植物內生蒙塔腔菌及其用途
2024-01-23 16:09:15 2
植物內生蒙塔腔菌及其用途
【專利摘要】本發明涉及一種鹽生根系內生蒙塔腔菌（Montagnulaceae?sp.）菌株及其用途，屬於生物【技術領域】。具體而言，本發明公開了一種真菌菌株，該菌株為蒙塔腔菌（Montagnulaceae?sp.）（菌株編號：JP-ROOT-44），保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；地址：中國科學院微生物研究所，北京市朝陽區北辰西路1號院3號；保藏日：2014年1月13號，保藏號：CGMCC?No.8756。該菌株能用於促進植物的生長和/或提高其耐鹽性能。
【專利說明】植物內生蒙塔腔菌及其用途
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種鹽生根系內生蒙塔腔菌(Montagnulaceae sp.)菌株及其用途,屬於生物【技術領域】。
【背景技術】
[0002]植物內生真菌(Endophytic fungi)是一類可定植在根、莖、葉、花、種子等各種組織器官，但並不引起宿主明顯的病症的真菌類群。內生真菌諸多生物學特性都區別於菌根真菌、根瘤固氮菌和弗蘭克氏菌。根系內生真菌是植物根系微生物類群的重要組成部分，在某些環境中(如鹽脅迫、乾旱等)根系內生真菌可能比菌根真菌或其他微生物扮演著更加重要的生物學功能。自2007年美國領銜實施植物微生物組計劃(Plant Microbiome Project)以來，科學家一致認為:一個植株不是單個生命體，而是「植物-共生菌」的超級生物體。共生菌對宿主植物的一系列性狀(生長、適逆和發育等)起到了關鍵調控作用；特定植物環境中有益微生物種群的遺傳多樣性能夠擴展宿主的生態適應性，從而協同植物形成更強的適逆能力。
[0003]我國鹽鹼地面積約有14億多畝，廣泛分布於西北內陸和濱海地區；多數鹽潰土還與荒漠乾旱區相鄰或鑲嵌。這種極端環境不僅制約了農業對土地資源的利用，而且造成植被不斷退化。生理育種和分子改良技術在創製新的耐旱耐鹽林木種質資源方面發揮了重要作用。然而由於植物抗逆性狀由多個數量性狀基因(QTL)控制，導致傳統的育種方式進展緩慢；抗逆型轉基因苗木也難以適應複雜脅迫環境，在生產實踐中尚不能推廣應用。
[0004]Rodriguez等(2 009)認為有兩類內生真菌參與調控植物的非生物脅迫反應:
[0005]I) Class 2 內生菌:
[0006]主要特徵:全局性侵染模式；宿主範圍較廣；垂直或水平傳播。華盛頓大學Rodriguez教授研究團隊從生長在地熱土壤的植物(Dichanthelium Ianuginosum)中分離到一種內生管突彎孢黴(Curvularia protuberata),該菌可以定殖在根、莖和葉片組織；接種試驗表明植物-內生真菌的共生關係使得彼此可以生長在高達65°C的環境中。該成果發表在Science雜誌(Redman et al.，2002)。隨後，該研究小組從沿海植物-濱麥(Leymusmollis)中分離到一株內生黃色鐮刀菌(Fusarium culmorum),該菌株能提高多種植物的耐鹽性能(Rodriguez and Redman, 2008)。利用這種「共生基因感化」(symbiogenic,symbio=symbiosis ；genic=gene influence)策略，使這些特殊生境下的內生真菌可以幫助植物適應由於氣候變化可能導致的乾旱、鹽度增加和氣溫升高等惡劣環境，對提高農作物的產量(如水稻等)意義重大(Redman et al., 2011;Woodward et al.，2012)。由Rodriguez教授創建的Symbiogenics公司已經對Class 2內生菌進行商業化投產(www.adaptivesymbiotictechno1gies.com)。美國農業部(USDA)Lucero 博士利用顯微技術、培養和高通量測序等方法發現在兩種旱生小灌木的葉片和根部都發現有大量內生菌存在，而且在植物細胞表面會形成類似微生物膜(microbial biofilm)的結構；組織培養證實這些內生菌依然可以與宿主愈傷組織緊密結合(Lucero et al.，2011)。這種內生菌-愈傷組織複合體還可以和多種非宿主植物建立共生關係，並提高其生長活力和抗逆性(Barrow etal.，2008; Lucero et al.，2008)。這種內生真菌生物技術可能與傳統的抗逆育種和轉基因培育技術並駕齊驅(Barrow et al.，2008),應用前景十分廣闊。目前國內已有的林木微生物肥料還局限於菌根真菌、固氮菌等營養型接種劑，而專用於協同植物抗逆的微生物資源和菌劑研發還鮮見報導，缺乏系統研究，與國際同類研究相比差距較大。
[0007]2)、Class 4內生菌。主要特徵:局限在根系分布；宿主範圍較廣；水平傳播。暗色有隔內生菌(DSEs, dark septate endophytes)是Class 4類群的主要代表。DSEs通常在宿主根部皮層細胞形成「微菌核」結構(miciOslerotia)(劉茂軍等2009)微菌核」及其暗色菌絲含有的黑色素活性物質具有很強的耐受性，這對植物適應逆境可能是至關重要的(Zhang et al., 2008;Li et al., 2011;Zhan et al.，2011)。
【發明內容】
[0008]本發明要解決的技術問題是提供一種源於鹽生植物(鹽地鹼蓬)根系內生真菌，該菌株能用於促進植物的生長並提高其耐鹽性能。
[0009]為了解決上述技術問題，本發明一種真菌菌株:該菌株為蒙塔腔菌(Montagnulaceae sp.)(菌株編號:JP-R00T-44),保藏單位:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址是:中國科學院微生物研究所，北京市朝陽區北辰西路I號院3號；保藏日:2014年I月13號，保藏號:CGMCC N0.8756。
[0010]作為本發明的真菌菌株的改進，該菌株JP-R00T-44屬於真菌界Fungi，子囊菌門Ascomycota,座囊菌綱Dothideomycetes,格抱腔目Pleosporales,蒙塔腔菌科Montagnulaceae。
[0011]本發明還同時提供了上述真菌菌株的用途:能用於促進植物的生長和/或提高其耐鹽性能。
·[0012]備註說明:促進植物的生長表現在促進植株增高、或促進植株生物量。
[0013]作為本發明的真菌菌株的用途的改進:所述植物為水稻或黃瓜。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0014]下面結合附圖對本發明的【具體實施方式】作進一步詳細說明。
[0015]圖1為菌株JP-R00T-44的培養特徵圖。A:在PDA培養基培養10天；B:在PDA培養基培養3周；C:在1.5%MEA培養3周。
[0016]圖2為基於LSU基因構建的菌株JP-R00T-44的系統發育樹。
[0017]圖3為根系接種菌株JP-R00T-44後對水稻耐鹽性的影響對比圖。EF group:未接種水稻；EI group:接種菌株JP-R00T-44的水稻。
[0018]圖4為鹽脅迫下接種菌株JP-R00T-44後對水稻生物量的影響對比圖；
[0019]圖5為菌株JP-R00T-44菌絲在水稻根系部位的定植及侵染結構圖。A:菌絲(H)在侵染水稻根系表面(RR) ；B:菌絲在根系皮層細胞形成的「類菌核」(S)結構。
[0020]圖6為在非鹽脅迫培養、氮源為甘氨酸(Gly)條件下菌株JP-R00T-44對水稻生長的影響圖。
[0021]上圖為處理與對照組水稻幼苗在共培養基上生長情況；[0022]下圖為從上述培養基上取出處理與對照組水稻幼苗後的對比情況。
[0023]圖7為在非鹽脅迫、氮源為甘氨酸(Gly)條件下接種菌株JP_R00T_44對水稻生物量和株高的影響對比圖。
[0024]圖8為在非鹽脅迫、氮源為硝酸鈉(NaN03)、纈氨酸(Val)培養條件下接種菌株JP-R00T-44對黃瓜幼苗的生長影響。
[0025]圖9為在非鹽脅迫、氮源為硝酸鈉(NaN03)、纈氨酸(Val)培養條件下接種菌株JP-R00T-44對黃瓜幼苗鮮重的影響。EF:對照組(不接菌)；E1:處理組(接菌)。
[0026]a-a表示在統計學意義上差異不顯著；a_b表示在統計學意義上差異顯著。
[0027]圖10為不同溫度、鹽濃度和pH值條件下對菌株JP-R00T-44生長的影響。
【具體實施方式】
[0028]為對本發明進行更好的說明，結合附圖舉例如下:
[0029]實施例1、菌株JP-R00T-44的分離培養
[0030]1、菌株分離培養基:
[0031]I)、先製備 1.5%麥芽粉瓊脂培養基(malt extract agar，MEA):15g麥芽粉(Oxoid公司)，瓊脂粉20g，1000ml蒸餾水；高溫滅菌(為常規的高溫滅菌，一般為在1.1個大氣壓，121°C下滅菌 20min)。
[0032]2)、隨後在 上述1.5%麥芽粉瓊脂培養基中加入硫酸鏈黴素(sti^ptomycinsulfate)和鹽酸四環素(tetracycline hydrochloride)使其終濃度分別為50mg/L和20mg/L，用於抑制細菌生長；得菌株分離培養基。
[0033]2、培養菌株的馬鈴薯葡萄糖固體培養基(potato dextrose agar, PDA):
[0034]馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂粉20g，1000ml蒸餾水；高溫滅菌(為常規的高溫滅菌，一般為在1.1個大氣壓，121°C下滅菌20min)。
[0035]3、PDB 培養基:
[0036]馬鈴薯200g，葡萄糖20g，1000ml蒸餾水；高溫滅菌(為常規的高溫滅菌，一般為在
1.1個大氣壓，121°C下滅菌20min)。
[0037]4、在本實驗中，按下列條件分離培養，即可獲得本發明所描述的蒙塔腔菌:
[0038]從山東東營沿海採集在灘涂生長的鹽地鹼蓬(Suaeda salsa)，將根系用自來水衝洗乾淨，去除土壤顆粒及雜物。首先在75%酒精(V/V)浸泡40秒，再在1% (質量％)次氯酸鈉(NaClO)溶液中消毒10分鐘，隨後置入95% (V/V)酒精漂洗30秒，最後用無菌水清洗3次以上。用無菌剪刀將根系切成0.5cm長的根段，置入菌株分離培養基，25°C黑暗培養。培養至第5天，從組織切口邊緣處長出內生真菌菌絲，用接種針小心將其挑出後轉接到新鮮PDA培養基上純化培養並記錄菌株編號。
[0039]所述純化培養為:用接種針切取菌落邊緣少許菌絲轉移至新鮮PDA培養基，重複上述操作3-4次；符合菌落顏色、形態勻一的作為下述實施例2所用的菌株。
[0040]所得的菌株進行了保藏:該菌株為蒙塔腔菌(Montagnulaceae sp.)(菌株編號:JP-R00T-44)，保藏單位:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址是:中國科學院微生物研究所，北京市朝陽區北辰西路I號院3號。保藏日:2014年I月13號，保藏號:CGMCC N0.8756。[0041]實施例2、菌株JP-R00T-44的分子生物學鑑定
[0042]I)、基因組DNA提取
[0043]將菌株接種在JP-R00T-44在PDA平板上25°C黑暗培養一周。用接種針挑取少量菌絲塊於1.5ml無菌離心管中，放入直徑Imm和5mm的鋼珠各5粒，在液氮中浸泡I分鐘，隨後在JXFSTPRP冷凍研磨機(上海淨信科技有限公司)上充分研磨樣品。使用DN41-真菌基因組DNA快速提取試劑盒(北京艾德萊生物科技有限公司)進行提取基因組DNA。加入400 μ I API和4μ1 RNaseA(10mg/ml)，漩渦振蕩。隨後在65°C水浴孵育20分鐘，充分裂解樣本。加入130 μ I ΑΡ2，充分混勻，在冰浴上放置5分鐘。HOOOrpm離心8分鐘，小心吸取上清液到一個新的1.5ml無菌離心管中，加入1.5倍體積的AP3/E，用槍頭進行吹打混勻得到混合液，先加650 μ I混合液加入一個吸附柱AC中(吸附柱放在收集管中)，13000rpm離心40秒，倒掉收集管中的廢液，重複上述步驟直至加完所有混合液。在吸附柱中加入600 μ I漂洗液WB，12000rpm離心30秒，棄廢液。將吸附柱AC重新放回收集管中，13000rpm離心2分鐘，儘量除去殘留的漂洗液。取出吸附柱AC放入新的1.5ml無菌離心管中，在吸附膜的中間部位加入100 μ I洗脫緩衝液ΕΒ，室溫放置5分鐘，12000rpm離心I分鐘，即獲得DNA樣品，在_20°C保存備用。
[0044]2)、PCR 擴增
[0045]對菌株JP-R00T-44的核糖體28S大亞基(LSU)、核糖體轉錄間隔區(ITS)、RNA聚合酶次大亞基基因(RPB2)和翻譯延長因子1-α (tefl-α )等用於真菌系統發育和分子鑑定的基因序列進行測定。菌株JP-R00T-44的ITS\LSU\R0PB2\TEF基因的PCR擴增引物及反應體系見表1和表2。四個基因的PCR擴增反應條件為:94°C預變性2分鐘；94°C變性30秒，55°C退火40秒，72°C延伸50秒(LSU\RPB2\TEF基因的延伸時間為90秒)，35次循環；最後72°C延伸10分鐘。
[0046]表1、PCR擴增弓丨物·名稱及序列
[0047]
【權利要求】
1.真菌菌株，其特徵是:該菌株為蒙塔腔菌(Montagnulaceaesp.)(菌株編號:JP-R00T-44)，保藏單位:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；地址:中國科學院微生物研究所，北京市朝陽區北辰西路I號院3號；保藏日:2014年I月13號，保藏號:CGMCC N0.8756。
2.根據權利要求1所述的真菌菌株的用途，其特徵是:用於促進植物的生長和/或提高其耐鹽性能。
3.根據權利要求2所述的真菌菌株的用`途，其特徵`是:所述植物為水稻或黃瓜。
【文檔編號】C12R1/645GK103849571SQ201410045895
【公開日】2014年6月11日 申請日期:2014年2月10日 優先權日:2014年2月10日
【發明者】袁志林, 孫海菁 申請人:中國林業科學研究院亞熱帶林業研究所