Hip/pap或其衍生物的新應用的製作方法

2023-10-25 21:52:07 1

專利名稱：Hip/pap或其衍生物的新應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及神經學領域，其包括新生兒、兒童和成人神經學。本發明更具體涉及新生」L腦損傷領域。
背景技術：
新生兒腦損傷構成醫學研究的特定領域，因為參與新生兒神經損傷的過程不同於導致成人患者神經損傷的那些過程。儘管具有改善的產科護理和新生兒護理，兩類新生兒仍然具有發生具有永久性神經學損傷的圍產期腦損傷的風險，稱為具有主要白質損傷的早產兒和具有含缺氧缺血性腦損傷的足月窒息嬰兒。除缺氧缺血外，導致興奮性中毒細胞死亡的穀氨酸的增加釋放和活性氧類別(ROS)的產生在這兩組的腦損傷過程中是重要的。新生兒窒息，也稱為缺氧缺血(HI)，是嬰兒在早產發生、生產、分娩或直接產後期過程中因氧氣攝取不足引起的狀況。新生兒窒息仍然是新生兒中慢性神經發病率和急性死亡率的主要原因，並通常引起缺氧缺血性腦病。現有研究已經顯示，短至六分鐘的新生兒缺氧可導致永久性神經損傷。大約14. 6%的所有出生死亡均是由新生兒缺氧引起的。在西方國家，約O. 9%的新生兒患有新生兒缺氧。約15-20%的新生兒死亡，並且在存活者中，因長期併發症，如智力遲鈍、腦性麻痺、痙攣、學習困難或癲癇，25%的新生兒嚴重殘疾。此外，越來越多地認識到，即使輕度缺氧的兒童開始時看起來可以恢復而沒有併發症，但在兒童期也會具有行為問題，這可追溯到這種新生兒損傷。一般地，新生兒腦損傷的開始和發展是複雜的過程，其具有多種作用機制和途徑，導致早期和延遲損傷。研究已經集中在了這些過程的多個方面，包括氧化應激、炎症和興奮性中毒，其在成熟或未成熟腦中非常不同(Gonzalez等,2008, Pharmacology andTherapeutics,120 卷:43-53)。目前，除作為重症監護的一部分提供的支持療法和幹預治療外，沒有用於與新生兒HI相關腦損傷的經批准治療法。然而，具有大量有希望的研究途徑，以在跟隨已經用於檢測臨床應用但失敗了的治療中改善幹預並發現新的策略。失敗治療的實例包括在復甦過程中補充葡萄糖、換氣過度、咪達唑侖、巴比妥酸鹽、地塞米松和其他糖皮質激素、鈣通道阻滯劑、硫酸鎂、吲哚美辛、綴合聚乙二醇的超氧化物歧化酶/過氧化氫酶、MK-801、右美沙芬、和胱天蛋白酶抑制劑。新生兒大腦HI的處理包括支持療法，以提供充分換氣、精確的流 體處理、避免低血壓和低血糖，和對發作的治療。實際上，已經假設，改善嬰兒在HI後復甦的方式是邁向改善結果並減少殘疾至關重要的第一步。復甦過程中使用的氧氣濃度可影響HI後的腦損傷。已經在患有HI的新生兒和局部缺血性中風的齧齒動物模型中嘗試了高壓氧，並獲得了一些成功。需要進一步的研究來澄清氧氣在中風新生兒中的作用，所述新生兒也具有患氧自由基疾病的風險。除了改善重症監護，已經進行了許多研究來鑑定新的治療選項和可能的幹預，以改善進行性腦損傷的過程。簡言之，已經發展了多種策略，包括檢測抗氧化劑、抗炎劑、細胞死亡抑制劑、生長因子、幹細胞治療或低體溫。已經研究了多種抗炎症化合物。因其副作用譜和一些失敗的試驗，幾種幹預，如別嘌醇/奧昔嘌醇、去鐵敏和褪黑激素嘗試降低因自由基引起的HI誘導的腦損傷已經不能引起臨床興趣了。近期有希望的治療法包括促紅細胞生成素和N-乙醯半胱氨酸。促紅細胞生成素是具有抗細胞凋亡、antinitrosative和血管生成性質的抗氧化劑。也已經報導了促紅細胞生成素通過改變細胞命運決定而促進神經保護和神經發生，並在未成熟大鼠中風後改善功能結果。眾所周知的抗氧化劑和自由基清除劑N-乙醯半胱氨酸可穿過胎盤和血腦屏障(BBB)，並在懷孕期具有良好的安全譜。除在窒息後觀察到的改善的心腎恢復外，已經顯示N-乙醯半胱氨酸降低氧化應激、恢復細胞內穀胱甘肽水平、清除氧自由基、提高細胞氧化還原電位並減少細胞凋亡和新生兒腦的炎症。氫治療可能也代表了待開發的治療策略。此外，已經嘗試了通過腦室內注射神經幹細胞/祖細胞與軟骨素酶ABC在新生缺氧缺血大鼠中減輕腦損傷(Sato等，2008，Reprod Sci,15(η。 6)卷613-620)。
在引起極大醫學關注的腦外傷中，當外部力量損傷腦時發生外傷性腦損傷(TBI)。TBI是全世界死亡和殘疾，特別是兒童和青年人死亡和殘疾的主要原因。TBI定義為因外部機械力，如快速加速或減速、撞擊、衝擊波、或發射物穿透引起的腦損傷。腦外傷引起繼發性損傷，其包括腦血流量和顱骨內壓力改變。TBI可引起許多身體、認知、情緒和行為影響。TBI結果可在完全恢復到永久性殘疾或死亡範圍內。20世紀已經在診斷和治療中看到了關鍵性的進展，其已經降低了死亡率並改善了結果。這些包括成像技術，如計算機層析X射線照相術和磁共振成像。受TBI影響的人應該在損傷後所謂的「黃金時間」內立即進行急救。患有中等到重度損傷的人在神經外科病房後可能在重病監護病房接受治療。治療依賴於患者的恢復階段。在急性期，主要目標是穩定患者併集中在預防進一步的損傷上，因為很難逆轉外傷引起的最初損傷。主要的醫學關注是保證適當的氧供應，維持充足的腦血流量，並控制升高的顱內壓。目前進行研究以設計可能的醫學治療，其可以幫助患者的神經保護。然而，測試可阻止腦細胞損傷的試劑的臨床試驗大多數都失敗了。例如，在低溫冷卻受傷的大腦以限制TBI損傷中存在興趣，但臨床試驗顯示其在治療TBI中沒有用。這些失敗可能是由於這樣的因素，所述因素包括試驗設計中的錯誤或單一試劑不足以防止繼發性損傷中涉及到的系列損傷過程。已經評估高壓氧療法(HBO)為TBI之後的輔助治療，總結了 Cochrane綜述，即其用途不能判定用於TBI的HBO仍然有爭議，因為研究已經尋找了改善機制，並且進一步的證據顯示其具有治療潛力。先前的評論表明，迄今為止，非常需要醫學進步來治療患有外傷性腦損傷的患者。本領域中需要鑑定有效治療新生兒腦損傷的其他化合物。本領域還需要鑑定用於治療外傷性腦損傷(TBI)的化合物，所述外傷性腦損傷引起神經元細胞死亡，並且目前很少有用於此的治療方法。本領域還需要鑑定用於治療小腦疾病的化合物，所述小腦疾病包括小腦遺傳疾病，以及環境性小腦疾病。本領域還需要鑑定用於治療阿爾茨海默氏病以及阿爾茨海默氏病特定症狀之前的意識認知缺損的化合物。發明概述本發明提供用於預防或治療多種類型腦損傷的其他化合物。
本發明涉及HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物用於預防或治療新生兒腦損傷的用途，所述新生兒腦損傷包括腦缺氧引起的新生兒腦損傷。本發明還涉及HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物用於預防或治療外傷性腦損傷(TBI)的用途。
本發明涉及HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物用於預防或治療腦缺氧引起的腦損傷的用途。本發明特別涉及HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物用於預防或治療由腦缺氧引起的新生兒腦損傷組成的腦損傷的用途。本發明還涉及HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物用於預防或治療由腦缺氧引起的兒童腦損傷組成的腦損傷的用途。本發明還涉及HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物用於預防或治療由腦缺氧引起的成人腦損傷組成的腦損傷的用途。本發明還涉及HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物用於預防或治療由腦血管事故或外傷性腦損傷組成的腦損傷的用途，所述腦損傷包括中風，並且其中中風優選選自缺血性中風和出血性中風。本發明特別涉及HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物用於預防或治療由小腦疾病或小腦病症(其包括小腦性共濟失調)的用途。本發明還涉及HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物用於體外或體內調節、增強或改善神經元生長或可塑性的用途。本發明還涉及HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物用於調節神經元細胞的結構重塑或可塑性的用途。本發明還涉及HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物用於保護神經元細胞免於細胞凋亡或細胞死亡的用途。本發明還涉及HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物用於預防或治療病症或疾病的用途，所述病症或疾病涉及Gap-43產生的去調節或缺陷,或Gap-43磷酸化的去調節或缺陷。本發明還具有HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物用於體外培養神經元細胞的用途的主題。本發明還涉及用於神經元細胞的培養基，其包含HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物。附圖
簡述圖I圖解了 HIP/PAP對來自GAP 43+/+小鼠的皮質神經元細胞的細胞凋亡的保護作用。縱坐標=TUNEL陽性細胞的百分比；橫坐標從左到右，與(I)對照培養基，⑵NMDA，
(3)匪0麼和!^/^ ，和(4)單獨匪04溫育的細胞。'#":與對照相比顯著的；"*":與NMDA相比顯著的。圖2圖解了 HIP/PAP對來自GAP 43+/+小鼠的皮質神經元細胞中的初級軸突的數量的影響。縱坐標具有特定數量的初級軸突的細胞的百分比。橫坐標四組條形，從左到右分別是(I)具有O個初級軸突的細胞，(2)具有I個初級軸突的細胞，(3)具有2個初級軸突的細胞，(4)具有3個或更多初級軸突的細胞；每組條形圖解了從左到右，利用(a)對照培養基，(b)NMDA, (c) NMDA和HIP/PAP，和(d)單獨HIP/PAP獲得的結果·』 ' #":與對照相比顯著的；":與NMDA相比顯著的。
圖3圖解了 HIP/PAP對小鼠皮質神經元細胞中的二級軸突的數量的影響。縱坐標具有二級軸突的細胞的百分比。橫坐標四組條形，從左到右分別是(I)對照培養基，(2)NMDA, (3)匪04和!11 ^^ ，和(4)單獨HIP/PAP ;每組條形圖解了利用來自以下小鼠皮質細胞獲得的結果，從左到右是(a)GAP 43+/+小鼠，(b)GAP 43+/-小鼠和(c)GAP 43-/-小鼠；'#":與對照相比顯著的；":與NMDA相比顯著的。
圖4圖解了 HIP/PAP對小鼠皮質神經元細胞中的三級軸突的數量的影響。縱坐標具有三級軸突的細胞的百分比。橫坐標四組條形，從左到右分別是(I)對照培養基，(2)NMDA, (3)匪04和!11 ^^ ，和(4)單獨HIP/PAP ;每組條形圖解了利用來自以下小鼠皮質細胞獲得的結果，從左到右是(a)GAP 43+/+小鼠，(b)GAP 43+/-小鼠和(c)GAP 43-/-小鼠；'#":與對照相比顯著的；":與NMDA相比顯著的。圖5圖解了 HIP/PAP對來自GAP 43+/+小鼠的皮質神經元細胞中的分支點的數量的影響。縱坐標具有特定數量的分支點的細胞的百分比。橫坐標三組條形，從左到右分別是⑴具有I個分支點的細胞，⑵具有2個分支點的細胞，(3)具有3個或更多分支點的細胞；每組條形圖解了從左到右，利用(a)對照培養基，(b)NMDA, (c)NMDA和HIP/PAP，和(d)單獨HIP/PAP獲得的結果；'#":與對照相比顯著的；":與NMDA相比顯著的。圖6圖解了 HIP/PAP對來自GAP 43+/+小鼠的皮質神經元細胞中的軸突長度的影響。縱坐標具有特定的軸突長度範圍的細胞的百分比。橫坐標四組條形，從左到右分別是(I)軸突長度範圍在O到IOym的細胞，⑵軸突長度範圍在11到25 μ m的細胞，(3)軸突長度範圍在25到40 μ m的細胞，和(4)軸突長度大於40 μ m的細胞；每組條形圖解了從左到右，利用(a)對照培養基，(b)NMDA, (c) NMDA和HIP/PAP，和(d)單獨HIP/PAP獲得的結果；'#":與對照相比顯著的；"*":與NMDA相比顯著的。發明詳述此處已經發現，HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物能夠保護免於神經元細胞死亡，尤其免於在腦損傷中發生的神經元細胞死亡，所述腦損傷包括新生兒腦損傷、兒童腦損傷和成人腦損傷。此處讓人想起的是，HIP/PAP蛋白先前在本領域中稱為肝細胞的促有絲分裂因子。先前也已知HIP/PAP(Reg IIIa)基因在炎性腦疾病(稱為實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE))的小鼠實驗模型中上調，並且顯示HIP/PAP蛋白可能在小鼠EAE上發揮預防效應。這些初步數據已經導致以前的讀者斷言Reg III蛋白對於治療成人患者非常多種的炎性或神經疾病，包括多發性硬化、視神經炎、視神經脊髓炎、腎上腺腦白質營養不良、腎上腺脊髓神經病、脊髓損傷、肌萎縮性脊髓側索硬化、炎性腸病或膿毒具有有益影響(參閱美國專利申請n° US 2005/0277593)。此處讓人想起的是，EAE由腦炎症的動物模型組成，模擬中樞神經系統的炎性脫髓鞘疾病，像多發性硬化和急性播散性腦脊髓炎(ADEM)。一般而言，EAE也是T細胞介導的自身免疫疾病的原型。也讓人想起的是，髓鞘由神經膠質細胞的向外生長組成，並且施萬細胞為外周神經元提供髓鞘，然而，少突神經膠質細胞，尤其是束中類型的少突神經膠質細胞使中樞神經系統的軸突髓鞘化。脫髓鞘病基本上包括多發性硬化、急性播散性腦脊髓炎、橫貫性脊髓炎、慢性炎性脫髓鞘性多神經病、吉-巴症候群、中央腦橋脂肪髓磷脂化、家族黑朦性白痴，以及遺傳性脫髓鞘性病，如leucodistrophy和CharcotMarie Tooth。不需要說的是，疾病，像膿毒、肌萎縮性脊髓側索硬化、脊髓損傷、炎性腸病、阿爾茨海默氏病、痴呆、血管炎或局部缺血損傷不由最初因脫髓鞘引起的疾病組成。結果，通過抑制EAE症狀的物質對這些後面疾病的預防或治療缺乏對本領域技術人員而言任何技術可靠性。本領域中也顯示，在HIP/PAP基因的基因組序列的等位基因多態性與多發性硬化發生之間存在相關性(參閱PCT申請n° WO 2007/071437)。最終，本領域中也顯示，Reg家族成員將是受損神經元與神經膠質細胞之間的介體，並可能在神經再生過程中起作用(參閱 Namikawa 等，2005，Biochem Biophys Res Commun, 332 卷(η° 1) 126-134) 根據本發明已經發現，ΗΙΡ/ΡΑΡ蛋白或其蛋白衍生物在腦損傷過程中具有神經保護性質。已經發現，ΗΙΡ/ΡΑΡ蛋白或其蛋白衍生物在新生兒腦損傷過程中，因此在早期發育中發生的腦損傷過程中具有神經保護性質，所述早期發育中發生的腦損傷完全不同於成人已發育的腦發生的腦損傷。更精確的是，此處已經發現ΗΙΡ/ΡΑΡ在腦損傷的實驗模型中，尤其在新生兒腦損傷的實驗模型中具有體外和體內神經保護效應。本發明涉及ΗΙΡ/ΡΑΡ蛋白或其蛋白衍生物用於保護神經元細胞免於細胞凋亡或細胞死亡的用途。本發明還涉及ΗΙΡ/ΡΑΡ蛋白或其蛋白衍生物用於預防或治療新生兒、兒童和成人腦損傷的用途。本發明一般涉及ΗΙΡ/ΡΑΡ或其蛋白衍生物，其用於預防或治療胎兒、新生兒、兒童和成人外傷性腦損傷(TBI)。一般而言，當此處詳細說明ΗΙΡ/ΡΑΡ蛋白或其蛋白衍生物用於預防或治療病理學狀態，包括創傷、疾病和病症的用途時，這也表示本發明的方面涉及ΗΙΡ/ΡΑΡ或其蛋白衍生物，其用於預防或治療所述病理學狀態。一般而言，當此處詳細說明ΗΙΡ/ΡΑΡ蛋白或其蛋白衍生物用於預防或治療病理學狀態，包括創傷、疾病和病症的用途時，這也表示本發明的方面涉及ΗΙΡ/ΡΑΡ或其蛋白衍生物用於製備預防或治療所述病理學狀態的藥物的用途。一般而言，當此處詳細說明ΗΙΡ/ΡΑΡ蛋白或其蛋白衍生物用於預防或治療病理學狀態，包括創傷、疾病和病症的用途時，這也表示本發明的方面涉及用於預防或治療所述病理學狀態的方法，其包括向需要預防或治療的患者施用ΗΙΡ/ΡΑΡ或其蛋白衍生物的步驟。如此處所用，在醫學上根據Glascow Coma Scale (GCS)確定並劃分外傷性腦損傷，根據所述Glascow Coma Scale (GCS),基於對刺激的言語、行動和睜眼反應將人的意識水平在 3 到 15 的等級上分級(參閱 Marion Dff (1999). " Introduction " ，in MarionDff. Traumatic Brain Injury. Stuttgart Thieme)。本發明涉及HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物用於預防或治療選自新生兒腦損傷和成人或兒童腦損傷，包括腦缺氧引起的成人或兒童腦損傷的疾病的用途。其因此涉及HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物用於製備預防或治療選自新生兒腦損傷和成人或兒童腦損傷，包括腦缺氧引起的成人或兒童腦損傷的疾病的藥物的用途。本發明涉及用於預防或治療腦損傷，尤其是新生兒腦損傷的實驗模型中的腦損傷的方法，其中所述方法包括向需要預防或治療的患者施用適當量的HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物的步驟。
本發明還提供用於預防或治療胎兒、新生兒、兒童和成人外傷性腦損傷(TBI)的方法，其中所述方法包括向需要預防或治療的患者施用適當量的HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物的步驟。其還涉及用於預防或治療選自新生兒腦損傷和成人或兒童腦損傷，包括腦缺氧引起的成人或兒童腦損傷的疾病的方法，其中所述方法包括向需要預防或治療的患者施用適當量的HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物的步驟。本發明還涉及HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物用於預防或治療胎兒、新生兒、兒童和成人外傷性腦損傷(TBI)的用途。本發明包括HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物用於預防或治療新生兒腦損傷的用途。本發明還涉及HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物用於製備預防或治療胎兒、新生兒、兒童和成人外傷性腦損傷(TBI)的藥物的用途。
其因此涉及HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物用於製備預防或治療新生兒腦損傷的藥物的用途。其也涉及用於預防或治療新生兒腦損傷的方法，其中所述方法包括向需要預防或治療的患者施用適當量的HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物的步驟。本發明還涉及HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物用於預防或治療用於預防或治療小腦疾病或病症，包括新生兒、兒童和成人個體中小腦疾病或病症的用途。本發明還涉及HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物用於預防或治療在Gap-43產生或磷酸化中具有缺陷的疾病的用途。在本說明書中描述的預防性或治療性方法的大多數實施方案中，所述HIP/PAP蛋白或所述其蛋白衍生物與一種或多種藥學上可接受的賦形劑組合，以形成藥物組合物。藥學上可接受的賦形劑優選由美國藥典或歐洲藥典中認可或列舉的那些組成。本發明通過提供新的保護組合物針對任何腦損傷/外傷/變性的神經元保護提供新線索。「HIP/PAP蛋白」此處指包含SEQ ID N。I的胺基酸序列的蛋白質。HIP/PAP蛋白的特定實施方案包括這樣的蛋白質，其包含選自SEQ ID N0 2和SEQ ID N0 3的胺基酸序列。SEQ ID N0 3的HIP/PAP蛋白由此處實施例中更明確闡明的HIP/PAP蛋白組成，其中其也可稱為「ALF5755」。如此處的實施例中所闡明，可在大腸桿菌(E. coli)中重組產生SEQID N0 3的HIP/PAP蛋白。SEQ ID N0 3的HIP/PAP蛋白包含12個胺基酸的N末端前肽部分，在體內切割所述N末端前肽部分，用於釋放所述HIP/PAP蛋白的生物活性部分。所述HIP/PAP蛋白的所述生物活性部分定位在SEQID N0 3的13位異亮氨酸殘基到150位天冬氨酸殘基之間。類似地，所述HIP/PAP蛋白的所述生物活性部分定位在SEQ ID N0 2的12位色氨酸殘基到149位天冬氨酸殘基之間。優選地，HIP/PAP蛋白的任何實施方案，以及其衍生物的任何實施方案由重組蛋白質，例如在細菌或動物細胞(包括昆蟲細胞和哺乳動物細胞)中重組產生的蛋白質組成。本發明人已經表明HIP/PAP蛋白顯著降低興奮性中毒腦損傷的新生小鼠模型中的神經元死亡或凋亡。本發明還通過HIP/PAP的抗氧化能力提供針對氧化應激的治療工具，所述氧化應激是神經元異常和變性的主要因素，如下文進一步詳細說明。此外且有趣的是，當在CNS外周施用，而不是直接向CNS遞送時，也觀察到HIP/PAP蛋白的效果。最後，HIP/PAP蛋白的保護作用包括預防神經元死亡並誘導神經元可塑性。 本發明還涉及HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物用於調節神經元細胞結構重塑或可塑性的用途。如此處實施例所示，HIP/PAP蛋白在小鼠神經元原代培養中防止體外N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)誘導的神經元細胞死亡。此處還顯示，HIP/PAP蛋白在原代小鼠神經元培養物中挽救了體外N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)誘導的神經元細胞死亡。同樣，本發明顯示，HIP/PAP蛋白防止正發育的小鼠腦中穀氨酸能類似物鵝膏蕈氨酸引起的體內興奮性中毒損傷。此外，實施例中呈現的結果公開了 HIP/PAP蛋白對正發育的小鼠腦中穀氨酸能類似物鵝膏蕈氨酸引起的興奮性中毒損傷具有體內挽救效應。此外，根據本發明已經發現，HIP/PAP蛋白對新生兒腦損傷的預防性和治療性體內效應可能是HIP/PAP的多效活性的結果，即HIP/PAP參與多種神經元挽救生理學途徑的結
果O作為HIP/PAP在預防或治療新生兒腦損傷中的多效活性的闡明，此處還顯示HIP/PAP影響針對活性氧類別，像過氧化氫(H2O2)誘導的新生兒神經元細胞死亡的神經保護。作為HIP/PAP在預防或治療新生兒腦損傷中的多效活性的進一步說明，此處還顯示在新生兒腦損傷的體外和體內模型中，HIP/PAP誘導GAP-43或磷酸化GAP-43的產生、磷酸化和分布的改變，本領域中已知其為參與軸突生長和神經元可塑性的蛋白質。值得注意的是，HIP/PAP誘導GAP-43標記的神經元過程的束狀分布。同樣，HIP/PAP誘導GAP-43蛋白的磷酸化形式的增強表達，即在GAP-43胺基酸序列的41位定位的絲氨酸殘基(S41)上磷酸化的GAP-43形式的增強表達。HIP/PAP更誘導GAP-43總細胞量的減少，同時誘導磷酸(S41)-GAP-43的增加。不希望受任何特定理論的束縛，本發明人相信HIP/PAP對GAP-43的生物學效應對預防或治療腦缺氧引起的腦損傷重要，尤其對預防或治療新生兒腦損傷重要。在該上下文中，本發明人相信HIP/PAP對GAP-43產生和代謝的作用緩解某些神經元細胞死亡或凋亡的後果。然而，已經在此處的實施例中顯示，HIP/PAP對神經元細胞死亡或神經元細胞凋亡的保護效應不受HIP/PAP對GAP-43作用的強制介導，因為在不產生GAP-43蛋白(GAP43-/-)的哺乳動物中維持了 HIP/PAP的所述保護效應。此外，此處實施例中顯示，HIP/PAP甚至在不產生GAP-43的哺乳動物(GAP43-/-)中誘導或增加神經可塑性。在此處實施例中通過HIP/PAP產生增加數量的軸突，以及產生具有高複雜性的軸突(存在一級、二級和三級軸突，以及具有增加數量分支點的軸突)的能力闡明HIP/PAP引起的增加的神經元可塑性。在此處實施例中也通過HIP/PAP逆轉毒性劑，像NMDA對軸突生長的有害效應的能力闡明HIP/PAP引起的增加的神經元可塑性。如此處所用，可與此處的術語「腦可塑性」互換使用的術語「神經可塑性」指腦在成熟、學習、環境攻擊或病理，包括外傷性事件，像也可稱為顱內損傷的外傷性腦損傷(TBI)過程中改變其結構和功能的能力。HIP/PAP引起的增加的神經可塑性特別在治療經歷不利事件的患者的方法中具有治療有用性，所述不利事件引起血液向腦的供應中斷，其包括外傷性腦損傷和中風。實際上，在突觸、細胞和網絡水平上充分記載了局部缺血損傷後大腦皮質和皮質下結構中發生的可塑性現象。先前的工作顯示，神經可塑性在人中風存活者中局部缺血後腦的神經康復過程中起關鍵作用。上述實驗結果支持HIP/PAP蛋白在體外和體內調節、增強或改善神經元生長或神經元可塑性的有用性，神經元生長或神經元可塑性的所述調節或所述改善受Gap-43調節或不受Gap-43調節。此外，如此處實施例所述，HIP/PAP蛋白防止小鼠小腦粒細胞的原代培養物中體外興奮性中毒誘導的細胞死亡和氧化細胞死亡。這些結果支持HIP/PAP蛋白用於預防和治療小腦狀況，如脊髓小腦性共濟失調的有用性。這些實驗結果還支持HIP/PAP蛋白針對多種神經元細胞類型，尤其是皮質和小腦中存在的那些類型的神經保護活性。如此處所用，腦缺氧包括這樣的情況，其中腦損傷由向腦，尤其是向神經元細胞的氧供應減少引起，並且其中腦缺氧引起神經元細胞死亡或凋亡。認為當血管阻塞和/或當在腦組織中發生任何其他原因的氧氣耗盡，尤其是窒息時發生腦缺氧。如此處所用，「新生兒」腦損傷包括對胎兒(也稱為胎兒腦損傷)、早產新生兒、足月新生兒和過期產新生兒，以及小於I歲的兒童的腦引起的任何損傷。因此，新生兒腦損傷包括通常稱為《圍產期的》的腦損傷(其在分娩之前和之後立即發生)，以及通常稱為新生兒腦損傷的腦損傷(其在長達四周的圍產期時發生)。新生兒腦損傷包括中風、產傷、代謝或遺傳病症、癲癇持續狀態，和導致缺氧和局部缺血(HI)的多種窒息事件。HI通常導致早產嬰兒中腦室周白質損傷，而足月兒發生皮質/皮質下損傷。一般地，本領域承認的是，在獨特形式腦病基礎上識別新生兒腦損傷，所述腦病在生命前三天內從昏睡發展到興奮性過度到木僵。FerrieiO公開了診斷新生兒腦損傷的可用方法的綜述，本領域技術人員可參考所述綜述，此處公開了其完整內容(Ferriero, 204,New England Journal of Medicine, 351卷(n 。 19) 1985-1995)。在胎兒生命中，新生兒腦損傷可由以下引起(i)因低動脈血氧分壓誘導的血流灌注不足的缺氧缺血性紊亂或(ii)嚴重的低氧血症，其導致心肌功能障礙，隨後大腦血流灌注不足，導致神經元局部缺血。新生兒腦損傷包括胎兒低氧血症，其通常是胎盤機能不全的結果。新生兒腦損傷也包括圍產期低氧血症，其通常是呼吸或心肌機能不全單獨或組合引起的出生後低氧血症。新生兒腦損傷包括胎兒局部缺血。新生兒腦損傷包括圍產期局部缺血，其為出生後局部缺血，這可能是由於嚴重的心臟收縮功能障礙，其導致大腦血流灌注不足和腦血管調節喪失。循環功能不全可能起因於嚴重的出生前或出生後出血或新生兒膿毒。新生兒腦損傷也包括壓力被動腦循環引起的損傷，其中腦循環的自身調節受到損傷並且誘導了低氧血症。
新生兒腦損傷也包括由於灌注不足的新生兒缺氧，所述灌注不足影響溝的深度並產生對低血壓損傷的增強的敏感性。實際上，新生兒損傷包括新生兒腦缺氧期間的過度釋放或興奮性神經遞質。根據本發明，HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物可用於預防或治療新生兒腦損傷，根據用於劃分腦缺氧缺血性腦病(HIE)的Sarnat的常規分級系統，所述新生兒腦損傷等級劃分在階段I到階段3範圍內。Sarnat分級系統的階段I依賴於早期症候群的發現和腦電圖(EEG)的發現，所述早期症候群的特徵在於高度警覺和交感神經激活、對刺激的過度反應、正常音調的弱吮吸。該階段持續少於24小時，並且保持在階段I的患者具有正常的神經學結果。進行到Sarnat分級系統階段2的患者具有輕微的張力減退，是昏睡或遲鈍的(例如，對感覺刺激具有延遲的和不完整的響應)、臨床發作、具有瞳孔縮小(甚至在暗光中)的副交感神經激活、心率緩慢(< 120bpm)、蠕動增加和分泌物豐富。早期開始時，EEG顯示相對低電壓振幅(在緩慢Θ和S範圍內< 25 μ V)。第二天，EEG在失眠或遲鈍(其在睡眠期間惡化)期間顯示了爆發模式和具有中央或暫時優勢的多病灶低頻率(I-到I. 5-Hz)EEG發作。如果EEG在5天內恢復，其再次變得完全正常。如果在多於5天內發生恢復，觀察到低振幅的減緩。階段2持續2-14天。5天內的臨床和EEG恢復與良好的預後相關。如果爆發間間隔是完全等電位的，或如果爆發頻率低於每6秒鐘一次，並且爆發模式(每3-6秒)持續多於7天，那麼周期性EEG可能指示預後不良。Sarnat分級系統的階段3的特徵在於僅對強烈刺激響應的木僵、具有退縮或去大腦體態、嚴重的張力減退(例如，肌肉鬆弛)和深度肌腱反射的抑制、初級(例如，莫羅、緊張性頸、吮吸)反射，和腦幹(例如，角膜、眼腦、咽)反射。臨床發作在階段3比在階段2中發生頻率低。患者具有全身交感或副交感神經自主功能障礙，具有異常呼吸和對光反應弱的小或中間位置的瞳孔。EEG顯示加深的周期性模式，其具有增加的爆發幅度和降低的爆發頻率(每6-12秒)。圖像的進一步惡化導致非常低的電壓或等電位EEG。如此處所用，「兒童」腦損傷，尤其是兒童外傷性腦損傷包括，或由腦損傷，尤其是外傷性腦損傷組成，其發生在大於一歲到十二歲範圍內的個體中。如此處所用，「成人」腦損傷，尤其是成人外傷性腦損傷包括，或由腦損傷，尤其是外傷性腦損傷組成，其發生在大於十二歲到死亡年齡範圍內的個體中。如此處所用，HIP/PAP蛋白的「衍生物」包括這樣的多肽，其包含與選自SEQ IDN0 I到3的多肽具有至少90%胺基酸同一性的胺基酸序列。用於本說明書時，認為包含及其語法變型表示所述特徵、整數、步驟或其組分或組的存在，但不排除一種或多種其他特徵、整數、步驟或其組分或組的存在或添加。HIP/PAP蛋白衍生物包括這樣的蛋白質，其包含與選自SEQ ID N。I到3的多肽有至少90%，優選至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高胺基酸
同一性的胺基酸序列。 在一些實施方案中，HIP/PAP蛋白衍生物包括這樣的蛋白質，其與選自SEQ IDN0 1-3的HIP/PAP蛋白具有強胺基酸同一性，並與參考HIP/PAP蛋白相比具有一個或多個胺基酸殘基添加、替換或缺失。根據這些實施方案，所述HIP/PAP蛋白衍生物與參考HIP/PAP 蛋白的胺基酸序列相比，包含 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多胺基酸殘基添加、替換或缺失。根據這些實施方案，所述HIP/PAP蛋白與參考HIP/PAP蛋白的胺基酸序列相比，具有不超過25個胺基酸殘基添加、替換或缺失。如此處預期，HIP/PAP蛋白衍生物具有生 物學活性。如此處預期，HIP/PAP蛋白衍生物具有HIP/PAP蛋白的生物學活性部分。HIP/PAP蛋白的「生物學活性」衍生物包括HIP/PAP衍生的肽，其具有以下一種或多種生物學活性-⑴在小鼠神經元原代培養中，尤其在小鼠皮質神經元原代培養和小鼠小腦顆粒細胞原代培養中防止體外N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)誘導的神經元細胞死亡，-(ii)在正發育的腦，例如小鼠正發育的腦中防止穀氨酸能類似物鵝膏蕈氨酸引起的體內興奮性中毒損傷；-(iii)在正發育的腦，例如小鼠正發育的腦中對穀氨酸能類似物鵝膏蕈氨酸引起的體內興奮性中毒損傷具有體內挽救效應；-(iv)引起針對活性氧類別，像過氧化氫(H2O2)誘導的新生兒神經元細胞死亡的神經保護；-(V)防止體外H2O2誘導的原代小鼠小腦顆粒細胞損傷和-(vi)誘導Gap-43的產生、磷酸化和分布的改變。具有選自上述(i)-(v)的生物學活性的HIP/PAP蛋白的「生物學活性」衍生物不必賦予相同數量級的所述生物學活性，只要使用在此處實施例中公開的測定中，所述HIP/PAP蛋白衍生物具有可檢測水平的上述一種或多種生物學活性(i)-(iv)。在一些實施方案中，可通過適當的純化方案，使用標準的蛋白質純化技術從細胞或組織來源中分離HIP/PAP蛋白或其衍生物，包括如上所述的HIP/PAP的生物學活性部分。在其他實施方案中，可通過本領域技術人員熟悉的重組DNA技術產生HIP/PAP蛋白或其衍生物，包括如上所述的HIP/PAP的生物學活性部分。根據其他實施方案，可使用標準肽合成技術化學合成HIP/PAP蛋白或其衍生物，包括如上所述的HIP/PAP的生物學活性部分。分離的或純化的HIP/PAP蛋白或其衍生物，包括如上所述的HIP/PAP的生物學活性部分基本沒有來自細胞或組織來源(所述蛋白質來自所述細胞或組織來源)的細胞物質或其他汙染蛋白質，或當化學合成時基本沒有化學前體。HIP/PAP蛋白衍生物也包括HIP/PAP嵌合或融合蛋白。如此處所用，嵌合蛋白或融合蛋白包含融合到非HIP/PAP多肽的上文引用的多肽。在融合蛋白中，HIP/PAP多肽和非HIP/PAP多肽彼此融合。非HIP/PAP多肽可融合到HIP/PAP多肽的N末端或C末端上。例如，在一個實施方案中，融合蛋白是GST-ΗΙΡ/ΡΑΡ融合蛋白，其中HIP/PAP序列融合到GST序列的C末端。該融合蛋白可利於重組HIP/PAP的純化。在所有情況下，根據此處該表述的前述定義，本發明的融合蛋白是具有「生物學活性的」，其包括所述融合蛋白與SEQ ID N0 3的HIP/PAP具有相同生物學活性。為了本發明目的測定兩條胺基酸序列的百分比同一性，比對序列用於最佳比較目的。例如，可在第一條和第二條胺基酸序列的一條或兩條中弓丨入空位用於最佳比對，並且可忽略非同源序列用於比較目的。為了最佳比較目的，可利用CLUSTAL ff(版本I. 82)，用以下參數實現兩條胺基酸序列的百分比同一性(I)CPU MODE = Clustalff mp ； (2) ALIGNMENT =《全長》；(3) OUTPUTFORMAT =《aln w/numbers)) ； (4) OUTPUT ORDER =《比對》；(5) COLOR ALIGNMENT =《無》；(6) KTUP (字大小)=《默認》；(7) WINDOW LENGTH =《默認》；(8) SCORETYPE =《百分比》；(9)T0PDIAG =《默認》；(10) PAIRGAP =《默認》；(II) PHYLOGENETIC TREE/TREETYPE =《無》；(12)MATRIX =《默認》；(13) GAP OPEN =《默認》；(14) END GAPS =《默認》；(15) GAPEXTENSI0N=《默認》；(16) GAP DISTANCE S =《默認》；(17)TREETYPE =《進化樹》et (18) TREE GRAPDISTANCES =《隱藏》。HIP/PAP的生物學活性部分包括這樣的肽，其包含與SEQ ID N0 I到3任何一項的HIP/PAP的全長胺基酸序列充分同源的胺基酸序 列，其包括與相應的全長HIP/PAP相同數量的胺基酸，並顯示與HIP/PAP至少相同的生物學活性。HIP/PAP的生物學活性部分包括其他這樣的肽，其包含與SEQ ID N0 I到3任何一項的HIP/PAP的全長胺基酸序列充分同源的胺基酸序列，其比相應的全長HIP/PAP包括更多的胺基酸，並顯示與HIP/PAP至少相同的生物學活性。除了在哺乳動物中存在的HIP/PAP序列的生物學活性部分的天然發生的等位變體外，本領域技術人員還理解，可通過在SEQ ID N0 I到3任何一項的核苷酸序列中突變引入改變，由此導致HIP/PAP的胺基酸序列改變，但不改變HIP/PAP的生物學活性。此外，可在對應於HIP/PAP蛋白的序列中進行非必需胺基酸的替換。「非必需」胺基酸殘基是可從HIP/PAP的野生型序列中改變但不改變生物學活性的胺基酸殘基，而「必需」胺基酸殘基為生物學活性所需。一般地，HIP/PAP蛋白衍生物包括這樣的物質，其包含HIP/PAP蛋白或其HIP/PAP生物學活性部分。在這些HIP/PAP蛋白衍生物的某些實施方案中，HIP/PAP蛋白或其HIP/PAP生物學活性部分可通過非共價鍵與其非HIP/PAP部分組合或結合。示例性實施方案包括這樣的脂質體，其包含HIP/PAP蛋白或其HIP/PAP生物學活性部分，其中其非HIP/PAP部分由脂質體顆粒本身組成。根據考慮的脂質體的類型，或根據用於製備所述脂質體的方法，HIP/PAP蛋白或其生物學活性部分可定位在脂質體表面(例如，暴露於脂質體外部環境中)或包被在其中。在這些HIP/PAP蛋白衍生物的某些其他實施方案中，HIP/PAP蛋白或其HIP/PAP生物學活性部分可通過非共價鍵與其非HIP/PAP部分組合或結合。示例性地，HIP/PAP PAP蛋白或其生物學活性部分可共價結合選自蛋白質或非蛋白質化合物(像聚乙二醇分子)的HIP/PAP部分，其中最終的HIP/PAP衍生物由聚乙二醇化的HIP/PAP或聚乙二醇化的其生物學活性部分組成。在向需要所述HIP/PAP蛋白衍生物的患者施用之前的狀態考慮的HIP/PAP蛋白衍生物中，所述蛋白衍生物可以不是「生物學活性的」，只要所述HIP/PAP蛋白一旦向所述患者施用後具有生物學活性。同樣，在向需要所述HIP/PAP蛋白衍生物的患者施用之前狀態考慮的HIP/PAP蛋白衍生物中，所述蛋白衍生物可以是已有「生物學活性的」。一般地，當用於預防或治療腦損傷，或此處公開的任何其他HIP/PAP用途時，HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物與一種或多種生理學上可接受的賦形劑組合以有效量包含在藥物組合物中。不希望受任何特定理論束縛，本發明人相信序列SEQ ID N0 2的完整HIP/PAP蛋白，即包含CRD序列的多肽和前肽導致所述蛋白質的最佳摺疊，特別是當在已經轉染了編碼所述蛋白質的表達盒的真核細胞中通過DNA重組技術產生所述蛋白質時。偶然的是，與包含僅部分蛋白質的組合物相比，藥學上活性的HIP/PAP的正確摺疊可提高包含所述蛋白質的藥物組合物的生物學效率，用於預防或治療缺氧引起的腦損傷。然而，HIP/PAP蛋白的其他形式，包括SEQ ID N。I和2的多肽形式，以及本說明書中描述的任何一種HIP/PAP衍生物可在體外和體內使用，即使這些多肽不必由本發明的最優選實施方案組成。如本說明書中先前詳細說明，本發明主要涉及HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物用於預防或治療成人或兒童腦損傷，包括腦缺氧引起的那些腦損傷的用途。本發明因此涉及 HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物用於預防或治療腦缺氧引起的腦損傷的用途。在更一般方面，本發明涉及HIP/PAP蛋白在治療腦缺氧引起的腦損傷方法中的用途。不希望受任何特定理論的束縛，本發明人相信此處公開的HIP/PAP蛋白對體外和體內新生兒腦損傷的多種影響也可用於成人或兒童腦的非常特殊的病理生理學情況，其選自腦血管意外。因此，在本發明的某些實施方案中，所述成人或兒童腦損傷由腦血管意外(其也稱為中風)組成。腦血管意外或中風由因血管向腦供應血液紊亂引起的腦功能快速喪失組成。腦血管意外包括(i)血栓形成或栓塞引起的局部缺血，其也稱為「缺血性中風」和(ii)因出血引起的局部缺血，其也稱為「出血性中風」。像新生兒腦損傷，腦血管意外或中風可引起永久性神經損傷並可導致死亡。根據世界衛生組織，腦室意外或中風由腦血管原因的神經學缺陷組成，其持續超過24小時或在24小時內截至死亡為止。腦血管意外或中風包括血栓形成中風、栓塞性中風、心臟功能異常引起的局部缺血、全身性血流灌注不足、靜脈血栓形成和大腦內出血。外傷性腦損傷一般引起因大腦出血、血腫或水腫引起的腦氧氣流受損。本發明還涉及HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物用於預防或治療成人或兒童外傷性腦損傷的用途。在一些實施方案中，成人或兒童外傷性腦損傷屬於缺氧引起的腦損傷。當物理性外傷損傷腦時發生外傷性腦損傷(TBI)，並且根據意識喪失、記憶力喪失的程度，和損傷後神經學尺度上的得分，一般劃分為溫和的、中等的或嚴重的。通常通過選自 Glascow Coma Scale (GCS) (Arlinghaus 等，2005, Textbook of Traumatic BrainInjury, Washington, DC American Psychiatric Association,第 59-62 頁)的方法，測定外傷後遺忘症(PTA)的方法和衡量意識喪失的方法(LOC) (Rao等，2000，Psychosomatics,卷41(n° 2) :95-103)的方法進行外傷性腦損傷的診斷和衡量。一般承認，GCS為13或更高的TBI是溫和的，而GCS為9到12是中等的，GCS為8或更低是嚴重的。示例性地，這樣的人其GCS得分測定為13到15，該人外傷後遺忘症(PTA)持續時間少於24小時並且意識喪失(LOC)的持續時間在O到30分鐘範圍內。仍然示例性的說，這樣的人其GCS得分測定為9到12，其外傷後遺忘症(PTA)持續時間在I到7天範圍內並且意識喪失(LOC)的持續時間在30分鐘到24小時範圍內。仍然示例性的說，這樣的人其GCS得分測定為3到8，其外傷後遺忘症(PTA)持續時間多於7天並且意識喪失(LOC)的持續時間多於24小時。在外傷性腦損傷和新生兒腦損傷之間的生理學相似性中，因血管破裂引起的出血伴隨著TBI，其引起缺氧。 根據本發明，HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物可用於預防或治療GCS分類得分在3到15之間的外傷性腦損傷。因此，HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物可用於預防或治療這樣的外傷性腦損傷，其選自「溫和」TBI (GSC得分在13到15之間)、中等TBI (GCS得分在9到12之間)和嚴重TBI (GSC得分在3到8之間)。通常，溫和TBI具有13到15之間的GCS得分，低於I小時的PTA得分和低於30分鐘的LOC得分。通常，中等TBI具有9到12之間的GCS得分，30分鐘到24小時之間的PTA得分和I到24小時之間的LOC得分。通常，嚴重TBI具有3到8之間的GCS得分，高於I天的PTA得分和高於I天的LOC得分。根據本發明，相信HIP/PAP蛋白將證明在治療上一般可用於治療TBI的方法中，不管為待治療患者測定的GSC得分如何。HIP/PAP治療TBI的治療有用性包括治療直接外傷性小腦損傷，比額部的或顳顬的TBIs更不常見。然而，小腦經常受到影響，即使當初始損傷不直接涉及該結構時。這種間接損傷可誘導大量神經學病症，包括體位不穩定、震顫、平衡和精細運動技能的損傷和認知缺陷。即使未完全理解幕上外傷引起的間接小腦損傷的原因，若干研究揭示了興奮性中毒(神經遞質穀氨酸的過量釋放)參與損傷向小腦的傳遞(Potts等，Cerebellum, 2009,(8)，211-221)。不希望受任何特定理論束縛，本發明人相信，HIP/PAP蛋白或其衍生物可通過保護小腦細胞免於興奮性中毒從而保護兒童或成人患者中小腦神經元免於TBI引起的間接小腦損傷。因此，在一些實施方案中，本發明還涉及HIP/PAP蛋白或其衍生物用於治療或預防TBI引起的間接外傷性小腦損傷的用途。根據本發明，相信HIP/PAP蛋白應該在急性期內向受TBI影響的患者施用，儘管其也可以在慢性期內施用。根據本發明，TBI包括病灶性或彌散性TBI。彌散性TBI包括水腫和彌散性軸突損傷，其對軸突，包括白質束和向皮質的突出具有廣泛性損傷。彌散性TBI也包括震蕩和彌散性軸突損傷，對包括白質和大腦半球的區域中的軸突具有廣泛擴散性損傷。對於病灶性TBI，在穿透性TBI中具有病灶性損傷的最常見區域是眶額皮質和前顳葉，其由參與社會行為、情感調節、嗅覺和決策的區域組成。一種類型的病灶性損傷一腦撕裂傷在腦組織被切割或撕裂時發生。外傷性腦損傷包括，但不限於額TBI^ TBI、直接小腦TBI和間接小腦TBI。如本說明書中早已提及，HIP/PAP蛋白或其衍生物可保護體外小腦神經元免於興奮性中毒死亡和氧化死亡。不希望受任何特定理論束縛，本發明人相信HIP/PAP蛋白或其衍生物可保護小腦神經元免於多種小腦病症，如小腦性共濟失調中發生的死亡。在這種情況下，可觀察到小腦萎縮。因此，本發明還涉及HIP/PAP蛋白或其衍生物用於治療或預防小腦性共濟失調的用途。如此處所用，小腦性共濟失調指小腦的功能異常。小腦性共濟失調可引起多種初級神經缺陷，如拮抗劑張力減退、協同不能、辨距障礙、dyschronometria和輪替運動障礙。小腦性共濟失調包括遺傳性脊髓小腦性共濟失調和獲得性小腦性共濟失調。在一些實施方案中，本發明涉及HIP/PAP蛋白或其衍生物用於治療遺傳性脊髓小腦性共濟失調的用途。遺傳性脊髓小腦性共濟失調包括，但不限於常染色體顯性脊髓小腦性共濟失調 (SCAs)和常染色體隱性脊髓小腦性共濟失調。常染色體顯性脊髓小腦性共濟失調的實例包括SCAl (常染色體顯性類型I)、SCA2、SCA3、SCA4、SCA6、SCA7、SCA8、SCA9、SCA10、SCA11、SCA12、SCA13，周期性共濟失調類型I (EA-I)和周期性共濟失調類型2 (EA-2)。染色體隱性脊髓小腦性共濟失調包括，但不限於，弗裡德賴希氏共濟失調、運動失調性毛細血管擴張症和嬰兒發病期的脊髓小腦共濟失調。在一些實施方案中，本發明涉及HIP/PAP蛋白或其衍生物用於治療和預防獲得性小腦性共濟失調的用途。獲得性小腦性共濟失調包括，但不限於，瘤外症候群、醉酒誘導的小腦性共濟失調、感染性共濟失調和脈管小腦性共濟失調。可由暴露於毒素，如溶劑、汽油和重金屬中，攝入產物，如醇、巴比妥類或鋰和細胞毒性化學治療藥物引起中毒誘導的小腦性共濟失調。感染性共濟失調包括病毒、細菌或朊病毒感染引起的共濟失調。例如，病毒感染性小腦性共濟失調可由病毒和病毒後腦病引起。細菌感染性小腦性共濟失調包括，但不限於，腦膜血管性梅毒或萊姆病引起的共濟失調。脈管共濟失調包括，但不限於，局部缺血腦血管意外，包括小腦梗塞、出血或硬腦膜下血腫引起的共濟失調。如此處所用，不考慮所述腦損傷是否由新生兒腦損傷、兒童腦損傷或成人腦損傷組成，「腦損傷」不包括開始時由神經元細胞脫髓鞘引起的腦損傷。換言之，「腦損傷」不包括脫髓鞘病引起的腦損傷，不考慮脫髓鞘病的類型，例如自身免疫性或遺傳性疾病。因此，如此處預期，「腦損傷」不包括以下疾病引起的腦損傷多發性硬化、急性播散性腦脊髓炎、橫貫性脊髓炎、慢性炎性脫髓鞘性多神經病、吉-巴症候群、中央腦橋脂肪髓磷脂化、家族黑朦性白痴，以及遺傳性脫髓鞘病，如腦白質病和Charcot Marie Tooth。如此處所用，腦白質病包括腎上腺腦白質營養不良(WHO分類#E71. 3)，腎上腺脊髓神經病(WHO分類#E71. 3)、變色反應腦白質病(WHO分類#E75. 2)、克拉伯病(WHO分類#E75. 2)、佩-梅病(WHO分類#E75. 2)、卡納萬病、具有中央低髓鞘形成的兒童共濟失調(CACH)、具有白質消失的白質腦病、亞力山大病、雷夫敘姆病(WHO分類#G60. I)、澤韋格病、Aicardi-Goutieres症候群、巨腦腦白質病和腦腱黃瘤病。如本說明書中早已提及，因為此處已經顯示在Gap-43產生或磷酸化上的HIP/PAP活性，HIP/PAP蛋白或其衍生物也可用於體外和體內調節、增強或改善Gap-43介導的神經元生長或可塑性，所述Gap-43是神經元生長相關的蛋白質。
本發明因此還涉及HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物用於預防或治療病症或疾病的用途，所述病症或疾病涉及Gap-43產生的缺陷或下調或Gap-43磷酸化的缺陷或失調，其包括阿爾茨海默氏病。值得提及的是，在本領域中早已斷定HIP/PAP相關蛋白質可用於作用於阿爾茨海默氏病，但沒有在技術上支持該活性斷言的任何初始實驗結果。相反，HIP/PAP蛋白對Gap-43蛋白產生或磷酸化的生物學活性第一次支持所述HIP/PAP蛋白預防或治療阿爾茨海默氏病的有用性。實際上，本領域技術人員熟知的是，在阿爾茨海默氏病中發生Gap-43蛋白產生或磷酸化的缺陷。值得注意的是，本領域中已經顯示在受阿爾茨海默氏病影響的患者中涉及無活性Gap-43蛋白的產生。同樣，先前已經在本領域中顯示了受阿爾茨海默氏病影響的患者中Gap-43的改變的磷酸化。因此，本發明還涉及HIP/PAP蛋白或其衍生物用於預防或治療阿爾茨海默氏病的用途。本發明還涉及用於預防或治療阿爾茨海默氏病的方法，其包括向需要預防或治療的患者施用HIP/PAP蛋白或其衍生物的步驟。本發明還涉及HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物用於預防或治療在阿爾茨海默氏病本身發生前的病理學狀態的用途，所述病理學狀態包括精神認知功能損害。換言之，本發明還涉及HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物用於預防或治療在阿爾茨海默氏病本身發生之前的精神認知功能損害的用途。因為此處實施例中已經顯示HIP/PAP蛋白具有在體外挽救神經元細胞的能力，那麼也已經證明HIP/PAP蛋白或其衍生物可用作維持或改善培養的神經元細胞的存活力或生長的試劑。然後，此處實施例的結果支持HIP/PAP蛋白或其衍生物作為可加入神經元細胞培養基中的神經元細胞培養劑的有用性。本發明還包括HIP/PAP蛋白用於體外培養神經元細胞,包括神經元細胞的原代培養和神經元細胞系的培養的用途。本發明還涉及用於神經元細胞的培養基，其包含HIP/PAP蛋白或其衍生物。除了存在HIP/PAP蛋白或其衍生物，本領域技術人員容易地測定適當培養基的定性和定量組成。示例性的說，HIP/PAP蛋白或其衍生物可簡單地加入到適合於神經元細胞的已知培養基中，例如RPMI 199培養基中。所述培養基包括有效量的所述HIP/PAP蛋白或其所述衍生物。培養基中HIP/PAP蛋白或其衍生物的最終濃度優選在Ing/mL到10mg/ml範圍內。根據本發明，對於體內用途，HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物作為活性成分優選包含在藥物組合物中。
所述藥物組合物包含HIP/PAP蛋白，或其蛋白衍生物，和一種或多種藥學上可接受的賦形劑。所述藥物組合物包含有效量的HIP/PAP蛋白，或其蛋白衍生物。通常，根據本發明使用的藥物組合物基於藥物組合物總重量，包含以重量計O. 1%至99. 9%的HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物。因此，本發明的藥物組合物基於藥物組合物總重量，包含以重量計 O. 5%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更高的HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物。同樣，本發明的藥物組合物基於藥物組合物總重量，包含以重量計10 %、20 %、30 %、40 %、50 %、60 %、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99· 5% 或少於一種
或多種藥學上可接受的賦形劑。HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物的治療有效劑量當然依賴於這樣的因素變化，如待治療(包括預防)的病理學狀態、施用方法、用於治療的化合物的類型、涉及的任何共治療、患者的年齡、體重、一般醫療條件、醫療史等，並且其測定為從業醫師所熟知。因此，治療者有必要根據需要滴定劑量並修改施用途徑，以獲得最佳治療效果。臨床醫師會施用HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物，直至達到這樣的劑量，所述劑量實現治療所討論的狀況的預期效應。待治療的狀況指在本申請中描述的一種病理學狀況，如缺氧引起的新生兒腦損傷、缺氧引起的成人或兒童腦損傷，如腦血管意外、TBIs和小腦病症。如此處所用，術語「患者」指新生兒患者、兒童患者，或成人患者，後者包括懷孕患者。如此處更特別所用，有效量的HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物由這樣量的HIP/PAP蛋白或其衍生物組成，其可至少部分逆轉新生兒腦損傷過程中引起腦的物理損傷。特別的是，有效量的HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物由這樣量的HIP/PAP蛋白或其衍生物組成，其減少或阻止新生兒腦損傷過程中發生的神經元細胞死亡。從此處實施例中所示的結果開始，有效量的HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物可以在約O. lyg/kg體重到約100mg/kg體重範圍內。因此，根據本發明，有效量的HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物包括至少 I μ g/kg、2 μ g/kg、3 μ g/kg、4 μ g/kg、5 μ g/kg、6 μ g/kg、7 μ g/kg、8 μ g/kg、9 μ g/kg、10 μ g/kg、15 μ g/kg、20 μ g/kg、20 μ g/kg、30 μ g/kg、40 μ g/kg、50 μ g/kg、60 μ g/kg、70 μ g/kg、80 μ g/kg、90 μ g/kg、100 μ g/kg、200 μ g/kg、300 μ g/kg、400 μ g/kg>500 μ g/kg>600 μ g/kg>700 μ g/kg>800 μ g/kg>900 μ g/kg>lmg/kg 或以上患者體重的量。在新生兒損傷的情況下，術語「患者」指新生兒患者，包括胎兒以及懷孕患者。為了預防或治療胎兒身體的新生兒腦損傷，本發明的藥物組合物優選向懷孕的成人身體施用。然而，在一些實施方案中，可使用特定的內窺鏡檢查醫療儀器直接向胎兒身體施用所述藥物組合物。為了預防或治療分娩或分娩後新生兒的新生兒腦損傷，以及預防或治療成人的腦損傷，分別向新生兒身體或成人身體施用本發明的藥物組合物。在某些實施方案中，全身施用本發明的藥物組合物。在某些其他實施方案中，經過顱內途徑，尤其向胎兒身體或顱骨形成未停止的新生J L身體中局部施用本發明的藥物組合物。HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物的施用途徑與已知方法一致，例如通過靜脈內、肌內、大腦內、腹膜內、腦脊內、皮下注射或輸注、口腔、局部或吸入途徑，或通過下文指出的緩釋系統。
在一些實施方案中，以單次劑量施用HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物，或含有它們的藥物組合物。在一些其他實施方案中，在確定的時間間隔，例如從腦損傷診斷開始或從腦損傷預期診斷開始，直至所治療的身體脫離危險為止，以多次劑量施用HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物，或含有它們的藥物組合物。在本發明藥物組合物的某些實施方案中，HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物可與一種或多種其他活性成分組合，所述活性成分可用於預防或治療腦缺氧引起的腦損傷，包括本領域中已知用於預防或治療新生兒腦損傷的一種或多種活性成分。可通過混和具有適當純度的想要的分子與任選的藥學上可接受的載體、賦形劑或穩定劑(Remington, s Pharmaceutical Sciences,第 16 版,Osol, A.編輯(1980))以凍幹製劑或水溶液的形式製備本發明的治療組合物用於儲存。可接受的載體、賦形劑或穩定劑在使用的劑量和濃度下對接受者無毒，並且其包括緩衝劑，如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸和甲硫氨酸；防腐劑(如十八基二甲基苯甲基氯化銨；氯己雙銨；苯扎氯銨、氯化苄乙氧銨；苯酚、丁醇或苯甲醇；對羥苯甲酸烷基酯，如對羥基苯甲酸甲酯或丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；和間-甲 ));低分子量(少於約10個殘 基)多肽；蛋白質，如血清白蛋白、明膠，或免疫球蛋白；親水聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；胺基酸，如甘氨酸、穀氨醯胺、天冬醯胺、組氨酸、精氨酸或賴氨酸；單糖、二糖，和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖，或糊精；鰲合劑，如EDTA ;糖，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；鹽形成對抗離子，如鈉；金屬絡合物(例如鋅-蛋白質絡合物)；和/或非離子表面活性劑，如 TWEEN. TM.，PLUR0NICS. TM.或聚乙二醇(PEG)。此類載體的額外實例包括離子交換劑、礬土、硬脂酸鋁、卵磷脂、血清蛋白，如人血清白蛋白，緩衝物質，如磷酸鹽、甘氨酸、山梨酸、山梨酸鉀、飽和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物、水、鹽，或電解質，如硫酸魚精蛋白、磷酸氫二鈉、磷酸氫鉀、氯化鈉、鋅鹽、膠體矽、三矽酸鎂、聚乙烯吡咯烷酮、基於纖維素的物質，和聚乙二醇。根據本發明HIP/PAP或其衍生物物質的局部或基於凝膠形式的載體包括多糖，如羧甲基纖維素鈉或甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸酯、聚氧乙烯-聚氧丙烯-嵌段聚合物、聚乙二醇，和木蠟醇。對於所有施用，適當使用常規貯庫形式。這些形式包括，例如微囊、納米膠囊、脂質體、膏藥、吸入形式、鼻噴霧劑、舌下片劑，和緩釋製劑。HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物通常以約O. lmg/ml到100mg/ml的濃度在這些媒介物中配製。待用於體內施用的HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物必須無菌。這可在凍幹和重構之前或之後通過無菌過濾膜過濾容易地完成。如果全身施用，通常可以凍幹形式或在溶液中儲存HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物。如果在是凍幹形式，HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物通常與其他成分組合配製，用於在使用時以適當的稀釋劑重構。HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物的液體製劑的實例是填充在單次劑量小瓶中用於皮下注射的無菌、透明、無色、無防腐劑溶液。主要根據多肽的適應症和類型，適合於重複使用的防腐藥物組合物可含有例如a)HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物；b)能夠維持溶液中多肽或其他分子的pH在最大穩定性範圍內，優選約4-8的緩衝劑；c)主要穩定多肽或分子免於攪動誘導的聚集的去汙劑/表面活性劑；d)等滲劑；e)選自苯酚、苯甲醇和滷化苄乙氧銨，例如氯化苄乙氧銨的防腐劑；和f)水。
如果所用的去汙劑是非離子型的，其可以是例如聚山梨醇酯80 (例如，Polysorbate , Tween ⑧.)20、80 等)或泊洛沙姆(例如，Poloxamer ,⑧· 188)。非離子型表面活性劑的用途允許製劑暴露於剪切表面應力，但不引起多肽變性。此外，可在氣溶膠裝置，如用於肺施用和無針頭噴射注射器中使用的那些裝置中使用這些含表面活性劑的製劑(參閱例如，EP 257,956)。
可存在等滲劑以保證HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物的液體製劑的等滲性，並且所述等滲劑包括多羥基糖醇，優選三羥基糖醇或高級糖醇，如甘油、赤蘚醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇和甘露醇。可單獨或組合使用這些糖醇。或者，可使用氯化鈉或其他合適的無機鹽使溶液等滲。根據想要的pH，緩衝液可以是例如，乙酸鹽、檸檬酸鹽、琥珀酸鹽或磷酸鹽緩衝液。本發明一種類型液體製劑的pH緩衝在約4到8的範圍內，優選在約生理pH處。防腐劑苯酚、苯甲醇和滷化苄乙氧銨，例如氯化苄乙氧銨是可以使用的已知抗微生物劑。治療性HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物的組合物一般置於具有無菌入口的容器中，例如具有皮下注射針頭可刺穿的塞子的靜脈內溶液袋或瓶。製劑優選作為重複的靜脈內(靜脈)、皮下(皮下)，或肌內(肌內)注射，或適合於鼻內或肺內遞送(對於肺內遞送，參閱例如EP 257, 956)的氣溶膠製劑來施用。也可以緩釋製劑的形式施用HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物。緩釋製劑的合適實例包括含有蛋白質的固體疏水性聚合物的半透性基質，所述基質是成形物品形式，例如薄膜或微囊。緩釋基質的實例包括聚酯、Langer等，J. Biomed. Mater. Res. , 15 :167-277 (1981)和Langer, Chem. Tech. , 12 :98-105 (1982)描述的水凝膠(例如，聚(2-輕乙基-異丁烯酸酯))、或聚(乙烯醇)、聚交酯(美國專利號3，773，919、EP 58，481)、L-穀氨酸和Y乙基-L-穀氨酸酯的共聚物(Sidman等,Biopolymers, 22 :547-556 (1983))、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯(Langer等，上文)、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物，如Lupron Depot.TM.(由乳酸-乙醇酸共聚物和乙酸亮丙瑞林組成的可注射微球體)，和聚-D-(-)-3-羥基丁酸(EP 133，988)。當聚合物如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸能夠釋放分子超過100天時，某些水凝膠釋放蛋白質更短的時間。當被膜蛋白質長時間保留在體內時，它們可因在37°C暴露於水分中而變性或聚集，導致生物學活性喪失和免疫原性可能發生改變。可根據涉及的機制，設計合理的策略用於蛋白質穩定。例如，如果發現聚集機制是通過硫-二硫化物交換形成分子間S-S鍵，那麼可通過修飾巰基殘基、從酸性溶液凍幹、控制水分含量、使用適當的添加劑並開發特定的聚合物基質組合物實現穩定。緩釋的HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物也包括脂質體包被的多肽。通過本身已知的方法製備含有目的多肽的脂質體=DE 3,218, 121 ;Epstein等，Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 82 :3688-3692(1985) ；Hwang 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，77 :4030-4034 (1980) ；EP52, 322 ；EP 36, 676 ；EP 88, 046 ；EP 143, 949 ；EP 142，641 ;日本專利申請 83-118008 ;美國專利號4，485，045和4，544，545 ;和EP 102，324。通常，脂質體是小的(約200-800埃)單層類型，其中脂類含量高於約30摩爾％膽固醇，調整所選比例用於最佳治療。HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物的治療有效量將當然根據這樣的因素而變化，如待治療(包括預防)的病理學狀況、施用方法、用於治療的化合物的類型、涉及的任何共治療、患者的年齡、體重、一般醫療條件、醫療史等，並且其測定為開業醫師所熟知。因此，治療者有必要根據需要滴定劑量並修改施用途徑，以獲得最大治療效果。臨床醫師會施用HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物，直至達到這樣的劑量，所述劑量實現治療正在討論的狀況的預期效果O施用途徑根據已知方法，例如通過靜脈內、肌內、大腦內、腹膜內、腦脊內、皮下、眼內、關節內、滑膜內、鞘內注射或輸注、口腔、局部或吸入途徑來施用，或通過下文指出的緩釋系統來施用。也可通過損傷內或損傷周圍途徑適當地施用HIP/PAP或其蛋白衍生物，以發揮局部和全身治療效果。形成鹽並在下文中有用的分子的藥理學上可接受的鹽的實例包括鹼金屬鹽(例如鈉鹽、鉀鹽)、鹼土金屬鹽(例如，鈣鹽、鎂鹽)、銨鹽、有機鹼鹽(例如，批啶鹽、三乙胺鹽)、無機酸鹽(例如，鹽酸鹽、硫酸鹽、硝酸鹽)，和有機酸的鹽(例如，乙酸 鹽、草酸鹽、對-甲苯磺酸鹽)。HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物也可包被在微囊中，在膠體藥物遞送系統(例如，月旨質體、白蛋白微球體、微乳劑、納米顆粒和納米膠囊)或粗乳狀液中分別通過例如凝聚技術或通過界面聚合，例如通過羥甲基纖維素或明膠微囊和聚(甲基丙烯酸酯)微囊製備所述微囊。在 Remington' s Pharmaceutical Sciences,上文中公開了此類技術。可製備緩釋製劑。緩釋製劑的合適實例包括含有HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物的固體疏水性聚合物的半透性基質，所述基質是成形物品形式，例如薄膜或微囊。緩釋基質的實例包括聚酯、水凝膠(例如，聚(2-羥乙基-異丁烯酸酯)、或聚(乙烯醇)、聚交酯(美國專利號3，773，919)、L-穀氨酸和、乙基-L-穀氨酸酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物，如LUPRON DEPOT. TM.(由乳酸-乙醇酸共聚物和乙酸亮丙瑞林組成的可注射微球體)，和聚-D- (-) -3-羥基丁酸。儘管聚合物如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸共聚物能夠釋放分子超過100天時，某些水凝膠釋放蛋白質更短的時間。當被膜蛋白質長時間保留在體內時，它們可因暴露在37°C水分中而變性或聚集，導致生物學活性喪失。可根據涉及的變性機制設計合理的穩定策略。可通過修飾巰基殘基、從酸性溶液凍幹、控制水分含量、使用適當的添加劑並開發特定的聚合物基質組合物實現這些策略。通過，但不限於以下實施例進一步闡明本發明。
實施例在大腸桿菌細菌系統中產生重組人HIP/PAP蛋白，然後進行純化。所得產物稱為ALF-5755。與 HIP/PAP SEQ ID N。2 相比，SEQ ID N。3 的 ALF-5755 在 NH2 末端具有一個單獨的額外胺基酸甲硫氨酸。實施例I :新生兒腦損傷模型中HIP/PAP蛋白的體外影響A.材料和方法皮質神經元培養從E14. 5胚胎小鼠中製備原代皮質神經元培養物。簡言之，從子宮中取出胎兒並置於無菌培養皿中。切開腦並置於含IM HEPES的HBSS Ix(Invitrogen)中。使用解剖顯微鏡，解剖出腦、腦脊膜、基底神經節和海馬，並將新皮質置於含有B27補充劑的Neurobasal培養基(Invitrogen)中。然後,用O. 25%胰蛋白酶-O. 02% EDTA分離新皮質並與 DNase I (Sigma St-Quentin Fallavier, France)溫育。在包被了聚-DL-鳥苷酸(SigmaSt-Quentin Fallavier,France)的96孔板中以80000細胞/孔密度接種細胞與MEMlX和10%馬血清。接種後2到3小時，去除培養基並用Neurobasalplus B27代替。3天後，用5 μ M的AraC (阿糖胞苷)處理細胞，以抑制神經膠質增殖。在DIVlO和DIV12之間，用任何一種或另一種以下物質處理神經兀8小時
⑴PBS；(ii) 3μ g/ml 或 5 μ g/ml 的 ALF-5755 ；(iii) :300μΜ 的 NMDA ;(iv) 300 μ M 的 NMDA 力口 10 μ M 的 ΜΚ801 或 (V) 300 μ M 的 NMDA 和 3 μ g/ml 或 5 μ g/ml 的 ALF-5755。細胞成活力的測定使用MTS/甲月首測定(CellTiter 96Aqueous One Solution
Ce I IPro Iif erat ion Assay ；Promega, Charbonni eres, France)監測細胞成活力。Western 印跡分析從處理的神經元培養物(見下文)和幼鼠的右新皮質中提取總蛋白質，所述幼鼠在P5接受了 PBS、10 μ g的鵝膏蕈氨酸、0. 3 μ g的ALF-5755 (已經測定為ALF-5755的最有效濃度)或10 μ g鵝膏蕈氨酸與0. 3 μ g的ALF-5755的實質內注射。在藥物施用後4、24、48或120小時殺死幼鼠。根據市售試劑盒(Cell Signaling Technology)的方案提取蛋白質。以1/1000的濃度使用抗總Gap43和抗Ser41-Phospho_Gap43。為了標準化樣品間的蛋白質表達，我們以1/10000的濃度使用抗b微管蛋白山羊抗體(Santa CruzBiotechnology)。一式兩份進行Western印跡實驗。使用ImageJ評估樣品間的蛋白質濃
度差異。免疫細胞化學對於總Gap43、PhosphoGap43和生長錐(2G13)檢測，在4% PFA中固定處理的細胞培養物，並將其與抗總Gap43抗體(Interchim ; 1/200)、兔抗Ser41_PhosphoGap43抗體(Novus Biologicals 1/200)、鼠抗生長維 2G13 抗體(Novus Biologicals 1/200)反應。用Cy3綴合的驢抗雞抗體、AMCA綴合的驢抗兔抗體和Alexa488綴合的驢抗小鼠抗體(JacksonImmunoresearch)進行標記抗原的檢測。統計學分析為了研究各處理的效果,利用Kruskal-Wallis檢驗分析數據。B.結果在大腸桿菌細菌系統中產生重組人HIP/PAP蛋白，然後進行純化。所得產物稱為ALF-5755。與 HIP/PAP SEQ ID N。2 相比，SEQ ID N。3 的 ALF-5755 在 NH2 末端具有一個單獨的額外胺基酸甲硫氨酸。已經進行了 ALF-5755的生物化學、生物學和功能研究。他們確定ALF-5755顯示出與先前證明屬於幾種不同動物模型中的HIP/PAP的相同的生物學活性，尤其是促有絲分裂和抗細胞凋亡活性。在原代小鼠皮質神經元培養中已經研究了 ALF-5755體外針對N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)誘導的細胞死亡的神經保護功效。已經使用原代神經元培養物的良好建立的模型(來自暴露於NMDA的EHSwiss小鼠的大腦半球的神經元)評估了 ALF-5755體外神經保護性質。從培養開始第8天到第12天之間進行實驗。通過300 μ M的NMDA或10、30、100 μ M的H2O2進行8小時中毒開始後立即或開始後3小時向培養基中加入多劑量的HIP/PAP(150ng/ml到10 μ g/ml範圍內)。然後使用MTT測定來測量細胞的成活力。單獨暴露於NMDA (不加ALF-5755處理)後的神經元死亡是神經元的60%。利用ALF-5755處理引起神經元死亡的比例顯著劑量依賴型降低。當損傷開始後立即加入時，神經元死亡的減少在5μ g/mL的ALF-5755處是最大的(相對於不加ALF-5755時的45%，35%的神經元死亡)。當在損傷開始後3小時加入時，也觀察到了 ALF-5755的神經保護效應。單獨暴露於H2O2通過氧化損傷誘導細胞存活的劑量依賴性降低，其在100 μ M暴露處最大(64%的神經元死亡)。ALF-5755處理完全或部分逆轉H2O2的毒性。3 μ g/ml的ALF-5755的這種保護效應是最大的。ALF-5755的保護效應與利用過氧化氫酶觀察到的那些保護效應是相當的。無論在H2O2後立即加入還是損傷後3小時加入藥物，都能觀察到ALF-5755的保護效應。ALF-5755顯示抗氧化性質。在神經元培養物上進行免疫細胞化學(ICC)研究和western印跡(WB)分析，以測定ALF-5755對GAP-43的產生、41位絲氨酸(S41)上的磷酸化狀態和分布的影響，所述GAP-43是參與軸突生長和神經元可塑性的蛋白質。當在NMDA後立即加入時，ICC證明ALF-5755誘導GAP-43標記神經元過程的束狀分布。這種影響在5 μ g/ml處最佳，而在對照培養物，利用NMDA或H2O2處理的培養物，或在H2O2和ALF-5755處理的培養物中沒有觀察到。此外，ICC顯示，當與對照培養物或單獨用NMDA或H2O2處理的培養物相比時，ALF-5755誘導神經元過程中磷酸-GAP-43的增加的表達。來自培養的神經元的提取物的western印跡分析允許定量總GAP-43和磷酸-GAP-43水平的改變。NMDA不誘導GAP-43量的任何顯著改變。相反，ALF-5755單獨誘導總GAP-43的劑量依賴性降低，但誘導磷酸化GAP-43的比例(磷酸-GAP-43/總GAP-43)的顯著增加。ALF-5755對GAP-43的影響在暴露於NMDA的培養物中仍然更顯著。ALF-5755誘導的GAP-43的磷酸化狀態的這些改變可以解釋暴露於ALF-5755的培養物中觀察到的成束現象。總之，這些數據支持ALF-5755防止體外興奮性中毒和氧化神經元細胞死亡的假說。此外，ALF-5755誘導可塑性樣改變，包括GAP-43磷酸化和成束現象。實施例2 :新生兒腦損傷模型中HIP/PAP蛋白的體內效應A.材料和方法動物 兩種性別的Swiss小鼠用於該研究中。實驗方案為公共機構觀察委員會所批准並遵循'Institut National de Ia Santeet de Ia Recherche Medicale;的指導方針。藥物在磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中稀釋鵝膏蕈氨酸(Sigma, St-Quentin Fallavier,France)、ALF-5755、NMDA(Tocris, Bristol, UK)和 MK801 (Sigma, St-Quentin Fallavier,France)。施用興奮性中毒藥物如先前所述，通過向發育中的小鼠腦中注射鵝膏蕈氨酸來誘導興奮性中毒的腦損傷(Marret 等，1"5 ;Gressens 等，I997,1"8 ;Bac 等，1"8 ;Dommergues 等，2OOO ；Tahraoui等，2001 ；Laudenbach等，2001, 2002 ；Husson等，2002)。簡言之，在第P5天大腦內(向新皮質實質組織內)注射幼鼠。利用安裝在標有刻度的微型分配器上的50 μ I Hamilton注射器上的25號注射針進行實質組織內注射。針插入到右半球的額頂骨區中頭皮的外表面下2mm,離側向-中間平面中線2mm,和首尾平面冠矢點前3mm。以20秒間隔注射兩次I μ I劑量的鵝膏蕈氨酸或鵝膏蕈氨酸加ALF-5755或PBS。第一次快速濃注對應於白質內定位的注射，而第二次快速濃注代表了皮質注射。向各幼鼠施用10 μ g的鵝膏蕈氨酸或10 μ g的鵝膏蕈氨酸加 ALF-5755 (範圍0. 0015 μ g-0. 15 μ g)或 PBS。
對於一些幼鼠，不同濃度(從0.0015yg到1.5yg)的鵝膏蕈氨酸注射後立即或3小時後腹膜內注射ALF-5755。實驗組來自至少兩個不同窩的幼鼠用於各實驗組中，並從兩組或多組連續實驗中獲得數據。根據怎樣注射ALF_5755(與鵝膏蕈氨酸實質內共同施用，鵝膏蕈氨酸注射後I到5小時立即腹膜內注射)，組成三個不同組。第一個P5幼鼠組接受鵝膏蕈氨酸與PBS (媒介物對照)或O. 003,0. 015,0. 03或O. 3 μ g的ALF-5755的實質內注射。在設計用於比較ALF-5755的實質內注射與腹膜內注射的第二組實驗中，P5幼鼠接受鵝膏蕈氨酸與PBS的實質內注射，然後接受幾種濃度(O. 0015,0. 0075,0. 015,0. 075、O. 15、O. 75 或 I. 5 μ g 的 ALF-5755)的 ALF-5755 的腹膜內注射。為了知道ALF-5755是否可以修復，而非防止鵝膏蕈氨酸損傷，第三個P5小鼠幼鼠組在實質內注射鵝膏蕈氨酸後3小時接受O. 75或I. 5 μ g的ALF-5755的延遲腹膜內注射。鵝膏蕈氨酸注射後I或5小時，腹膜內檢測單一 ALF-5755濃度(I. 5 μ g)。損傷大小的測定12隻小鼠幼鼠用於各實驗組中。在興奮性中毒攻擊後120小時通過斷頭殺死小鼠幼鼠。立即在4%福馬林中固定腦至少4天。包埋在石蠟中後，我們切下20 μ m厚的頭盧頁切片。用甲酹紫染色每三個切片。先前的研究(Marret等，1995 ;Gressens等，1997 ;Husson等，2002)已經顯示了在興奮性中毒損傷的側向-中間和額枕軸中損傷的最大尺寸之間完美的相關性。這允許精確並可重複地測定損傷的最大額枕直徑，其等於損傷存在的切片數目乘以20 μ m。B.結果通過新生兒興奮性中毒腦損傷的小鼠模型評估體內ALF-5755的神經保護潛能，所述小鼠模型模擬與腦癱相關的腦損傷。通過鵝膏蕈氨酸誘導腦損傷，所述鵝膏蕈氨酸是作用於NMDA和促代謝型穀氨酸受體上的穀氨酸能激動劑。當在出生後第(P)5天向小鼠新皮質注射時，鵝膏蕈氨酸在新皮質中產生顯著的神經元損失，並且大的腦室周白質包囊與在室周白質軟化(Ieukomalacia)中看到的那些相似，其為在許多人類早產新生兒中出現的損傷。ALF-5755在P5時與鵝膏蕈氨酸大腦內共注射，或在鵝膏蕈氨酸後立即或3小時後腹膜內注射ALF-5755。在PlO進行腦損傷的分析。對於150ng的ALF-5755的劑量而言，ALF-5755與鵝膏蕈氨酸共注射分別降低了白質和皮質灰質損傷37%和67% (與僅用鵝膏蕈氨酸處理的幼鼠相比)。當在損傷後立即或3小時後腹膜內進行ALF-5755注射時，也觀察到良好的(大腦損傷大小50%的減少)神經保護。這確定了 ALF-5755通過全身途徑單次注射的功效，即使有所延遲。這也表明大腦內或外周施用ALF5755可在神經學疾病和上文定義的相關疾病中顯示治療效果。進一步驗證了體外數據，western印跡分析顯示與對照或鵝膏蕈氨酸單獨注射的動物相比時，ALF-5755單獨或與鵝膏蕈氨酸組合誘導了總GAP-43的顯著降低，但磷酸化的GAP-43的比例顯著並且非常大量的增加。實施例3 :在小鼠幼鼠的發育中的小腦中HIP/PAP蛋白的體內表達和小腦損傷模型中ALF-5755蛋白的體外效應A.材料和方法定量RT-PCR使用RNeasy小試劑盒(Quiagen)從P0、P5_7和P60swiss小鼠小腦、P5皮質和成體子宮中提取RNAs。以600ng的總RNAs進行反轉錄，以獲得HIP/PAP和HPRT cDNAs。利用Biorad系統引出HIP/PAP和HPRT轉錄物的定量PCR (利用適當的引物，94°C變性30秒，58°C雜交30秒，72 V聚合30秒，45個循環)。通過將HIP/PAP針對HPRT轉錄物進行合理化(相關的Biorad軟體)獲得多種年齡的幼鼠小腦中HIP/PAP表達的定量，以校準RT PCR並比較隨時間HIP/PAP表達的水平。小腦顆粒神經元培養粒細胞代表大多數小腦神經元。從P7小鼠幼鼠製備原代顆粒神經元培養物。簡言之，解剖腦並置於HHGN(含有IM HEPES和4. 45%葡萄糖的HBSS Ix ；Invitrogen)中。去除腦脊膜，以避免星形細胞的大量汙染。分離後，在HHGN中洗滌小腦，切成小塊，並用O. 25%膜蛋白酶 _0· 02% EDTA 分離細胞並且與 DNA 酶 I (Sigma St-Quentin Fallavier, France)溫育。在聚-L-鳥苷酸(Sigma)包被的24孔板中以2千2百萬細胞/孔的密度在MEMlX和10%馬血清中平板接種細胞。接種後24小時，向培養基中加入10 μ M的AraC (阿糖胞苷)，以抑制神經膠質細胞增殖。體外7天(DIV7)後，通過處理細胞I小時並允許隨後用以下誘導物恢復8、16或24小時來誘導神經死亡(i) =H2O2O. 01到ImM，以誘導氧化應激並實現隨後60%的細胞死亡，(ii) 0. 3到3mM NMDA,以誘導興奮性中毒並實現隨後約40%的細胞死亡。在兩種情況下，存在O. 3mM的H2O2濃度或存在ImM的NMDA時在5和10 μ g/ml處估計ALF-5755神經保護效應。免疫細胞化學對於GFAP(星形細胞檢測)、NeuN(神經元檢測)、Zicl (成熟的粒細胞檢測)、MAP2(神經元檢測)和切割的(clived)胱天蛋白酶3 (活性胱天蛋白酶3檢測)染色，處理 的細胞培養物在4% PFA中固定，並與抗GFAP (Dako，1/500)、抗NeuN(MiIIipore，1/100)、抗Zicl (Abeam 1/100)、抗 MAP2 (Abeam, 1/2000)和抗-切割的胱天蛋白酶 3 (Cell SignalingTechnology, 1/100)抗體反應。根據實驗，分別用在多個波長處發突光的二級抗體Cy3綴合的驢抗小鼠抗體(1/1000, Jackson Immunoresearch)和488綴合的驢抗兔抗體(1/1000,Molecular Probes)進行標記抗原的檢測。然後用Dapi (1/1000)復染細胞核。統計學分析用Graphpad軟體進行統 計學分析。B.結果出生後發育過程中HIP/PAP的小腦表達到目前為止，從未記載過出生後發育的小鼠的皮質和小腦中有HIP/PAP表達。這裡，我們報導了 HIP/PAP在P5以低但可比較的水平在兩個區域內表達HIP/PAP。HIP/PAP水平在小腦中隨時間增加，與P5小鼠比較時在成年小鼠中達到20倍強度。其他結構中的表達正在研究中。評估ALF-5755對H2O2誘導的細胞死亡的保護效應顯示暴露在濃度為O. 3mM的H2O2中I小時並隨後恢復16小時誘導約61 %的細胞死亡。觀察到細胞H2O2暴露不誘導胱天蛋白酶3的切割。結果，H2O2誘導的細胞不依賴於胱天蛋白酶3途徑。5或10μ g/mL(yM)的ALF-5755處理不影響切割的胱天蛋白酶3水平或AIF定位。然而，暴露在5或10 μ g/ml的ALF-5755中的細胞當與對照細胞相比時顯示改善的形態。用ALF-5755處理的細胞具有比對照細胞較不高級的緻密方面，因為染色質濃縮較不重要。因此,該結果顯示ALF-5755蛋白可保護小腦粒細胞免於H2O2誘導的細胞死亡。評估ALF-5755對NMDA誘導的細胞死亡的保護效應濃度為ImM的NMDA處理I小時並恢復16小時誘導約34%的細胞死亡。觀察到細胞NMDA暴露誘導胱天蛋白酶3的切割。結果，NMDA誘導的細胞死亡通過激活胱天蛋白酶途徑而發出信號。用5或10μΜ的ALF-5755處理顯著減少了緻密細胞的出現在對照樣品中，約80 %的細胞顯示緻密方面，而存在5 μ M或10 μ M的ALF-5755時，緻密細胞的百分比不超過40%。因此，顯示ALF-5755保護粒細胞神經元免於NMDA誘導的細胞死亡。總之，這些結果強烈地提示，ALF-5755可防止小腦粒細胞免於興奮性中毒和氧化死亡。實施例4 ΗΙΡ/ΡΑΡ蛋白針對皮質神經元細胞的凋亡的保護效應Α.材料和方法Α. I.皮質培養物通過低溫處死PO幼鼠；在CMF-TyiOde溶液中無菌條件下解剖它們的皮質。去除腦脊膜，將組織剁成更小的塊並在CMF-TyiOde中收集。用胰蛋白酶-DNA酶處理這些，然後通過研磨在相同溶液中分離，以製備單個細胞懸浮液，沉澱並在含有15mM HEPES, L-穀氨酸胺、鹽酸卩比卩多醇(pyroxidine hydrochloride) (Invitrogen, Carlsbad, CA)、N2 補充劑(Invitrogen)、10%胎牛血清、25mM KCl和青黴素-鏈黴素的Dulbecco改良Eagle培養基-F-12 (DMEM-F-12)中重懸浮。
將細胞以2x IO4細胞/cm2的密度接種到聚-D-賴氨酸-包被的Labtek室中(Nunc,Roskilde,DK)。在37°C下5% CO2中溫育24小時後，去除含血清的培養基。然後在無血清培養基中培養細胞12個小時，其後開始用NMDA (終濃度為O. 3mM)和HIP (終濃度為18. 3ng)進行處理。處理持續24小時，其後用IX PBS洗滌細胞，然後在4% PFA中固定。
A. 2. TUNEL 測定從Roche購買TUNEL試劑盒並根據製造商的建議進行測定。簡言之，在O. 02%Triton-X中透化細胞30分鐘，在由末端核苷酸轉移酶和經標記的核苷酸混合物組成的標記混合物中37°C下潮溼的室中溫育I小時。通過計數兩個孔中各自共10個隨機視野的TUNEL陽性細胞進行培養物中TUNEL陽性細胞的定量。B.結果在圖I中概述了結果，其中通過測定TUNEL陽性細胞的百分比評估皮質細胞凋亡的水平。如圖I所示，HIP/PAP蛋白發揮皮質神經元細胞的保護作用，即使當單獨使用時(見圖I最右邊部分的"HIP"條形)。這些結果表示，HIP/PAP蛋白單獨誘導對體外細胞培養的基線效應的保護作用。最重要的是，圖I顯示HIP/PAP蛋白發揮針對NMDA誘導的皮質神經元細胞凋亡的強保護作用(將"NMDA"條形與"NMDA+HIP"條形比較)。從來自對野生型GAP 43基因純合的小鼠(GAP43+/+)的皮質細胞體外培養物中獲得圖I中顯示的結果。儘管未顯示，通過使用皮質細胞的體外培養物獲得了相同的結果，所述皮質細胞來自(i)GAP43+/_ 小鼠或(ii)GAP43-/_ 小鼠。後面的結果提示，所看到的HIP/PAP蛋白的保護效應不需要GAP43蛋白的存在。實施例5 HIP/PAP蛋白對神經元細胞可塑性的影響A.材料和方法A. I.皮質培養物通過低溫處死PO幼鼠；在CMF-TyiOde溶液中無菌條件下解剖它們的皮質。去除腦脊膜，將組織剁成更小的塊並在CMF-TyiOde中收集。用胰蛋白酶-DNA酶處理這些，然後通過研磨在相同溶液中分離，以製備單個細胞懸浮液，沉澱並在含有15mM HEPES, L-穀氨醯胺、鹽酸卩比卩多醇(Invitrogen, Carlsbad, CA)、N2補充劑(Invitrogen)、10%胎牛血清、25mMKCl和青黴素-鏈黴素的Dulbecco改良的Eagle培養基_F_12 (DMEM-F-12)中重懸浮。將細胞以2x IO4細胞/cm2的密度接種到聚-D-賴氨酸-包被的Labtek室中(Nunc,Roskilde,DK)。在37°C下5% CO2中溫育24小時後，去除含血清的培養基。然後在無血清培養基中培養細胞12個小時，其後開始用NMDA (終濃度為O. 3mM)和HIP (終濃度為18. 3ng)處理。處理持續24小時，其後用IX PBS洗滌細胞，然後在4% PFA中固定。A. 2.顯微鏡檢查法在Zeiss Axioplan 2顯微鏡上使用Axio Cam HRC C⑶照相機捕獲圖像，並使用Zeiss KS 4003. O軟體完成分析。圖像需要稍微調整對比度和亮度。不需要額外的圖像改變。A. 3.軸突長度分析
除了觀察分支點的數量，還觀察一級、二級和三級軸突的數量。β III微管蛋白用作標記物(在實施例中未顯示數據)。在Zeiss Axioplan II上捕獲圖像。使用ΙΜ50軟體獲得軸突長度。
B.結果分別在圖2到6中描述了結果。圖2到5的結果顯示，ΗΙΡ/ΡΑΡ蛋白，即使單獨使用時也在神經可塑性中產生增加，因為所述ΗΙΡ/ΡΑΡ蛋白(i)增加一級軸突的數量(圖2)，以及具有二級和三級軸突的細胞的數量(分別見圖3和4)。圖6中描述的結果顯示，HIP/PAP蛋白具有保護神經元細胞免於NMDA在軸突生長上引起的不利作用的能力。更精確地，圖6中呈現的結果顯示HIP/PAP，當加入與NMDA溫育的神經元細胞時，恢復軸突生長的水平，在與單獨培養基溫育的對照神經元細胞培養物中測量所述軸突生長水平。此外，已經顯示HIP/PAP蛋白具有恢復皮質神經元細胞神經可塑性的能力，所述皮質神經元細胞與細胞毒性量的NMDA進行溫育。從來自對野生型GAP 43基因純合的小鼠(GAP43+/+)的皮質細胞的體外培養物中獲得圖2、5和6中顯示的結果。儘管未顯示，通過使用皮質細胞的體外培養物獲得了相同的結果，所述皮質細胞來自(i)GAP43+/_ 小鼠或(ii)GAP43-/_ 小鼠。後面的結果提示，所看到的HIP/PAP蛋白對神經可塑性的保護效應不需要GAP43蛋白的存在。
權利要求
1.HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物用於預防或治療選自以下組成的組的疾病的用途 -新生兒腦損傷，其包括腦缺氧引起的新生兒腦損傷， -成人或兒童腦損傷，其包括腦缺氧引起的成人或兒童腦損傷， -成人或兒童或新生兒外傷性腦損傷， -小腦疾病或病症，和 -涉及Gap-43的產生或磷酸化中的缺陷的疾病。
2.權利要求I的用途，其中新生兒腦損傷包括選自胎兒低氧血、圍產期低氧血、胎兒局部缺血、圍產期局部缺血，和興奮性神經遞質過度釋放的病理學狀態。
3.權利要求I的用途，其中所述新生兒、成人或兒童腦損傷由腦血管意外組成，其包括中風。
4.權利要求I的用途，其中所述新生兒、成人或兒童腦損傷選自缺血性中風和出血性中風。
5.權利要求I的用途，其中所述小腦疾病或病症是小腦性共濟失調。
6.權利要求I的用途，其中涉及Gap-43的產生或磷酸化中缺陷的所述疾病由阿爾茨海默氏病組成。
7.權利要求I至6任何一項的用途，其中所述HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物調節神經元細胞的結構重塑或可塑性。
8.權利要求I至7任何一項的用途，其中所述HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物發揮針對神經元細胞凋亡或針對神經元細胞死亡的保護效應。
9.權利要求I至6任何一項的用途，其中所述HIP/PAP蛋白或其衍生物包含與選自SEQID N0 I到3的多肽的多肽具有至少90%胺基酸同一性的胺基酸序列。
10.權利要求I至9任何一項的用途，其中所述HIP/PAP蛋白衍生物選自HIP/PAP蛋白的生物學活性部分和HIP/PAP嵌合或融合蛋白。
11.HIP/PAP蛋白用於體外培養神經元細胞的用途。
12.用於神經元細胞的培養基，其包含HIP/PAP蛋白或其衍生物。
全文摘要
本發明由HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物用於製備預防或治療選自以下疾病的藥物的用途組成新生兒腦損傷，其包括腦缺氧引起的新生兒腦損傷；成人或兒童腦損傷，其包括腦缺氧引起的成人或兒童腦損傷；成人或兒童或新生兒外傷性腦損傷；小腦疾病或病症，和涉及Gap-43的產生或磷酸化中缺陷的疾病。
文檔編號A61K38/00GK102625707SQ201080035101
公開日2012年8月1日 申請日期2010年6月11日 優先權日2009年6月11日
發明者C·布雷紹, E·盧吉爾, G·阿穆亞爾, J·費爾, P·格萊森, P·阿穆亞爾 申請人:國立健康與醫學研究所, 阿爾法科特創新公司