人或人源化免疫球蛋白在非人轉基因動物中增強的表達的製作方法

2023-10-27 12:47:12 2

專利名稱：：人或人源化免疫球蛋白在非人轉基因動物中增強的表達的製作方法人或人源化免疫球蛋白在非人轉基因動物中增強的表達發明領域本發明涉及通過促進正常B細胞發育和通過維持攜帶有人(或人源化)免疫球蛋白基因座的非人動物中人(或人源化)抗體的表達而改善非人轉基因動物中人(或人源化)免疫球蛋白的表達的方法。特別地，本發明涉及同時表達編碼人(或人源化)Iga和/或IgP(B細胞受體的組分)的轉基因以及編碼人(或人源化)免疫球蛋白基因座的轉基因。本方法允許人(或人源化)抗體例如在轉基因非人動物的血液、乳液或卵中的顯著表達。相關技術的說明抗體是已經成功用於治療多種人類疾病和病症(例如癌症、過敏性疾病)、預防移植排斥和宿主抗移植物疾病的一類重要的藥學產品。獲得自非人動物的抗體製劑的主要問題在於非人免疫球蛋白在人類患者中的固有免疫原性。為了降低非人抗體的免疫原性，已表明可以通過將動物可變區(V)外顯子與人類恆定區(C)外顯子融合而獲得嵌合抗體基因。該嵌合或人源化的抗體具有對人類最小的免疫原性並且適合用於人類受試者的治療性治療。已經研發了人源化單克隆抗體並且將其用於臨床應用。然而，總體上，無論是嵌合、人源化還是人單克隆抗體在治療諸如癌症或烈性病原體感染等破壞性疾病上的應用由於這些疾病的複雜性、多因子病因學和適應性而受到限制。針對於單一限定靶標的單克隆抗體通常在這些靶標改變、進化和突變時失效。例如，惡性腫瘤可獲得對標準單克隆抗體治療的抗性。這一問題的解決方案是4吏用具有靶向多個進化靶標能力的多克隆抗體。多克隆抗體可以中和細菌或病毒毒素，並引導免疫應答以殺死和消除病原體。因此，對於大規模生產高效價、高親和性、人源化多克隆和單克隆抗體的適合方法存在巨大的臨床需求。此外，由於從抗體產量的角度講偏愛在如兔、雞、綿羊和牛等較大型轉基因動物中生產抗體，因此也高度需要表達較大量轉基因編碼的產物的較大型建立者動物的產生。人源化單克隆抗體通常是這樣的人類抗體，其中一些CDR殘基，以及可能一些FR殘基由來自非人動物(如嚙齒類)的抗體的同功位點殘基所取代。基本上可以按照Winter及其同事的方法(Jones等人，AW"r。321:522(1986);Riechmann等人，胸跳332:323(1988);Verhoeyen等人，腸證，239:1534(1988))，通過用非人動物(例如嚙齒類)CDR或CDR序列取代人類單克隆抗體的相應序列而進行人源化。在動物中製造人源化抗體時遇到的一個問題是宿主抗體的內源性生產高於轉基因抗體，而需要抑制該內源性抗體的生產。已經描述了抗體(嵌合和種系突變鼠中的重鏈連接區(JH)基因)的純*失，導致內源性抗體生產的完全抑制。將人種系免疫球蛋白基因陣列轉移到該種系突變鼠中將導致在抗原攻擊時人抗體的生產。參見例如，Jakobovits7V""t/W,90:2551(1993);Jakobovits等人，7V"，362:255(1993);Bruggemann等人，/"/附附w朋/.，7;33(1993);2006年6月20日授權的美國專利No.7,064,244;其公開內容在此通過整體引用作為參考。將人免疫球蛋白基因導入小鼠基因組導致這些遺傳改造的小鼠中多樣4乜的人抗體i普的表達。Pluschke等人，/owfwa,o//m附MW0/ogica/M^/^^215:27-37(1998)已經描述了表i^A-鼠嵌合抗體的小鼠的產生。Neuberger等人，7V","/r338:350-2(1989);Lonberg等人，7w/LWev./附附wzi0/.13(1):65-93(1995);和Bruggemann等人，C匿0—.5/他由o/.，8(4):455-8(1997);1996年8月授權的美國專利No.5,545,806;1996年8月授權的美國專利No.5,545,807和1996年10月授權的美國專利No.5,569,825中已經描述了表ii^免疫球蛋白多肽的小鼠的產生，其公開內容在此通過整體引用作為參考。Kuroiwa等人，A^MM祝We(^20(9):889-894(2002)已經描述了表達人抗體的牛的產生。PCT公開號No.WO92/03918、WO02/12437,以及美國專利No.5,814,318和5,570,429也已經描述了表ii^(或人源化)免疫球蛋白轉基因座(transloci)的非人轉基因動物的生產以及從該轉基因動物生產抗體，其公開內容在此明確地通過整體引用作為參考。所獲得的人源化抗體具有對人最小的免疫原性並且適合用於人類受試者的治療性治療。儘管上面引述的遺傳改造方法導致人免疫球蛋白多肽在遺傳改造小鼠中表達，但是人免疫球蛋白的表達水平低於正常水平。這可能由於在免疫球蛋白基因座中免疫球蛋白的有效表達所需的物種特異性調控元件。如在轉染的細胞系中所顯示的人免疫球蛋白基因中存在的調控元件在非人動物中可能不能適當地發揮作用。已經描述了若干免疫球蛋白基因中的調控元件。尤其重要的是重鏈恆定區下遊(3')的增強子和輕鏈基因內部(intronic)的增強子。此外，其它(仍待鑑定的)控制元件可能存在於免疫球蛋白基因中。在小鼠中的研究顯示了膜結合形式的免疫球蛋白分子的膜和胞質尾部分對於人Cyl基因為純合的小鼠血清中人-鼠嵌合抗體的表達水平起重要作用。因此，對於動物中異源性免疫球蛋白基因的表達，需要用通常在動物的類似位置中發現的序列來代替含有增強子元件和編碼跨膜部分的外顯子(Ml外顯子)和胞質尾的外顯子(M2外顯子)的序列。這些遺傳改造的動物中的人免疫球蛋白表達也可受到攜帶人或人源化免疫球蛋白基因座的非人的B細胞發育的影響。已經在小鼠中廣泛地研究了B細胞受體(BCR)對B細胞發育的影響。然而，還並不清楚人或部分人抗體如何組合以形成功能性BCR，以及是否該BCR將有效地影響表達人(或人源化)Ig的非人B細胞在轉基因動物中的發育和存活，其反過來將影響抗體的產量。附圖筒述圖1示出人Igot多肽序列(SEQIDNO:1)與其它非人Iga序列(SEQII)NO:2-6)的胺基酸比對。圖2示出人IgP多肽序列(SEQIDNO:7)與其它非人Igp序列(SEQIDNO:8-12)的胺基酸比對。發明概述一方面，本發明提供編碼BCR的嵌合Igoc亞基的轉基因構建體，其中該嵌合Igot亞基包括非人Iga多肽序列的細胞內結構域序列和跨膜結構域序列；以及與SEQIDNO.:1的人Igct的胞外結構域具有至少85%序列同一性的多肽。第二方面，本發明提供編碼BCR的嵌合IgP亞基的轉基因構建體，其中該嵌合IgP亞基包括非人IgP多肽序列的細胞內結構域序列和跨膜結構域序列；以及與SEQIDNO.:7的人Ig(3的胞外結構域具有至少85%序列同一性的多肽。本發明的某實施方式中，非人Iga多肽序列的類型包括但不限於牛(SEQIDNO:2);鼠(SEQIDNO:3);犬(SEQIDNO:4);靈長類(SEQIDNO:5);兔(SEQIDNO:6)或其它非人序列。本發明另一個實施方式中，非人IgP多肽序列的類型包括但不限於犬(SEQIDNO:8);大鼠(SEQIDNO:9);牛(SEQIDNO:10);鼠(SEQIDNO:11);雞(SEQIDNO:12)或其它非人序列。第三方面，非人轉基因動物包括(a)編碼SEQIDNO.:1的全長人Igoc亞基，或如上所限定的嵌合Igct亞基的轉基因構建體，和/或(b)編碼SEQIDNO.:7的全長人IgP亞基，或如上所限定的嵌合IgP亞基的轉基因構建體，和(c)編碼人(或人源化)免疫球蛋白基因座的轉基因構建體，其中生成的轉基因產物組合以形成人(或人源化)B細胞受體複合物。這方面的一個實施方式中，充分地降低非人轉基因動物的任何內源性Ig產物的表達，和/或內源性Igoc和/或內源性Igp亞基的表達。另一個實施方式中，非人轉基因動物選自兔、小鼠、大鼠、豬、綿羊、山羊、鳥類、馬、驢和牛。優選實施方式中，非人轉基因動物是兔。第四方面，本發明還提供來自上述限定的非人轉基因動物的分離的人(或人源化)免疫球蛋白，其是抗體或抗體片段。這一方面的某實施方式中，分離的人(或人源化)免疫球蛋白是多克隆或單克隆抗體，或者是抗體片段。該抗體片段可以來自多克隆或單克隆抗體。另外，可以標記該抗體或抗體片段，或者將其與毒素融合以形成免疫毒素，或者與治療劑偶聯，或者與任何本領域充分定義及使用的異源胺基酸序列融合。一些實施方式中，該抗體片段是Fc、Fv、Fab、Fab，或FUb，)2片段。第五方面，本發明提供來自上述限定的非人轉基因動物的分離的B細胞，其中B細胞表達天然的人Igot亞基或嵌合Igoc亞基和/或表達天然的人Ig(3亞基或嵌合IgP亞基，此外還表達人(或人源化)免疫球蛋白基因座。某些實施方式中，該B細胞是永生化的，且在優選的實施方式中其源自兔。第六方面，本發明提供包含如上所述的抗體或抗體片段的抗體製劑。第七方面，本發明提供包含與可藥用成分混合的如上所述抗體或抗體片段的藥物組合物。該藥物組合物可以包含單克隆抗體或其片段，或者包含一或多種多克隆抗體或其片段。第八方面，本發明提供在非人動物中生產人(或人源化)抗體的方法，包括(a)將編碼天然人Igot亞基或嵌合Iga亞基的轉基因構建體，和/或編碼天然的人IgP亞基或嵌合IgP亞基的轉基因構建體導入非人動物中並在其中表達；和(b)將編碼人(或人源化)免疫球蛋白基因座的轉基因構建體導入非人動物中並在其中表達；(c)使該動物接受抗原刺激；和(d)從該動物中分離人(或人源化)抗體。該方面的某實施方式中，抗體是多克隆或單克隆抗體，或是多克隆或單克隆抗體的片段。此外，該抗體或抗體片段可以被標記，或者可以與毒素融合以形成免疫毒素，或者與治療劑偶聯，或者可以與任何異源性胺基酸序列融合。第九方面，本發明提供生產表達人(或人源化)抗體的非人動物的方法，包括(a)將編碼天然人Iga亞基或嵌合Igoc亞基的轉基因構建體，和/或編碼天然人IgP亞基或嵌合IgP亞基的轉基因構建體導入非人動物的B細胞中並在其中表達；和(b)將編碼人(或人源化)免疫球蛋白基因座的轉基因構建體導入非人動物中並在其中表達；其中，生成的轉基因產物組合以形成人(或人源化)B細胞受體複合物。一個實施方式中，表達人(或人源化)抗體的非人動物是通過基因轉換和/或體細胞高變而產生抗體多樣性的動物。優選實施方式中，該動物是兔。發明詳述定義除非另有定義，本文使用的技術和科學術語具有與本發明所屬領域技術人員的常規理解相同的含義。Singleton等人，"/"/owflo;o/Af/craA/o/o^做^/Afo/ec'M/"rA/。/o狄，第二版，丄Wiley&Sons(NewYork,NY1994)，以及March,v4fMmceflfOrgflm'cC^脂'5^yi^flcrifms,Afec/rflw/5ms5^w"mm，第四版，JohnWiley&Sons(NewYork,NY1992)為本領域技術人員提供了許多本申請所使用術語的總體指導。本領域技術人員將認識到許多可用於實現本發明的，與本文所述那些相似或等效的方法和材料。事實上，本發明並不限於所述方法和材料。出於本發明的目的，在下面限定下述術語。本文定義的"轉基因構建體或表達構建體"指DNA分子，其含有至少一種目的轉基因的編碼序列以及該目的轉基因在非人轉基因動物的靶細胞中時間性、細胞特異性和/或增強的表達所需的適當的調控序列。"B細胞，，定義為能夠在其生命周期的某階段進行免疫球蛋白基因片段重排並表達免疫球蛋白基因的B譜系細胞。這些細胞包括但不限於，早期祖B細胞、晚期祖B細胞、大前B細胞、小前B細胞、未成熟B細胞、成熟B細胞、記憶性B細胞、漿細胞等。本文定義的"B細胞受體(BCR)複合物"指B細胞上表達的多亞基免疫識別受體，其包括下述亞基抗原(Ag)受體、膜結合的免疫球蛋白(mlg)、Iga亞基和IgP亞基。Wienands等人，/.9(2):449-455(19卯)，Venkitaraman等人，TV"似"352:777-781(1991)，Herren等10人，/附附朋o/og/c/^.26(1-3):35-43(2002)已經描述了B細胞受體、其組分及其與五類免疫球蛋白的締合。此外，還有若干已經被克隆並測序的BCR相關蛋白質(BAP)，但它們的功能仍未知，且其作為BCR組分的作用尚存疑問。Adachi等人，/15(7):1534-1541(1996)和Schamd等人，屍7VAS1100(17):9861-9866(2003)描述了BCR相關蛋白質。"天然Iga或IgP亞基"指天然存在的Igoc或IgP多肽序列，其包括在給定動物類型或相關物種中發現的Igoc或IgP亞基的天然存在的等位基因。這也指"全長Igoc或IgP序列，，。Flaswinkel等人，/附附wwogew^'"36(4):266-69(1992)克隆了人Iga多肽序列，其檢索號為M74721(圖1，SEQIDNO:1)。Mueller等人，五肌丄22，1621-25(1992)克隆了人IgP多肽序列，其檢索號為M80461(圖2，SEQIDNO:7)。術語"人(或人源化)"指完全的人序列或含有一或多條人序列的序列。因此，如本文所使用，該術語包括人和人源化序列。"嵌合Iga，，亞基或蛋白質或多肽指來自諸如大鼠、小鼠、人、兔、雞等的動物的Igoc多肽序列，其中，Igoc多肽的一或多個結構域由來自另一動物或物種的不同Iga多肽的相應結構域所代替，或者由來自不同等位基因的Iga類型或來自具有一或多個M酸取代的變體Iga序列或來自與給定Iga序列的相應結構域具有至少85%序列同一性的變體Iga序列的相應結構域所代替。術語"嵌合Iga，，和"人(或人源化)Iga"在整個說明書中互換使用。圖1也定義了來自一些非人動物的Igoc多肽序列(SEQIDNO:2-6)。"嵌合IgP，，亞基或蛋白質或多肽指來自諸如大鼠、小鼠、人、兔、雞等動物的IgP多肽序列，其中，IgP多肽的一或多個結構域由來自另一動物或物種的不同IgP多肽的相應結構域所代替，或者由來自不同等位基因的IgP類型或來自具有一或多個胺基酸取代的變體IgP序列或來自與給定IgP序列的相應結構域具有至少85%序列同一性的變體IgP序列的相應結構域所代替。術語"嵌合IgP，，和"人(或人源化)IgP"在整個說明書中互換使用。圖2也定義了來自一些非人動物的IgP多肽序列(SEQIDNO:8-12)。"胞內多肽或結構域"或"胞質尾"指給定膜結合蛋白質或亞基的存在於細胞內的那部分多肽序列。通常，蛋白質的胞內結構域負責信號轉導。Iga或IgP亞基的"胞內結構域序列，，指Igcx或IgP多肽通常存在於細胞內的多肽序列或其片段。Igcc或Ig|3亞基的"跨膜結構域序列"指Igct或IgP多肽跨越生物膜(例如質膜、細胞器膜或脂雙層)的多肽序列或其片段。本文定義的"跨膜結構域序列，，包括天然存在的跨膜多肽，或者可以是非天然存在的共有序列，或它們的片段。"胞外多肽或結構域，，指給定膜結合蛋白質或亞基通常存在於細胞外的那部分多肽序列。"Iga或IgP的胞外結構域"指Iga或IgP多肽存在於細胞外的多肽序列或其片段。本文所用的術語"人(或人源化)免疫球蛋白基因座"包括人免疫球蛋白或Ig基因座或其片段的天然存在的序列，人Ig基因座或其片段的天然存在的序列的簡併形式，以及編碼與由人lg基因座或其片段天然存在的序列所編碼的多肽基本上相同的多肽序列的合成序列。具體實施方式中，人Ig基因片段賦予免疫球蛋白分子在人中的非免疫原性。此處，術語"人(或人源化)或人源化免疫球蛋白(Ig)重和/或輕鏈基因座，，或"人或人(或人源化)免疫球蛋白或Ig基因座，，可互換使用。本文所用的術語"人(或人源化)B細胞受體(BCR)複合物"指這樣的多亞基BCR複合物，其中Iga亞基為天然的人Iga亞基或具有如上所述的人或人源化Iga序列的嵌合Iga亞基；和/或另外，其中IgP亞基為天然的人IgP亞基或具有如上所述的人或人源化IgP序列的嵌合IgP亞基；以及另外，膜結合免疫球蛋白(mlg)是如上所述的人(或人源化)免疫球蛋白。本文所用的術語"人抗體"和"人免疫球蛋白"指包括完整的人序列的抗體及免疫球蛋白分子。本文所用的術語"人源化抗體，，和"人源化免疫^求蛋白"指包括人免疫球蛋白多肽序列(或由人免疫球蛋白基因片段編碼的多肽序列)的至少一部分的免疫球蛋白分子。本發明的人源化免疫球蛋白分子可以分離自經遺傳改造以產生人源化免疫球蛋白分子的轉基因非人動物。與由動物所製備的或由源自動物的細胞所製備的非人源化免疫球蛋白分子相比，此類人源化免疫球蛋白分子具有對靈長類動物，尤其是人的較小免疫原性。人源化免疫球蛋白或抗體包括通過在基因轉換動物中的基因轉換和體細胞高變而進一步多樣化的免疫球蛋白(Ig)和抗體。此類人源化Ig或抗體並非"人源"的，這是由於它們並非由人類天然產生(因為人類不通過基因轉換而多樣化其抗體譜)，但是人源化Ig或抗體因為它們在其結構中具有人Ig序列而對於人是非免疫原性的。術語"充分地降低，，內源Ig產物，和/或IgOt和/或IgP亞基表達指轉基因動物中內源Ig單獨生產的程度，或者另外還有內源Iga和/或IgP表達的程度降低優選至少約30%-49%，或更優選至少約50%-79%，或甚至更優選至少約80-89%,或最優選約卯-100%。術語"單克隆抗體，，用於指由單個B細胞克隆合成的抗體分子。術語"多克隆抗體"指由B細胞群合成的抗體分子群。具有進行基因重排和基因轉換能力的"免疫球蛋白(Ig)基因座"在本文也稱為"功能性，，Ig基因座，且具有由功能性Ig基因座產生的多樣性的抗體在本文也稱為"功能性"抗體或"功能性"的抗體譜。本文所用的術語"非人(轉基因)動物"包括但不限於哺乳動物，例如非人靈長類動物、嚙齒類動物(例如小鼠和大鼠)、非嚙齒類哺乳動物，例如兔、豬、綿羊、山羊、牛、豬、馬和驢，以及鳥類(例如雞、火雞、鴨、鵝等)。本文使用的術語"非靈長類動物"包括但不限於除靈長類動物以外的哺乳動物，包括但不限於上面具體列舉的哺乳動物。詳述本發明至少部分基於這樣的認識，即非人轉基因動物中的人或人源化免疫球蛋白(包括免疫球蛋白鏈)的生產可以通過在該動物的B細胞中共表iiA或人源化Igoc和/或IgP而顯著增加。據認為轉基因動物的B細胞中包括人或人源化Iga和/或IgP重組並提高B細胞受體蛋白質之間的相互作用，從而增強攜帶該轉基因的B細胞的抗原識別、B細胞發育和存活。在已經攜帶了人或人源化Igoc和/或IgP轉基因的轉基因動物中共表iiA源化免疫球蛋白將極大地提高人源化免疫球蛋白的生產。另外還希望針對優選內源性Ig以及內源性Iga和/或IgP都敲除的背景，表iiA或人源化Igoc和/或IgP轉基因和人源化免疫球蛋白轉基因。B細胞受體及其相關蛋白質B細胞受體由膜結合免疫球蛋白和信號轉導異源二聚體所組成，該異源二聚體由兩個稱作Igct和IgP的二疏鍵連接的糖蛋白所組成。此外，已經描述了BCR相關蛋白質(BAP)。BCR表達對於B細胞發育、選擇和存活很重要。這些過程依賴於經過Iga/IgP異源二聚體的BCR信號。這些分子的胞質結構域攜帶含有若干組裝成所謂的免疫受體酪氨酸活化模體(ITAM)的酪氨酸殘基的序列模體，其在BCR引發下磷酸化。基因靶向實驗顯示了Iga/1gP異源二聚體的胞質結構域對於B細胞發育是至關重要的。由Igot/IgP異源二聚體轉導的信號參與發育中的B細胞的陽性和陰性篩選。膜結合免疫球蛋白(mlg)分子由兩條重鏈(形成同源二聚體)和兩條輕鏈(每條共價結合重鏈之一)組成。重鏈的N-末端攜帶VH結構域，取決於同種型，該結構域後為4(IgM、IgE)、3(IgG、IgA)或2(IgD)個C-結構域。通過VH:VL對的高變區形成抗原結合位點。因此，每個mlg分子具有兩個抗原結合位點。mlgM分子與分泌型IgM的不同之處在於分泌型IgM形成具有10個潛在抗原結合位點的五聚體。在分泌的us鏈的C-末端部分中的序列控制五聚化。膜結合iim鏈沒有這一由22個胺基酸組成的部分，取而代之，其攜帶由Ml和M2外顯子編碼的48個C末端胺基酸。序列的Mm特異性部分是整個IgM分子在進化上最保守的部分。其在小鼠、兔和人mlgM之間幾乎相同，且即使將小鼠與篁魚的mlgM相比，該保守性也仍很明顯。當將小鼠mlgM的C末端序列與其它mlg同種型的C末端序列相比時，胺基酸的保守性也很明顯。這一發現提供了保守的跨膜胺基酸在H鏈同源二聚體中彼此相互作用或與Iga和IgP亞勤目互作用的證據。Iga和IgP都具有22個tt酸跨膜片段，其後為含有若干酪氨酸殘基的約40-70個胺基酸的C末端胞質尾。在N末端，兩種蛋白質都攜帶前導肽，其後為含半胱氨酸殘基、色氨酸、以及若干在Ig超家族蛋白質中發現的其它保守胺基酸的胞外結構域。這表明Iga和IgP亞基的胞外部分形成類Ig結構域。除了形成結構域內二硫鍵的半胱氨酸，Iga和IgP序列還含有其它可能在Iga和IgP亞基之間形成鏈間二硫鍵的半胱氨酸。在小鼠和人Iga序列之間的比較顯示所有對於Ig結構域和鏈間鍵合的信息重要的殘基在兩物種的Iga之間是保守的。然而，這一比較也顯示胞外部分中的序列保守性只達到約56%，而跨膜和胞質尾分別顯示100%和87。/。的保守性。後者反映了分子C末端部分內的殘基的重要性。mlgM分子與Iga/IgP異源二聚體的組裝對於mlgM的表面表達是必要的。可以通過使pim鏈的跨膜部分突變而消除這一需要。例如，用H-2KK分子的跨膜部分代替Pm鏈的跨膜區導致mlgM的表面表達不依賴於Igoc/IgP。這些數據表明ym鏈和Iga/IgP異源二聚體之間的特異相互作用需要ILim跨膜區。此外，B細胞具有防止跨膜蛋白質複合物的單個或不完全組裝的組分轉運出ER的控制機制。儘管BCR的跨膜部分可能是形成BCR複合物所需的最重要結構，但也提示Iga和IgP的胞外Ig結構域在mlgM分子的結合上起作用。例如，在不表達小鼠Iga的小鼠細胞系J558Liam中，用Iga轉基因進行轉染恢復了mlgM的表面表達。引人注意地，用小鼠Igoc基因進行轉染導致比用人Iga基因進行轉染的表達高10倍。此外，這一數據提示Iga的胞外結構域可與mlgM的胞外部分相互作用。另一方面，帶有人免疫球蛋白基因座的轉基因小鼠確實表達人免疫球蛋白。轉基因非人動物中B細胞發育、B細胞存活或人(或人源化)mlgM的表達是否受到攜帶人(或人源化)mlgM基因的B細胞中人Igoc和/或人IgP的共表達的影響仍舊不清楚。此外，已經克隆並測序了若干BCR相關蛋白質(BAP)，但其功能仍舊未知。儘管這些蛋白質與BCR相關，但它們作為BCR組分的作用尚存疑問。然而，BAP的普遍表達以及強的進化保守性提示它們一定起重要作用，可能在普遍的細胞過程中發揮作用且已提出了若干假設功能。例如，這些蛋白質可參與BCR偶聯到細胞骨架，或者參與控制嚢泡轉運。最後，提出了它們作為分子伴侶起作用，幫助跨膜蛋白質的摺疊和組裝。相關文獻Wie瞧ds等人，￡MWO/9(2):449-455(19卯)，Venkitaraman等人，iV,"/r352:777-781(1991)，Herren等人，/附/mwwo/w.c'i^s.26(1-3):35-43(2002)描述了B細胞受體、其組分以及其與五類免疫球蛋白的相關性。Adachi等人，層50/15(7):1534-1541(1996)和Schamel等人，/WAS100(17):9861-9866(2003)描述了BCR締合的蛋白質。。//附附朋o/o狄10:97-121(1992)，Kraus等人，Ce〃117(6):787-800(2004),Sayegh等人，/麵w朋一Wiev/麵175:187-200(2000)，Reichlin等人，/o"應/0/jE"jc/7m'附ew,"/Af^"Vie193(1):13-23(2001)，Pike等人，/證冊/。//附細wo/柳172:2210-2218(2004),Pdanda等人，/owwa/0//附附wio/ogy169:865-872(2002)描述了B細胞受體對B細胞發育和存活的影響。Cronin等人，//附附""o/ogv161:252-259(1998)，Muller等人，/WAS97(15):8451-8454(2000)，Cragg等人，B/wd100:3068-3076(2002)，Wang等人，//附/mmo/ogv171:6381-6388(2003)，Fuentes-Panan4等人，//麵膽/柳174:1245-1252(2005)描述了BCR信號調控及其對B細胞發育及凋亡的影響。上面引用文獻的公開內容在此通過整體引用作為參考。因此，本發明涉及用於在B細胞中，尤其是在能夠產生多樣化的人(或人源化)抗體鐠的轉基因動物的B細胞中共表i^A(或人源化)Iga和/或人(或人源化)IgP以提高在該轉基因動物中B細胞存活的方法。動物的類型包括豐交大型非人動物，像兔、鳥、雞、綿羊、山羊、牛、豬、馬和驢。當這些動物表達Ig轉基因座，由於其較大的體型，其抗體產量也將是較大的。因此，本發明旨在產生較大的建立者動物，其通過增強的B細胞發育和存活生產較高量的人(或人源化)免疫球蛋白。因此，本發明涉及編碼全長人Igcx和IgP多肽的轉基因構建體，或編碼嵌合或人源化Iga和嵌合或人源化IgP多肽的嵌合轉基因構建體，這將在下面進一步限定。"編碼人Igoc和/或IgP多肽的轉基因或轉基因構建體"分別指天然的、全長人Iga和/或IgPDNA序列，以及編碼Iga或IgP的功能性等效多肽的任何變體，密碼子優化的DNA序列，但其根據密碼子的簡併性而具有不同的DNA序列。這一概念將在下面進一步詳細討論。SEQIDNO:1(圖1)定義了天然的、全長人Iga多肽序列。SEQIDNO:7(圖1)定義了天然的、全長人IgP多肽序列。本文還涉及"編碼嵌合或人(或人源化)Iga的核酸分子或轉基因或轉基因構建體"。"嵌合Igoc"亞基或蛋白質或多肽指來自動物(例如大鼠、小鼠、人、兔、雞等)的Iga多肽序列，其中Iga多肽的一或多個結構域由來自另一動物或物種的不同Iga多肽的相應結構域所替換，或由來自不同等位的Iga類型、或來自具有一或多個胺基酸取代的變體Igoc序列、或來自與給定Igot序列的相應結構域具有至少85%序列同一性的變體Iga序列的相應結構域所替換。術語"嵌合Igcc，，和"人(或人源化)Iga"在本說明書通篇中互換使用。從其可以獲得胞內和/或跨膜結構域序列的非人Iga多肽序列例如包括但不限於牛(SEQIDNO:2);鼠(SEQIDNO:3);犬(SEQIDNO:4);靈長類(SEQIDNO:5);兔(SEQIDNO:6)或其它非人序列。本文還涉及"編碼嵌合或人(或人源化)Igp的核酸分子或轉基因或轉基因構建體"。"嵌合IgP，，亞基或蛋白質或多肽指來自動物(例如大鼠、小鼠、人、兔、雞等)的IgP多肽序列，其中IgP多肽的一或多個結構域由來自另一動物或物種的不同IgP多肽的相應結構域所替換，或由來自不同等位的IgP類型、或來自具有一或多個胺基酸取代的變體IgP序列、或來自與給定IgP序列的相應結構域具有至少85。/。序列同一性的變體IgP序列的相應結構域所替換。術語"嵌合IgP"和"人(或人源化)IgP"在本說明書通篇中互換使用。從其可以獲得胞內和/或跨膜結構域序列的非人IgP多肽序列例如包括但不限於犬(SEQIDNO:8);大鼠(SEQIDNO:9);牛(SEQIDNO:10);鼠(SEQIDNO:11);雞(SEQIDNO:12)或其它非人序列。因此，簡言之，嵌合Iga或IgP轉基因由1)分別編碼人Igot或IgP的胞外結構域的核苷酸序列和2)分別編碼來自宿主轉基因動物的Igoc或Ig(3的跨膜和胞內結構域的核苷酸序列所組成。再一方面，本發明還涉及編碼人(或人源化)免疫球蛋白或基因座的轉基因構建體，如之前遞交的於2003年1月23日公開的美國公開No.2003-0017534，以及於2006年2月2日7>開的美國/>開No.2006-0026696的美國申請所描述的，所述申請的公開內容通過整體引用作為參考。其中公開的轉基因動物、其產生的B細胞或細胞系，以及相關方法也形成本發明的一方面。上述提及方面的替代的方法中，本發明還涉及編碼人(或人源化)免疫球蛋白或Ig鏈或基因座的轉基因構建體，如1996年8月授權的美國專利No.5,545,806;1996年8月授權的美國專利No.5,545,807以及1996年10月授權的美國專利No.5,569,825，2006年6月20日授權的美國專利No.7,064,244;或PCT公開No.WO92/03918、WO02/12437,和美國專利No.5,814,318及5,570,429中所述；也參見Jakobovits等人，AW/,/lc"di/5^,卯2551(1993);Jakobovits等人，iV"似"，362:255(1993);Bruggemann等人，l^w*/附附w加/.,7..33(1993);Pluschke等人，ToM/Ym/"/7附附wwo/^r/cfl/M"/wtfe215:27-37(1998);Neuberger等人，AWw"338:18350-2(1989);Lonberg等人，/wf.觸/畫騰/.13(1):65-93(1995);和Bruggemann等人，C0—.5z》,ec/^/.，8(4):455-8(1997);以及Kuroiwa等人，7Va似^醜/otec/r20(9):889-894(2002)，其公開內容在此通過整體引用作為參考。其中公開的轉基因動物、其產生的B細胞或細胞系，以及相關方法也形成本發明的一方面。可通過包括前核的微注射、轉染、核轉移克隆、精子介導的基因轉移、睪丸介導的基因轉移等多種技術將轉基因或轉基因構建體導入動物基因組。一個實施方式中，通過免疫特異性啟動子，優選B細胞特異性啟動子在轉基因動物的B細胞中優選表達人Iga和/或IgP基因。此人Iga或Ig^基因的表達優選僅在B細胞中發生，導致非人轉基因動物的增強的B細胞發育和存活。"B細胞特異性啟動子"指任何B細胞特異性基因的啟動子/增強子序列，和/或其變體或基因改造的部分，它們通常控制B細胞中表達的基因的表達，其實例包括但不限於CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、C歸、CD72、Blimp-l、CD79b(也稱作B29或IgP)、mb-l(也稱作Iga)、酪氨酸激酶blk，VpreB，免疫球蛋白重鏈，免疫球蛋白K輕鏈，免疫球蛋白入輕鏈，免疫球蛋白J鏈等的啟動子/增強子。優選實施方式中，CD79a、CD79b或K輕鏈啟動子/增強子驅動人Iga和/或IgP基因的B細胞特異性表達。又一個實施方式中，包括編碼人Iga和/或IgP基因的核酸分子的轉基因構建體與包括外源免疫球蛋白或免疫球蛋白(Ig)鏈轉基因基因座的轉基因構建體共表達。該實施方式中，Ig轉基因基因座和人Igoc和/或IgP轉基因都可存在於相同的轉基因表達載體或兩種不同的轉基因表達載體中。後者中，兩種轉基因表達載體可同時或按順序導入非人轉基因動物中。根據本發明，本文包括Igoc或IgP的人全長或只是胞外結構域的變體。這指允許遺傳密碼子簡併性的核酸序列，編碼包括功能性等效殘基的tt酸取代和/或增強胞外結構域的功能性的突變的多肽序列的核酸序列。"胞外結構域的功能性，，包括但不限於形成能夠進行信號轉導的BCR。對於允許遺傳密碼子簡併性，本發明包括與人Iga和人IgP的胞外多肽序列具有至少約70。/。、更通常約80-85%,優選至少約90。/。和最優選約95%序列同一性的序列。術語生物功能等效性是本領域充分知曉的且進一步在本文中詳細定義。因此，在胺基酸水平具有約70%至約80%;或更優選約81%至約卯％;或甚至更優選約91%至約99%同一性的序列，只要保留了蛋白質的生物活性，就被認為是與人Iga和Ig卩功能等效的。本文使用的術語功能等效的密碼子指編碼相同氛基酸的密碼子(例如精氨酸或絲氨酸的六種密碼子)，且也指編碼生物學等效的胺基酸的密碼子。下面是基於改變蛋白質的胺基酸以產生等效的，或者甚至是改良的第二代分子的討論。例如，蛋白質結構中的某些胺基酸可由其它胺基酸取代而不明顯喪失與諸如抗體的抗原結合區或底物分子的結合位點的結構的相互結合能力。由於正是蛋白質的相互作用能力和性質限定該蛋白質的生物功能性活性，可以在蛋白質序列及在其實質的DNA編碼序列中進行某些胺基酸取代，然而還產生具有類似特性的蛋白質。因此考慮可對基因的DNA序列進^f亍多種改變而不明顯喪失其生物學利用性或活性，如下所述。進行該改變時，也可考慮胺基酸的親水性指數(hydropathicindex)。胺基酸的親水性指數在賦予蛋白質相互作用的生物學功能中的重要性是本領域普遍知曉的(Kyte&Doolittle，1982)。胺基酸的相關親水特性對生成的蛋白質的二級結構起作用是可接受的，其反過來限定蛋白質與其它分子，例如酶、底物、受體、DNA、抗體、抗原等的相互作用。本領域還知曉可以基於親水性而有效地進行類似胺基酸的取代。引入本文作為參考的美國專利No.4,554，101說明了蛋白質的最大局部平均親水性(受其相鄰胺基酸的親水性所控制)與該蛋白質的生物特性相關。如在美國專利No.4,554,101中所詳述的將下面的親水值指定給胺基酸殘基精氨酸(+3.0);賴氨酸(+3.0);天冬氨酸(+3.0.+-.1);穀氨酸(+3.0.+-.1);絲氨酸(+0.3);天冬醯胺(+0.2);穀氨醯胺(+0.2);甘氨酸(0);蘇氨酸(-0.4);脯氨酸(-0.5.+-.1);丙氨酸(-0.5);組氨酸(-0.5);半胱氨酸(-1.0);甲硫氨酸(-1.3);纈氨酸(-1.5);亮氨酸(-1.8);異亮氨酸(-1.8);酪氨酸(-2.3);苯丙氨酸(-2.5);色氨酸(-3.4)。應理解胺基酸可以由具有相似親水值的另一種氛基酸所取代而仍舊產生生物學等效的及免疫學等效的蛋白質。此類改變中，優選親水值在+-.2之內，尤其優選在+-.1之內，甚至尤其更優選在+-.0.5之內的胺基酸的取代。如本文所概述，胺基酸取代通常基於胺基酸側鏈取代基的相對相似性，例如其疏水性、親水性、電荷、大小等。考慮多種前述特性的示例性取代是本領域技術人員所公知的且包括精氨酸和賴氨酸；穀氨酸和天冬氨酸；絲氨酸和蘇氨酸；穀氨醯胺和天冬醯胺；以及纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸。製備本發明多肽的另一個實施方式是使用肽模擬物。模擬物是模擬蛋白質二級結構組件的含肽分子(Johnson1993)。使用肽模擬物的基本原理在於存在的蛋白質的肽主鏈主要以促進分子相互作用(例如抗體和抗原的那些相互作用)的方式定向胺基酸側鏈。期望肽^t擬物允許類似於天然分子的相互作用。這些原理可與上面概述的原理聯合用於遺傳改造具有人Igoc或IgP的多種天然特徵且特性改變並改良的第二代分子。因此，多種編碼人Igoc或IgP以;5LAIgot或IgP的功能性等效多肽的核酸序列變體在本發明中是有用的。含有目的基因的轉基因載體可導入受體細胞然後通過隨機整合或靶向整合而整合到受體細胞的基因組中。對於隨機整合，可以通過標準轉基因技術將含有人Igoc或IgP的轉基因載體導入動物受體細胞中。例如，轉基因載體可以直接注射到受精卵母細胞的前核中。也可以在卵母細胞受精前通過轉基因栽體與精子共孵育而導入轉基因載體。可以由受精的卵母細胞發育轉基因動物。另一種導入轉基因載體的方法是通過轉染胚胎幹細胞並隨後將該經遺傳修飾的胚胎幹細胞注射到發育胚中。或者，可以將轉基因載體(棵露的或與促進試劑組合)直接注射到發育的胚中。最終，由該胚產生嵌合轉基因動物，其含有整合在該轉基因動物的至少一些體細胞基因組中的人(或人源化)Ig轉基因。具體實施方式中，含有人Iga或IgP的轉基因隨機整合到源自內源性Iga或IgP受損表達的動物品系的受體細胞(例如受精卵母細胞或發育胚)的基因組中。該動物品系的應用允許從人(或人源化)轉基因Ig基因座上優先表達免疫球蛋白分子。或者，具有人(或人源化)Iga和/或IgP轉基因的轉基因動物可以與內源性Iga和/或IgP受損表達的動物品系交配。可以獲得受損的lga和/或IgP;^A(或人源化)Iga和/或IgP的純合後代。或者，可使用反義技術、細胞內抗Iga和/或IgP表達等來抑制或降低內源性lga和/或Ige的表達。一個實施方式中，選擇用於敲除宿主動物Iga和/或IgP的內源性生產的方法是RNA幹擾(RNAi)法，其將雙鏈RNA(dsRNA)或更優選，短的或小幹擾RNA雙鏈(siRNA)導入具有胞內宿主動物Iga和/或IgP核酸序列的B細胞中。這可以^使用市售可得的試劑盒而實現，包括但不限於來自Invitrogen公司的BlockiTTM或StealthRNA試劑盒。對於耙向整合，可以將轉基因載體導入適合的動物受體細胞，例如胚胎幹細胞或已經分化的體細胞。此後，可以通過標準方法(參見例如，Kuroiwa等人，NatureGenetics,2004年6月6日)選擇通過同源重組而整合到動物基因組且代替了相應的內源基因的轉基因的細胞。經選擇的細胞然後可與去核的核轉移單元細胞(例如卵母細胞或胚胎千細胞)融合，其是全能的且能夠形成功能性新生兒。按照成熟的常規技術進行融合。也可以通過使用注射移液管的顯微手術進行卵母細胞的核去除及核轉移(參見例如，Wakayama等人，A^,"^f1998)394:369)。然後在適合的培養基中培養生成的卵細胞並將其轉移到同步化的受體中以用於產生轉基因動物。或者，可以將經選擇的遺傳修飾的細胞注射到發育的胚中，該胚隨後發育成嵌合動物。此外，才艮據本發明，可以通過下述方法製造能夠生產人(或人源化)Igoc和/或IgP的轉基因動物將本文上述的一或多種重組載體導入受體細胞，所述載體之一攜帶人Iga和/或IgP基因片段，該片段相連於與內源性Iga和/或IgP基因片段的側翼序列同源的5，和3'側翼序列，然後選擇通過同源重組使其內源性Igcc和/或Igp基因片段由人Igct和/或IgP基因片段代替的細胞，並從所選的遺傳修飾的受體細胞得到動物。與轉基因載體的靶向插入類似，適合在本方法中用作受體細胞的細胞包括胚胎幹細胞或已經分化的體細胞。可以通過諸如轉染的任何可行方法將攜帶人Igoc和/或Ig卩基因片段的重組載體導入該受體細胞。此後，可以利用標準方法選擇通過同源重組由人Igoc和/或IgP基因片段代替了相應的內源性Igoc和/或IgP基因片段的細胞。這些遺傳修飾的細胞可以在用於克隆轉基因動物的核轉移過程中用作核供體細胞。或者，可以將經選擇的遺傳修飾的胚胎幹細胞注射到發育胚中，該胚隨後發育成嵌合動物。具體實施方式中，可通過直接將轉基因注射到胚中或間接地將它們注射到受孕母體或產蛋母雞中而將本發明的轉基因構建體導入胚胎期的轉基因動物中。由任意前述方法生產的轉基因動物形成本發明另一個實施方式。該轉基因動物在其基因組中至少具有一個(即一或多個)人(或人源化)Igot和/或IgP基因，可以由該基因生產功能性人(或人源化)Iga和/或IgP蛋白質。此外，優選在針對於內源性Ig以及內源性Igoc和/或IgP敲除的任一或更優選兩者的敲除背景下，表達本發明的轉基因構建體，即人或人源化Igot和/或IgP轉基因和人源化免疫球蛋白轉基因。從而，本發明的轉基因動物能夠在具有充分地降低內源性Ig表達和更優選也充分地降低內源性Igot和/或IgP的背景下，重排人(或人源化)Ig基因座並有效表達功能性人(或人源化)抗體鐠。這一上下文中，"充分地"指僅僅是內源性Ig表達或還有內源性Iga和/或IgP表達的內源性生產的程度降低優選至少約30-49%，或更優選至少約50-79%,或甚至更優選至少約80-89%，或最優選約卯-100%。本發明提供表達一或多種人(或人源化)Ig基因座和人(或人源化)Iga和/或IgP的轉基因兔，其能夠使人(或人源化)Ig基因座進行重排和基因轉換，並且表達功能性人(或人源化)抗體譜。優選這些兔還不產生大量的功能性內源兔免疫球蛋白或功能性內源兔Igot和/或Igp。23本發明還提供其它表達一或多種人(或人源化)Ig基因座和人(或人源化)Iga和/或IgP的大型轉基因動物，包括但不限於鳥類、嚙齒類和家畜像牛、豬、綿羊、山羊、驢、馬等。而且優選，這些動物還不產生大量的功能性內源免疫球蛋白或功能性內源Iga和/或IgP。從而，這些轉基因動物能夠使人(或人源化)Ig基因座重排並以提高的產量有效表達功能性人(或人源化)抗體語。本發明還涉及分離自上述不同類型的轉基因動物的B細胞，其表i^A(或人源化)Igot和/或IgP基因和人(或人源化)免疫球蛋白基因座。此外，可以使用本領域熟練技術人員公知且使用的常規方法，包括但不限於使用病毒轉化等來使此類B細胞永生化。抗原免疫導致在所述轉基因動物中產生抗相同抗原的人(或人源化)抗體。儘管本發明的優選實施方式涉及具有人(或人源化)Ig基因座的轉基因動物，應理解具有靈長類動物源化的Ig基因座和靈長類動物源化的多克隆抗血清的轉基因動物也在本發明的精神內。與人(或人源化)多克隆抗血清組成類似，靈長類動物源化的多克隆抗血清組成可能在人類個體中具有降低的免疫原性。一旦製造了能夠產生多樣化的人(或人源化)免疫球蛋白分子的轉基因非人動物(如下進一步提出)，可以通過用抗原免疫該動物而容易地獲得抗該抗原的人(或人源化)免疫球蛋白和人(或人源化)抗體製劑。多種抗原可以用於免疫轉基因宿主動物。該抗原包括微生物，例如活的、減毒的或死的病毒和單細胞生物(例如細菌和真菌)、微生物片段，或分離自該微生物的抗原分子。用於免疫動物的優選細菌抗原包括來自金黃色葡萄球菌(5te/7/v/ocoa"sfl"m^)的純化的抗原，例如5型和8型莢膜多糖、毒力因子的重組型，例如a-毒素、粘附素結合蛋白、膠原結合蛋白和纖連蛋白結合蛋白。優選的細菌抗原還包括金黃色葡萄球菌、銅綠假單孢菌(i^w^歸wflsaerM^iascf)、腸球菌(enterococcus)、腸桿菌屬(enterobacter)和肺炎克雷伯氏菌(兀/^^/e〃"/mew附omW)的減毒型或來自這些細菌細胞的培養物上清液。可以用於免疫的其它細菌抗原包括來自銅綠假單孢菌、腸球菌、腸桿菌屬和肺炎克雷伯氏菌的純化的脂多糖(LPS)、莢膜抗原、莢膜多糖和/或外膜蛋白質的重組型、纖連蛋白連接蛋白，內毒素和外毒素。用於製備抗真菌抗體的優選抗原包括真菌的減毒型或其外膜蛋白質，該真菌包括但不限於白假絲酵母(Om力V/tffl仿/cfl附)、近平滑假絲酵母(CVm力Wfl/7"r"戸7。5^)、熱帶假絲酵母(Cfl"力V/fl加/7/c"fc)和新型隱球酵母(Oj/7tococc"51weo/or附朋s1)。用於免疫以產生抗病毒抗體的優選抗原包括病毒的^皮膜蛋白質和減毒型，該病毒包括但不限於呼吸道合胞病毒(RSV)(尤其是F-蛋白)，C型肝炎病毒(HCV)、B型肝炎病毒(HBV)、巨細胞病毒(CMV)、EBV和HSV。可以通過用分離的腫瘤細胞或胂瘤細胞系的腫瘤相關抗原免疫轉基因動物而產生用於治療癌症的治療性抗體，腫瘤相關抗原包括但不限於Her-2-neu抗原(其抗體用於治療乳腺癌)；CD19、CD20、CD22和CD53抗原(其抗體用於治療B細胞淋巴瘤)，(3)前列腺特異的膜抗原(PMSA)(其抗體用於治療前列腺癌)，和17-1A分子(其抗體用於治療結腸癌)。可以利用或不利用佐劑，通過任何便捷的方式將抗原施用於轉基因宿主動物，並且可以按照預定的安排將抗原施用於轉基因宿主動物。免疫後，可以將來自經免疫的轉基因動物的血清或乳液分級分離用於純化抗原特異的藥物級多克隆抗體。轉基因鳥類的情況下，也可以通過分級分離卵黃而製備抗體。可通過色譜(親和、離子交換、凝膠過濾等)，用諸如硫酸銨的鹽，諸如乙醇的有機溶劑或諸如聚乙二醇的聚合物選擇性沉澱來獲得濃縮的、純化的免疫球蛋白級分。經分級分離的人(或人源化)抗體可溶解或稀釋在適於人靜脈內給藥的無毒性、無致熱原的介質中，例如滅菌的緩衝生理鹽水。用於給藥的抗體製劑通常特徵為具有濃度為0.1至100mg/ml,更通常1至10mg/ml的免疫球蛋白。抗體製劑可含有多種同種型的免疫球蛋白。或者，抗體製劑可僅含有一種同種型的抗體，或若千經選擇的同種型的抗體。為了製造人(或人源化)單克隆抗體，從已排除其表達動物內源性免疫球蛋白的B細胞的已免疫轉基因動物中分離脾細胞。分離的脾細胞或者用於與轉化的細胞系進行細胞融合以生產雜交瘤，或通過標準分子生物學技術克隆編碼抗體的cDNA並在轉染的細胞中表達。製造多克隆抗體的方法在本領域是成熟的。參見例如，歐洲專利申請0583980Al("MethodForGeneratingMonoclonalAntibodiesFromRabbits，，)、美國專利No.4,977,081("StableRabbit-mouseHybridomasAndSecretionProductsThereof)、WO97/16537("StableChickenB-cellLineAndMethodofUseThereof")和EP0491057Bl("HybridomaWhichProducesAvianSpecificImmunoglobulinG，，)，其公開內容在此通過引用作為參考。Andris-Widhopf等人，"Methodsforthegenerationofchickenmonoclonalantibodyfragmentsbyphagedisplay"，//附附wwo/M^/rocfe242:/59(2000)和Burton,D.R.，"Phagedisplay"，/附/M"w他c/two/ogy/.,S7"995)描述了由克隆的cDNA分子體外生產單克隆抗體，其公開內容在此通過引用作為參考。多數情況下，抗體製劑由沒有(例如通過化學品或酶)修飾的免疫球蛋白組成，即由動物所製備的沒有額外修飾的人(或人源化)抗體組成。或者，可對免疫球蛋白級分進行處理，例如酶消化(例如用胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、纖溶酶、糖苷酶、核酶等)、加熱等和/或進一步分級分離以產生"抗體片段"。本發明還包括藥物組合物或抗體製劑，其包括由上面限定的方法所獲得的抗體或其片段。本文所用的術語"可藥用成分"或"製劑"旨在涵蓋包括特定量的所主張的活性成分，即人(或人源化)抗體或抗體片段，以及任何直接或間接由該特定量的特定活性成分的組合得到的產品。該術語旨在涵蓋包括該活性成分和組成載體的惰性成分的產品，以及直接或間接從任何兩種或更多種成分的組合、絡合或聚集得到的、或由一種或多種成分的分解得到的、或由一種或多種成分的反應或相互作用的其他類型得到的產品。因此，本發明的"藥物組合物"涵蓋由混合任何本發明的活性化合物和可藥用載體而製造的任何組合物。術語"給藥"和/或"給予"化合物應理解為指向需要治療的個體提供任何配方的任何本發明的活性化合物。用於給予本發明化合物的藥物組合物可方便地以劑量單位形式存在且可通過藥學領域公知的方法製備。適合使用的方法和載體是現有技術中充分描述的那些，且例如，見Remington,TheScienceandPracticeofPharmacy,Gennaro等人編，第20版(2000)，當然，免疫學領域的熟練技術人員將容易地理解其它方法是已知的且適於製備本發明的組合物。所有的方法包括使活性成分與組成一或多種輔助成分的載體組合的步驟。一般地，通過使活性成分均一，並立即與液體載體或細粉碎的固體載體或與兩者組合，然後(必要時)將該產品成型為期望的製劑而製備藥物組合物。該藥物組合物中包括上面討論過的，足以對疾病的病程或症狀產生期望效果的有效量的活性成分。此外，美國專利No.6，706,:289描述了用於控釋、緩釋抗體分子的配方，其方法在此通過引用作為參考。因此，轉基因構建體、包括該轉基因構建體的載體以及使用上面描述的方法產生的轉基因動物都是本發明的實施方式。通過下述實施例進一步說明本發明，但本發明並不局限於此。實施例l、用人Igoc和Ig0轉染兔B細胞係為了證明人Igot和IgP對人mlgM在兔B細胞中表達的影響，用編碼人Igot或IgP或人mlgM的表達載體轉染該細胞。將人Iga和人IgP和人IgM編碼基因克隆入表達載體中。用該表達載體轉染永生化的兔B細胞系並將該細胞在含有用於篩選穩定轉染體的新黴素的培養基中培養。使用對人IgM和人Igoc和/或Igfi特異的抗體，通過流式細胞術分析抗性細胞。編碼人IgM的表達載體對兔B27細胞的轉染導致人IgM的低細胞表面表達。人Iga和/或IgP的共轉染導致人mlgM的高細胞表面表達。這證明人Iga和/或IgP對於人(或人源化)的或嵌合mIgM的高細胞表面表達是必要且足夠的。實施例2、使用人Iga和IgP轉染源自任何動物的B細胞係為了證明人Igoc和IgP對源自動物的B細胞中人mlgM的表達的影響，用編碼人Iga或IgP或人mlgM的表達載體轉染源自雞(DT40)、牛和豬的B細^。用該表達載體轉染永生化的B細胞系並將該細胞在含有用於篩選穩定轉染體的新黴素的培養基中培養。使用對人IgM和人Iga和/或IgP特異的抗體，通過流式細胞術分析抗性細胞。編碼人IgM的表達載體對兔B細胞的轉染導致人IgM的低細胞表面表達。人Iga和/或IgP的共轉染導致人mlgM的高細胞表面表達。這證明人Iga和/或IgP對於人(或人源化)的或嵌合mlgM的高細胞表面表達是必要且足夠的。實施例3、表^v源化免疫球蛋白輕鏈和/或重鏈轉基因的轉基因兔，其同時表i^/vIgoc和/或IgP或不表達人Iga和/或IgP按Fan等人(屍fl幼o/.49:583-594，1999)所述產生轉基因兔。簡言之，使用標準方法使雌兔超排卵並與雄兔交配。從輸卵管收集前核期的受精卵並將其置於適當的培養基中，如補充了20%胎牛血清的Dulbecco氏磷酸緩沖鹽水。在一對操作手的輔助下，將外源DNA(例如含有人(或人源化)免疫球蛋白基因座或人Iga或人Igp的表達載體)微注射到前核中。將形態學上存活的受精卵轉移到假孕兔的輸卵管中。通過注射人絨毛膜促性腺激素(hCG)誘導假孕。約0.1-1%的經注射的受精卵發育成活的轉基因兔。通過PCR和FISH確認基因組中的轉基因整合。使用ELISA檢測法來測定轉基因建立者兔的血清中含人IgG和/或人k輕鏈抗原決定簇的抗體的存在。通過流式細胞術分析B細胞表面的抗體表達。具有編碼人(或人源化)免疫球蛋白重鏈基因座的轉基因兔表達l-10|ng/ml的人IgM。幼齡動物(6-9周)表達100-4000ng/ml的人IgM。然而，人IgG的表達迅速降至lO-lOOjig/ml的水平。對外周血中B細胞的流式細胞術分析顯示存在小量的人mlgM+細胞群(1-2%)。幼齡兔的闌尾中含有至多10。/。的人mlgM+細胞，而其隨著年齡迅速消失。編碼人Igoc和/或IgP的轉基因的導入導致血清中表達100-2000pg/ml的人(或人源化)IgM且穩定表達2000-12000pg/ml的人(或人源化)IgG。闌尾30-70%的淋巴細胞是人(或人源化)mlgM+。外周血中，相等量的B細胞表達兔和人(或人源化)mlgM或mlgG。本^Hf通篇引用的所有參考文獻以及其中引用的所有文獻在此明確地通過引用作為參考。雖然通過參考某些實施方式來說明本發明，但其並不限於此。本領域技術人員將理解可輕易得到並進行多種修改而本質上不改變本發明的工作方式。本文主張的發明範圍特別旨在包括所有這些修改。權利要求1.一種編碼BCR的嵌合Igα亞基的轉基因構建體，所述嵌合Igα亞基包括(a)非人Igα多肽序列的胞內結構域序列和跨膜結構域序列；以及(b)與SEQIDNO.1的人Igα的胞外結構域具有至少85％序列同一性的多肽。2.—種編碼BCR的嵌合IgP亞基的轉基因構建體，所述嵌合IgP亞基包括(a)非人IgP亞基的胞內結構域序列和跨膜結構域序列；以及(b)與SEQIDNO.:7的人IgP的胞外結構域具有至少85%序列同一性的多肽。3.權利要求1的轉基因構建體，其中所述非人Igot多肽序列包括牛(SEQIDNO:2);鼠類(SEQIDNO:3);犬(SEQIDNO:4);靈長類(SEQIDNO:5);兔(SEQIDNO:6)或其它非人序列。4.權利要求2的轉基因構建體，其中所述非人IgP多肽序列包括犬(SEQIDNO:8);大鼠(SEQIDNO:9);牛(SEQIDNO:10);鼠類(SEQIDNO:11);雞(SEQIDNO:12)或其它非人序列。5.—種非人轉基因動物，包括(a)編碼SEQIDNO.:1的全長人Iga亞基，或權利要求1的嵌合Iga亞基的轉基因構建體；和/或(b)編碼SEQIDNO.:7的全長人IgP亞基，或權利要求2的嵌合IgP亞基的轉基因構建體；和(c)編碼人或人源化免疫球蛋白基因座的轉基因構建體；其中生成的轉基因產物組合以形成人或人源化B細胞受體複合物。6.權利要求5的非人轉基因動物，其中充分地降低非人轉基因動物的任何內源性Ig產物和/或Iga和/或IgP亞基的表達。7.權利要求5的非人轉基因動物，其中所述動物選自兔、小鼠、大鼠、豬、綿羊、山羊、鳥類、馬、驢和牛。8.權利要求5的非人轉基因動物，其是兔。9.來自權利要求5的非人轉基因動物的分離的人或人源化免疫球蛋白，其中所述人或人源化免疫球蛋白是抗體或抗體片段。10.權利要求9的分離的人或人源化免疫球蛋白，其中所述抗體是多克隆或單克隆抗體。11.權利要求9的分離的人或人源化免疫球蛋白，其中所述抗體片段是多克隆抗體或單克隆抗體的片段。12.權利要求9的分離的人或人源化免疫球蛋白，其中所述抗體或抗體片段^皮標記。13.權利要求9的分離的人或人源化免疫球蛋白，其中所述抗體或抗體片段與毒素融合以形成免疫毒素，或者與治療劑偶聯。14.權利要求9的分離的人或人源化免疫球蛋白，其中所述抗體或抗體片段與異源M^列融合。15.權利要求ll的分離的人或人源化免疫球蛋白，其中所述抗體片段是Fc、Fv、Fab、Fab'或F(ab，)2片段。16.來自權利要求5的所述非人轉基因動物的分離的B細胞，其中所述B細胞表達天然的人Iga亞基或嵌合Iga亞基和/或表達天然的人IgP亞基或嵌合IgP亞基，以M達人或人源化免疫球蛋白基因座。17.權利要求16的分離的B細胞，其中所述B細胞是永生化的。18.權利要求16或17的分離的B細胞，其中所述B細胞源自兔。19.包含權利要求9的抗體或抗體片段的抗體製劑。20.包含與可藥用成分混合的權利要求19的抗體製劑的藥物組合物。21.權利要求20的藥物組合物，包含單克隆抗體或其片段。22.權利要求20的藥物組合物，包含一或多種多克隆抗體或其片段。23.—種在非人動物中生產人或人源化抗體的方法，包括(a)將編碼天然的人Iga亞基或嵌合Iga亞基的轉基因構建體和/或編碼天然的人IgP亞基或嵌合IgP亞基的轉基因構建體導入所述非人動物中並在其中表達；和(b)將編碼人或人源化免疫球蛋白基因座的轉基因構建體導入所述非人動物中並在其中表達；(c)使所述動物接受抗原刺激；和(d)從所述動物中分離人或人源化抗體。24.權利要求23的生產人或人源化抗體的方法，其中所述抗體是多克隆或單克隆抗體。25.權利要求23的生產人或人源化抗體的方法，其中所述抗體片段是多克隆或單克隆抗體的片段。26.權利要求23的生產人或人源化抗體的方法，其中所述抗體或抗體片段淨皮標記。27.權利要求23的生產人或人源化抗體的方法，其中所述抗體或抗體片段與毒素融合以形成免疫毒素，或者與治療劑偶聯。28.權利要求23的生產人或人源化抗體的方法，其中所述抗體或抗體片段與異源的M酸序列融合。29.—種生產表itA或人源化抗體的非人動物的方法，包括(a)將編碼天然的人Iga亞基或嵌合Iga亞基的轉基因構建體和/或編碼天然的人IgP亞基或嵌合IgP亞基的轉基因構建體導入所述非人動物的B細胞中並在其中表達；和(b)將編碼人或人源化免疫球蛋白基因座的轉基因構建體導入所述非人動物並在其中表達；其中，生成的轉基因產物組合以形成人或人源化B細胞受體複合物。30.權利要求27的生產表達人或人源化抗體的非人動物的方法，其中所述動物通過基因轉換和/或體細胞高變而產生抗體多樣性。31.權利要求27的生產表達人或人源化抗體的非人動物的方法，其中所述動物是兔。全文摘要本發明描述了具有人(或人源化)免疫球蛋白基因座和編碼人(或人源化)Igα和/或Igβ序列的轉基因的轉基因動物。尤其是具有轉基因重鏈和輕鏈免疫球蛋白基因座的能夠產生多樣化的人(或人源化)抗體譜的動物，其Ig和/或內源性Igα和/或Igβ序列的內源性生產受到抑制。同時表達人(或人源化)免疫球蛋白和人(或人源化)Igα和/或Igβ使得正常B細胞發育、人(或人源化)抗體親和力成熟以及高效表達。文檔編號C07K14/705GK101506235SQ200780031747公開日2009年8月12日申請日期2007年8月29日優先權日2006年9月1日發明者R·比洛申請人:人類多細胞株治療學公司