半無菌培養異養小球藻的方法
2023-10-27 05:49:57
專利名稱：半無菌培養異養小球藻的方法
技術領域：
本發明屬於藻類生物培養技術，特別涉及以低成本培養，獲得純度高、生長快，在異養條件下的一種半無菌培養異養小球藻的方法。
背景技術：
藻類生物生態分布廣，生長速度快，應用價值高。小球藻含豐富的蛋白質、多糖、脂類、葉綠素、維生素、微量元素和一些生物活性代謝產物，廣泛應用於保健食品、飼料、食品添加劑、精細化工品和醫藥製劑原料。長期以來，小球藻不僅是生物學研究中優良的實驗材料，而且是受人注目的開發利用對象。小球藻細胞除了可在自養條件下利用光能和二氧化碳進行正常的生長外，還可以在異養條件下利用有機碳源進行生長繁殖，類似於細菌的代謝生長。目前大規模培養主要採用水泥池中開放培養，易染菌、產量低、獲得的藻不純，這種傳統的、低產量的池塘光培養系統已不能滿足要求。80年代以來各種半密閉和密閉培養系統的研究受到廣泛重視，應用各種光生物反應器進行間歇流加、連續流加等方式培養，在一定程度上提高了小球藻的產量和產率，但由於仍然採用光照自養方式，生產效率並沒有得到根本的改變。以有機物作為小球藻的唯一碳源進行異養培養，具有無需光照，細胞增殖快，濃度高，生產系統易於實現自動控制，可利用現有的發酵設備等優點，已引起國外高度重視。但是目前為止，國內對小球藻的異養培養報導甚少，如何簡化操作、降低異養培養成本、特別在不滅菌的條件下培養獲得純度高生長快的異養藻細胞，是國內外尚未解決的關鍵技術問題。
迄今為止，已報導的異養轉化和培養實驗都是嚴格地在無菌條件下進行的。因為異養生長的藻細胞需要消耗大量的葡萄糖等有機碳源，在含有葡萄糖的培養液中，細菌等微生物易於大量繁殖，因此必須對培養液和實驗容器進行高溫滅菌處理。這樣的滅菌處理一方面操作繁瑣，另一方面消耗大量電能。
發明內容
本發明的目的是提供一種半無菌培養異養小球藻的方法，該技術採用兩步法，即第一步無菌擴種培養，第二步開放式大容量培養。其特徵在於所述無菌擴種培養是在400ml通氣培養瓶中對異養小球藻細胞進行無菌培養，即對培養基和培養器皿進行高壓為20p.s.i滅菌處理後，在培養器皿中進行無菌培養，控制溫度25～27℃，待藻生長到對數期時，再移到較大通氣培養器皿無菌培養，培養時間為20～24小時；所述開放式大容量培養是在非無菌條件下將藻種轉移到大廣口瓶中進行室溫大體積培養，溫度範圍22-28℃，培養瓶和培養液均不做滅菌處理，用氣泵通入空氣提供細胞懸浮與攪拌，進行第二步開放式培養過程中嚴格監視藻細胞的生長情況，並進行補料培養，測定細胞密度，繪製細胞生長曲線。
所述氣泵通氣流量為60-100L/h。
所述補料培養為在第二步操作過程中進行，補料時間為藻生長後24h，補料量為10L培養液中加入葡萄糖50g，甘氨酸0.5g；或20L培養液中加入葡萄糖90g，甘氨酸0.9g。補料經高壓滅菌。
本發明的有益效果是1.兩步法半無菌培養異養小球藻技術與現有技術比，簡化了培養操作，大幅降低了培養成本，特別是在不滅菌的條件下，培養獲得純度高、生長快的異養藻細胞。即讓處於對數生長期旺盛生長的細胞快速大量繁殖，讓細菌等微生物還來不及繁殖起來的時候，異養藻細胞便形成了單種優勢，達到了收穫所需要的密度，通過兩步法培養，每升藻液所得乾重約為3.8g。2.在不補料條件下培養得到的藻顏色呈淡黃色，色澤較幹，油性少，補料後，不僅藻的生長速度提高，OD值增大；而且得到的藻色澤較油，每升所得乾重也較多。在OD值相同時，如OD值為10時，通常在不補料情況下，每升所得乾重約為3.8g，而補料後每升所得乾重可達到5.4g。
圖1為無菌培養和開放式培養條件下的異養小球藻生長比較曲線；圖2為異養小球藻在不同半無菌條件下的細胞生長曲線具體實施方式
本發明為一種半無菌培養異養小球藻的方法，該技術採用兩步法，即第一步無菌擴種培養，無菌擴種培養是在400ml通氣培養瓶中對異養小球藻細胞進行無菌培養，即對培養液和培養器皿進行高壓為20p.s.i滅菌後，在培養器皿中對異養小球藻進行無菌培養，控制溫度25-27℃，待藻生長到對數期時，再移到較大通氣培養器皿無菌培養，培養期為24小時後進行第二步，開放式大容量培養，在非無菌條件下將藻種轉移到大廣口瓶中進行室溫大體積培養，溫度範圍22-28℃，培養瓶和培養液均不做滅菌處理，用氣泵通入通氣流量為60-100L/h的空氣提供細胞懸浮與攪拌。進行第二步開放式培養過程中嚴格監視藻細胞的生長情況，並進行補料培養，補料量為10L培養液加葡萄糖50g，甘氨酸0.5g；20L培養液加葡萄糖90g，甘氨酸0.9g。補料經高壓為20p.s.i滅菌。結果表明異養小球藻在半無菌條件下，生長速度明顯高於在開放式條件下的生長，測定細胞密度，繪製細胞生長曲線表明兩步法培養的最終細胞密度大大高於開放式的細胞密度，離心收集得到的藻純度很高。在不補料條件下培養得到的藻顏色呈淡黃色，色澤較幹，油性少，可能是營養受限所至。補料後，不僅藻的生長速度提高，OD值增大；而且得到的藻色澤較油，每升所得乾重也較多。在OD值相同時，如OD值為10時，通常在不補料情況下，每升所得乾重約為3.8g，而補料後每升所得乾重可達到5.4g。上述異養培養液基本組成為葡萄糖10.0g/L，L-甘氨酸0.1g/L，K2HPO439.3g/L，KH2PO470.0g/L，MgSO414.6g/L，微量元素A51.0ml/L，FeSO40.3g/L，VB110.0μg/L。調pH為6.1，在培養的同時用100w的燈進行光照。
下面再結合具體實施例對發明作進一步的說明。
實施例1對簡單的無菌培養和開放式培養條件下異養藻細胞的生長狀態進行比較，結果顯示(如圖1所示)。小球藻在不經滅菌的20L玻璃缸中開放式培養(培養液也未滅菌)，異養細胞的生長很慢，染菌程度高，反映異養細胞密度的OD值增長較慢，最終僅達到3左右。小球藻不易被離心沉澱，不利於細胞產物的收集。如果補料(即在培養液中繼續補充營養鹽和葡萄糖)，則更容易使細菌大量生長，離心收集得到的藻不純且生物量較低。經過滅菌處理的實驗組異養細胞的生長曲線顯示，反映異養細胞密度的OD值增長較快，最終達到了9左右，是開放式培養的3倍。嚴格滅菌條件下培養的異養小球藻易於被離心沉澱，因此利於細胞產物的收集。但是對培養液和實驗容器進行高溫滅菌處理操作繁瑣，消耗大量電能，大大地增加生產成本。在無菌條件下也不能進行補料(即在培養液中繼續補充營養鹽和葡萄糖)操作。
實施例2分別對小球藻在10L、20L下口瓶(補料)半無菌培養的生長狀態進行比較，結果顯示(如圖2所示)。在第一步操作中，所有培養液和培養器皿均高壓滅菌。然後，對異養小球藻藻種在400ml通氣培養瓶中進行嚴格的無菌培養，溫度26℃，光照強度不作要求。待藻細胞生長到對數期時，20-24小時後，在無菌條件下將藻細胞轉移到3L三角瓶中繼續在光照培養箱中培養，作為20L大量培養的藻種。在第二步操作中，將3L三角瓶中的藻種在非無菌條件下(開放體系中)轉移到10L或20L下口瓶中培養。下口瓶的上下口均給予通氣，培養溫度隨實驗室溫度變化而變化，光照強度不作要求。
在做補料培養時，補料量為10L培養液加葡萄糖50g，甘氨酸0.5g；20L培養液加葡萄糖90g，甘氨酸0.9g。補料是經高壓滅菌的。在藻生長24h後補料，96h或120h後收集藻細胞。
權利要求
1.一種半無菌培養異養小球藻的方法，該技術採用兩步法，即第一步無菌擴種培養，第二步開放式大容量培養，其特徵在於所述無菌擴種培養是在400ml通氣培養瓶中對異養小球藻細胞進行無菌培養，即對培養基和培養器皿進行高壓為20p.s.i滅菌處理後，在培養器皿中對異養小球藻進行無菌培養，控制溫度25～27℃，待藻生長到對數期時，再移到較大通氣培養器皿無菌培養，培養時間為20～24小時；所述開放式大容量培養是在非無菌條件下將藻種轉移到大廣口瓶中進行室溫大體積培養，溫度範圍22-28℃，培養瓶和培養液均不做滅菌處理，用氣泵通入空氣提供細胞懸浮與攪拌，進行第二步開放式培養過程中嚴格監視藻細胞的生長情況，並進行補料培養，測定細胞密度，繪製細胞生長曲線。
2.根據權利要求1所述半無菌培養異養小球藻的方法，其特徵在於所述氣泵通氣流量為60-100L/h。
3.根據權利要求1所述半無菌培養異養小球藻的方法，其特徵在於所述補料培養為在第二步操作過程中進行，補料時間為藻生長後24h，補料量為10L培養液中加入葡萄糖50g，甘氨酸0.5g；或20L培養液中加入葡萄糖90g，甘氨酸0.9g。補料經高壓為20p.s.i滅菌處理。
全文摘要
本發明公開了屬於藻類生物培養技術的一種半無菌培養異養小球藻的方法，該技術採用兩步法，第一步無菌擴種培養，第二步開放式大容量培養。該技術解決了在不影響產率的情況下，簡化了培養操作，大幅降低了培養成本，獲得了高純度的異養小球藻，為工業生產和對小球藻的大規模開發利用打下了基礎。我們採用的兩步法半無菌培養，操作較為方便，實驗和生產成本低，獲得的藻純度很高；而且在相同OD值情況下，生物量與生物反應器中培養得到的生物量相當或更高，適於在實驗室中或工業上大量培養，為對小球藻的大規模開發利用打下了基礎。
文檔編號C12N1/12GK1418946SQ0214668
公開日2003年5月21日 申請日期2002年11月5日 優先權日2002年11月5日
發明者吳慶餘, 繆曉玲, 赫振華, 徐瀚 申請人:清華大學