一種基於量子點的單病毒示蹤方法
2024-02-17 14:05:15
專利名稱：一種基於量子點的單病毒示蹤方法
技術領域：
本發明涉及一種基於量子點的單病毒示蹤方法，屬於化學及生物醫學領域。
背景技術：
病毒侵染宿主細胞的過程非常複雜，往往包含許多階段、多種途徑並涉及不同亞細胞結構。為了滿足抗腫瘤藥物的設計及基因治療方面的發展，病毒侵染機制的研究非常重要。單病毒示蹤技術是利用顯微鏡實時監控單個病毒或亞病毒結構在活細胞內的運動行為，研究病毒的侵染過程及病毒與亞細胞結構之間相互作用，進一步揭示未發現的生物機制的動態成像技術。近幾年，單病毒示蹤技術被廣泛地應用於病毒侵染機制的研究領域， 成為監控病毒的侵染路徑或病毒的組分與宿主細胞相互作用一個強有力的工具。但是，實現對病毒粒子的螢光標記成為進行單病毒示蹤的首要條件。傳統的螢光標記物存在易光漂、標記效率低等缺點，不能滿足長時間、實時動態可視的示蹤效果。
發明內容
本發明所要解決的技術問題在於提供一種可長時間、實時動態可視化的單病毒示
蹤方法。為了實現長時間的單病毒示蹤，本發明以量子點作為螢光標記物來標記病毒，利用帶有在線培養裝置的轉盤式螢光共聚焦為成像儀器，通過兩步法的標記策略，從而實現基於量子點的單病毒的長時間示蹤。具體的技術方案包括如下步驟
1.利用生物素化的試劑盒，將病毒表面進行生物素化修飾； 2利用病毒與細胞表面受體結合的作用，將生物素化的病毒吸附到細胞表面；
3.利用鏈酶親和素與生物素的相互作用，將鏈酶親和素化的量子點標記到病毒表面；
4.利用帶有在線培養裝置的轉盤式螢光共聚焦為成像儀器，對病毒在活細胞內的侵染行為進行監控。本發明利用一種簡單高效的基於量子點的病毒標記策略，建立了一種基於量子點的長時間的單病毒示蹤技術。量子點作為螢光標記物，具有獨特又優越的光學性能，如消光係數大，量子產率高，激發光譜寬，發射光譜窄，亮度比傳統的螢光染料高10-100倍，光穩定性比傳統的螢光染料高100-1000倍等特點。該技術將成為各種病毒侵染機制的強有利工具。本發明可更廣泛地應用於生物和醫學科學等領域。
圖1量子點標記病毒的流程示意圖。圖2在細胞表面量子點標記的病毒。(左圖)細胞的微分幹涉相差圖片，(右圖) 細胞表面量子點標記病毒的螢光照片。
圖3 H9N2亞型禽流感病毒在活細胞的軌跡。圖4 H9N2病毒的速度與時間的關係曲線，標尺20微米。
具體實施例方式
下面對量子點標記病毒的操作方法詳細說明。1.將狗腎上皮細胞培養在共焦專用的培養小皿中，24h後可以用於實驗。利用生物素化試劑Sulfo-NHS-LC-Biotin (Thermo),通過與H9N2禽流感病毒表面的氨基將生物素連接到病毒表面。具體操作如下取0.3mg生物素化試劑 Sulfo-NHS-LC-Biotin，加入到300 μ L (蛋白濃度為400 mg/ml)的純化好的病毒溶液中， 室溫搖床反應2h。多餘的生物素化試劑利用NAP-5 (GE Healthcare)的脫鹽柱除掉多餘的生物素化試劑，獲得體積為700 μ L標記好的病毒溶液。2.取100 μ L生物素化的病毒加入到細胞表面，4度孵育lOmin，用IX PBS緩衝溶液洗3次。3.再加入100 μ L濃度為InM的鏈黴親和素化的量子點(SA_QDs，武漢珈源量子點有限公司)到細胞表面4度孵育lOmin，用PBS緩衝溶液洗3次。4.放在100X的共焦顯微鏡下進行觀察，獲得圖2。5.用高斯濾波出去背景噪音。6.利用圖像處理軟體對單個病毒在每一幀運動位置進行獲取，得到病毒的運動軌跡(圖3)。將病毒每幀的運動速度與相對時間做曲線，得到圖4。該技術可以有效地長時間的實現對病毒侵染機制的動態研究。
權利要求
1.一種基於量子點的單病毒示蹤方法，其特徵在於，包括如下步驟1)利用生物素化的試劑盒，將病毒表面進行生物素化修飾；2)利用病毒與細胞表面受體結合的作用，將生物素化的病毒吸附到細胞表面；3)利用鏈酶親和素與生物素的相互作用，將鏈酶親和素化的量子點標記到病毒表面；4)利用帶有在線培養裝置的轉盤式螢光共聚焦為成像儀器，對病毒在活細胞內的侵染行為進行監控。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述的病毒為H9N2禽流感病毒。
3.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述的細胞為狗腎上皮細胞。
4.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，對病毒表面進行生物素化修飾後，利用脫鹽柱除掉多餘的生物素化試劑。
全文摘要
本專利涉及一種基於量子點的單病毒示蹤方法。該方法以量子點作為螢光標記物，通過生物素與鏈酶親和素的相互作用，實現量子點對單個病毒的標記。通過實時動態的單顆粒成像技術，可以實現對單病毒侵染宿主細胞的侵染過程的全程示蹤。該標記方法具有很高的標記效率，能夠充分反映病毒在單個細胞內的群體動態侵染行為。結合量子點優異的光學性質，我們建立了一種多目標的，實時的，長時間的單分子示蹤的方法，對全局地，高效地研究病毒侵染機制提供了強有力的工具。本發明可更廣泛生物醫學領域，用於研究囊膜及無囊膜病毒的侵染機制。
文檔編號G01N33/58GK102445541SQ201110299128
公開日2012年5月9日 申請日期2011年9月29日 優先權日2011年9月29日
發明者劉書琳, 龐代文, 張志凌 申請人:武漢大學