抗原致敏的人gm－csf基因修飾的人樹突狀細胞、其製法和用途的製作方法

2023-05-20 14:33:56 1

專利名稱：抗原致敏的人gm－csf基因修飾的人樹突狀細胞、其製法和用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及一類通過粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF)基因修飾後免疫激發功能增強的樹突狀細胞(dendritic cells，DC)、及其製備方法，還涉及該基因修飾的DC在多種腫瘤和肝炎等感染性疾病治療中的應用。
從分子生物學角度，基因治療可被理解為將正常有功能的基因置換或增補缺陷基因的方法，從更廣義的疾病治療角度，可以認為凡是將新的遺傳物質轉移到某個體內使其獲得治療效果的方法均屬基因治療。近年來，隨著分子生物學、免疫學等相關學科的發展和交叉滲透，該方面研究取得了重大進展，已為廣大學者所接受並已從實驗研究及基礎研究過渡到臨床試用階段。目前世界上已有數百項基因治療臨床研究項目正在試驗中，可以預見基因治療作為一種全新的疾病治療手段，將一定程度地改變人類疾病治療的歷史進程。
基因治療可分為兩種方式，一種為基因矯正和置換，即將基因的異常序列進行校正和精確的原位修復，例如通過同源重組可以用正常基因置換缺陷的基因，目前這種方式尚無突破性進展；另一種方式是基因添加和增補，即不去除異常基因，而是通過具有治療意義的外源基因作定點的整合，使其表達正常產物以補償缺陷基因的功能，目前絕大多數基因治療屬於此種。
基因治療的策略主要包括in vivo(直接體內法)和ex vivo(可理解為離體法)。目前研究最多的是ex vivo，即先在體外將外源基因導入載體細胞，然後將基因轉染後的細胞回輸給受者，使攜有外源基因的載體細胞在體內表達治療產物以達到治療目的。在體外可將外源基因導入載體細胞的方法有很多，目前應用較為廣泛的重組腺病毒載體具有其它載體如逆轉錄病毒等所不具備的優點。腺病毒為一DNA雙鏈無包膜病毒，基因組為36Kb，基因背景比較清楚。腺病毒已在美國應用多年，證實對人類是無害的。腺病毒載體有較大的宿主範圍，可以感染非分裂細胞，在invivo的基因轉移上有很大的優勢，同時由於腺病毒感染細胞時其DNA不整合到宿主染色體中，因此沒有潛在的致癌危險。腺病毒載體的構建一般採用同源重組，E1區及E3區可被外源基因取代，從而使外源基因的插入可達7.5Kb。由於E1區是病毒複製所必需的，E1缺陷型病毒載體只能在輔助細胞中複製，目前腫瘤基因治療中所應用的腺病毒載體一般缺失整個E1a和部分E1b基因，必須由293細胞提供E1蛋白，複製出具有感染能力的病毒，這些重組病毒可在許多細胞中表達外源基因，卻不能在E1-的細胞中複製。in vivo即將外源性基因直接導入受者體內有關的器官組織或細胞內以達到治療目的，這是一種簡便易行的方法，如肌肉注射、靜脈注射、器官內灌輸、皮下包埋等，但是基因轉染率太低，近年來隨著腺病毒等基因治療載體的改進和發展，此方面進展較大，直接將攜帶外源基因的腺病毒注射至宿主治療腫瘤的方法引起較為廣泛的關注。
目前基因治療的範圍已從過去罕見的單基因疾病擴大至常見的單基因疾病和多基因疾病，已從治療遺傳性疾病擴展至治療惡性腫瘤、心血管疾病、神經系統疾病、自身免疫性疾病(如關節炎等)、感染性疾病(如愛滋病、肝炎等)。由於腫瘤患者的種類和數量眾多，缺乏有效的治療手段，預後差，其對於基因治療這類新型治療方法的臨床迫切性較強，患者和家屬易於接受，倫理學問題較少，故腫瘤基因治療的研究最為熱門，且最受矚目，目前大多數基因治療臨床項目是腫瘤的基因治療，且部分臨床項目取得了肯定的療效。
腫瘤基因治療研究項目被正式批准試用於臨床，表明其已經過大量基礎性研究，在理論上和技術方面已相當成熟，也有巨大的社會效益和經濟效益。目前國際上有百餘項腫瘤基因治療臨床項目大致可分為免疫基因治療(Immuno-genetherapy)、藥物抵抗(主要是MDR)、藥物敏感(自殺基因療法)、腫瘤抑制基因、基因標記研究等。其中，免疫基因治療佔絕大多數，而腫瘤的免疫基因治療的研究又多集中於細胞因子基因治療(cytokine gene therapy)研究。雖然隨著生物高技術的發展，人們已經製備純化出了多種可供臨床大量應用的基因工程細胞因子，但是大量的臨床試用資料表明，需要給腫瘤患者反覆多次注射高劑量細胞因子方能取得一定療效且患者往往表現出嚴重的副作用。細胞因子基因治療在一定程度上克服了以往細胞因子注射療法需反覆多次應用、副作用嚴重等缺點，也取得了細胞因子注射療法所不具備的療效。
在眾多細胞因子，粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte-macrophagecolony-stimulating factor，GM-CSF)GM-CSF是一個具有多項潛能的造血生長因子，不僅能夠促進造血前體細胞的增殖、分化和成熟，而且對其他的細胞，如抗原遞呈細胞(APC)、成纖維細胞、角質細胞、皮膚黏膜細胞等，均有著不同程度的刺激作用。由於GM-CSF對骨髓抑制的修復作用，目前在臨床上的用途主要是用於治療惡性腫瘤因放、化療所致的白細胞減少症，GM-CSF在升高白細胞方面的作用已經比較肯定。
近年來有許多研究報導表明，GM-CSF在抗病毒、抗真菌感染等的治療中也有著良好的療效。目前，真菌感染已成為腫瘤患者的主要死亡原因之一，近些年來的屍體解剖結果表明，腫瘤患者真菌感染的發生率逐年增高，主要是因為腫瘤患者強烈化療導致嚴重骨髓抑制，以及免疫機能的下降等(Clin Infect Dis，1994，1825，Eur J Clin Microbiol Infect Dis，1997，1656)。另外，廣譜抗生素、糖皮質激素的長期應用，靜脈輸液裝置的採用等也有助於病菌的入侵而發生感染。有文獻報導，對於持續發熱並伴有白細胞低下的患者，經抗生素治療1周後，系統性真菌感染的發生率約為33％，而對於骨髓移植患者，侵入性真菌感染的發生率也高達15％～30％(J Infect Dis，1990，161381，Clin Infect Dis，1994，18273)。這些現象已經明確地顯示，真菌感染對惡性腫瘤患者的預後產生了嚴重的影響。現在臨床上常用的抗真菌製劑主要有兩性黴素、制黴菌素、克黴唑、氟康唑、酮康唑等，這些藥物都有著一定的抗真菌作用，但是它們同時均有著一個嚴重的副反應——骨髓抑制，以致許多患者不得不終止治療。
GM-CSF是一種具有多項潛能的造血生長因子，它不僅能夠促進造血前體細胞的增殖、分化和成熟，恢復因腫瘤化療所致的骨髓抑制，而且對機體免疫機能的調節也起著一定的作用。鑑於此，GM-CSF在治療真菌感染中能夠發揮良好的作用。Peter等對145例進行自體幹細胞移植患者的真菌感染情況進行了回顧性分析，發現採用rhGM-CSF治療的70例患者中有2例存在真菌感染，發生率為2.9％；而在對照組，75例患者中有9例發生真菌感染，發生率為12％，兩者之間存在明顯差異。另外，還發現有10例死亡患者，其中5例的死亡原因是真菌感染，且這5例中有4例是未用rhGM-CSF治療的(Bone Marrow Transplant，1996，1893)。
對慢性肝炎的治療仍以「幹擾素」為首選藥物，其作用機理是除直接抑制病毒複製外，還直接或間接地作用於細胞因子網絡，調節宿主的免疫反應，從而減輕肝臟損傷的程度，防止疾病的進一步發展。但是，近些年的許多研究和觀察表明，幹擾素對病毒性肝炎的治療效果不甚理想，尤其在治療過程中產生的骨髓抑制等副作用，使得治療不得不停止，因此尋找新的、更有效的藥物已是勢在必行。GM-CSF作為免疫調節劑可以增強抗病毒藥物的療效以及增強宿主對肝炎疫苗的應答反應。1993年Martin等他們對9例HBeAg和HBV DNA均陽性的慢性B型肝炎患者給予GM-CSF治療，結果表明，GM-CSF能夠使患者血清HBV DNA水平顯著地下降，有4例患者的血清HBV DNA和HBeAg完全消失，且其中有2例出現抗HBe抗體。隨著GM-CSF治療時間的延長，升高的轉氨酶也會逐漸恢復正常水平若在治療慢性B型肝炎時聯合應用GM-CSF與幹擾素(IFN)，則HBVDNA水平的下降將更為明顯，說明GM-CSF與IFN對殺滅B肝病毒有協同作用(Hepatology，1993，18775)。Philip等將108名健康志願者隨機分為兩組實驗組81例，給予GM-CSF；對照組27例，採用安慰劑。結果顯示，實驗組有11例出現對B肝病毒的保護性抗體(抗HBs)，滴度為10mIU/ml；而對照組無1例產生這種抗體，兩者之間存在明顯差異。表明，GM-CSF能夠促進慢性B肝患者產生保護性抗體(抗HBs)。以上研究說明，GM-CSF在真菌、病毒等感染的治療中具有良好的應用前景(Vaccine，1996，141199)。
GM-CSF基因治療腫瘤的研究和應用也非常引人注目。研究表明，GM-CSF基因修飾的瘤苗能比其它細胞因子基因修飾的瘤苗在體內更有效地誘導出抗腫瘤免疫反應，其原因之一是瘤苗免疫部位浸潤了較多數量的抗原提呈細胞(antigen-presenting cells，APC)，尤其是樹突狀細胞(dendnritic cells，DC)。Dranoff等比較了絕大多數細胞因子基因轉染瘤苗的治療效果，發現GM-CSF基因轉染的瘤苗治療效果最佳，並由此提出將GM-CSF基因轉染瘤苗用於臨床試治晚期患者。Ogawa等(2000)通過腺病毒載體的介導，將鼠GM-CSF基因轉移至鼠胰腺癌細胞HPD1NR，將此細胞經X線照射和製備成瘤苗後發現，此類瘤苗在體內誘導機體產生了較強的抗腫瘤免疫反應，預先接種此類瘤苗的動物模型對未轉染GM-CSF基因的腫瘤細胞產生了抵抗作用(J Hepatobiliary Pancreat Surg，2000；7306)。Dunussi-Joannopoulos等(1997)也曾發現，GM-CSF基因修飾的白血病細胞製備的瘤苗對於荷瘤小鼠也有一定的治療作用。此外，有學者發現，將GM-CSF基因轉入造血幹細胞中可以促進放化療後造血損害的恢復(J Pediatr Hematol Oncol，1997；19536)。
目前，也有部分GM-CSF基因治療項目已應用於臨床治療晚期腫瘤患者，如Mastrangelo等(1999)將攜帶人GM-CSF基因的重組腺病毒載體直接瘤體內注射治療了6例黑色素瘤患者，其中3例出現了治療反應，瘤體縮小，轉移減弱。表明該療法具有一定的治療作用(Cancer Gene Ther，1999；6409)。國外已將GM-CSF基因療法試用於臨床治療包括前列腺癌、胰腺癌、黑色素瘤及肉瘤等多種腫瘤患者，正在對其療效作長期觀察。
同理，基因療法也可應用於感染性疾病的預防和治療，其原理是通過理化或生物學的方法，把目的基因導入機體的適當靶細胞內，間接或直接抑制病原微生物的複製，或是提高機體的免疫功能，以期治療和預防感染。如部分治療HIV、HBV感染的基因治療方案已經進入到臨床I期試驗。
依據將細胞因子及其受體基因導入體內的途徑和原理不同，可將細胞因子基因治療分為多種類型，包括免疫效應細胞介導的細胞因子基因治療、成纖維細胞等載體細胞介導的細胞因子基因治療、以抗原提呈細胞為基礎的細胞因子基因治療等。其中，被認為很有希望的是以抗原提呈細胞(主要為樹突狀細胞)為基礎的細胞因子基因治療的研究。
樹突狀細胞相關的腫瘤及感染性疾病治療方法的研製和應用樹突狀細胞(dendritic cells，DC)是已知的機體內功能最強的抗原提呈細胞(antigen-presenting cells，APC)，是目前發現的唯一一種能直接激活初始型T細胞的APC。DC在激活、啟動機體免疫應答尤其是細胞免疫應答反應中起著十分重要的作用。作為腫瘤細胞(或病原微生物感染細胞)與特異性免疫效應細胞之間的「橋梁」，DC所具有的處理、加工和提呈抗原的功能在抗原誘導宿主免疫反應，尤其是T細胞介導的抗腫瘤或抗感染免疫功能的過程中所發揮的作用極為重要。近年來，隨著對DC研究的不斷深入，尤其是DC大量擴增技術的建立，以DC為基礎的特異性免疫治療和基因治療的研究成為相當熱門的研究課題，並顯示出良好的基礎研究及臨床應用前景，有望為腫瘤或感染性疾病的治療提供新的途徑。
近年來，在該方面最引人囑目的研究工作是應用抗原或抗原多肽在體外衝擊致敏(pulsing)DC，然後將之回輸或免疫接種至荷瘤或感染宿主，進行免疫治療，已證明該療法能顯著地誘導機體產生抗原特異性CTL，產生保護性免疫反應並能治療荷瘤或感染宿主。但其療效有待提高。
目前，應用各種形式的腫瘤抗原(腫瘤細胞、亞細胞組分、重組抗原蛋白、重組腫瘤抗原多肽)，在體外致敏DC，然後將載有腫瘤抗原的DC作為新型瘤苗體內接種或回輸治療腫瘤的方法經過臨床I/II期試驗，已證明療效確切，且在臨床上尚未觀察到患者發生自身免疫性疾病等毒副作用。
許多感染的發生與持續是由於DC數量和功能的缺失，無法誘導初次免疫應答及激活特異性的CTL，同時也可能導致記憶性T、B細胞的缺失，使機體無法對病原產生再次免疫應答。因此，在體外擴增DC後採用抗原觸發，然後回輸體內，可以誘導機體對病原特異性的免疫。Ludewig等採用淋巴細胞脈絡叢腦膜炎病毒(LCMV)特異性肽GP33-41衝擊DC誘導LCMV特異性的抗病毒免疫，結果在接種抗原衝擊多肽的第二天，小鼠就獲得了對LCMV感染的完全保護，免疫後4天體外可以檢測到特異性的細胞毒活性，60天後，小鼠仍然可以抵抗LCMV的感染，表明採用抗原衝擊DC誘導特異性的抗病毒免疫有效、快速、持久，是一種有效的主動性抗病毒免疫治療方法(J Virol，1998，723812)。Kundu等採用HLA相似的同種異體DC，用HIV-1的gp160或Env、gag、pol的合成肽衝擊DC後，注入AIDS患者體內6-9次，結果表明，部分患者體內env特異性的CTL數量明顯增加，淋巴細胞增殖反應增強，IFN-γ和IL-2的產量也增加(AIDS Res Hum Retroviruses，1998，14551)。
雖然，人們在與腫瘤作鬥爭的過程中已取得了不少進步，然而目前現有的治療方法和治療劑仍不能滿足高效、副作用小等需要。因此，本領域迫切需要開發新的治療劑和治療方法。
本發明的目的就是提供一類通過粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)基因修飾後免疫激發功能增強的樹突狀細胞(dendritic cells，DC)，這類樹突狀細胞可用於治療腫瘤或感染時，不僅高效，而且副作用小。
本發明的另一目的是提供所述的基因修飾的樹突狀細胞的製備方法，還涉及該基因修飾的DC在多種腫瘤和肝炎等感染性疾病治療中的應用。
在本發明的第一方面，提供了一種樹突狀細胞，它被攜帶GM-CSF基因的腺病毒修飾過，從而表達GM-CSF。
較佳地，所述的腺病毒的基因組缺失E1區和E3區，並且在E1區位置插入了人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子表達盒，該表達盒依次包括啟動子序列，人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子編碼序列和聚腺苷酸化信號序列；而且，在腺病毒表面結合有雙特異性抗體，該抗體既特異性地針對腺病毒表面的結合位點，又特異性地針對樹突狀細胞表面的受體分子。
更佳地，所述腺病毒為Ad5型腺病毒；且所述的受體分子選自下組CD1a、CD40、CD44、CD54、CD80、CD83、CD86、MHC分子。
在一實施例中，所述的腺病毒是重組5型腺病毒Ad.GM-CSF-DC，CCTCC
在本發明的第二方面，提供了一種藥物組合物，它包括有效量的樹突狀細胞和藥學上可接受的載體或賦形劑，所述的樹突狀細胞被攜帶GM-CSF基因的腺病毒修飾過，從而表達GM-CSF。
在本發明的第三方面，提供了一種製備GM-CSF修飾的樹突狀細胞的方法，它包括步驟(a)用重組腺病毒轉染樹突狀細胞，所述的腺病毒的基因組缺失E1區和E3區，並且在E1區位置插入了人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子表達盒，該表達盒依次包括啟動子序列，人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子編碼序列和聚腺苷酸化信號序列，而且，在腺病毒表面結合有雙特異性抗體，該抗體既特異性地針對腺病毒表面的結合位點，又特異性地針對樹突狀細胞表面的受體分子；(b)分離出表達GM-CSF的樹突狀細胞。
在附圖中，

圖1是本發明用腺病毒Ad.GM-CSF/CD40轉染後，在用抗原衝擊致敏之前的樹突狀細胞的電鏡照片；圖2是本發明用腺病毒Ad.GM-CSF/CD40轉染後，在用抗原衝擊致敏之前的樹突狀細胞的流式細胞儀分析的表型分析結果。
圖3是本發明用腺病毒Ad.GM-CSF/CD40轉染後，在用抗原衝擊致敏之前的樹突狀細胞的混合淋巴細胞反應曲線圖。
圖4是本發明用腺病毒Ad.GM-CSF/CD40轉染後，並用抗原衝擊致敏之後的樹突狀細胞的電鏡照片；圖5是本發明用腺病毒Ad.GM-CSF/CD40轉染後，並用抗原衝擊致敏之後的樹突狀細胞的流式細胞儀分析的表型分析結果。
圖6是本發明用腺病毒Ad.GM-CSF/CD40轉染後，並用抗原衝擊致敏之後的樹突狀細胞的混合淋巴細胞反應曲線圖。
進一步提高DC治療腫瘤或感染的效果以最大程度地滿足臨床的要求是目前該方面研究的熱門課題，以DC為基礎的腫瘤或感染性疾病的基因治療被人們寄予厚望。該方面研究的主要策略是將能增強DC功能的細胞因子基因導入DC中以提高其抗原提呈的效率和激活T細胞免疫應答的能力，從而取得更好的疾病治療效果。
在眾多的細胞因子中，對DC功能影響最大的當屬GM-CSF。以往曾發現GM-CSF基因修飾的瘤苗能比其它細胞因子基因修飾的瘤苗在體內更有效地誘導出抗腫瘤免疫反應，研究表明，其原因之一就是瘤苗免疫部位浸潤了較多數量的DC。而且GM-CSF不僅是DC維持生存所必需，還對DC的功能具有極為重要的影響。義大利Colombo小組(1999)用GM-CSF和CD40L基因共同修飾C26小鼠結腸腺癌細胞，發現其腫瘤接種部位內浸潤有大量DC並存在大量腫瘤細胞凋亡小體，將腫瘤浸潤性DC分離純化後研究表明，其能誘導出針對C-26抗原AH-1和KSP的特異性細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)，由此提出腫瘤局部浸潤的DC可通過攝取腫瘤凋亡小體，在局部成熟並將抗原提呈給T細胞(JExp Med 1999；190125)。曹雪濤等研究表明，GM-CSF基因修飾的脾臟DC的抗原提呈能力增強，體內應用後可誘導更顯著的抗腫瘤免疫反應(Science in China，1997；40(5)539-545)。Curiel-Lewandrowski等(1999)觀察了小鼠骨髓來源的非成熟鼠DC經GM-CSF體外基因修飾後，其體內外的分化發育、遷移能力及抗原提呈能力，發現體內應用後能顯著地誘導出抗原的初次免疫應答，此效果與其遷移能力增強有關(J Immunol，1999；163174-83)。
同理，病原微生物抗原觸發的GM-CSF基因修飾DC在體內也必然能誘導機體產生更強的抗感染免疫。
本發明人研究發現，用各種抗原衝擊致敏後的GM-CSF基因修飾DC，可以獲得出乎意料的高抗腫瘤效果，尤其是用改進過的腺病毒轉染DC使其被GM-CSF修飾後，進一步提高了治療的針對性和效率。在此基礎上，完成了本發明。
在本發明中，術語「粒細胞巨噬細胞集落刺激因子編碼序列(GM-CSF)」指天然存在的或人工合成的GM-CSF編碼序列，該編碼序列可以編碼天然形式的GM-CSF，也可以編碼各種變異形式的GM-CSF(例如GM-CSF的保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導突變體，或其活性片段)，只要該變異形式的GM-CSF具有GM-CSF的生物活性。
在本發明中，術語「粒細胞巨噬細胞集落刺激因子表達盒」指含有GM-CSF編碼序列以及表達所需元件的序列組件，表達所需的組件包括啟動子和聚腺苷酸化信號序列。此外，粒細胞巨噬細胞集落刺激因子表達盒還可以含有或不含有其他序列，其中包括但並不限於增強子、分泌信號肽序列等。較佳地，在粒細胞巨噬細胞集落刺激因子表達盒含有雙拷貝或多拷貝的GM-CSF編碼序列。一種實現雙拷貝表達的方法是利用IRES序列將GM-CSF的cDNA進行串聯融合，從而實現雙拷貝表達。
在本發明中，術語「細胞表面受體分子」指在哺乳動物細胞(尤其是樹突狀細胞)的細胞表面上，可用作抗體結合位點的分子。代表性的例子包括各種CD分子，例如CD1a、CD40、CD44、CD54、CD80、CD83、CD86、MHC分子等。CD40是一種主要表達於樹突狀細胞、B細胞、單核細胞等細胞表面的膜分子，在其對應的配體分子CD40L左右下，介導細胞活化信號。
在本發明中，對於樹突狀細胞的來源沒有特別限制，例如所述的樹突狀細胞包括(但並不限於)下列細胞外周血單核細胞培養的DC、骨髓來源的DC、臍帶血來源的DC。
在本發明中，可以適用於人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子表達盒的啟動子可以是任何一種常見的啟動子，它可以是組成型啟動子或誘導型啟動子。較佳地，該啟動子是組成型的強啟動子，例如巨細胞病毒啟動子、牛乳頭瘤病毒啟動子等其它適用於真核表達的啟動子。
在本發明中，用GM-CSF基因修飾DC的方法包括腺病毒載體、腺相關病毒載體(AAV)、痘苗病毒載體、逆轉錄病毒載體、脂質體、電穿孔等介導的GM-CSF基因轉移。較佳地，是用腺病毒載體介導的GM-CSF基因轉移。
在本發明中，可供使用重組腺病毒可以是任何一種血清型的腺病毒，較佳地，為了防止在製備過程產生親本的複製型腺病毒，宜採用E1區缺失型腺病毒。更佳地，使用E1區和E3區都缺失的腺病毒。此外，宜採用已研究得較為透徹的腺病毒類型，例如Ad2和Ad5型腺病毒。
在獲得了GM-CSF修飾的DC之後，用各種不同抗原來致敏DC，其中包括抗原蛋白、抗原多肽、細胞或細菌裂解物、放射性照射的細胞或細菌、抗原RNA、抗原cDNA等。更具體地，樹突狀細胞可被選自下組的抗原衝擊致敏(a)食管癌、胃癌、大腸癌、胰腺癌、肝癌、肺癌、黑色素瘤、腎癌、膀胱癌、前列腺癌、白血病、淋巴瘤、腦膠質瘤的細胞、或細胞組份；(b)B肝抗原、瘧原蟲抗原、結核桿菌蛋白抗原、真菌抗原。
在本發明中，針對DC表面分子的靶向性基因轉染，可以利用DC表達的各種表面分子如CD1a、CD40、CD44、CD54、CD80、CD83、CD86、MHC分子等而實現。即利用雙特異性抗體，該抗體既特異性地針對腺病毒表面的結合位點，又特異性地針對樹突狀細胞表面的受體分子(例如CD1a、CD40、CD44、CD54、CD80、CD83、CD86、MHC分子)，從而使腺病毒靶向性地與樹突狀細胞結合，從而實現靶向性基因轉染。
在本發明的一個實施例中，構建了一種高效的樹突狀細胞CD40靶向性的表達人粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子的雙拷貝型重組腺病毒(AdGM-CSF/CD40)，其依據是DC高表達CD40，故CD40可作為DC基因導入的靶分子，通過改造重組腺病毒衣殼蛋白，使之具有與CD40分子結合的特點，構建成高效靶向性DC基因轉染的重組腺病毒載體AdGM-CSF/CD40，AdGM-CSF/CD40能比常規製備的GM-CSF重組腺病毒更有效地將GM-CSF基因導入DC，使基因修飾的DC更有效地表達分泌GM-CSF。並且，將GM-CSF基因修飾的DC經不同抗原觸發致敏後免疫機體，以打破機體對該種抗原的免疫耐受。
在本發明中，將GM-CSF基因修飾的DC經腫瘤抗原觸發致敏後，可用於治療各種惡性腫瘤，其中包括(但並不限於)食管癌、胃癌、大腸癌、胰腺癌、肝癌、肺癌、黑色素瘤、腎癌、膀胱癌、前列腺癌、白血病、淋巴瘤、腦膠質瘤等。
將GM-CSF基因修飾的DC經病原微生物抗原觸發致敏後用於治療和預防多種感染性疾病。例如，經HBsAg觸發後治療或預防B肝、經瘧原蟲抗原觸發後治療或預防瘧疾、經結核桿菌蛋白觸發後治療或預防結核、真菌抗原觸發後治療真菌感染等。
本發明的優點在於(1)構建了一種高效的樹突狀細胞CD40靶向性的表達人粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子的雙拷貝型重組腺病毒(AdGM-CSF/CD40)。AdGM-CSF/CD40能比常規製備的GM-CSF重組腺病毒更有效地將GM-CSF基因導入DC，使基因修飾的DC更有效地表達分泌GM-CSF。在應用其它攜帶人GM-CSF基因的載體轉染GM-CSF基因至人DC時發現，其轉染效率很難達到50％，這大大地影響了GM-CSF基因修飾DC在腫瘤及感染性疾病治療中的應用。
(2)已知CD40抗體與CD40的結合是對DC的有效活化，因此，通過AdGM-CSF/CD40將GM-CSF基因導入DC的同時，DC獲得了多重功能增強因素的刺激，可使DC的功能得到明顯的增強。
(3)已知GM-CSF是影響DC分化發育的重要因子，可維持DC的存活、促進DC表達對其抗原提呈功能具有影響的表面分子的表達、增強其刺激T淋巴細胞增殖的能力，因此，DC高表達的GM-CSF對於其抗原提呈功能具有明顯的增強作用。
(4)GM-CSF是一種具有多種免疫調節作用的細胞因子，能增強抗病毒藥物的治療效果，增強宿主對肝炎疫苗的應答反應，還能增強宿主的免疫功能，因此，目前已用於病毒性肝炎的治療；作為一種具有造血促進作用的細胞因子，GM-CSF對於抗真菌製劑所引起的免疫抑制具有明顯的治療作用。因此，DC分泌的GM-CSF在體內除了對DC的功能具有增強作用外，還可發揮多種其它效應包括造血調控作用、免疫增強作用等。
(5)、應用不同類型的抗原觸發致敏DC，因而可用於多種疾病的治療。對於腫瘤抗原，可針對各種不同的腫瘤分別採用不同形式的腫瘤抗原包括腫瘤細胞、腫瘤蛋白、腫瘤抗原多肽、腫瘤抗原基因轉染等；對於病原微生物也可採用不同的抗原致敏DC以誘導機體產生免疫反應(如針對B肝的治療可採用B肝表面抗原、針對瘧疾的治療可採用瘧原蟲蛋白抗原、針對結核病的治療可採用結核桿菌蛋白抗原等)。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，比如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(NewYorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。
實施例1人外周血來源的樹突狀細胞的大量培養和擴增取患者或HLA配型的健康獻血員抗凝外周全血，通過血細胞分離機及淋巴細胞分離液(p＝1.077)分離外周血單個核細胞，洗2遍後給以無血清RPMI1640培養基培養2小時，洗棄非貼壁細胞，給以含2.5％人血清、GM-CSF(1000U/ml)、IL-4(1000U/ml)的RPMI1640培養基培養5～7天，獲得人外周血來源的未成熟樹突狀細胞，其特徵是高表達CD1a、CD80、CD86、CD40等表面分子，具有吞噬功能，但刺激T淋巴細胞增殖的能力較弱。對以上特徵鑑定後可置於液氮保存。
實施例2人CD34+幹細胞來源的樹突狀細胞的大量培養和擴增取HLA配型的健康孕婦抗凝臍帶血，通過淋巴細胞分離液(p＝1.077)分離單個核細胞，洗2遍後通過免疫磁珠分離CD34+幹細胞，給以含2.5％人血清、IL-3(10ng/ml)、IL-6(100ng/ml)及SCF(10ng/ml)培養7天，再給以GM-CSF(1000U/ml)、IL-4(100ng/ml)的RPMI1640培養基培養14～21天，獲得人CD34+幹細胞來源的未成熟樹突狀細胞，其特徵是高表達CD1a、CD80、CD86、CD40等表面分子，具有吞噬功能，但刺激T淋巴細胞增殖的能力較弱。對以上特徵鑑定後可置於液氮保存。
實施例3CD40靶向性、高效表達人GM-CSF重組腺病毒Ad.GM-CSF/CD40的製備(1)人GM-CSF cDNA的克隆通過RT-PCR從活化的人T淋巴細胞中擴增人GM-CSF cDNA。首先用人T細胞分離柱(Biotex公司)從健康人外周血中分取T細胞，體外經有絲分裂原ConA(10μg/ml，Sigma公司)刺激培養24小時後，用Trizol試劑(Gibco公司)提取細胞總RNA；用AMV逆轉錄酶(Promega公司)合成cDNA第一鏈，以其為模板進行PCR擴增。
PCR擴增採用的上遊引物和下遊引物序列為5』cggaattctagaccaccATGTGGCTGCAGAGCCTG 3』(SEQ ID NO4)5』cgggatccTCACTCCTGGACTGGCTCCC 3』(SEQ ID NO5)在上遊引物中設計了EcoRI和XbaI位點，下遊引物中設計了BamHI位點。所擴增產物包括人GM-CSF的全部編碼序列，預計大小為456bp。PCR反應體積為50μl，其中引物濃度為0.3μM，擴增參數為94℃1』、58℃1』、72℃2』，20個循環後產物行2％瓊脂糖凝膠電泳分析。PCR產物經EcoRI和BamHI酶切後，定向克隆至pGEM-3Z載體(Promega公司)，連接產物轉化大腸桿菌DH5α(Stratagene公司)，得到的重組載體記為pGEM-hGM，用M13-21和SP6引物進行全自動測序(ABI373，PE公司)。經測序分析，所擴增到的人GM-CSFcDNA序列完全正確，包含全部編碼序列(SEQ ID NO1和SEQ ID NO2)。
(2)IRES cDNA的克隆以質粒pIRES-hrGFP(Stratagene公司)為模板進行PCR擴增。上遊引物為5』gg GGA TCC cgg GAC GAC TGC ATA GGG TTAC(SEQ ID NO6)，其中設計了BamHI位點；下遊引物為5』gGAA TTC CTG CAG CCA TTA TCA TCG TGTTTTTC(SEQ ID NO7)，其中設計了EcoRI位點；所擴增產物預計大小為620bp。PCR反應體積為50μl，其中引物濃度為0.3μM，擴增參數為94℃1』、52℃1』、72℃2』，25個循環後產物行2％瓊脂糖凝膠電泳分析。PCR產物經EcoRI和BamHI酶切後，定向克隆至pBluescript II-KS載體(Stratagene公司)，連接產物轉化大腸桿菌DH5α(Stratagene公司)，得到的重組載體記為pKS-IRES，用T7和T3引物進行全自動測序(ABI373，PE公司)。經測序分析，所擴增到IRES序列完全正確(SEQ ID NO3)。
(3)雙拷貝人GM-CSF融合基因的構建首先從pGEM-hGM載體中切出GM-CSF的XbaI/BamHI片段，插入pKS-IRES，使GM-CSF cDNA位於IRES的上遊，得到重組載體pKS-GM-IRES；再從pGEM-hGM載體中切出GM-CSF的EcoRI/SalI片段，插入pKS-GM-IRES，使該GM-CSFcDNA位於IRES的下遊，這樣得到GM-CSF雙拷貝融合基因，重組載體命名為pKS-GM-DC，融合基因序列見SEQ ID NO3。
(4)雙拷貝人GM-CSF腺病毒載體的構建所採用的腺病毒穿梭載體pShuttle-CMV購自Stratagene公司，含有Ad5腺病毒的左右同源臂，其中含有多個供外源基因插入的克隆位點。從pSK-GM-DC載體中切出雙拷貝GM-CSF融合基因的NotI/XhoI片段，克隆至pShuttle-CMV的NotI/XhoI位點，連接產物轉化DH5α菌，得到重組腺病毒穿梭載體pShuttle-GM-DC。
重組腺病毒穿梭載體pShuttle-GM-DC經PacI線性化和去磷酸化處理後，取1μg與100ng的pAdEasy-1載體(Stratagene公司)混合，電穿孔法共轉化BJ5183感受態細菌(Stratagene公司)，經BJ5183細菌的同源重組，得到GM-CSF的重組腺病毒，陽性克隆經PacI酶切鑑定後，記為pAd.GM-DC。
陽性克隆pAd.GM-DC進一步轉化XL-10感受態細菌(Stratagene公司)，進行DNA的大量擴增。用高濃度肉湯TB培養基500～1000ml大量擴增陽性克隆菌，鹼裂法抽提粘粒DNA，溶於4ml TE中，加入44.4g CsCl(Gibco公司)、0.4ml溴化乙錠(10mg/ml)混合，置5ml離心管(Beckman)梯度離心(VTi65.1轉頭，55,000rpm，20℃，16h)，收集超螺旋條帶，用等體積Butanol(Sigma)抽提4～6遍，4℃下用TE透析過夜，或直接加入3倍體積無菌去離子水、8倍體積無水乙醇，於4℃沉澱DNA(3～5小時)，乾燥後DNA溶於無菌TE，用分光光度計檢測其濃度和純度。
(5)重組腺病毒的包裝重組腺病毒DNA載體pAd.GM-DC經磷酸鈣DNA共沉澱法轉染293細胞(ATCC公司)，經胞內包裝產生人GM-CSF重組腺病毒。轉染前一天，待轉染的293細胞更換新鮮培養基。於500μl體積中將5μg經PacI線性化處理的重組腺病毒載體pAd.GM-DC、CaCl2(終濃度為0.25M)混合後，加入500μl的2×BBS緩衝液(50mM BES(N，N-bis(2-hydroxyethl)-2-aminoethane-sulfonic acid)，280mM NaCl，1.5mM Na2HPO4(pH6.95))，混合後置室溫作用10～20分鐘，逐滴加入293細胞，置37℃、5％CO2培養12～24小時。將共轉染的293細胞與未經轉染的293細胞按1∶1、1∶10和1∶100等不同比例混合，分別接種至96孔培養板(100μl/孔)，此後的第4天和第8天各補加DMEM培養基(50μl/孔)。於轉染後的第12~14天，收集陽性克隆孔的細胞及其培養液，超聲破碎後的病毒上清為第一代種子病毒(1st seed)，於-80℃保存。第一代種子病毒用病毒上清(10μl/孔)感染24孔培養板中的293細胞，每個克隆設2個復孔；3～4天收集一個復孔的細胞行細胞基因組DNA的酶切分析，另一復孔中的細胞經超聲破碎後收集病毒上清，為第二代種子病毒(2nd seed)，留作擴增用。結果，在轉染的12～14天，在1∶10的96孔培養板中收集到病變死亡的293細胞克隆95個，經酶切鑑定得到雙拷貝GM-CSF的重組腺病毒克隆。
(6)重組腺病毒的擴增、純化與滴度檢測酶切鑑定正確的重組克隆的第二代種子病毒上清(2nd seed)，用於感染293細胞擴增病毒，3～4天後，超聲破碎細胞，離心去除細胞碎片，病毒上清經CsCl梯度離心(25,000rpm，4℃，2h)，濃縮的病毒液進行第二次CsCl梯度離心(35,000rpm，4℃，3h)純化，最後將收集病毒液對含10％甘油的PBS緩衝液透析過夜，過濾除菌後分裝，速凍保存於-80℃。
以293細胞為靶細胞、用微量細胞病變法檢測病毒滴度。96孔板中先加入50ml培養液/孔，前8孔加入25ml經104稀釋的病毒液，開始行3倍的倍比稀釋，共11個稀釋度，每一稀釋度設8復孔，每孔加50μl 293細胞，FCS的終度為5％，同時設細胞對照，此後第4天和第8天分別補加50μl含10％FCS的DMEM培養基，12～14天後判定結果。對其中的一個陽性克隆進行擴增，所擴增的人GM-CSF重組腺病毒滴度為7.67×1010pfu/ml。用注射用水稀釋、分裝成5×1010pfu/ml，保存於-80℃。
該腺病毒被命名為「雙拷貝表達人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子的重組5型腺病毒Ad.GM-CSF-DC」，2001年4月11日保藏於中國典型培養物保藏中心(中國，武漢)，保藏編號為CCTCC No.V200103。
(7)抗腺病毒和人CD40分子雙特異性抗體的製備小鼠抗Ad5腺病毒纖維蛋白(fiber)單抗1D6.14和抗人CD40單抗G28.5分別從其雜交瘤細胞株(ATCC公司)的培養上清中，經Protein A(Pharmacia公司)親和層析純化製備後，用木瓜蛋白酶(Pierce公司)消化、Protein A(Pharmacia公司)親和層析純化抗體的Fab片段。這兩種單抗的Fab片段用N-succinimidyl 3-(2-pyridldithio)propionate(SPDP)偶聯，製備得到抗Ad5腺病毒和人CD40的雙特異性抗體。具體方法參照文獻(Production ofbispecific antibodies.in Current Protocols in Immunology，New York，1997；p2.13.1)。
(8)CD40靶向性腺病毒的製備GM-CSF重組腺病毒中加入10ng/106pfu雙特異性抗體，於4℃孵育1小時，雙特異性抗體通過其抗腺病毒的結合位點與GM-CSF重組腺病毒結合，而其中的抗CD40的結合位點仍然預留著，能與細胞膜表面的人CD40分子特異性結合，這樣就製備成功CD40靶向性的人GM-CSF重組腺病毒，記為Ad.GM-CSF/CD40。
實施例4製備人GM-CSF基因修飾的人樹突狀細胞復甦凍存的DC或取新鮮培養的DC，給以無血清培養(5％CO2，37℃)，加入腺病毒AdGM-CSF/CD40(MOI＝50)，每10分鐘輕輕搖動1分鐘，1小時後洗2遍，繼續培養24小時，鑑定細胞的活力、表型及功能。此時細胞仍表現出未成熟DC的特徵(圖1，2，3)。
實施例5腫瘤抗原或病原微生物抗原在體外觸發致敏人樹突狀細胞在培養的DC中加入TNFα(100ng/ml)培養24小時，收集培養的DC，置於50ml離心管，加入蛋白抗原，置於37℃水浴中，緩慢瑤動，2小時後1000g離心10分鐘，棄上清，加入生理鹽水，配製成1×107/ml懸液備用。其特徵是低表達CD1a，高表達CD80、CD86、CD40、CD83等表面分子，無吞噬功能，但刺激T淋巴細胞增殖的能力較強，此時細胞表現出相對成熟DC的特徵(圖4，5，6)。
實施例6皮下多點注射免疫患者於患者左右兩臂及左右大腿近淋巴結處皮下分別多點注射DC懸液，每2周1次，共3次，每次2×106～5×107細胞。
序列表110上海華康生物技術有限公司120抗原致敏的人GM-CSF基因修飾的人樹突狀細胞、其製法和用途1300119761607170PatentIn version 3.02101211456212DNA213Homo sapiens220221CDS222(16)..(450)4001gaattctaga ccacc atg tgg ctg cag agc ctg ctg ctc ttg ggc act gtg51Met Trp Leu Gln Ser Leu Leu Leu Leu Gly Thr Val1 5 10gcc tgc agc atc tct gca ccc gcc cgc tcg ccc agc ccc agc acg cag 99Ala Cys Ser Ile Ser Ala Pro Ala Arg Ser Pro Ser Pro Ser Thr Gln15 20 25ccc tgg gag cat gtg aat gcc atc cag gag gcc cgg cgt ctc ctg aac147Pro Trp Glu His Val Asn Ala Ile Gln Glu Ala Arg Arg Leu Leu Asn30 35 40ctg agt aga gac act gct gct gag atg aat gaa aca gta gaa gtc atc195Leu Ser Arg Asp Thr Ala Ala Glu Met Asn Glu Thr Val Glu Val Ile45 50 55 60tca gaa atg ttt gac ctc cag gag ccg acc tgc cta cag acc cgc ctg243Ser Glu Met Phe Asp Leu Gln Glu Pro Thr Cys Leu Gln Thr Arg Leu65 70 75gag ctg tac aag cag ggc ctg cgg ggc agc ctc acc aag ctc aag ggc291Glu Leu Tyr Lys Gln Gly Leu Arg Gly Ser Leu Thr Lys Leu Lys Gly
80 85 90ccc ttg acc atg atg gcc agc cac tac aag cag cac tgc cct cca acc339Pro Leu Thr Met Met Ala Ser His Tyr Lys Gln His Cys Pro Pro Thr95 100 105ccg gaa act tcc tgt gca acc cag act atc acc ttt gaa agt ttc aaa387Pro Glu Thr Ser Cys Ala Thr Gln Thr Ile Thr Phe Glu Ser Phe Lys110 115 120gag aac ctg aag gac ttt ctg ctt gtc atc ccc ttt gac tgc tgg gag435Glu Asn Leu Lys Asp Phe Leu Leu Val Ile Pro Phe Asp Cys Trp Glu125 130 135 140cca gtc cag gag tga ggatcc 456Pro Val Gln Glu2102211144212PRT213Homo sapiens4002Met Trp Leu Gln Ser Leu Leu Leu Leu Gly Thr Val Ala Cys Ser Ile1 5 10 15Ser Ala Pro Ala Arg Ser Pro Ser Pro Ser Thr Gln Pro Trp Glu His20 25 30Val Asn Ala Ile Gln Glu Ala Arg Arg Leu Leu Asn Leu Ser Arg Asp35 40 45Thr Ala Ala Glu Met Asn Glu Thr Val Glu Val Ile Ser Glu Met Phe50 55 60Asp Leu Gln Glu Pro Thr Cys Leu Gln Thr Arg Leu Glu Leu Tyr Lys65 70 75 80Gln Gly Leu Arg Gly Ser Leu Thr Lys Leu Lys Gly Pro Leu Thr Met85 90 95Met Ala Ser His Tyr Lys Gln His Cys Pro Pro Thr Pro Glu Thr Ser
100 105 110Cys Ala Thr Gln Thr Ile Thr Phe Glu Ser Phe Lys Glu Asn Leu Lys115 120 125Asp Phe Leu Leu Val Ile Pro Phe Asp Cys Trp Glu Pro Val Gln Glu130 135 14021032111538212DNA213雙拷貝GM-CSF編碼序列4003gcggccgctc tagaccacca tgtggctgca gagcctgctg ctcttgggca ctgtggcctg 60cagcatctct gcacccgccc gctcgcccag ccccagcacg cagccctggg agcatgtgaa120tgccatccag gaggcccggc gtctcctgaa cctgagtaga gacactgctg ctgagatgaa180tgaaacagta gaagtcatct cagaaatgtt tgacctccag gagccgacct gcctacagac240ccgcctggag ctgtacaagc agggcctgcg gggcagcctc accaagctca agggcccctt300gaccatgatg gccagccact acaagcagca ctgccctcca accccggaaa cttcctgtgc360aacccagact atcacctttg aaagtttcaa agagaacctg aaggactttc tgcttgtcat420cccctttgac tgctgggagc cagtccagga gtgaggatcc cgggacgact gcataggtta480cccccctctc cctccccccc ccctaacgtt actggccgaa gccgcttgga ataaggccgg540tgtgcgtttg tctatatgtt attttccacc atattgccgt cttttggcaa tgtgagggcc600cggaaacctg gccctgtctt cttgacgagc attcctaggg gtctttcccc tctcgccaaa660ggaatgcaag gtctgttgaa tgtcgtgaag gaagcagttc ctctggaagc ttcttgaaga720caaacaacgt ctgtagcgac cctttgcagg cagcggaacc ccccacctgg cgacaggtgc780ctctgcggcc aaaagccacg tgtataagat acacctgcaa aggcggcaca accccagtgc840cacgttgtga gttggatagt tgtggaaaga gtcaaatggc tctcctcaag cgtattcaac900aaggggctga aggatgccca gaaggtaccc cattgtatgg gatctgatct ggggcctcgg 960tgcacatgct ttacatgtgt ttagtcgagg ttaaaaaacg tctaggcccc ccgaaccacg 1020gggacgtggt tttcctttga aaaacacgat gataatggct gcaggaattc tagaccacca 1080tgtggctgca gagcctgctg ctcttgggca ctgtggcctg cagcatctct gcacccgccc 1140gctcgcccag ccccagcacg cagccctggg agcatgtgaa tgccatccag gaggcccggc 1200gtctcctgaa cctgagtaga gacactgctg ctgagatgaa tgaaacagta gaagtcatct 1260cagaaatgtt tgacctccag gagccgacct gcctacagac ccgcctggag ctgtacaagc 1320agggcctgcg gggcagcctc accaagctca agggcccctt gaccatgatg gccagccact 1380acaagcagca ctgccctcca accccggaaa cttcctgtgc aacccagact atcacctttg 1440aaagtttcaa agagaacctg aaggactttc tgcttgtcat cccctttgac tgctgggagc 1500cagtccagga gtgaggatcc tctagagtcg acctcgag 1538210421135212DNA213合成的引物4004cggaattcta gaccaccatg tggctgcaga gcctg 35210521128212DNA213合成的引物4005cgggatcctc actcctggac tggctccc 28210621130212DNA213合成的引物4006ggggatcccg ggacgactgc atagggttac 30210721133212DNA213合成的引物4007ggaattcctg cagccattat catcgtgttt ttc 3權利要求
1.一種樹突狀細胞，其特徵在於，它被攜帶GM-CSF基因的腺病毒修飾過，從而表達GM-CSF。
2.如權利要求1所述的樹突狀細胞，其特徵在於，所述的腺病毒的基因組缺失E1區和E3區，並且在E1區位置插入了人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子表達盒，該表達盒依次包括啟動子序列，人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子編碼序列和聚腺苷酸化信號序列，而且，在腺病毒表面結合有雙特異性抗體，該抗體既特異性地針對腺病毒表面的結合位點，又特異性地針對樹突狀細胞表面的受體分子。
3.如權利要求3所述重組腺病毒，其特徵在於，該腺病毒為Ad5型腺病毒；且所述的受體分子選自下組CD1a、CD40、CD44、CD54、CD80、CD83、CD86、MHC分子。
4.如權利要求1所述的樹突狀細胞，其特徵在於，所述的受體分子是CD40。
5.如權利要求1所述的樹突狀細胞，其特徵在於，所述的腺病毒是重組5型腺病毒Ad.GM-CSF-DC，CCTCC No.V200103。
6.如權利要求1所述的樹突狀細胞，其特徵在於，所述的樹突狀細胞被選自下組的抗原衝擊致敏(a)食管癌、胃癌、大腸癌、胰腺癌、肝癌、肺癌、黑色素瘤、腎癌、膀胱癌、前列腺癌、白血病、淋巴瘤、腦膠質瘤的細胞、或細胞組份；(b)B肝抗原、瘧原蟲抗原、結核桿菌蛋白抗原、真菌抗原。
7.如權利要求1所述的樹突狀細胞，其特徵在於，所述的樹突狀細胞包括下列細胞外周血單核細胞培養的DC、骨髓來源的DC、臍帶血來源的DC。
8.一種藥物組合物，其特徵在於，它包括有效量的樹突狀細胞和藥學上可接受的載體或賦形劑，所述的樹突狀細胞被攜帶GM-CSF基因的腺病毒修飾過，從而表達GM-CSF。
9.如權利要求8所述的藥物組合物，其特徵在於，該腺病毒是表達人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子的重組5型腺病毒Ad.GM-CSF-DC，CCTCC No.V200103。
10.一種製備GM-CSF修飾的樹突狀細胞的方法，其特徵在於，它包括步驟(a)用重組腺病毒轉染樹突狀細胞，所述的腺病毒的基因組缺失E1區和E3區，並且在E1區位置插入了人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子表達盒，該表達盒依次包括啟動子序列，人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子編碼序列和聚腺苷酸化信號序列，而且，在腺病毒表面結合有雙特異性抗體，該抗體既特異性地針對腺病毒表面的結合位點，又特異性地針對樹突狀細胞表面的受體分子；(b)分離出表達GM-CSF的樹突狀細胞。
全文摘要
本發明提供了一類通過粒細胞－巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte－macrophage colony－stimulatingfactor,GM－CSF)基因修飾後免疫激發功能增強的樹突狀細胞(dendritic cells,DC)、及其製備方法。還涉及該基因修飾的DC在多種腫瘤和肝炎等感染性疾病治療中的應用。
文檔編號A61P1/00GK1381562SQ0110597
公開日2002年11月27日 申請日期2001年4月13日 優先權日2001年4月13日
發明者王建莉 申請人:上海華康生物技術有限公司