根據T線、C線顯色與否來判斷陰陽性結果。
2.根據權利要求1所述的一種用雙指示線免疫層析半定量診斷促黃體生成素的方法， 其特徵在於，抗體劃線濃度為Tl線用濃度為0. 75mg/mL的α -LH抗體劃線，用於檢出25mIU/ml的LH ； T2線用濃度為0. 40mg/mL的α -LH抗體劃線，用於檢出50mIU/ml的LH ； C線用0. 75mg/mL羊抗鼠多克隆載體劃線； 將硝酸纖維素膜置於40°C烘箱乾燥3天。
3.根據權利要求1所述的一種用雙指示線免疫層析半定量診斷促黃體生成素的方法， 其特徵在於，運用不同濃度的抗體溶液在相同的基質上劃線，以膠體金方法檢測多個不同濃度水平物質的方法。
全文摘要
本發明公開了一種生物工程技術領域的檢測方法，具體是一種用雙指示線免疫層析半定量診斷促黃體生成素的方法。促黃體生成素是由垂體前葉分泌的一種糖蛋白激素。促黃體生成激素(LH)是隨女性月經周期而含量呈周期性變化的激素，其作用是刺激卵巢內成熟卵子的釋放。動態的監測掌握LH變化特點，確定LH的峰值及時間，從而可以更準確的預測與監測排卵情況，為臨床提供更準確的結果，指導育齡婦女選擇最佳受孕時機或指導安全期避孕。免疫膠體金技術近年來發展迅速，得到了廣泛應用，如傳染病、早孕、癌症等的檢測。本發明採用膠體金免疫層析法，建立快速檢測LH的方法。並且能夠半定量檢測25～50mIU/ml這一LH灰區範圍。
文檔編號G01N33/558GK102565426SQ201110433729
公開日2012年7月11日 申請日期2011年12月22日 優先權日2011年12月22日
發明者劉寅, 嶽曉燕, 張有青, 王晶, 羅雲萍, 霍五奎, 馬雪明 申請人:正元盛邦(天津)生物科技有限公司