大黃魚雌核發育二倍體誘導方法
2024-01-20 17:06:15
專利名稱：大黃魚雌核發育二倍體誘導方法
技術領域：
本發明涉及一種雌核發育方法，尤其是涉及一種大黃魚雌核發育二倍體誘導方法。
背景技術：
利用細胞工程技術為水產養殖業培育優良品種具有深遠的理論意義和廣闊的應用前景。雌核發育是一種細胞工程技術，指卵子只依靠本身的遺傳物質發育成為個體的現象，它需要同種或異種精子進入卵內，但這些精子只起激動作用，而並不參與發育，胚胎發育完全是在雌核的控制之下進行的，因此得到的後裔全部是母性性狀，基因型與母本相同或略有差異。人工誘導雌核發育是加速魚類優良基因純合化，使優良的遺傳性狀得以迅速固定，從而實現快速育種的最有效方法之一，同時也是進行魚類遺傳分析與性別控制的有效輔助手段，已經被廣泛應用於國內外許多種魚類遺傳育種的研究與實踐。例如，日本已經對幾乎所有該國開展養殖的海、淡水魚類都進行人工雌核發育研究，藉助該項技術進行魚類快速育種、性別控制以及各種遺傳性狀包括DNA標記的遺傳分析，培育出全雌虹鱒與牙鮃魚苗供養殖利用，培育了各種養殖對象的雌核發育純合g隆魚供遺傳學研究；美國在20世紀80年代就藉助人工雌核發育技術進行草魚的性別控制；國內也已經對多種淡水魚類開展人工雌核發育研究，利用該項細胞工程(染色體組操作)技術培育出了異育銀鯽，在較短的時間內使建鯉與高寒鯉的優良性狀得到固定，促進了良種的快速育成。
大黃魚是目前福建省海水養殖魚類中的最重要種類，其養殖規模、產量、從業人員數量等都居於海水養殖魚類之首。然而，大黃魚養殖業的持續發展，面臨著種質退化等問題迫切需要研究解決。排除與減少群體中存在的不良及有害基因，增加優良基因與基因型的頻率，消除或減少不良基因的影響，是解決大黃魚種質退化問題的最根本辦法。然而傳統的育種方式(定向選擇+近交)基因純合速度慢，育種周期長，不符合當前大黃魚養殖業發展的迫切需要，因此有必要開展可加速育種進程的人工雌核發育技術研究。另一方面，大黃魚不論是野生或是在人工養殖中，雌雄兩性個體的生長都存在著顯著的差異，雌魚的生長速度明顯快於雄魚。目前，大黃魚的雌核發育研究尚屬空白。
發明內容
本發明的目的在於針對已有的大黃魚育種技術中存在的問題，提供一種大黃魚雌核發育二倍體的誘導方法。
本發明所說的大黃魚雌核發育二倍體誘導方法其步驟為1)、精子的遺傳失活取大黃魚精液經稀釋液稀釋10～50倍後用紫外線照射，紫外線照射劑量為50000-100000μW/cm22)、卵子雌核發育的啟動在海水中混合大黃魚成熟卵子及經過紫外線照射的大黃魚精子，精子最終濃度至少為105個/ml；3)、雌核發育單倍體染色體組加倍卵子授精後3～5min，轉移到0～3C的海水中冷休克或轉移到水壓機中靜水壓處理，使染色體組加倍，產生雌核發育二倍體；4)、將大黃魚雌核發育卵轉入海水中，按普通大黃魚苗生產方法管理，生產出大黃魚雌核發育二倍體魚苗。
在步驟1)中，取大黃魚精液經稀釋液稀釋30倍後用紫外線照射，精液的厚度最好為0.5～1.0mm；稀釋液的配製為稱取NaCl 7.5g、KCl 0.2g、CaCl20.2g、NaHCO30.2g，加蒸餾水逐項溶解後調至1L。
在步驟2)中，海水水溫最好為20～25℃。
在步驟3)中，在海水中冷休克的時間為5～15min，最好為10min；轉移到水壓機中靜水壓處理的壓力為45MPa/cm2，水壓機中靜水壓處理的時間為2～3min。
本發明利用失活大黃魚精子的遺傳物質、啟動卵子雌核發育以及染色體組加倍的措施，所誘導產生的後代只含有雌性親本的基因，可加速優良基因純合化、使優良的遺傳性狀得以迅速固定，因此本發明可應用於大黃魚快速育種，同時也是進行大黃魚遺傳分析與性別控制的有效輔助手段。
具體實施例方式
以下實施例將對本發明作進一步的說明。
實施例1取大黃魚精液經稀釋液稀釋30倍後放置於直徑為6～15cm的培養皿內，用紫外線照射，紫外線照射劑量為50000-100000μW/cm2，精液厚度0.5mm。稀釋液的配製為每升溶液中含NaCl 7.5g、KCl 0.2g、CaCl20.2g、NaHCO30.2g，使精子的遺傳失活。將海水水溫調整到22～23℃，在此海水中混合大黃魚成熟卵子及經過紫外線照射的大黃魚精子，精子最終濃度至少為105個/ml，啟動大黃魚卵子的雌核發育。卵子授精後3～4min，轉移到0～1℃的海水中冷休克10min，使大黃魚雌核發育單倍體染色體組加倍成為雌核發育二倍體。經上述處理後的大黃魚雌核發育卵轉入正常水溫海水中，按普通大黃魚種苗生產方法管理，生產出大黃魚雌核發育二倍體苗種。
所說的普通大黃魚魚苗生產方法管理是指採用靜水孵化法，受精卵在水中的密度為3×104粒/m3～1×104粒/m3。放養密度為仔魚期2.4×104尾/m3～0.8×104尾/m3，稚魚期0.6×104尾/m3～0.3×104尾/m3，幼魚期0.2×104尾/m3～0.1×104尾/m3。可採用以下餌料系列1)褶皺臂尾輪蟲投餵前經6h以上20×106個/mL小球藻液強化培養，投餵量見表1。
表1褶皺臂尾輪蟲投餵方法
2)滷蟲無節幼體投餵時間為12日齡～16日齡，水中密度為0.5個/mL～1個/mL。
3)橈足類及其無節幼體應從無汙染、無病原體的水域中採捕。從12日齡開始投喂，水體中保持密度在0.2個/mL～0.5個/mL。
4)魚、蝦、貝肉糜及配合飼料肉糜日投餵量20日齡～30日齡，50g/萬尾～80g/萬尾；30日齡～45日齡100g/萬尾～120g/萬尾。35日齡以上可在肉糜中拌入適量粉狀配合飼料。
在日常管理中，應連續充氣，使水中溶解氧保持在5mg/L以上。每天換水1次～2次，日換水量20％～120％，並在換水前用虹吸管吸去池底的殘餌、死苗、糞渣及其他雜物。經常進行仔稚魚攝食情況的觀察，監測理化因子變化情況，發現問題及時處理。中間培育時，魚苗在室內水泥池中培育至全長20mm以上時，可移到海區網箱中繼續進行培育，直至全長30mm為止。
實施例2與實施例1類似，其區別在於取大黃魚精液經稀釋液稀釋10倍後用紫外線照射，紫外線照射劑量為50000-100000μW/cm2，精液厚度0.8mm。稀釋液的配製為每升溶液中含NaCl 7.5g、KCl 0.2g、CaCl20.2g、NaHCO30.2g，使精子的遺傳失活。將海水水溫調整到20～22℃，在此海水中混合大黃魚成熟卵子及經過紫外線照射的大黃魚精子，精子最終濃度至少為105個/ml，啟動大黃魚卵子的雌核發育。卵子授精後4～5min，轉移到水壓機中靜水壓處理，壓力為45MPa/cm2，水壓機中靜水壓處理的時間為2～3min。使大黃魚雌核發育單倍體染色體組加倍成為雌核發育二倍體。經上述處理後的大黃魚雌核發育卵轉入正常水溫海水中，按普通大黃魚種苗生產方法管理，生產出大黃魚雌核發育二倍體苗種。
實施例3與實施例1類似，其區別在於取大黃魚精液經稀釋液稀釋50倍後用紫外線照射，紫外線照射劑量為50000-100000μW/cm2，精液厚度1.0mm。稀釋液的配製為每升溶液中含NaCl 7.5g、KCl 0.2g、CaCl20.2g、NaHCO30.2g，使精子的遺傳失活。將海水水溫調整到23～25℃，在此海水中混合大黃魚成熟卵子及經過紫外線照射的大黃魚精子，精子最終濃度至少為105個/ml，啟動大黃魚卵子的雌核發育。卵子授精後4min，轉移到水壓機中靜水壓處理，壓力為45MPa/cm2，水壓機中靜水壓處理的時間為3min。使大黃魚雌核發育單倍體染色體組加倍成為雌核發育二倍體。經上述處理後的大黃魚雌核發育卵轉入正常水溫海水中，按普通大黃魚種苗生產方法管理，生產出大黃魚雌核發育二倍體苗種。
實施例4取大黃魚精液經稀釋液稀釋25倍後用紫外線照射，紫外線照射劑量為50000-100000μW/cm2，精液厚度0.6mm。稀釋液的配製為每升溶液中含NaCl 7.5g、KCl 0.2g、CaCl20.2g、NaHCO30.2g，使精子的遺傳失活。將海水水溫調整到23～24℃，在此海水中混合大黃魚成熟卵子及經過紫外線照射的大黃魚精子，精子最終濃度至少為105個/ml，啟動大黃魚卵子的雌核發育。卵子授精後3min，轉移到2～3℃的海水中冷休克5min，使大黃魚雌核發育單倍體染色體組加倍成為雌核發育二倍體。經上述處理後的大黃魚雌核發育卵轉入正常水溫海水中，按普通大黃魚種苗生產方法管理，生產出大黃魚雌核發育二倍體苗種。
實施例5取大黃魚精液經稀釋液稀釋35倍後用紫外線照射，紫外線照射劑量為50000-100000μW/cm2，精液厚度0.7mm。稀釋液的配製為每升溶液中含NaCl 7.5g、KCl 0.2g、CaCl20.2g、NaHCO30.2g，使精子的遺傳失活。將海水水溫調整到23～24℃，在此海水中混合大黃魚成熟卵子及經過紫外線照射的大黃魚精子，精子最終濃度至少為105個/ml，啟動大黃魚卵子的雌核發育。卵子授精後4min，轉移到1～2℃的海水中冷休克15min，使大黃魚雌核發育單倍體染色體組加倍成為雌核發育二倍體。經上述處理後的大黃魚雌核發育卵轉入正常水溫海水中，按普通大黃魚種苗生產方法管理，生產出大黃魚雌核發育二倍體苗種。
權利要求
1.大黃魚雌核發育二倍體誘導方法，其特徵在於其步驟為1)、精子的遺傳失活取大黃魚精液經稀釋液稀釋10～50倍後用紫外線照射，紫外線照射劑量為50000-100000μW/cm2；2)、卵子雌核發育的啟動在海水中混合大黃魚成熟卵子及經過紫外線照射的大黃魚精子，精子最終濃度至少為105個/ml；3)、雌核發育單倍體染色體組加倍卵子授精後3～5min，轉移到0～3℃的海水中冷休克或轉移到水壓機中靜水壓處理，使染色體組加倍，產生雌核發育二倍體；4)、將大黃魚雌核發育卵轉入海水中，按普通大黃魚苗生產方法管理，生產出大黃魚雌核發育二倍體魚苗。
2.如權利要求1所述的大黃魚雌核發育二倍體誘導方法，其特徵在於在步驟1)中，取大黃魚精液經稀釋液稀釋30倍後用紫外線照射。
3.如權利要求1所述的大黃魚雌核發育二倍體誘導方法，其特徵在於在步驟1)中，精液的厚度為0.5～1.0mm。
4.如權利要求1所述的大黃魚雌核發育二倍體誘導方法，其特徵在於在步驟2)中，海水水溫為20～25℃。
5.如權利要求1所述的大黃魚雌核發育二倍體誘導方法，其特徵在於在步驟3)中，在海水中冷休克的時間為5～15min。
6.如權利要求5所述的大黃魚雌核發育二倍體誘導方法，其特徵在於在步驟3)中，在海水中冷體克的時間為10min。
7.如權利要求1所述的大黃魚雌核發育二倍體誘導方法，其特徵在於在步驟3)中，轉移到水壓機中靜水壓處理的壓力為45MPa/cm2。
8.如權利要求1或7所述的大黃魚雌核發育二倍體誘導方法，其特徵在於在步驟3)中，水壓機中靜水壓處理的時間為2～3min。
全文摘要
大黃魚雌核發育二倍體誘導方法，涉及一種雌核發育方法，尤其是涉及一種大黃魚雌核發育二倍體誘導方法。提供一種大黃魚雌核發育二倍體的誘導方法。取大黃魚精液經稀釋液稀釋後用紫外線照射，使精子的遺傳失活。在海水中混合大黃魚成熟卵子及經紫外線照射的大黃魚精子，啟動卵子雌核發育；卵子授精後轉移到海水中冷休克或靜水壓處理，使染色體組加倍，產生雌核發育二倍體；將大黃魚雌核發育卵轉入海水中，按普通大黃魚苗管理，即得黃魚雌核發育二倍體魚苗。所誘導產生的後代只含有雌性親本的基因，可加速優良基因純合化、使優良的遺傳性狀得以迅速固定，可應用於大黃魚快速育種，是大黃魚遺傳分析與性別控制的輔助手段。
文檔編號A01K61/00GK1792347SQ20051009977
公開日2006年6月28日 申請日期2005年9月7日 優先權日2005年9月7日
發明者王志勇, 謝芳靖, 劉家富 申請人:集美大學