腸毒素生物電極及其製備方法

2023-12-12 20:43:22

專利名稱：腸毒素生物電極及其製備方法
技術領域：
本發明涉及生物毒素檢測技術的改進，具體講是一種腸毒素生物電極及其製備方法，其屬於生物電化學傳感器技術領域。
背景技術：
金黃色葡萄球菌是人類和某些動物的病原菌，它是食物中毒的主要致病因子。其中，金葡菌腸毒素引起的食物中毒佔整個細菌性食物中毒的50％。金葡菌腸毒素可以汙染多種食品，如牛奶、醬肉、米飯、魚類、粉皮和熟雞蛋等。現有的金葡菌腸毒素(簡稱SEC1)檢測技術多利用光導纖維、壓電石英晶體、聲學、微波等手段，這些方法耗時費力，價格昂貴。醫學研究中常用的放射免疫法測定SEC1，也非常煩瑣且放射性汙染嚴重，投資大，成本高。
(三)技術內容本發明的目的是要提供一種生物電化學傳感器，即腸毒素生物電極及其製備方法，來取代上述較繁瑣的檢測方法。該生物電極具有制樣簡單，體積小，便於攜帶，測試時間短，響應速度快，檢測靈敏度高，過程穩定，控制容易的特點。
本發明的目的是由以下技術方案實現的，研製了一種腸毒素生物電極，其包括導電的棒狀基體，電鍍在該基體棒端外表面上的鉑黑鍍層，固定在該鉑黑鍍層上的氧化酶膜。在該氧化酶膜上通過戊二醛耦聯有腸毒素抗體膜，由該基體～鉑黑鍍層～氧化酶膜～腸毒素抗體膜，構成用於特異性檢測試樣溶液中腸毒素抗原含量的腸毒素酶免疫電極。
所述的氧化酶，其或為葡萄糖氧化酶，或為辣根過氧化物酶，或為半乳糖氧化酶，或為胺基酸氧化酶。
所述的導電的棒狀基體，其或是玻碳棒狀基體，或是石墨棒狀基體，或是鋁棒狀基體。
本腸毒素生物電極的製備步驟如下(1)基體預處理選用嵌入絕緣套管中的導電基體，經金相砂紙打磨該基體棒端外表面，再用溼潤的拋光粉拋光該打磨表面，再用酒精棉擦拭該打磨表面，然後在超聲波清洗池中清洗5分鐘，得到有潔淨外表面的導電基體；(2)製備鉑黑電極首先將(1)中處理後的導電基體在-300～-600mV(相對於飽和甘汞電極)電位下陰極極化，待該基體的打磨表面析出氫氣20分鐘後結束陰極極化；再在含2.5％K2Cr2O7和10％HNO3的氧化液中於+2.2V電位下，陽極氧化40秒，並在支持電解質中於-0.8～+0.8V範圍內以20mV/s速度循環掃描30分鐘；然後在-50～-500mV之間選定一恆電位，在該恆電位下將該基體投入鍍鉑電鍍液中，電鍍溫度控制在20～30℃內，並以醋酸緩衝液控制電鍍液的pH值在5.0～7.5之間，鍍鉑時間在10～60分鐘，取出漂洗，即得到具有粗糙表面鉑黑鍍層的鍍鉑電極；(3)製備酶電極取適量的氧化酶溶液，滴注在鍍鉑電極的粗糙表面鉑黑鍍層上，放入冰箱過夜或室溫反應1～3小時，待涼幹後，用蒸餾水輕柔漂洗，漂洗時間不超過20分鐘，再擦淨殘液後，即製得酶電極；(4)製備腸毒素酶免疫電極將(3)製備的酶電極浸入或滴上幾滴1～10％的戊二醛溶液，放入冰箱過夜或室溫反應30～180分鐘，待涼幹後取出，用蒸餾水輕柔漂洗，再將耦聯有戊二醛的酶電極浸入腸毒素抗體液中反應30～60分鐘，取出用蒸餾水輕柔漂洗，漂洗時間不超過10分鐘，再擦淨殘液後，即製得腸毒素酶免疫電極。
所述的(2)製備鉑黑電極的鍍鉑電鍍液，其電鍍液中含有10～50g/L的氯鉑酸(H2PtCl6)和0.5～1.0g/L的弱酸性陰離子。
所述的(3)製備酶電極中滴注的氧化酶溶液，是稱取一定量的氧化酶，溶解在pH5.2～5.8的醋酸緩衝溶液中，配製成10～100U的氧化酶溶液，在(3)製備酶電極中，氧化酶滴注量為15～60U。
所述的腸毒素抗體液是用pH7.0～8.0的磷酸緩衝溶液製成，配製濃度為0.2～1.8mg/ml的腸毒素抗體溶液。
本發明的優點在於，從本腸毒素生物電極的製備步驟來看，由於經過金相砂紙打磨、拋光、擦拭和超聲波清洗處理的導電基體棒端外表面，再經過陰極極化和陽極氧化，使導電基體棒端有更潔淨的適於電鍍鉑黑的外表面。由於在電鍍液中含有10～50g/L的氯鉑酸(H2PtCl6)和0.5～1.0g/L的弱酸性陰離子，可以有效恰當地電鍍鉑黑。再由於在-50～-500mV之間選定一恆電位，並控制在該恆電位下鍍鉑，又控制電鍍溫度在20～30℃範圍內，並以醋酸緩衝液控制電鍍液的pH值在5.0～7.5之間，三管齊下，鍍鉑時間在10～60分鐘，使得鉑黑鍍層具有牢固的粗糙表面積，從而極大地提高了電極鉑黑鍍層的表面積，進而使得氧化酶能夠更多地牢固固定(吸附)在經過鍍鉑修飾的基體電極表面上。鍍鉑效果見表1表1 不同鍍鉑工藝條件下的玻碳電極表面積
由於本發明腸毒素生物電極的實質是在酶電極的基礎上耦聯腸毒素抗體而製成的。本發明利用酶的固定化方法先將酶固定(吸附)在經過鍍鉑修飾的基體電極表面，然後利用雙官能團交聯劑——戊二醛將腸毒素抗體耦聯在氧化酶上，這樣即可製得酶免疫電極。本發明腸毒素生物電極的檢測機理是腸毒素抗體經戊二醛與氧化酶耦聯，由於腸毒素抗體與氧化酶的耦聯改變了氧化酶的結構或佔據了氧化酶的活性中心，從而降低了氧化酶對底物的催化作用，而腸毒素抗原與腸毒素抗體的結合又部分地恢復了氧化酶固有的構型或部分地釋放了氧化酶的催化活性中心，這樣就又部分地提高了氧化酶的催化活性。所以腸毒素抗原與腸毒素抗體間的免疫反應對氧化酶的活性有調製作用。腸毒素抗原與腸毒素抗體的結合調製了由氧化酶催化活性的改變而引起的介體電極響應電流的變化，從而達到檢測腸毒素抗原的目的。本發明腸毒素生物電極是用來檢測樣品中微量(痕量)SEC1的生物傳感器，其檢測靈敏度最低檢測下限為6ng/ml，用於檢測樣品濃度的數量級為ug/ml。本發明腸毒素生物電極兼有酶電極的催化放大作用和免疫電極的抗原與抗體之間分子識別反應的特異性作用，因此具有生物活性、較高的靈敏度和穩定性。用本發明腸毒素生物電極檢測樣品確實具有制樣簡單，體積小，便於攜帶，測試時間短，響應速度快，檢測靈敏度高，易於控制的特點。
(四)附圖及其實施例，本發明的實施例結合附圖進一步說明如下，本發明的保護範圍不僅局限於實施例中。


圖1為腸毒素生物電極的結構原理示意圖。
圖2為不同酶量的SEC1酶免疫電極的響應特性圖。
圖3為不同抗體濃度的SEC1酶免疫電極的響應特性圖。
參見圖1，製成的一種腸毒素生物電極，其包括導電的棒狀玻碳基體1，電鍍在該基體1棒端外表面上的鉑黑鍍層2，固定在該鉑黑鍍層2上的葡萄糖氧化酶，或為辣根過氧化物酶的氧化酶膜3。在該氧化酶膜3上通過戊二醛耦聯有腸毒素抗體膜4，由該基體1～鉑黑鍍層2～氧化酶膜3～腸毒素抗體膜4，構成用於特異性檢測試樣溶液中腸毒素抗原含量的腸毒素酶免疫電極。
本腸毒素生物電極的製備步驟如下(1)基體預處理選用嵌入聚四氟乙烯質的絕緣套管5中導電的玻碳基體1，經1#、2#、3#金相砂紙打磨該基體1棒端外表面，再用溼潤的氧化鋁拋光粉拋光該打磨表面，再用酒精棉擦拭該打磨表面，然後在超聲波清洗池中清洗5分鐘，得到有潔淨外表面的導電的玻碳基體1；(2)製備鉑黑電極首先將(1)中處理後的導電的玻碳基體1在-400mV(相對於飽和甘汞電極)電位下陰極極化，待該基體1的打磨表面析出氫氣20分鐘後結束陰極極化；再在含2.5％K2Cr2O7和10％HNO3的氧化液中於+2.2V電位下，陽極氧化40秒，並在支持電解質中於-0.8～+0.8V範圍內以20mV/s速度循環掃描30分鐘；然後在-250mV恆電位下，將該基體投入鍍鉑電鍍液中，電鍍溫度控制在25℃±1℃，並以醋酸緩衝液控制電鍍液的pH值為7.0，鍍鉑時間為30分鐘，取出漂洗，即得到具有粗糙表面鉑黑鍍層的鍍鉑電極；(3)製備酶電極取適量的葡萄糖氧化酶溶液，滴注在鍍鉑電極的粗糙表面鉑黑鍍層上，放入冰箱過夜或室溫反應1～3小時，待涼幹後，用蒸餾水輕柔漂洗，漂洗時間為15分鐘，再擦淨殘液後，即製得酶電極；(4)製備腸毒素酶免疫電極將(3)製備的酶電極浸入或滴上幾滴2.5％的戊二醛溶液，放入冰箱過夜或室溫反應60分鐘，待涼幹後取出，用蒸餾水輕柔漂洗，再將耦聯有戊二醛的酶電極浸入腸毒素抗體液中反應30分鐘，取出用蒸餾水輕柔漂洗，漂洗時間不超過10分鐘，再擦淨殘液後，即製得腸毒素酶免疫電極。
所述的(2)製備鉑黑電極的鍍鉑電鍍液，其中含有30g/L的氯鉑酸(H2PtCl6)和0.6g/L的醋酸根陰離子。所述的(3)製備酶電極中滴注的葡萄糖氧化酶溶液，是稱取一定量的葡萄糖氧化酶，溶解在pH5.6的醋酸緩衝溶液中，配製成80U的氧化酶溶液，在(3)製備酶電極中，氧化酶滴注量為15～60U。
所述的(4)製備腸毒素酶免疫電極中，腸毒素抗體液是用pH7.2的磷酸緩衝溶液，配製濃度為0.2～1.8mg/ml的腸毒素抗體溶液。
製備本腸毒素生物電極所使用儀器是Model 273A恆電位/恆電流儀，葡萄糖氧化酶(Glucose Oxidase，127U/mg)購自日本TOYOBO有限公司，二甲胺基甲基二茂鐵(介體)購自美國Aldrich化學公司，SEC1抗體和SEC1抗原由中國人民解放軍軍事醫學科學院微生物流行病研究所提供。本發明採用循環伏安法檢測本腸毒素生物電極的響應特性。
實驗中電解池採用三電極體系，研究電極為本腸毒素生物電極，參比電極為Ag/AgCl電極，輔助電極為鉑絲。電解液為含2mmol/L二甲胺基甲基二茂鐵和120mmol/L葡萄糖的pH7.0的磷酸緩衝溶液，待循環伏安曲線穩定後，加入不同量的SEC1抗原，記錄穩定後的循環伏安曲線。
實例1在鍍鉑電極上分別交聯30U、20U、15U、10U的葡萄糖氧化酶之後，用0.8mg/ml的SEC1抗體製成SEC1酶免疫電極，並檢測不同SEC1抗原濃度的電極響應曲線，得到如圖2所示的響應特性。從圖2中可以看出交聯30U葡萄糖氧化酶的電極靈敏度較高，這是因為酶量多，耦聯的抗體量也多，檢測時抗體與抗原結合的機率就大，釋放的酶活性也就多，即產生的響應電流也就高，也就是靈敏度高。與之相反，交聯20U葡萄糖氧化酶的電極上耦聯的抗體量較少，其與抗原結合的機率就小，釋放的酶活性也就少。只有當抗原濃度較大時，才能使酶的活性釋放量大，所以交聯20U葡萄糖氧化酶的免疫電極的靈敏度較低，但檢測範圍較大。交聯15U和10U葡萄糖氧化酶的酶免疫電極，因為酶量少，耦聯的抗體量也少，所以它們的靈敏度低，檢測範圍也不是很大。
實例2將交聯30U葡萄糖氧化酶的酶電極，分別耦聯0.8mg/ml和3mg/ml的腸毒素抗體，再測定其對不同濃度SEC1抗原的響應曲線，得到如圖3所示的響應特性圖。從圖3中可以看出兩支電極的檢測範圍差不多，但耦聯0.8mg/ml的SEC1抗體製成的SEC1酶免疫電極靈敏度高。檢測範圍較接近是因為兩支電極所交聯的酶量相同。所以不管抗體濃度相差多大，耦聯到電極上的抗體量相差不多，因此能夠與抗體結合的最大抗原量就比較接近。而耦聯0.8mg/ml抗體的電極靈敏度高是由於在耦聯抗體的過程中，高濃度(3mg/ml)的抗體對於酶的活性抑制較大，因此使其在檢測過程中酶的催化能力較弱，即加入相同量的抗原時，耦聯3mg/ml抗體的電極響應電流就小。
權利要求
1.一種腸毒素生物電極，其包括導電的棒狀基體，電鍍在該基體棒端外表面上的鉑黑鍍層，固定在該鉑黑鍍層上的氧化酶膜，其特徵在於在該氧化酶膜上通過戊二醛耦聯有腸毒素抗體膜，由該基體～鉑黑鍍層～氧化酶膜～腸毒素抗體膜，構成用於特異性檢測試樣溶液中腸毒素抗原含量的腸毒素酶免疫電極。
2.根據權利要求1所述腸毒素生物電極，其特徵在於所述的氧化酶，其或為葡萄糖氧化酶，或為辣根過氧化物酶，或為半乳糖氧化酶，或為胺基酸氧化酶。
3.根據權利要求1所述腸毒素生物電極，其特徵在於所述的導電的棒狀基體，其或是玻碳棒狀基體，或是石墨棒狀基體，或是鋁棒狀基體。
4.根據權利要求1所述腸毒素生物電極的製備方法，其特徵在於該生物電極的製備步驟如下(1)基體預處理選用嵌入絕緣套管中的導電基體，經金相砂紙打磨該基體棒端外表面，再用溼潤的拋光粉拋光該打磨表面，再用酒精棉擦拭該打磨表面，然後在超聲波清洗池中清洗5分鐘，得到有潔淨外表面的導電基體；(2)製備鉑黑電極首先將(1)中處理後的導電基體在-300～-600mV(相對於飽和甘汞電極)電位下陰極極化，待該基體的打磨表面析出氫氣20分鐘後，結束陰極極化；再在含2.5％K2Cr2O7和10％HNO3的氧化液中於+2.2V電位下，陽極氧化40秒，並在支持電解質中於-0.8～+0.8V範圍內以20mV/s速度循環掃描30分鐘；然後在-50～-500mV之間選定一恆電位，在該恆電位下將該基體投入鍍鉑電鍍液中，電鍍溫度控制在20～30℃範圍內，並以醋酸緩衝液控制電鍍液的pH值在5.0～7.5之間，鍍鉑時間在10～60分鐘，取出漂洗，即得到具有粗糙表面鉑黑鍍層的鍍鉑電極；(3)製備酶電極取適量的氧化酶溶液，滴注在鍍鉑電極的粗糙表面鉑黑鍍層上，放入冰箱過夜或室溫反應1～3小時，待涼幹後，用蒸餾水輕柔漂洗，漂洗時間不超過20分鐘，再擦淨殘液後，即製得酶電極；(4)製備腸毒素酶免疫電極將(3)製備的酶電極浸入或滴上幾滴1～10％的戊二醛溶液，放入冰箱過夜或室溫反應30～180分鐘，待涼幹後取出，用蒸餾水輕柔漂洗，再將耦聯有戊二醛的酶電極浸入腸毒素抗體液中反應30～60分鐘，取出用蒸餾水輕柔漂洗，漂洗時間不超過10分鐘，再擦淨殘液後，即製得腸毒素酶免疫電極。
5.根據權利要求4所述腸毒素生物電極的製備方法，其特徵在於所述的(2)製備鉑黑電極的鍍鉑電鍍液，其電鍍液中含有10～50g/L的氯鉑酸(H2PtCl6)和0.5～1.0g/L的弱酸性陰離子。
6.根據權利要求4所述腸毒素生物電極的製備方法，其特徵在於所述的(3)製備酶電極中滴注的氧化酶溶液，是稱取一定量的氧化酶，溶解在pH5.2～5.8的醋酸緩衝溶液中，配製成10～100U的氧化酶溶液，在(3)製備酶電極中，氧化酶滴注量為15～60U。
7.根據權利要求4所述腸毒素生物電極的製備方法，其特徵在於所述的腸毒素抗體液是用pH7.0～8.0的磷酸緩衝溶液製成的，配製濃度為0.2～1.8mg/ml的腸毒素抗體溶液。
全文摘要
本發明公開了一種腸毒素生物電極，其包括導電的棒狀基體，電鍍在該基體棒端外表面上的鉑黑鍍層，固定在該鉑黑鍍層上的氧化酶膜。在該氧化酶膜上通過戊二醛耦聯有腸毒素抗體膜，由該基體～鉑黑鍍層～氧化酶膜～腸毒素抗體膜，構成用於特異性檢測試樣溶液中腸毒素抗原含量的腸毒素酶免疫電極。其製備步驟如下(1)基體預處理；(2)製備鉑黑電極；(3)製備酶電極；(4)製備腸毒素酶免疫電極。本電極用於檢測樣品濃度的數量級為ug/ml。其兼有酶電極的催化放大作用和免疫電極的抗原與抗體之間分子識別反應的特異性作用，具有生物活性、較高的靈敏度和穩定性，並具有制樣簡單，體積小，便於攜帶，測試時間短，響應速度快，檢測靈敏度高，易於控制的特點。
文檔編號G01N27/327GK1442690SQ03111928
公開日2003年9月17日 申請日期2003年3月7日 優先權日2003年3月7日
發明者董颯英 申請人:中國船舶重工集團公司第七二五研究所