乳清酸磷酸核糖轉移酶啟動子及應用和構建體與載體的製作方法

2023-10-28 21:27:57 1

專利名稱：乳清酸磷酸核糖轉移酶啟動子及應用和構建體與載體的製作方法
技術領域：
本專利屬於基因工程技術領域，具體涉及圓紅冬孢酵母啟動子、終止子及其用途， 包括基因工程菌株構建所必需的轉化方法等。
背景技術：
微生物是自然界中分布最廣泛的物種之一，具有卓越的生物合成能力，幾乎能合成地球上所有的有機化學品。微生物的種屬多樣性和遺傳多樣性決定了其代謝多樣性。與多細胞生物相比，微生物的代謝途徑雖然相對簡單，但其化合物的生產高效、快捷，並與人類日常生產生活關係密切。
做為某一化學品的天然生產菌株或環境治理應用菌株，其特定的生產性能往往並非最優化。如何優化或改變工業菌株的代謝網絡和表達調控網絡，以提高生物基產品的積累速度或定向控制靶產品的質量，是當今生物技術領域研究的熱點和難點。實際上，對微生物油脂代謝過程的理解、開發和利用是否能達到或者超過化學加工水平，也是提高發酵過程經濟性的關鍵。全基因組測序和基因工程技術的進步，為菌株生理學特性的認識和菌株改良提供了比傳統誘變技術更為合理的方法。
代謝工程的實質是利用重組DNA技術和其它技術，有目的地改變已有的代謝和表達調控網絡，更好地理解和利用細胞的代謝途徑。代謝工程可以在細胞與分子水平上認識和改造細胞過程，其不僅可以解釋細胞生理生化特性，而且還可賦於出發菌株新的性狀和表型(1)擴大底物利用範圍；( 生產原來不存在的新化合物；C3)增強對環境中毒害物質的降解能力；(4)提高菌體對環境的適應能力；(5)阻斷或降低副產品的生成；(6)代謝產品生產速率和生產性能的提高等(Bailey J Ε. Toward a science ofmetabolic engineering. Science. 1991,252(5013) :1668-1675 ；Aristidou A,Penttila M. Metabolic engineering applications to renewable resource utilization. Curr. Opin.Biotechnol.2000，11(2) :187-198)。
圓紅冬孢酵母屬於擔子菌門異宗配合型真菌，是發酵工業中一種極為重要的微生物，可利用源於生物質的己糖和戊糖為原料生產重要的生物基產品微生物油脂， 胞內油脂可達細胞乾重的60 %以上(Ratledge C, WynnJ P. The biochemistry and molecular biology of lipid accumulation in oleaginousmicroorganisms.Adv. Appl. Microbiol. 2002, 51 :1-51 ；Li Y, Zhao Z, Bai F. High-density cultivation of oleaginous yeast Rhodosporidium toruloides Y4infed-batch culture.Enzyme Microb. Technol. 2007,41 (3) :312-317)；工業用酶或藥物合成用酶如磷酸二酯酶、苯丙氨酸角軍氨酶(Hodgins D S. Yeastphenylalanine ammonia-lyase. Purification, properties, and the identification ofcatalytically essential dehydroalanine. J Biol.Chem. 1971,246(9) :2977-2985 ；Gilbert H J, Clarke I N, Gibson R K, et al. Molecular cloning of the phenylalanineammonia lyase gene from Rhodosporidium toruloides in Escherichia coli K-12. JBacteriol. 1985,161 (1) :314-320)、D胺基酸氧化酶(Gadda G Negri A,PiloneM S. Reaction of phenylglyoxal with arginine groups in D-amino-acid oxidasefrom Rhodotorula gracilis. J Biol. Chem. 1994,269(27) 17809-17814 ；Liao G J, Lee Y J, Lee Y H, et al. Structure and expression of the D-amino-acid oxidasegene from the yeast Rhodosporidium toruloides. Biotechnol. Appl. Biochem. 1998，27 (Pt 1) :55-61)等；β-胡蘿蔔素和胞外多糖；並在汙水處理和生物製藥中有較廣泛的應用。實驗結果表明，該菌可同時利用五碳糖和六碳糖為底物，抗逆性好，能直接以玉米秸稈酸水解液為碳源積累油脂，可實現生物質到生物基產品的高效轉化 (李永紅，劉波，孫豔，等.廣譜碳源產油酵母菌的篩選.中國生物工程雜誌，2005，25 (12) 39-44)。
雖然圓紅冬孢酵母具有優良的工業生產性能，同時，圓紅冬孢酵母來源的蛋白酶異源表達也獲得成功(Pollegioni L，Molla G，Campaner S，Cloning，sequencing and expression in Ε.coli of a D—amino acid oxidase cDNA fromRhodotorula gracilis active on cephalosporin C. J Biotechnol. 1997，58 (2) : 115-123 ；Faulkner J D， Anson J G，Tuite M F，et al. High-level expression of thephenylalanine ammonia lyase-encoding gene from Rhodosporidium toruloidesin Saccharomyces cerevisiae and Escherichia coli using a bifunctionalexpression system. Gene. 1994,143 (1) 13-20)，但圓紅冬孢酵母自身缺乏相應的遺傳作業系統。以圓紅冬孢酵母為宿主菌，無論是基因工程操作還是代謝工程菌株改良，都受到遺傳作業系統的制約，難以進行靶向性的菌株改造。
啟動子對於遺傳作業系統來說必不可少。因此，如果要對圓紅冬孢酵母進行遺傳操作，獲得能在圓紅冬孢酵母中起作用的啟動子是該工作的關鍵環節。

發明內容
鑑於上述現有技術瓶頸，本發明的主要目的是提供可用於在圓紅冬孢酵母中有效表達外源基因，並且可用於通過遺傳工程技術進行圓紅冬孢酵母菌種改良的啟動子和終止子。
為實現本發明的目的，本發明人對圓紅冬孢酵母中的基因表達情況進行了深入研究，發現ura5為一個組成型表達基因，其啟動子為中強啟動子。通過實驗設計，結合簡併 PCR、染色體步移等方法，從圓紅冬孢酵母染色體DNA中成功獲得了包含有效啟動子的DNA 片段，由此完成了本發明。
具體講，本發明包含下述實施方案(A)到(H) (A)本發明涉及一種具有圓紅冬孢酵母轉錄啟動子活性的DNA片段，所述DNA片段具有如SEQ ID NO :1所示DNA序列的全部序列或包含該DNA序列自3，-末端起800bp以內的部分序列，或具有可與如SEQ ID NO 1所示序列的全部或其DNA序列3，-末端起SOObp 以內的部分序列雜交的、且保持轉錄啟動子活性的序列，或對SEQ ID NO :1所示的脫氧核苷酸序列進行一個或多個鹼基的取代、缺失、插入或添加所獲得的，與SEQ ID NO :1所示序列具有50%以上同源性、且具有啟動子活性的序列。
(B)本發明涉及一種來自圓紅冬孢酵母的DNA片段，所述DNA片段具有如下特徵 (1)如SEQ ID NO 2所示的DNA序列的全部或包含該DNA序列5，-末端的部分序列；(2)或具有可與如(1)所示序列雜交的、且保持如(1)所述序列活性的序列。
(C)本發明涉及一種可完成靶基因在圓紅冬孢酵母中轉錄起始和轉錄終止的DNA 分子，它同時具有如㈧所述序列和如⑶所述序列，且如⑶所述序列位於如㈧所述序列的下遊，與其相鄰1-10000個核苷酸的DNA片段。
(D)本發明涉及一種可將靶基因與(A)-(C)所述的任一種DNA分子連接的DNA構建體，以便於靶基因能夠在圓紅冬孢酵母中表達的重組DNA。所述靶基因為蛋白編碼核酸或反義核酸編碼核酸。
(E)本發明涉及一種攜帶(A)-(D)所述的的DNA分子中的任意一個的載體。所述載體可以是質粒載體或粘粒載體。
(F)本發明涉及轉入了如⑶所述的DNA分子或如(E)所述載體的圓紅冬孢酵母或紅冬孢酵母屬(Miodosporidium)真菌。
(G)本發明所涉及的的pRtura5啟動子，其特徵在於其來源於圓紅冬孢酵母，可啟動目的基因在圓紅冬孢酵母中的轉錄和表達。
(H)本發明涉及編碼具有乳清酸磷酸核糖轉移酶(orotat印hosphoribosyl transferase)活性的多肽的DNA片段，其cDNA序列具有如SEQ ID NO 3所示的脫氧核苷酸序列，其基因組DNA具有SEQ ID NO :5所示的脫氧核苷酸序列，其胺基酸序列如SEQ ID NO 4所示。
使用本發明中具有啟動子活性的DNA分子和具有轉錄終止子活性的DNA，可實現外源基因或內源基因在圓紅冬孢酵母中的表達，本發明提供了用於遺傳工程圓紅冬孢酵母的啟動子、終止子和載體。為圓紅冬孢酵母開啟了一條育種新途徑，並因此可以提供具有工業用途的新型圓紅冬孢酵母。


圖1表示Rtura5簡併PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳的結果。
圖2表示pRtura5啟動子DNA片段的瓊脂糖凝膠電泳的結果。
圖3表示Rtura5t終止子DNA片段的瓊脂糖凝膠電泳的結果。
圖4表示Rtura5啟動子-ORF-終止子全長片段的瓊脂糖凝膠電泳的結果。
圖5表示pRtura5啟動子啟動GFPuv在圓紅冬孢酵母ATCC 10788中的整合性表達結果。
圖6表示pRtura5啟動子啟動博來黴素抗性基因ble在紅冬孢酵母ATCC10788的抗生表達結果。
圖7表示pRtura5啟動子啟動遺傳黴素抗性基因kanmx4在紅冬孢酵母ATCC 10788的抗生表達結果。
圖8表示重組圓紅冬孢酵母在5』 -FOA上的培養結果。
圖9是質粒pura5gfp的結構圖。
圖10是質粒pura5ble的結構圖。
圖11是質粒pura5kan的結構圖。
圖12是圓紅冬孢酵母乳清酸磷酸核糖轉移酶OPRTase的晶體結構模型，其表明三維結構正確。
本明的
具體實施例方式在本文中，「啟動子」是指能夠被RNA聚合酶識別、結合併能啟動基因轉錄的DNA序列。術語「啟動子」還可理解為包括5』非編碼區、順式作用元件(如增強子)以及其它能與轉錄因子結合的核苷酸序列。
啟動子的存在或強度通常是通過啟動子活性表示，其測定方法將報告基因(如綠色螢光蛋白)連接於所述啟動子的下遊，並將該DNA構建體轉化相應宿主細胞，檢測報告基因表達量。如果人們觀察到連接於所述啟動子下遊報告基因的表達，就可以認為所述啟動子在它所轉化的宿主細胞內有活性。
在本文中，「終止子」是指染色體上提供終止信號使RNA聚合酶與DNA模板分離而使轉錄終止的一段DNA序列。可以通過諸如Northern雜交或RT-PCR的方法檢查所轉錄 RNA的大小而確認終止子的存在。或通過「啟動子-報告基因-終止子」構建體使報告基因有效表達而確定終止子的活性。
本發明中的「圓紅冬孢酵母」，包括屬於該「物種」的任何二倍體和單倍體，野生型菌株和營養缺陷型菌株。本發明中的「紅冬孢酵母屬真菌」，沒有具體限制，其例子包括歸屬於該屬的真菌，除圓紅冬孢酵母外，如Rhodosporidium azoricum, Rhodosporidium bab jevae, I hodosporidiumsphaerocarpum0 本發明的「目的基因」，包括能夠在圓紅冬孢酵母中表達的蛋白編碼序列，反義RNA 編碼序列和核酸酶編碼序列。能夠在圓紅冬孢酵母中表達的蛋白編碼序列的例子包括源於圓紅冬孢酵母的核酸序列，且並不局限於此。本發明的目的基因還包括來源於其它微生物、 植物和動物的蛋白編碼序列。
本發明中的啟動子具有如SEQ ID NO 1所示DNA序列的全部或包含該DNA序列 3，-末端的部分序列，或具有可與如SEQ ID NO 1所示序列的全部或其DNA序列3，-末端的部分序列雜交的、且保持轉錄啟動子活性的序列，或對SEQ ID NO :1所示的脫氧核苷酸序列進行一個或多個鹼基的取代、缺失、插入或添加所獲得的，與SEQ ID NO :1所示序列具有 50%以上同源性、且具有啟動子活性的序列。
本發明中的終止子具有如如SEQ ID NO 2所示的DNA序列的全部或包含該DNA序列5，-末端的部分序列，或具有可與如SEQ ID NO 2所示序列的全部或其DNA序列5，-末端的部分序列雜交的、且保持轉錄終止子活性的序列，或對SEQ ID NO :2所示的脫氧核苷酸序列進行一個或多個鹼基的取代、缺失、插入或添加所獲得的，與SEQ ID NO :2所示序列具有50%以上同源性、且具有終止子活性的序列。
本發明中的啟動子-目的基因的構建體、目的基因-終止子的構建體或啟動子-目的基因-終止子的構建體，可以直接或經載體介導轉化圓紅冬孢酵母，以便於目的基因表達，可以優選質粒載體作為介導載體。
本發明的啟動子可以按照以下方面從圓紅冬孢酵母中分離。
下面結合附圖及實施例對本發明作進一步說明，將有助於本領域的普通技術人員理解本發明，但不以任何形式限制本發明。下述實施例中所有引物合成及測序工作，如無特別說明則均由大連TaKaRa公司完成。
實施例1 圓紅冬孢酵母ATCC 10788總RNA的提取 將新鮮圓紅冬孢酵母R. toruloides ATCC 10788 (購自美國標準生物品收藏中心，ATCC)由斜面接種到50ml YEPD液體培養基中，於30°C搖床培養Mh，再以1 50的體積比例將菌液分別轉接到100ml YEPD液體培養基中，於30°C搖床培養1 達對數生長期。在 4°C下，5000rpm離心％iin，收集菌體，用液氮迅速冷凍菌體，研磨破壁。使用TaKaRa公司 RNAiso試劑盒，並按照其標準步驟提取總RNA。
RNA進行1. 5%瓊脂糖凝膠電泳，使用螢光-紫外分析儀觀察鑑定，可見清晰的兩條帶。用紫外/可見光光譜儀分析總RNA樣品，測得OD26tZOD28tl = 2. 01，表明總RNA質量很好。總RNA樣品凍存於_80°C，備用。
實施例2 圓紅冬孢酵母ATCC 10788 cDNA第一鏈合成和ura5簡併PCR 以圓紅冬孢酵母R. toruloides ATCC 10788總RNA為模板，反轉錄合成cDNA第一鏈。首先，將 1. 0 μ 1 總 RNA(約 2 μ g)，1. 0 μ 1 引物 SMART IV 5' -AAGCAGTGGTATCAACGCA GAGTGGCCATTACGGCCGGG-3『和 1.0 μ loligo dT_ 接頭引物 CDS III/3' 5' -ATTCTAGAGG CCGAGGCGGCCGACATG-d (T) 30N-iN-3 『，2. 0 μ 1 DEPC處理水(焦碳酸二乙酯處理水，購自大連 TaKaRa公司)，加入到PCR管中混勻，於72°C保溫2min,立即置於冰上冷卻2min,將2. 0 μ 1 5 X first strandbuff er, 1. 0μ 1 DTT (20mM), 1. 0 μ 1 dNTP (IOmM), 1. 0μ 1 powerscript reversetranscriptase(Clontech公司)加入到體系中，混勻。於42°C延伸反應60min，最後4°C結束反應，存於_20°C，備用。
根據NCBI公布的其它物種來源的乳清酸磷酸核糖轉移酶胺基酸序列，通過序列比對獲得其相對保守區域，並利用此保守區域設計合成兩條簡併引物，ura5-sense 5 『 -ATGAG(AGCT)GC(AGCT)AC(AGCT)TCCTA(AGCT)GC-3 『和 ura5_anti 5 『 -CTA(AGCT) T (CT) (AG) AC (AG) CC (AGCT) CACT-3 『，以反轉錄合成的 cDNA 第一鏈為模板，進行 Rtura5 基因的簡併 PCR 擴增，10XPCR 緩衝液 5. 0 μ 1，dNTPs (IOmM) 1· 0μ 1，ura5_sense 引物 (50mmol/l) 1. 0μ l，ura5_anti 引物(50mmol/l) 1. 0ul，rTaq 酶(大連 TakaRa) 0· 5 μ 1，合成的 cDNA 第一鏈模板 1. 0 μ LddH2O 40. 5 μ 1，於 94°C保溫 3min，然後於 94°C 30s, 57°C 45s， 72°C lmin，35個循環，72°C lOmin，4°C結束反應。擴增產物進行(質量/體積濃度)瓊脂糖凝膠電泳，觀察到0. Skb左右的條帶(圖1)，利用DNA回收試劑盒(購自碧雲天)，按照供應商建議步驟純化PCR產物。PCR產物參照TaKaRa公司提供的方法克隆到pMD18_T載體(購自TaKaRa)，轉化入E. coli DH5 α感受態細胞，其中感受態細胞按氯化鈣法(分子克隆實驗指南第三版，薩姆布魯克著，黃培堂等譯，科學出版社出版)製備。挑選Amp抗性轉化子進行增菌培養、質粒提取。重組質粒樣品送至TaKaRa公司測序，序列結果推測出的胺基酸序列經Blastp分析，證實為乳清酸磷酸核糖轉移酶序列，如SEQ ID NO :4序列所示。 乳清酸磷酸核糖轉移酶cDNA序列如SEQ ID NO 3序列所示。
實施例3 :Rtura5基因基因組DNA序列的擴增 1. R. toruloides ATCC 10788 (購自美國標準生物品收藏中心，ATCC)的基因組 DNA提取採用玻璃珠破壁法(精編分子生物學實驗指南第三版第13章，奧斯伯等著，顏子穎等譯，科學出版社出版)。製備好的基因組DNA，利用Nanodrop 1000測定，測得ODa5tZOD28tl =1.85，表明基因組DNA質量很好。濃度為120ng/l·! 1，共500μ 1，基因組DNA樣品凍存於-20°C，備用。
2.根據實施例2中獲得的乳清酸磷酸核糖轉移酶cDNA序列，設計1對基因特異性引物，ura5-0RF-pl :5，-ATGAGCGCCACGTCCTACGC-3，和 ura5_0RF_p2 5，-CTAGTTAACGCCCCACTTTGCG-3，，以圓紅冬孢酵母ATCC 10788的基因組DNA為模板，按照常規方法進行PCR擴增，得到約0. Skb的PCR產物(圖略)。PCR擴增產物按照實施例2的操作步驟回收、克隆到PMD18-T載體，並進行測序，得到如序列表SEQ ID NO :5所示的DNA 序列。經與實施例2中獲得的乳清酸磷酸核糖轉移酶cDNA序列比對，證實該基因片段為其乳清酸磷酸核糖轉移酶基因組DNA序列，無內含子。
實施例4 染色體步移獲得Rtura5基因5』翼側序列(啟動子) 本實施例利用Genome Walking Kit(購自 TaKaRa)完成。
根據實施例3中得到的ura5基因組DNA序列，設計3條Specific Primer (基因特異性引物)，ura5-SPl :5，-AGCGACGAGGGGGATGCCCTTGT-3，，ura5-SP2 5，-GTTGAAGAAGTAGGGCGAGGAGC-3，和 ura5_SP3 :5，-GAGAGCGGTCTCGATGATCGAG-3，，做為下遊引物，按照試劑盒說明書進行以下操作。
1. IstPCR 反應 以實施例3中精製的基因組DNA為模板，進行第一輪擴增。反應體系50 μ 1 =IOXLA PCR buffer II (Mg2+plus) 5· 0 μ 1，dNTPs (2. 5mmol/l) 8· 0 μ 1，LA Taq DNA 聚合酶(5U/μ 1, 大連 TakaRa) 1. 0 μ 1，AP Primer (100 μ mol/1，大連 TakaRa) 1· 0 μ 1，ura5-SPl (10 μ mol/ 1)1.0 μ 1，R. toruloides ATCC 10788 基因組 DNA 模板(120ng/y 1)1.0 μ 1，ddH20 加至 50 μ 1。反應條件先進行5個高溫退火溫度的高特異性反應，然後進行1個極低退火溫度的低特異性反應；然後進行熱不對稱PCR :2個高退火溫度(65°C )的高特異性反應和1個低退火溫度(44°C )的低特異性反應交替循環，共15次。具體參數如下94°C lmin,98°C Imin ； 94 °C 30s, 65 °C lmin，72°C 2min,共 5 個循環；94°C 30s, 25 °C 3min，72°C 2min ；94 °C 30s, 65°C lmin，72°C 2min，94°C 30s,65°C lmin，72°C 2min，94°C 30s,44°C lmin，72°C 2min，共 15 個循環；72°C lOmin，結束反應。
2. 2nd 巢式 PCR 反應 反應體系50μ1 10 X LA PCR buffer II (Mg2+plus) 5· 0 μ 1，dNTPs (2. 5mmol/ 1)8. 0 μ 1, LA Taq DNA 聚合酶(5U/μ 1，大連 TakaRa) 1. 0 μ 1，API Primer (100 μ mol/1, 大連 TakaRa) 1. 0 μ 1，IstPCR 反應產物 1.0 μ 1，ura5-SP2 (10 μ mol/1) 1. 0 μ 1，ddH20 加至 50 μ 1。反應條件94°C 30s, 65°C lmin，72°C 2min，94°C 30s, 65°C lmin，72°C 2min，94°C 30s, 44°C lmin，72°C 2min，共 15 個循環；72°C lOmin，結束反應。
3. 3rd 巢式 PCR 反應 反應體系50μ1 10 X LA PCR buffer II (Mg2+plus) 5· 0 μ 1，dNTPs (2. 5mmol/ 1)8.0 μ 1，LA Taq DNA 聚合酶(5U/μ 1，大連 TakaRa) 1. 0 μ 1，API Primer (100 μ mol/1，大連 TakaRa) 1.0 μ 1,2nd 巢式 PCR 反應產物 1.0 μ 1, ura5-SP3 (10 μ mol/1) 1. 0 μ l，ddH20 加至 50 μ 1。反應條件94°C 30s, 65°C lmin，72°C 2min，94°C 30s, 65°C lmin，72°C 2min，94°C 30s, 44°C lmin，72°C 2min，共 15 個循環；72°C lOmin，結束反應。
3rd巢式PCR反應產物經1 % (質量/體積濃度)瓊脂糖凝膠電泳後切割目的條帶，利用DNA片段凝膠純化試劑盒(購自碧雲天)進行純化。純化後的DNA片段經TA克隆插入pMD18-T載體(購自I^akaRa公司)，轉化DH5 α感受態細胞；其中感受態細胞按氯化鈣法(分子克隆實驗指南第三版，薩姆布魯克著，黃培堂等譯，科學出版社出版)製備。挑選Amp抗性轉化子進行增菌培養、質粒提取。重組質粒樣品送至TaKaRa公司測序，得到如SEQ ID NO 1所示的DNA序列，證實為預期的pRtura5基因序列。
1TGCCGCCTATCTGTTAAAACTCAATGGATACAATGCAAAGTCGGCTCGCGCCCTCTTCTC 61CCGTTCCCCCGTACCTAGACATGCGTCGTGAGTGCTTCCCTCCGTCATGCAACCGTCGCA 121AGCTCCTCGCTCCGTCGTCGCTGCTGAAGCTGCTCCTGCGCAATCCGCTGCGCGGCGGGT 181ACCTCGCCTCGCTCCCTTTCCGCCGCCCGAATCGCCTGTGTGAGCCTGTTCCTCCGAGAC 241ACGACCATCGTCTTGGGATTGGCTTGTGGTACGGGCAGAGGGCTGGTCTCTGCAATTGAG 301CAAGCGAGCCGAGGCAGCGATGGTCAGTTCCGGTCGCAGACCGAGGCTCCAGGGAAGGGA 361CGGCGGGACGCACTGATGACGCCGGCCTGAATGAGCAGCTTCTCAAAGCGCTTTGTCGGC 421AGCGCACCCTGGCTGAGCCAGTACCGGACCCGCTCCAGGTTCCACTCGACCTTCTTCTGC 481CCGACCTTGGCGACGCCCGTGTTGGGCGTGTGCTGCCGTGGTCCCCACTCCTTCGGGTCC 541CTGACCTGACCGTTTGGCGAGACCGACGGCGCTGGCACGACGACCGGTCGCGGGTTGTAC 601GAACCGAGGAGCTCGAGGGGTTTGGCGGTCTGGCGCTGCGGCGCGCGGATGGCGACGAGC 661GAGTAGACGGGGTTGTTGCGCGTGCAGTGGTGGCGCGCGAGGCGCAATCGGACCGACATC 721TCGTGCGCTGGCGGAGAGCGAGTGTGCGAGGACGAGGAAAAGGAGCGGGAGGAGGAGGGT 781TGGGAGCGAACCACCTCGTGCAGCTGGACTGGACGCGCTAGACGACTGCCAGACTCGCTA 841TACTGCTCTTTACATCCGCTAGAATCCTGCACCCGCTCGAACCAGCTCCTCCCACCGTCA 901GTTCGCCTCCCCCTCTCATCCTCATCTCTCAAAGGACTTCCTCGCTCGCAACTCGCTGGA 961GGGAGCTGCAAGACTGACACGAGGTCGAAAACACCGTCAG 實施例5 染色體步移獲得Rtura5基因3』翼側序列(終止子) 本實施例也是利用Genome Walking Kit(購自TaKaRa)完成。
根據實施例3中得到的ura5DNA序列，設計3條Specific Primer (基因特異性引物)，分別為 ura5-SPll :5，-CACGACGAGGACGTGATATCGGCT-3，，ura5-SP22 5，-GAGGGCGGTCAGACGGCGGGTATT-3，和 ura5_SP33 :5，-CGTCGTCAAGATGCGCGACATCGTT-3，，做為上遊引物，按照試劑盒說明書進行3』翼側染色體步移操作，除Specific ft~imer分別由 ura5-SPl，ura5-SP2，ura5-SP3 依次更換為 ura5-SPll，ura5_SP22，ura5_SP33 外，其它同實施例4。
3rd巢式PCR反應產物利用DNA片段凝膠純化試劑盒(購自碧雲天)進行純化，經 TA克隆插入pMD18-T載體(購自TakaRa公司)，轉化DH5 α感受態細胞；其中感受態細胞按氯化鈣法(分子克隆實驗指南第三版，薩姆布魯克著，黃培堂等譯，科學出版社出版)製備。挑選Amp抗性轉化子進行增菌培養、質粒提取。重組質粒樣品送至TaKaRa公司測序， 得到如SEQ ID NO 2所示的DNA序列，證實為預期的Rtura5t基因序列。
實施例6 :Rtura5啟動子-開放閱讀框架-終止子全長基因獲得 根據實施例4和實施例5中獲得的啟動子和終止子序列，重新設計一對引物進行 Rtura5 「啟動子-開放閱讀框架-終止子」全長基因的擴增。pRtura5t-pl :5，-TGCCGCCT ATCTGTTAAAACTCAATG-3，，pRtura5t-p2 :5，-GCCATTCAATCTGTTCAGCCACCC-3，。以實施例 3中製備的R. toruloides基因組DNA為模板進行PCR擴增。PCR體系(50 μ 1) =IOXSpeed buffer 5.0 μ 1，dNTPs (10mmol/l) 1. 0 μ 1，上遊引物 Rtura5_pl (10 μ mol/1) 2. 0 μ 1，下遊引 ^ Rtura5-p2 (10 μ mol/1) 2. 0 μ 1，SpeedSTAR HS DNA 聚合酶(擴增速度快，lkb/10s，購自大連TaKaRa公司)0. 5 μ 1，基因組DNA模板(120ng/μ 1) 2 μ 1，ddH20加至50 μ 1。反應條 # 98°C lmin,98°C 10s，65°C 1. Omin，35 個循環，72°C lOmin，4°C結束反應。PCR 產物經 (質量/體積濃度)瓊脂糖凝膠電泳分析後利用PCR片段純化試劑盒(購自碧雲天)進行純化。片段經TA克隆插入pMDIS-T載體(購自TakaRa公司)，轉化DH5 α感受態細胞；其中感受態細胞按氯化鈣法(分子克隆實驗指南第三版，薩姆布魯克著，黃培堂等譯，科學出版社出版)製備。挑選Amp抗性轉化子進行增菌培養、質粒提取。重組質粒樣品送至TaKaRa 公司測序，得到如SEQ ID NO :6所示的DNA序列，證實為預期的pRtura5t全長序列，該重組載體命名為T-pRtura5t。
實施例7 圓紅冬孢酵母特異性綠色螢光蛋白表達盒ura5gfp的構建 ura5gfp圓紅冬孢酵母特異性綠色螢光蛋白表達盒的構建利用的是RF克隆(Van den Ent, F. , Lowe, J. ,2006. RF cloning :A restriction-free method forinserting target genes into plasmids. J. Biochem. Biophys. Methods 67 :67-74 ；Yang F, Zhang S, Tang W, Zhao Z,2008. Identification of theorotidine-5 ' -monophosphate decarboxylase gene of the oleaginous yeastRhodosporidium toruloides. Yeast 25(9) :623-630)的方法。
pRtura5t全長序列擴增和克隆見實施例6。
1.綠色螢光蛋白編碼基因GFPuv的獲得 以pGFPuv質粒(購自BD Biosciences)為模板，利用一對引物gfp-pl 5， -ATGAGTAAAGGAGAAGAACT-3 『和 gfp_p2 5' -TCATTTGTAGAGCTCATCCAT-3，，進行 PCR 擴增。體系(50 μ 1) 5XPrimebuffer 10. 0 μ 1，dNTPs (2. 5mmol/l) 4. 0 μ 1，上遊引物 gfp-pl (10 μ mol/1) 2. 0 μ 1，下遊引物 gfp-p2 (10 μ mol/1) 2. 0 μ 1，PrimeSTAR HS DNA 聚合酶(大連 TakaRa) 1. 0 μ 1，pGFPuv 質粒(120ng/ μ 1) 1 μ 1，ddH20 加至 50 μ 1。反應條件 95°C 3min，98°C 8s, 49°C 15s，72°C lmin，；35 個循環，72°C lOmin，4°C結束反應。PCR 反應產物利用DNA片段膠回收純化試劑盒純化，利用taq DNA聚合酶進行DNA片段3，末端加A， 體系(50μ1) 10 X PCRbuffer 5. 0μ 1, dNTPs (2. 5mmol/l) 4· 0 μ 1，純化後的 GFPuv DNA 片段30μ l，ddH20加至50μ 1。反應條件72°C 30min，4°C結束反應。3，末端加A後的GFPuv DNA片段利用DNA片段膠回收純化試劑盒純化，克隆入pMDIS-T載體，送TaKaRa公司測序， 得到如SEQ ID NO :7所示的DNA序列，證實為預期的GFPuv基因序列。
2.參照文獻方法(Van den Ent, F. , Lowe, J. ,2006. RF cloning Are strict ion-free method for inserting target genes into plasmids. J. Biochem. Biophys. Methods 67:67-74)，設計 RF 克隆引物ura5-gfp-pl 5 『 -CACGAGGTCGAAAACACCGTCAG atgagtaaaggagaagaact-3 『 禾口 ura5_gfp_p2 5' -GGAACTGCCCAGACGCACTTGTAT ctatttgtagagctcatccat-3『(其中大寫字母部分序列與pRtura5t克隆載體中原有的ura50RF翼側序列互補，小寫字母部分序列與綠色螢光蛋白 GFPuv ORF 互補)。
3. RF I反應體系及流程以本實施例操作項1中構建的GFPuvTA克隆載體為模
10板，利用ura5gfp-pl和ura5gfp-p2為引物，進行RF第一輪擴增。體系(50 μ 1) 5XPrime buffer 10. 0μ 1, dNTPs (2. 5mmol/l)4. 0μ 1，上遊引物(10 μ mol/1) 2. 0 μ 1，下遊引物 (10 μ mol/1) 2· 0 μ 1，PrimeSTAR HS DNA 聚合酶(大連 TakaRa) 1. 0 μ 1，T-GFPuv 質粒 (lOOng/μ 1) 1 μ 1, ddH20 加至 50 μ 1。反應條件:95V 3min，98°C 8s, 49°C 15s，72°C lmin, 30個循環，72°C 10min，4°C結束反應。RF I反應產物利用DNA片段膠回收純化試劑盒純化，-20°C保存備用。
4. RF II 反應5 XPrime buffer 10. 0 μ 1，dNTPs (2. 5mmol/l) 4. 0 μ 1，實施例 6 中構建的T-pRtura5t質粒(lOOng/μ 1) 1. 0 μ 1，本實施例前述步驟中RFI反應產物(IOOng/ μ 1) 5. 0 μ 1，PrimeSTAR HS DNA 聚合酶(大連 TakaRa) 1. 0 μ 1，ddH20 加至 50 μ 1。反應條件:95V 3min，68°C 12min，之後 95°C 30s, 65°C 45s (_1°C /cyc)，68°C 12min, 15 個循環，接下來再進行一輪95°C 30s, 55°C 45s, 68°C 12min，20 個循環，72°C lOmin，4°C結束反應。
5. DpnI消化和電擊轉化取8μ 1 RF II反應產物加入Ιμ DpnI (購自New England Biolabs)和 1 μ 1 DpnI buffer 混勻後在37°C作用 120min去除原T_pl tura5t質粒後，分別取2μ1電擊轉化DH5ci感受態細胞，感受態細胞按標準方法製備(分子克隆實驗指南第三版，薩姆布魯克著，黃培堂等譯，科學出版社出版)，電擊轉化參數2200-2500V， 400Q，25yF，0°C。挑選Amp抗性轉化子進行增菌培養、質粒提取，並利用RF I反應所用引物ura5gfp-p 1和ura5gfp-p2進行菌落PCR鑑定，鑑定陽性的重組載體送TaKaRa進行測序， 得到5』端和3』端分別為ura5啟動子和ura5終止子的ura5gfp表達盒，同時，該重組載體命名為pura5gfp。GFPuv ORF序列如SEQ ID NO :7所示；完整的ura5gfp表達盒如SEQ ID NO 8所示。
實施例8 利用ura5gfp表達盒進行Rtura5基因敲除兼綠色螢光蛋白表達 1. Rtura5gfp敲除盒的製備 以實施例7構建的pUra5gfP載體為模板，以實施例6中的寡核苷酸序列 pRtura5t-pl和pRtura5t_p2為引物，進行Rtura5gfp敲除盒的大量製備。PCR體系 (500 μ 1) 10 X Speed buffer 50. 0 μ 1，dNTPs (10mmol/l) 10. 0 μ 1，上遊引物(lOymol/ 1)20. 0μ 1,下遊引物(10 μ mol/1) 20. 0 μ 1, SpeedSTAR HS DNA 聚合酶(大連 TaKaRa 公司)5.0μ 1，基因組DNA模板(120ng/y 1)15. 0μ 1，ddH20加至500 μ 1。反應條件 980C lmin，98°C 10s，65°C 60s，；35 個循環，72°C lOmin，4°C結束反應。PCR 產物經 (質量 /體積濃度)瓊脂糖凝膠電泳分析後利用PCR片段純化試劑盒(購自碧雲天)進行純化。 純化後的DNA片段濃度在380ng/l·! 1，共50μ 1，_20°C保存備用。
2.單倍體圓紅冬孢酵母ATCC 10788感受態細胞製備 R. toruloides npll 感受態細胞的製備R. toruloides ATCC 10788(購自美國標準生物品收藏中心ATCC)菌株挑菌落接種10ml YEPD培養基(葡萄糖20. Og/Ι，酵母提取物 10.0g/l，蛋白腖 20.0g/l，pH 6. 0)，30°C，200rpm，培養 20h ；培養物 1 50 比例轉接新鮮YEPD培養基，100ml (500ml錐形瓶，裝液量100ml) ,30 °C, 200rpm,培養6_9h，OD值達到 0. 6-1. 2 ；培養物冰浴 10-30min，4°C，4000rpm 離心 5min，棄上清；0°C無菌 Milli-Q 水洗 1 次；0°C lmol/1山梨醇洗滌2次；冰浴，備用。
3.圓紅冬孢酵母ATCC 10788的電擊轉化和轉化子的PCR鑑定 Rtura5gfp 敲除盒的電擊轉化取 100 μ 1 R. toruloides ATCC 10788 感受態細胞，加入Rtura5gfp敲除盒5 μ 1 (總共2 μ g)，混勻後冰浴5min，移入預冷至0°C的電擊杯中，電壓0. 8-2. 0千伏，電阻200 Ω，電容25 μ F，時間4-lOms ；電擊後立即加入Iml YEPD, 30°C溫育1- ；塗布YEPD平板，10 μ 1/平板，30°C培養觀_3乩；逐一挑單克隆利用螢光顯微鏡進行鏡檢，陽性重組子ATCC 10788 Δ ura5 gfp的螢光相片如圖5所示。
3株重組圓紅冬孢酵母ATCC 10788 Aura5: :gfp YEPD培養24h的培養物，利用生理鹽水(0.9% NaCl緩衝液)進行倍比稀釋，選擇其10-3、10-4、10_5、10-6四個稀釋度，分另Ij 移取10 μ 1菌液於含5』 -FOA (5』 -氟乳清酸，購自上海金和生物技術有限公司)的SC固體培養基(0. 2% 5' -F0A，葡萄糖 70g/L，(NH4)2SO4 0. lg/L，酵母粉 0. 75g/L，KH2PO4 0. 4g/L， MgSO4 ·7Η201. 5g/L，pH 6. 0)平板，待液體吸收完全，於30°C倒置培養2天，發現重組圓紅冬孢酵母ATCC 10788 Δ ura5:: gfp具備5，-FOA抗性，而對照菌株圓紅冬孢酵母ATCC 10788 則無菌落生長。
以上結果說明，Rtura5gfp敲除盒(表達盒)在啟動綠色螢光蛋白在圓紅冬孢酵母中的整合性表達的同時，可以滅活整合位置ura5基因編碼的乳清酸核苷-5'-磷酸脫羧酶活性。這樣的設計有利於後期的遺傳操作。
實施例9 圓紅冬孢酵母特異性博來黴素抗性表達盒ura5ble的構建 ura5ble圓紅冬孢酵母特異性博來黴素表達盒的構建，同樣是利用RF克隆的方法。pRtura5t全長序列擴增和克隆見實施例6。
1.參照文獻方法(Van den Ent, F. , Lowe, J. ,2006. RF cloning Arestriction—free method for inserting target genes into plasmids. J. Biochem. Biophys. Methods 67:67-74)，設計 RF 克隆引物ura5_ble_pl 5 『 -CACGAGGTCGAAAACACCGTCAG atggccaagttgaccagtgccgtt-3 『和 ura5_ble_p2 5' -GGAACTGCCCAGACGCACTT GTATctagtcctgctcctcggccacg-3『(其中大寫字母部分序列與pRtura5t克隆載體中原有的ura50RF翼側序列互補，小寫字母部分與博來黴素抗性基因 ble ORF 互補)。
2. RF I反應體系及流程以PPICZaA質粒(購自hvitrogen公司)為模板，利用 ura5ble-pl 和 ura5ble-p2 為引物，進行 RF 第一輪擴增。體系(50 μ 1) 5 XPrime buffer 10. 0μ 1, dNTPs (2. 5mmol/l)4. 0μ 1，上遊引物(10 μ mol/1) 2. 0 μ 1，下遊引物(lOymol/ 1)2. 0μ 1, PrimeSTAR HS DNA 聚合酶(大連 TakaRa) 1· 0 μ 1，pPICZ α A 質粒(lOOng/ μ 1) 1 μ 1，ddH20 加至 50 μ I0 反應條件95°C 3min，98°C 8s, 49°C 15s，72°C lmin，30 個循環，72°C 10min，4°C結束反應。RF I反應產物利用DNA片段膠回收純化試劑盒純化，-20°C 保存備用。
3. RF II 反應5 XPrime buffer 10. 0 μ 1，dNTPs (2. 5mmol/l) 4. 0 μ 1，實施例 6 中構建的T-pRtura5t質粒(lOOng/μ 1) 1. 0 μ 1，本實施例前述步驟中RFI反應產物(lOOng/ μ 1) 5. 0 μ 1，PrimeSTAR HS DNA 聚合酶(大連 TakaRa) 1. 0 μ 1，ddH20 加至 50 μ 1。反應條件95°C 3min，68°C 12min，之後 95°C 30s, 65°C 45s(_l°C /cyc)，68°C 12min，15 個循環，接下來再進行一輪95°C 30s, 55°C 45s, 68°C 12min，20 個循環，72°C lOmin，4°C結束反應。
4. DpnI消化和電擊轉化取8μ 1 RF II反應產物加入Ιμ DpnI (購自New England Biolabs)禾口 1 μ 1 DpnI buffer 混勻後在37°C作用 120min去除原T_pl tura5t質粒後，分別取2μ1電擊轉化DH5ci感受態細胞，感受態細胞按標準方法製備(分子克隆實驗指南第三版，薩姆布魯克著，黃培堂等譯，科學出版社出版)，電擊轉化參數2200-2500V， 400Q，25yF，0°C。挑選Amp抗性轉化子進行增菌培養、質粒提取，並利用RF I反應所用引物ura5ble-pl和urMble-p2進行菌落PCR鑑定，鑑定陽性的重組載體送TaKaRa進行測序，得到5』端和3』端分別為ura5啟動子和ura5終止子的urMble表達盒，同時，該重組載體命名為pura5ble。ble ORF序列如SEQ ID NO 9所示；完整的ura5ble表達盒如SEQ ID NO 10 所示。
實施例10 利用urMble表達盒進行Rtura5基因敲除兼博來黴素抗性表達 LRtura^3Ie敲除盒的製備 以實施例9構建的purMble載體為模板，以實施例6中的寡核苷酸序列 pRtura5t-pl和pRtura5t_p2為引物，進行Rtura5ble敲除盒的大量製備。PCR體系 (500 μ 1) 10 X Speed buffer 50. 0 μ 1，dNTPs (10mmol/l) 10. 0 μ 1，上遊引物(lOymol/ 1)20. 0μ 1,下遊引物(10 μ mol/1) 20. 0 μ 1, SpeedSTAR HS DNA 聚合酶(大連 TaKaRa 公司)5.0μ 1，基因組DNA模板(120ng/y 1)15. 0μ 1，ddH20加至500 μ 1。反應條件 980C lmin，98°C 10s，65°C 60s, 35 個循環，72°C lOmin，4°C結束反應。
PCR產物經(質量/體積濃度)瓊脂糖凝膠電泳分析後利用PCR片段純化試劑盒(購自碧雲天)進行純化。純化後的DNA片段濃度在300ng/yl，共50μ1，-20 保存 2.單倍體圓紅冬孢酵母ATCC 10788感受態細胞製備 R. toruloides npll感受態細胞的製備同實施例8中的操作項3。
3.圓紅冬孢酵母ATCC 10788的電擊轉化和轉化子的PCR鑑定 Rtura5ble 敲除盒的電擊轉化取 100 μ 1 R. toruloides ATCC 10788 感受態細胞，加入Rtura5ble敲除盒10 μ 1 (總共3 μ g)，混勻後移入預冷至0°C的電擊杯中，電壓 0. 8-2. 0千伏，電阻200 Ω，電容25 μ F，時間4_10ms ；電擊後立即加入Iml YEPD, 30°C溫育 l-2h ；塗布含 20 μ g/ml Zeocin (購自 Invitrogen 公司)的 YEPD 平板，200 μ 1/ 平板，30°C 培養2-10d，約有100個轉化子陸續出現。
挑取3個kocin抗性轉化子於YEPD培養基中培養Mh，培養物利用生理鹽水 (0.9% NaCl緩衝液)進行倍比稀釋，選擇其10_3、10_4、10_5、10_6四個稀釋度，分別移取 10 μ 1菌液點樣於含5』 -FOA(購自上海金和生物技術有限公司)的SC固體培養基(0. 2% 5，_F0A，葡萄糖 70g/L，(NH4)2SO4O. lg/L，酵母粉 0. 75g/L，KH2PO4 0. 4g/L，MgSO4 ·7Η20 1. 5g/ L，pH 6. 0)平板，待液體吸收完全後，於30°C倒置培養3天，發現重組圓紅冬孢酵母ATCC 10788 Δ ura5: :ble具備5，_F0A抗性，而對照菌株圓紅冬孢酵母ATCC10788則無菌落生長。
以上結果說明，Rtur^ble敲除盒(表達盒)在啟動博來黴素抗性基因在圓紅冬孢酵母中整合性表達的同時，可以滅活整合位置ura5基因編碼的乳清酸核苷-5'-磷酸脫羧酶活性。這樣的設計有利於後期的遺傳操作。
實施例11 圓紅冬孢酵母特異性遺傳黴素抗性表達盒ura5kan的構建 ura5kan圓紅冬孢酵母特異性遺傳黴素抗性表達盒的構建，同樣是利用RF克隆的方法。pRtura5t全長序列擴增和克隆見實施例6。
1.參照文獻方法(Van den Ent，F.，Lowe，J.，2006. RF cloning Are strict ion-free method for inserting target genes into plasmids.
13J. Biochem. Biophys. Methods 67:67-74)，設計 RF 克隆引物ura5_kan_pl 5 『 -CACGAGGTCGAAAACACCGTCAG atgggtaaggaaaagactcacgt-3 『 禾口 ura5_kan-p2 5' -GGAACTGCCCAGACGCACTT GTATttagaaaaactcatcgagcatc-3『(其中大寫字母部分序列與pRtura5t克隆載體中原有的ura50RF翼側序列互補，小寫字母部分序列與遺傳黴素抗性基因kanmx40RF互補)。
2. RF I反應體系及流程以pFA6-kanmx4質粒(購自EUROSCARF)為模板，利用 ura5kan-pl 和 ura5kan-p2 為引物，進行 RF 第一輪擴增。體系(50 μ 1) 5 XPrime buffer 10. O μ 1, dNTPs (2. 5mmol/l)4. Ομ 1，上遊引物(10 μ mol/1) 2. O μ 1，下遊引物(lOymol/ 1)2. Ομ 1, PrimeSTAR HS DNA 聚合酶(大連 TakaRa) 1· O μ 1，pFA6_kanmx4 質粒(llOng/ μ 1) 1 μ 1，ddH20 加至 50 μ I0 反應條件95°C 3min，98°C 8s, 49°C 15s，72°C lmin，30 個循環，72°C 10min，4°C結束反應。RF I反應產物利用DNA片段膠回收純化試劑盒純化，-20°C 保存備用。
3. RF II 反應5 XPrime buffer 10. O μ 1，dNTPs (2. 5mmol/l) 4. O μ 1，實施例 6 中構建的T-pRtura5t質粒(lOOng/μ 1) 1. O μ 1，本實施例前述步驟中RFI反應產物(IOOng/ μ 1)5. Ομ 1, PrimeSTAR HS DNA 聚合酶(大連 TakaRa) 1. O μ 1，ddH20 加至 50 μ 1。反應條 # 95°C 3min，68°C 12min，之後 95°C 30s, 65°C 45s(_l°C /cyc)，68°C 12min，15 個循環，接下來再進行一輪95°C 30s, 55°C 45s, 68°C 12min，20 個循環，72°C lOmin，4°C結束反應。
4. DpnI消化和電擊轉化取8μ 1 RF II反應產物加入Ιμ DpnI (購自New England Biolabs)和 1 μ 1 DpnI buffer 混勻後在37°C作用 120min去除原T_pl tura5t質粒後，分別取2μ1電擊轉化DH5ci感受態細胞，感受態細胞按標準方法製備(分子克隆實驗指南第三版，薩姆布魯克著，黃培堂等譯，科學出版社出版)，電擊轉化參數2200-2500V， 400Q，25yF，0°C。挑選Amp抗性轉化子進行增菌培養、質粒提取，並利用RF I反應所用引物ura5kan-p 1和ura5kan-p2進行菌落PCR鑑定，鑑定陽性的重組載體送TaKaRa進行測序， 得到5』端和3』端分別為ura5啟動子和ura5終止子的ura5kan表達盒，同時，該重組載體命名為pura5kan。kanmx ORF序列如SEQID NO :11所示；完整的ura5kan表達盒如SEQ ID NO 12所示。
實施例12 利用ura5kan表達盒進行Rtura5基因敲除兼遺傳黴素抗性表達 1. Rtura5kan敲除盒的製備 以實施例11構建的purMkan載體為模板，以實施例6中的寡核苷酸序列 pRtura5t-pl和pRtura5t_p2為引物，進行Rtura5kan敲除盒的大量製備。PCR體系 (500 μ 1) 10 X Speed buffer 50. 0 μ 1, dNTPs (10mmol/l) 10. 0 μ 1，上遊引物(lOymol/ 1)20. 0μ 1,下遊引物(10 μ mol/1) 20. 0 μ 1, SpeedSTAR HS DNA 聚合酶(大連 TaKaRa 公司)5.0μ 1，基因組DNA模板(120ng/y 1)15. 0μ 1，ddH20加至500 μ 1。反應條件 980C lmin，98°C 10s，65°C 60s, 35 個循環，72°C lOmin，4°C結束反應。
PCR產物經1 % (質量/體積濃度)瓊脂糖凝膠電泳分析後利用PCR片段純化試劑盒(購自碧雲天)進行純化。純化後的DNA片段濃度在300ng/yl，共40μ1，-20 保存 2.單倍體圓紅冬孢酵母ATCC 10788感受態細胞製備 R. toruloides npll感受態細胞的製備同實施例8中的操作項3。
3.圓紅冬孢酵母ATCC 10788的電擊轉化和轉化子的PCR鑑定 Rtura5kan 敲除盒的電擊轉化取 100μ 1 R. toruloides ATCC 10788 感受態細胞，加入Rtura5kan敲除盒10 μ 1 (總共3. 2 μ g)，混勻後冰浴5min，移入預冷至0°C的電擊杯中，電壓0. 8-2. 0千伏，電阻200 Ω，電容25 μ F，時間4-lOms ；電擊後立即加入Iml YEPD, 30°C溫育l_2h ；塗布含50μβ/πιΚΜ18(購自北京舟鼎國)的YEPD平板，200 μ 1/平板，30°C 培養2-10d，約有60個轉化子陸續出現。
挑取3個G418抗性轉化子於YEPD培養基中培養Mh，培養物利用生理鹽水(0. 9% NaCl緩衝液)進行倍比稀釋，選擇其10_3、10_4、10_5、10_6四個稀釋度，分別移取10 μ 1菌液點樣於含5』-FOA(購自上海金和生物技術有限公司)的SC固體培養基(0.2% 5』-F0A， 葡萄糖 70g/L, (NH4)2SO4O. lg/L，酵母粉 0. 75g/L，KH2PO4 0. 4g/L，MgSO4 · 7H20 1. 5g/L， PH 6.0)平板，待液體吸收完全後，於30°C倒置培養3天，發現重組圓紅冬孢酵母ATCC 10788 Δ ura5: :kan具備5，_F0A抗性，而對照菌株圓紅冬孢酵母ATCC10788則無菌落生長。
以上結果說明，Rtur^kan敲除盒(表達盒)在啟動遺傳黴素抗性基因在圓紅冬孢酵母中整合性表達的同時，可以滅活整合位置的ura5基因編碼的乳清酸核苷-5'-磷酸脫羧酶活性。這樣的設計有利於後期的遺傳操作。
實施例13 :PRtura5啟動子和Rtura5t終止子的屬內(不同種間)活性測定 也即ura5gfp、ura5ble、ura5kan 等表達盒在 R. babjevae 的功能驗證。
在此利用^SrDNA基因做為整合位點，通過融合PCR方法使每個整合表達盒5』末端攜帶有約500bp的^SrDNA基因同源重組臂，分別進行ura5gfp表達盒、urMble表達盒、 ura5kan表達盒在R. babjevae中的整合性表達。
1.根據 NCBI 公布的 R. babjevae 26SrDNA 序列(NO. :EF595746)，設計一對引物 Rb26S-Rtura5-pl 5，-AGCGGCGAGCGAAGCGGTAAG-3，和 Rb26S_Rtura5_p2 :5，-gagttttaacag ataggcggcaACGCTGCGTTCCTCAGTCCCC-3，(其中大寫字母部分序列與R. babjevae 26SrDNA ψ 列3』端同源，小寫字母部分序列與圓紅冬孢酵母pura5啟動子5』端互補)。
2. Rb26S-Rtura5gfp、Rb26S_Rtura5ble、Rb26S-Rtura5kan 的構建 分別利用實施例5、實施例7和實施例9中的Pura5gfp、Pura^3Ie和Pura^an載體為模板，分別進行 M^6S-Rtura5gfp、M^6S-Rtura5ble、Rb26S-Rtura5kan 等 3 個融合表達盒的構建。PCR體系(各 500 μ 1) 10 X Speedbuffer 50. 0 μ 1, dNTPs (10mmol/l) 10. 0 μ 1， 上遊引物(10μπιο1/1)20. 0μ 1，下遊引物(10 μ mol/1) 20. 0 μ 1, SpeedSTAR HS DNA 聚合酶 5.0 μ 1，DNA 模板質粒 Rira5gfp 或 Pura5ble 或 Rira5kan (均 120ng/y 1)15.0 μ l,ddH20 加至 500 μ 1。反應條件98°C lmin,98°C 10s，65°C 60s，；35 個循環，72°C 10min，4°C 結束反應。
PCR產物經(質量/體積濃度)瓊脂糖凝膠電泳分析後利用PCR片段純化試劑盒(購自碧雲天)進行純化。純化後的Rl^6S-Rtura5gfp、Rb26S-Rtura5ble和 Rb26S-Rtura5kan 表達盒濃度分別為 3IOng/μ l、300ng/y 1 和 270ng/μ 1，均 45μ 1,-20°C
保存備用。
3. R. babjevae ATCC90942 感受態細胞製備 R. babjevae ATCC90942購自購自美國標準生物品收藏中心。首先，挑菌落接種 10ml YEPD培養基，觀°C，200rpm，培養24h ；培養物1 50比例轉接新鮮YEPD培養基，100ml (500ml 錐形瓶，裝液量 100ml)，28°C，200rpm,培養 7-10h, OD 值達到 0. 6-1. 2 ；培養物冰浴 10-30min，4°C，4000rpm 離心 5min，棄上清；0°C無菌 Milli-Q 水洗 1 次；0°C lmol/1 山梨醇洗滌2次；冰浴，備用。
4. R. babjevae ATCC90942的電擊轉化和表達結果觀察 取3 份 100 μ 1 R. babjevae ATCC90942 感受態細胞，分別加入 Rl^6S-Rtura5gfp、 Rb26S-Rtura5ble和Rl^6S-Rtura5kan表達盒各10 μ 1，混勻後移入預冷至0°C的電擊杯中，電壓0. 8-2. 0千伏，電阻200 Ω，電容25 μ F，時間4-lOms ；電擊後立即加入Iml YEPD, 30°C 溫育 1- ；Rb26S-Rtura5gfp 轉化液塗布 YEPD 平板，10 μ 1/ 平板；Rb26S-Rtura5ble 轉化液塗布含20 μ g/mlZeocin (購自hvitrogen公司)的YEPD平板，200 μ 1/平板； Rb26S-Rtura5kan轉化液塗布含50 μ g/ml G418 (購自北京舟鼎國)的YEPD平板，200 μ 1/ 平板；均培養2-10d。
R. babjevae ATCC90942/Rb26S-Rtura5gfp 轉化子逐一挑單克隆利用螢光顯微鏡進行鏡檢，每40個轉化子中可有一個螢光表達的陽性重組子，螢光相片略; Rb26S-Rtura5ble轉化液塗布含20 μ g/ml Zeocin的YEPD平板，培養5d時可觀察到大小不一的抗性重組子，平均100個/平板，轉化重組效率200個重組子/ μ g表達盒DNA ； Rb26S-Rtura5kan轉化液塗布含50 μ g/ml G418的YEPD平板，培養6d時可觀察到大小不一的抗性重組子，平均100個/平板，轉化重組效率200個重組子/ μ g表達盒DNA。
各表達盒在R. babjevae ATCC90942的表觀轉化重組效率，比在R. toruloides ATCC 10788中的高，可能是由於在R. babjevae ATCC90942進行的是單位點同源重組，而在 R. toruloides ATCC10788進行的是雙位點同源重組的原因。
以上實施例證明，ura5啟動子能夠啟動綠色螢光蛋白基因、博來黴素抗性基因和遺傳黴素抗性基因在R. toruloides ATCC 10788中的整合性表達；ura5gfp表達盒、 ura5ble表達盒、ura5kan表達盒為基礎構建的線性DNA敲除盒，能夠敲除圓紅冬孢酵母基因組上的ura5靶基因。使用本發明的具有啟動子活性的DNA分子和具有轉錄終止子活性的DNA，可實現外源基因或內源基因在圓紅冬孢酵母中的表達，本發明提供了用於遺傳工程圓紅冬孢酵母的啟動子、終止子和一系列DNA構建體。為圓紅冬孢酵母開啟了一條育種新途徑，並因此可以提供具有工業用途的新型圓紅冬孢酵母。並為紅冬孢酵母屬的其它酵母菌的遺傳操作提供了方法和平臺。
實施例14 圓紅冬孢酵母乳清酸磷酸核糖轉移酶OPRTase的結構表徵 參考分子克隆實驗指南第三版(薩姆布魯克著，黃培堂等譯，科學出版社出版)經分子排阻、離子交換純化得到圓紅冬孢酵母OPRTase。OPRTase晶體在室溫下通過懸滴法獲得。採用稀疏矩陣採樣法，摸索可獲得滿足高解析度結構解析要求的晶體的參數。最終的結晶條件如下=RtFBA蛋白溶液(15mg/ml)和等體積的母液(0. IM Tris-HCl (pH 7. 4),0. 08M 醋酸鎂二6% (w/v)聚乙二醇6000)混合，2-3周內出現晶體。用多波長反常散射法(MAD) 確定位相，MAD數據在ADSC Quantum-4R CXD探測器上收集，所有數據用DPS軟體包進行統一，用CCP4軟體包進行坐標修正與處理。模型用XtalView 4. 0軟體在Silicon Graphics OCTANE上構建和校正，用REFMAC程序進行精化。圓紅冬孢酵母OPRTase晶體屬於空間群 P4&2，晶格常數為a:=60A，b=60 λ, c=135 Α，根據衍射數據得到三維結構模型見圖 12。
本發明的有益效果是 為圓紅冬孢酵母或紅冬孢酵母屬的酵母菌提供了啟動子、終止子、選擇性標記基因表達盒和遺傳轉化方法，將有力促進今後的圓紅冬孢酵母或紅冬孢酵母屬的酵母菌的菌株改良研究，加快圓紅冬孢酵母代謝工程研究。
0157]SEQ ID NO10158]TGCCGCCTATCTGTTAAAACTCAATGGATACAATGCAAAGT0GGCTCGCGCCCTCTTCTC600159]CCGTTCCCCCGTACCTAGACATGCGT0GTGAGTGCTTCCCTCCGTCATGCAACCGT0GCA1200160]AGCTCCTCGCTCCGT0GTCGCTGCTGAAGCTGCTCCTG0GCAATC0GCTG0G0GGCGGGT1800161]ACCT0GCCTCGCTCCCTTTC0GCCGCCCGAATCGCCTGTGTGAGCCTGTTCCTC0GAGAC2400162]ACGACCAT0GTCTTGGGATTGGCTTGTGGTA0GGGCAGAGGGCTGGTCTCTGCAATTGAG3000163]CAAG0GAGCCGAGGCAG0GATGGTCAGTTCCGGT0GCAGAC0GAGGCTCCAGGGAAGGGA3600164]0GGCGGGA0GCACTGATGACGC0GGCCTGAATGAGCAGCTTCTCAAAGCGCTTTGT0GGC4200165]AG0GCACCCTGGCTGAGCCAGTAC0GGACCCGCTCCAGGTTCCACTCGACCTTCTTCTGC4800166]CCGACCTTGGCGA0GCC0GTGTTGGG0GTGTGCTGC0GTGGTCCCCACTCCTTCGGGTCC5400167]CTGACCTGACCGTTTGG0GAGACCGA0GGCGCTGGCACGA CGACCGGTCG0GGGTTGTAC6000168]GAAC0GAGGAGCT0GAGGGGTTTGGCGGTCTGGCGCTG0GG0G0G0GGATGG0GACGAGC6600169]GAGTAGACGGGGTTGTTGCG0GTGCAGTGGTGGCGCGCGAGGCGCAATCGGACCGACATC7200170]TCGTGCGCTGG0GGAGAGCGAGTGTG0GAGGACGAGGAAAAGGAG0GGGAGGAGGAGGGT7800171]TGGGAG0GAACCACCTCGTGCAGCTGGACTGGACGCGCTAGACGACTGCCAGACTCGCTA8400172]TACTGCTCTTTACATCCGCTAGAATCCTGCACCCGCTCGAACCAGCTCCTCCCACCGTCA9000173]GTTCGCCTCCCCCTCTCATCCTCATCTCTCAAAGGACTTCCTCGCTCGCAACTCGCTGGA9600174]GGGAGCTGCAAGACTGACACGAGGTCGAAAACAC0GTCAG10000175]SEQ ID NO 20176]ATACAAGTGCGTCTGGGCAGTTCCCCTCTTTTGCGTAGOG TACCCGCACGATTTACTGAC600177]GCAACT0GGGCGCTACAGTCCTGTCAATCTATCG0GATCTT0GCAGCGACACTCGC0GCT1200178]TC0GATTCCCGACTTTG0GTCCATCT0GCTCGCTTCGATAAGCTTCTTTGGCTGCTACAG1800179]ACGGCTCTCAACTCTGCTGGAAGATGCAGCATCAGCACTCA0GGGCTCCGCAACAGCTGC2400180]TGTCACGCCTCGAGTTCAGT0GGGCAGCTCT0GCCATCTCGCAACCCGTT ATGG0GATGG3000181]TCGACC0GTCT0G0GGCTTTCCCAGCGCTGCGTTTC0GCTTCAGCTGTCG0GGTACAAAC3600182]TTCATCGCCCCGTAG0GAGC0GTCTCTCGCGCAA0GAGGCAATCT0G0GCTTCTCTCCCT4200183]AA0GCTTTCTATCGGTCCCGGCCTCTCTCCCGCGGACTCTAAGAGACGTCGA0GCAGTTT4800184]0GATAT0GTCAACAG0GAGCGCAGACGAGCACTGCC0GAGCAGTGAA0GA0GACGAGCTC5400185]TGTA0GAAGCGAT0GGATCCGC0GCCTT0GCTCG0GACATGCT0GAGCTTTCCTGATCAC6000186]CTTGTCTGAG TTGCTCAGGCTCTGCTAAGTCAGT0GTG0GCAT0GGAGTTTGCTGAGG0G6600187]OGAGAAGGAT ATTACAGCTCGTACGAAGGACGGCGACTCTGGCTCGCTGTCCGTCACA0G7200188]AGACAGAGGC CAGCCTCGACCT0GTCAG0GAGTCGGTCTGTCCATGA0GGCTMCTMTG7800189]AGGGTGGCTG AACAGATTGAATGGC8050190]SEQ ID N0:3(圓紅冬孢酵母乳清酸磷酸核糖轉移酶cDNA序列)0191]ATGAGCGCCA CGTCCTAOGC OGCCTCGATC ATCGAGACOG CTCTCGCGAG 0GAGCAGCCC600192]ATCCTC0GCTT0GGCACCTTCACCCTCAAGTCTGGC0GCTCCT0GCCCTACTTCTTCAAC1200193]TTTGGCCTCTTCAACAC0GGCTCTCTCCTCCTCGCTCT0GCCT0GGCCTT0GCAGA0GCC1800194]ATCCTCGA0GCCTACCC0GAGATTGGCTCCTCCTCCGC0GGTCCCGACACGCCCAAAGTC2400195]CTCTTCGGACC0GCCTACAAGGGCATCCCCCTCGTCGCTGCTATCGCATC0GAACT0GCA3000196]0GACGAGGACGTGATAT0GGCTACAGCTACAACCGCAAGGAGAAGAAGGACCACGG0GAG3600197]GG0GGGTCGATTGTCGGTGCGC0GCTCAAGGGACAGAAGGTCCTCAT0GT0GACGA0GTG4200198]ATCA0GGC0GGTACTGCGATTCGCGAGG0GCACAAGAT0GT0GAGTCGGAGGGCGGTCAG4800199]ACGG0GGGTATTGTCGAGGCCCTCGACCGGGAGGAG0G0GGACAGGG0GAGCTCAGTA0G5400200]GTCCAGGAAGT0GAGAAGGAGCTCGG0GTCAAGGTCACGAG0GTCGTCAAGATG0G0GAC6000201]AT0GTTGCGTGGCTCAAAGAGAAGGGCAAGCTCGACGAGATGAAGGCCATGGAGGAGTAC6600202]0G0GCAAAGTGGGGCGTTAACTAG684
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0220
SEQ Met Ala Ser Thr Ile Asp Leu Ile Gly Ile His Glu Val Val Leu Val SEQ
ID NO 4SerAlaThrSerTyrAlaAlaSerlielieGluThrAlaLeuSerGluGlnProlieLeuArgPheGlyThrPheThrLeuLysGlyArgSerSerProTyrPhePheAsnPheGlyLeuPheAsnGlySerLeuLeuLeuAlaLeuAlaSerAlaPheAlaAspAlaLeuAspAlaTyrProGlulieGlySerSerSerAlaGlyProThrProLysValLeuPheGlyProAlaTyrLysGlylieProValAlaAlalieAlaSerGluLeuAlaArgArgGlyArgAspGlyTyrSerTyrAsnArgLysGluLysLysAspHisGlyGluGlySerlieValGlyAlaProLeuLysGlyGlnLysValLeuValAspAspVallieThrAlaGlyThrAlalieArgGluAlaLysIleValGluSerGluGlyGlyGlnThrAlaGlylieValAlaLeuAsPArgGluGluArgGlyGlnGlyGluLeuSerThrGlnGluValGluLysGluLeuGlyValLysValThrSerValLysMetArgAsplieValAlaTrpLeuLysGluLysGlyLysAspGluMetLysAlaMetGluGluTyrArgAlaLysTrpGlyAsn
ID NO 5(圓紅冬孢酵母乳清酸磷酸核糖轉移酶基因組DNA序列)
0221]ATGAGCGCCA CGTCCTA0GC0GCCTCGATCATCGAGACOGCTCTCGCGAGOGAGCAGCCC600222]ATCCTC0GCTT0GGCACCTTCACCCTCAAGTCTGGCOGCTCCTOGCCCTACTTCTTCAAC1200223]TTTGGCCTCTTCAACAC0GGCTCTCTCCTCCTCGCTCTOGCCTOGGCCTTOGCAGAOGCC1800224]ATCCTCGA0GCCTACCC0GAGATTGGCTCCTCCTCCGCOGGTCCCGACACGCCCAAAGTC2400225]CTCTTCGGACC0GCCTACAAGGGCATCCCCCTCGTCGCTGCTATCGCATCOGAACTOGCA3000226]0GACGAGGACGTGATAT0GGCTACAGCTACAACCGCAAGGAGAAGAAGGACCACGGOGAG3600227]GG0GGGTCGATTGTCGGTGCGCOGCTCAAGGGACAGAAGGTCCTCATOGTOGACGAOGTG4200228]ATCA0GGC0GGTACTGCGATTCGCGAGGOGCACAAGATOGTOGAGTCGGAGGGCGGTCAG4800229]ACGG0GGGTATTGTCGAGGCCCTCGACCGGGAGGAGOGOGGACAGGGOGAGCTCAGTAOG5400230]GTCCAGGAAGT0GAGAAGGAGCTCGGOGTCAAGGTCACGAGOGTCGTCAAGATGOGOGAC600
18 ATOGTTGCGT GGCTCAAAGAGAAGGGCAAGCTCGACGAGATGAAGGCCATGGAGGAGTAC660 0G0GCAAAGT GGGGCGTTAACTAG684 SEQ ID NO (6 TGCCGCCTATCTGTTAAAACTCAATGGATACAATGCAAAGTOGGCTCGCGCCCTCTTCTC60 CCGTTCCCCCGTACCTAGACATGCGT0GTGAGTGCTTCCCTCCGTCATGCAACCGTOGCA120 AGCTCCTCGCTCCGT0GTCGCTGCTGAAGCTGCTCCTG0GCAATCOGCTGOGOGGCGGGT180 ACCT0GCCTCGCTCCCTTTC0GCCGCCCGAATCGCCTGTGTGAGCCTGTTCCTCOGAGAC240 ACGACCAT0GTCTTGGGATTGGCTTGTGGTA0GGGCAGAGGGCTGGTCTCTGCAATTGAG300 CAAG0GAGCCGAGGCAG0GATGGTCAGTTCCGGT0GCAGACOGAGGCTCCAGGGAAGGGA360 0GGCGGGA0GCACTGATGACGC0GGCCTGAATGAGCAGCTTCTCAAAGCGCTTTGTOGGC420 AG0GCACCCTGGCTGAGCCAGTAC0GGACCCGCTCCAGGTTCCACTCGACCTTCTTCTGC480 CCGACCTTGGCGA0GCC0GTGTTGGG0GTGTGCTGC0GTGGTCCCCACTCCTTCGGGTCC540 CTGACCTGACCGTTTGG0GAGACCGA0GGCGCTGGCACGA CGACCGGTCGOGGGTTGTAC600 GAAC0GAGGAGCT0GAGGGGTTTGGCGGTCTGGCGCTG0GGOGOGOGGATGGOGACGAGC660 GAGTAGACGGGGTTGTTGCG0GTGCAGTGGTGGCGCGCGAGGCGCAATCGGACCGACATC720 TCGTGCGCTGG0GGAGAGCGAGTGTG0GAGGACGAGGAAAAGGAGOGGGAGGAGGAGGGT780 TGGGAG0GAACCACCTCGTGCAGCTGGACTGGACGCGCTAGACGACTGCCAGACTCGCTA840 TACTGCTCTTTACATCCGCTAGAATCCTGCACCCGCTCGAACCAGCTCCTCCCACCGTCA900 GTTCGCCTCCCCCTCTCATCCTCATCTCTCAAAGGACTTCCTCGCTCGCAACTCGCTGGA960 GGGAGCTGCAAGACTGACACGAGGTCGAAAACACOGTCAG ATGAG0GCCAOGTCCTACGC1020 0GCCTCGATCATCGAGACCGCTCT0G0GAGCGAGCAGCCCATCCTCCGCTTCGGCACCTT1080 CACCCTCAAGTCTGGCCGCTCCTCGCCCTACTTCTTCAACTTTGGCCTCTTCAACACCGG1140 CTCTCTCCTCCTCGCTCTCGCCTCGGCCTTCGCAGA0GCCATCCTOGACGCCTACCCCGA1200 GATTGGCTCCTCCTC0GCCGGTCC0GACACGCCCAAAGTCCTCTTOGGACCCGCCTACAA1260 GGGCATCCCCCTCGT0GCTGCTAT0GCATCCGAACT0GCACGAOGAGGACGTGATATCGG1320 CTACAGCTACAAC0GCAAGGAGAAGAAGGACCACGG0GAGGGCGGGTOGATTGTOGGTGC1380 GC0GCTCAAGGGACAGAAGGTCCTCATCGTCGACGA0GTGATCACGGCCGGTACTGOGAT1440 TCGCGAGG0GCACAAGATCGTCGAGT0GGAGGGCGGTCAGAOGGCGGGTATTGTOGAGGC1500 CCTCGACCGGGAGGAGCGCGGACAGGGCGAGCTCAGTA0GGTCCAGGAAGTCGAGAAGGA1560 GCTCGG0GTCAAGGTCA0GAGCGT0GTCAAGATG0G0GACATCGTTGOGTGGCTCAAAGA1620 GAAGGGCAAGCTCGA0GAGATGAAGGCCATGGAGGAGTACCGCGCAAAGTGGGGCGTTAA1680 CTAGATACAAGTG0GTCTGGGCAGTTCCCCTCTTTTGCGTAGCGTACCCGCAOGATTTAC1740 TGACGCAACTCGGGCGCTACAGTCCTGTCAATCTAT0G0GATCTTOGCAGOGACACTCGC1800 0GCTTC0GATTCC0GACTTTGCGTCCATCTCGCT0GCTTCGATAAGCTTCTTTGGCTGCT1860 ACAGACGGCTCTCAACTCTGCTGGAAGATG CAGCATCAGCACTCAOGGGCTCOGCAACAG1920 CTGCTGTCACGCCTCGAGTTCAGTOGGGCA GCTCTCGCCATCTOGCAACCOGTTATGGOG1980 ATGGTCGACCCGTCT0G0GGCTTTCCCAGC GCTG0GTTTCCGCTTCAGCTGTOGOGGTAC2040 AAACTTCATCGCCCCGTAGCGAGCOGTCTC T0GCGCAA0GAGGCAATCTCGCGCTTCTCT2100 CCCTAA0GCTTTCTATCGGTCCOGGCCTCT CTCC0G0GGACTCTAAGAGAOGTCGAOGCA2160 GTTT0GATATCGTCAACAGCGAGCGCAGACGAGCACTGCCCGAGCAGTGA ACGAOGACGA2220 GCTCTGTA0GAAG0GAT0GGATCCGC0GCCTTCGCTOGOGACATGCTOGA GCTTTCCTGA2280 TCACCTTGTCTGAGTTGCTCAGGCTCTGCTAAGTCAGTOGTGCGCATOGG AGTTTGCTGA2340 GG0G0GAGAAGGATATTACAGCTCGTACGAAGGAOGGCGACTCTGGCTCG CTGTCCGTCA2400 CA0GAGACAGAGGCCAGCCT0GACCT0GTCAGCGAGTCGGTCTGTCCATGACGGCTAACT2460 AATGAGGGTGGCTGAACAGATTGAATGGC2489 SEQ ID NO 7 (綠色螢光蛋白編碼基因) ATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCACTGGAGTTGTCCCAATTCTTGTTGAATTAGATGGT60 GATGTTAATGGGCACAAATTTTCTGTCAGTGGAGAGGGTGAAGGTGATGCAACATAOGGA120 AAACTTACCCTTAAATTTATTTGCACTACTGGAAAACTACCTGTTCCATGGCCAACACTT180 GTCACTACTTTCTCTTATGGTGTTCAATGCTTTTCCOGTTATCOGGATCATATGAAACGG240 CATGACTTTTTCAAGAGTGC CATGCC0GAAGGTTATGTACAGGAAOGCACTATATCTTTC300 AAAGATGA0GGGAACTACAAGA0G0GTGCTGAAGTCAAGTTTGAAGGTGATACCCTTGTT360 AATCGTAT0GAGTTAAAAGGTATTGATTTTAAAGAAGATGGAAACATTCTOGGACACAAA420 CT0GAGTACAACTATAACTCACACAATGTATACATCACGGCAGACAAACAAAAGAATGGA480 ATCAAAGCTAACTTCAAAATTCGCCACAACATTGAAGATGGATCCGTTCAACTAGCAGAC540 CATTATCAACAAAATACTCCAATTGGOGATGGCCCTGTCCTTTTACCAGACAACCATTAC600 CTGT0GACACAATCTGCCCTTTOGAAAGATCCCAACGAAAAGCGTGACCACATGGTCCTT660 CTTGAGTTTGTAACTGCTGCTGGGATTACACATGGCATGGATGAGCTCTACAAATAA717 SEQ ID NO S (綠色螢光蛋白編碼基因) TGCCGCCTATCTGTTAAAACTCAATGGATACAATGCAAAGTOGGCTCGCGCCCTCTTCTC60 CCGTTCCCCCGTACCTAGACATGCGTOGTGAGTGCTTCCCTCCGTCATGCAACCGTOGCA120 AGCTCCTCGCTCCGT0GTCGCTGCTGAAGCTGCTCCTGOGCAATCOGCTGOGOGGCGGGT180 ACCT0GCCTCGCTCCCTTTCOGCCGCCCGAATCGCCTGTGTGAGCCTGTTCCTCOGAGAC240 ACGACCAT0GTCTTGGGATTGGCTTGTGGTAOGGGCAGAGGGCTGGTCTCTGCAATTGAG300 CAAG0GAGCCGAGGCAG0GATGGTCAGTTCCGGTOGCAGACOGAGGCTCCAGGGAAGGGA360 0GGCGGGA0GCACTGATGACGCOGGCCTGAATGAGCAGCTTCTCAAAGCGCTTTGTOGGC420 AG0GCACCCTGGCTGAGCCAGTACOGGACCCGCTCCAGGTTCCACTCGACCTTCTTCTGC480 CCGACCTTGGCGA0GCC0GTGTTGGGOGTGTGCTGCOGTGGTCCCCACTCCTTCGGGTCC540 CTGACCTGACCGTTTGG0GAGACCGAOGGCGCTGGCACGA CGACCGGTCGOGGGTTGTAC600 GAAC0GAGGAGCT0GAGGGGTTTGGCGGTCTGGCGCTGOGGOGOGOGGATGGOGACGAGC660 GAGTAGACGGGGTTGTTGCGOGTGCAGTGGTGGCGCGCGAGGCGCAATCGGACCGACATC720 TCGTGCGCTGG0GGAGAGCGAGTGTGOGAGGACGAGGAAAAGGAGOGGGAGGAGGAGGGT780 TGGGAG0GAACCACCTCGTGCAGCTGGACTGGACGCGCTAGACGACTGCCAGACTCGCTA840 TACTGCTCTTTACATCCGCTAGAATCCTGCACCCGCTCGAACCAGCTCCTCCCACCGTCA900 GTTCGCCTCCCCCTCTCATCCTCATCTCTCAAAGGACTTCCTCGCTCGCAACTCGCTGGA960 GGGAGCTGCAAGACTGACACGAGGTCGAAAACACOGTCAGATGAGTAAAGGAGAAGAACT1020 TTTCACTGGAGTTGTCCCAATTCTTGTTGAATTAGATGGTGATGTTAATGGGCACAAATT1080 TTCTGTCAGTGGAGAGGGTGAAGGTGATGCAACATAOGGAAAACTTACCCTTAAATTTAT1140 TTGCACTACTGGAAAACTACCTGTTCCATG GCCAACACTTGTCACTACTTTCTCTTATGG1200 TGTTCAATGCTTTTCCCGTTATCCGGATCA TATGAAACGGCATGACTTTTTCAAGAGTGC1260 CATGCCOGAAGGTTATGTACAGGAACGCAC TATATCTTTCAAAGATGACGGGAACTACAA1320 GAOGOGTGCTGAAGTCAAGTTTGAAGGTGA TACCCTTGTTAATOGTATCGAGTTAAAAGG1380 TATTGATTTTAAAGAAGATGGAAACATTCTCGGACACAAACTCGAGTACAACTATAACTC1440 ACACAATGTATACATCAOGGCAGACAAACAAAAGAATGGAATCAAAGCTAACTTCAAAAT1500 TCGCCACAACATTGAAGATGGATCOGTTCAACTAGCAGACCATTATCAACAAAATACTCC1560 AATTGGOGATGGCCCTGTCCTTTTACCAGACAACCATTACCTGTCGACACAATCTGCCCT1620 TTOGAAAGATCCCAAOGAAAAGOGTGACCACATGGTCCTTCTTGAGTTTGTAACTGCTGC1680 TGGGATTACACATGGCATGGATGAGCTCTACAAATAGATACAAGTGCGTCTGGGCAGTTC1740 CCCTCTTTTGCGTAGOGTACCCGCACGATTTACTGAOGCAACTOGGGOGCTACAGTCCTG1800 TCAATCTATCGOGATCTTCGCAGCGACACTCGCCGCTTCCGATTCCCGAC TTTGOGTCCA1860 TCTCGCTCGCTTCGATAAGCTTCTTTGGCTGCTACAGAOGGCTCTCAACT CTGCTGGAAG1920 ATGCAGCATCAGCACTCACGGGCTCCGCAACAGCTGCTGTCACGCCTOGA GTTCAGTCGG1980 GCAGCTCTOGCCATCTCGCAACCCGTTATGGOGATGGTOGACCOGTCTCG OGGCTTTCCC2040 AGOGCTGCGTTTCOGCTTCAGCTGTCGCGGTACAAACTTCATCGCCCOGT AGOGAGCCGT2100 CTCTOGOGCAAOGAGGCAATCTOGOGCTTC TCTCCCTAACGCTTTCTATC GGTCCCGGCC2160 TCTCTCCCGCGGACTCTAAGAGACGTOGACGCAGTTTCGA TATOGTCAAC AGOGAGOGCA2220 GAOGAGCACTGCCOGAGCAGTGAAOGACGACGAGCTCTGTAOGAAGCGATOGGATCOGCC2280 GCCTTCGCTC GOGACATGCTOGAGCTTTCCTGATCACCTTGTCTGAGTTGCTCAGGCTCT2340 GCTAAGTCAG TOGTGOGCATOGGAGTTTGCTGAGGCGCGAGAAGGATATTACAGCTOGTA2400 OGAAGGACGG CGACTCTGGCTCGCTGTCOGTCACACGAGACAGAGGCCAGCCTCGACCTC2460 GTCAGCGAGT CGGTCTGTCCATGAOGGCTAACTAATGAGGGTGGCTGAACAGATTGAATG2520 GC2522 SEQ ID NO :9(博來黴素抗性基因ble) ATGGCCAAGTTGACCAGTGC OGTTCCGGTG CTCACCGCGCGOGACGTOGCOGGAGCGGTC60 GAGTTCTGGACOGACOGGCT OGGGTTCTCCCGGGACTTOGTGGAGGAOGACTTCGCOGGT120 GTGGTCOGGGAOGACGTGAC CCTGTTCATCAGCGOGGTCCAGGACCAGGTGGTGCCGGAC180 AACACCCTGGCCTGGGTGTG GGTGOGOGGCCTGGACGAGCTGTACGCOGAGTGGTCGGAG240 GTOGTGTCCACGAACTTCCG GGACGCCTCCGGGCOGGCCATGACCGAGATOGGCGAGCAG300 CCGTGGGGGCGGGAGTTOGC CCTGOGOGACCCGGCCGGCAACTGCGTGCACTTCGTGGCC360 GAGGAGCAGGACTGA375 SEQ ID NO 10(博來黴素抗性基因ble) TGCCGCCTATCTGTTAAAACTCAATGGATACAATGCAAAGTOGGCTCGCGCCCTCTTCTC60 CCGTTCCCCCGTACCTAGACATGCGTOGTGAGTGCTTCCCTCCGTCATGCAACCGTOGCA120 AGCTCCTCGCTCCGTOGTCGCTGCTGAAGCTGCTCCTGOGCAATCOGCTGOGOGGCGGGT180 ACCTOGCCTCGCTCCCTTTCOGCCGCCCGAATCGCCTGTGTGAGCCTGTTCCTCOGAGAC240 ACGACCATOGTCTTGGGATTGGCTTGTGGTAOGGGCAGAGGGCTGGTCTCTGCAATTGAG300 CAAGOGAGCCGAGGCAGOGATGGTCAGTTCCGGTOGCAGACOGAGGCTCCAGGGAAGGGA360 0GGCGGGA0GCACTGATGACGCOGGCCTGAATGAGCAGCT TCTCAAAGCGCTTTGTOGGC420 AGOGCACCCTGGCTGAGCCAGTACOGGACCCGCTCCAGGT TCCACTCGACCTTCTTCTGC480 CCGACCTTGGCGAOGCCOGTGTTGGGOGTGTGCTGCOGTG GTCCCCACTCCTTCGGGTCC540 CTGACCTGACCGTTTGGOGAGACCGAOGGCGCTGGCACGA CGACCGGTCGOGGGTTGTAC600 GAACOGAGGAGCTOGAGGGGTTTGGCGGTCTGGCGCTGOGGOGOGOGGATGGOGACGAGC660 GAGTAGACGGGGTTGTTGCGOGTGCAGTGGTGGCGCGCGAGGCGCAATCGGACCGACATC720 TCGTGCGCTGGOGGAGAGCGAGTGTGOGAGGACGAGGAAAAGGAGOGGGAGGAGGAGGGT780 TGGGAGOGAACCACCTCGTGCAGCTGGACTGGACGCGCTAGACGACTGCCAGACTCGCTA840 TACTGCTCTTTACATCCGCTAGAATCCTGCACCCGCTCGAACCAGCTCCTCCCACCGTCA900 GTTCGCCTCCCCCTCTCATCCTCATCTCTCAAAGGACTTCCTCGCTCGCAACTCGCTGGA960 GGGAGCTGCAAGACTGACACGAGGTCGAAAACACOGTCAGATGGCCAAGTTGACCAGTGC1020 OGTTCCGGTGCTCACOGOGCGCGAOGTCGCCGGAGCGGTCGAGTTCTGGACCGACCGGCT1080 OGGGTTCTCCCGGGACTTCGTGGAGGACGACTTCGCOGGTGTGGTCCGGGACGAOGTGAC1140 CCTGTTCATCAGCGCGGTCCAGGACCAGGTGGTGCCGGACAACACCCTGGCCTGGGTGTG1200 GGTGOGOGGCCTGGAOGAGCTGTAOGCCGAGTGGTCGGAGGTCGTGTCCAOGAACTTCOG1260 GGACGCCTCCGGGCCGGCCATGACOGAGATCGGCGAGCAGCOGTGGGGGCGGGAGTTCGC1320 CCTGOGOGACCOGGCOGGCAACTGOGTGCACTTCGTGGCCGAGGAGCAGGACTGAATACA1380 AGTGOGTCTGGGCAGTTCCCCTCTTTTGOGTAGCGTACCCGCAOGATTTACTGAOGCAAC1440 TCGGGCGCTACAGTCCTGTCAATCTATCGCGATCTTOGCAGOGACACTCGCCGCTTCCGA1500 TTCCOGACTTTGCGTCCATCTCGCTCGCTTCGATAAGCTTCTTTGGCTGCTACAGAOGGC1560 TCTCAACTCTGCTGGAAGATGCAGCATCAG CACTCAOGGGCTCOGCAACAGCTGCTGTCA1620 OGCCTCGAGTTCAGTOGGGCAGCTCTOGCCATCTOGCAACCOGTTATGGCGATGGTOGAC1680 CCGTCTOGOGGCTTTCCCAGOGCTGCGTTTCOGCTTCAGCTGTOGOGGTACAAACTTCAT1740 OGCCCCGTAGCGAGCOGTCTCTOGOGCAACGAGGCAATCTCGCGCTTCTCTCCCTAACGC1800 TTTCTATCGGTCCOGGCCTCTCTCCCGCGGACTCTAAGAGAOGTCGAOGCAGTTTCGATA1860 TCGTCAACAGCGAGCGCAGAOGAGCACTGCCOGAGCAGTGAACGAOGACGAGCTCTGTAC1920 GAAGOGATOGGATCCGCOGCCTTCGCTCGCGACATGCTOGAGCTTTCCTGATCACCTTGT1980 CTGAGTTGCTCAGGCTCTGCTAAGTCAGTCGTGCGCATOGGAGTTTGCTGAGGCGCGAGA2040 AGGATATTACAGCTCGTACGAAGGACGGOGACTCTGGCTCGCTGTCCGTCACACGAGACA2100 GAGGCCAGCCTOGACCTOGTCAGCGAGTOGGTCTGTCCATGACGGCTAACTAATGAGGGT2160 GGCTGAACAGATTGAATGGC2180 SEQ ID NO 11(遺傳黴素抗性基因kanmx4) ATGGGTAAGGAAAAGACTCAOGTTTCGAGGCOGCGATTAAATTCCAACATGGATGCTGAT60 TTATATGGGTATAAATGGGCTCGCGATAATGTCGGGCAATCAGGTGCGACAATCTATCGA120 TTGTATGGGAAGCCCGATGCGCCAGAGTTGTTTCTGAAACATGGCAAAGGTAGCGTTGCC180 AATGATGTTACAGATGAGATGGTCAGACTAAACTGGCTGACGGAATTTATGCCTCTTCOG240 ACCATCAAGCATTTTATCCGTACTCCTGATGATGCATGGT TACTCACCAC TGOGATCCCC300 GGCAAAACAGCATTCCAGGTATTAGAAGAATATCCTGATT CAGGTGAAAA TATTGTTGAT360 GCGCTGGCAGTGTTCCTGCGCCGGTTGCATTOGATTCCTG TTTGTAATTG TCCTTTTAAC420 AG0GAT0G0G TATTT0GTCT0GCTCAGG0GCAATCACGAATGAATAACGGTTTGGTTGAT480 GCGAGTGATT 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CGACCGGTCGOGGGTTGTAC600 GAAC0GAGGAGCT0GAGGGGTTTGGCGGTCTGGCGCTGOGGOGOGOGGATGGOGACGAGC660 GAGTAGACGGGGTTGTTGCGOGTGCAGTGGTGGCGCGCGAGGCGCAATCGGACCGACATC720 TCGTGCGCTGG0GGAGAGCGAGTGTGOGAGGACGAGGAAAAGGAGOGGGAGGAGGAGGGT780 TGGGAG0GAACCACCTCGTGCAGCTGGACTGGACGCGCTAGACGACTGCCAGACTCGCTA840 TACTGCTCTTTACATCCGCTAGAATCCTGCACCCGCTCGAACCAGCTCCTCCCACCGTCA900 GTTCGCCTCCCCCTCTCATCCTCATCTCTCAAAGGACTTCCTCGCTCGCAACTCGCTGGA960 GGGAGCTGCAAGACTGACACGAGGTCGAAAACACOGTCAGATGGGTAAGGAAAAGACTCA1020 0GTTTCGAGGC0G0GATTAAATTCCAACATGGATGCTGATTTATATGGGTATAAATGGGC1080 TCGCGATAATGTCGGGCAATCAGGTGOGACAATCTATCGA TTGTATGGGAAGCCOGATGC1140 GCCAGAGTTG TTTCTGAAACATGGCAAAGGTAGCGTTGCCAATGATGTTACAGATGAGAT1200 GGTCAGACTAAACTGGCTGAOGGAATTTATGCCTCTTCOGACCATCAAGCATTTTATCOG1260 TACTCCTGATGATGCATGGTTACTCACCACTGCGATCCCCGGCAAAACAGCATTCCAGGT1320 ATTAGAAGAATATCCTGATTCAGGTGAAAATATTGTTGATGOGCTGGCAGTGTTCCTGOG1380 CCGGTTGCATT0GATTCCTGTTTGTAATTGTCCTTTTAACAGCGATCGCGTATTTCGTCT1440 0GCTCAGG0GCAATCACGAATGAATAACGG TTTGGTTGATGCGAGTGATTTTGATGACGA1500 GCGTAATGGCTGGCCTGTTGAACAAGTCTGGAAAGAAATGCATAAGCTTTTGCCATTCTC1560 AC0GGATTCAGTCGTCACTCATGGTGATTTCTCACTTGATAACCTTATTTTTGACGAGGG1620 GAAATTAATAGGTTGTATTGATGTTGGAOGAGTCGGAATCGCAGACCGATACCAGGATCT1680 TGCCATCCTATGGAACTGCCTCGGTGAGTTTTCTCCTTCA TTACAGAAACGGCTTTTTCA1740 AAAATATGGTATTGATAATCCTGATATGAATAAATTGCAG TTTCATTTGATGCTCGATGA1800 GTTTTTCTAAATACAAGTGCGTCTGGGCAGTTCCCCTCTT TTGOGTAGCGTACCOGCAOG1860
23 ATTTACTGACGCAACTCGGG0GCTACAGTCCTGTCAATCT ATCGCGATCT TCGCAG0GAC1920 ACTCGC0GCTTCCGATTCCCGACTTTGCGTCCATCTOGCT CGCTTOGATA AGCTTCTTTG1980 GCTGCTACAGA0GGCTCTCAACTCTGCTGGAAGATGCAGC ATCAGCACTC ACGGGCTC0G2040 CAACAGCTGCTGTCA0GCCT0GAGTTCAGTCGGGCAGCTC TOGCCATCTC GCAACC0GTT2100 ATGG0GATGGT0GACCCGTCTCGCGGCTTTCCCAGCGCTG CGTTTCCGCT TCAGCTGT0G2160 0GGTACAAACTTCAT0GCCC0GTAGCGAGCCGTCTCTCGC GCAACGAGGC AATCTCGCGC2220 TTCTCTCCCTAACGCTTTCTAT0GGTCC0GGCCTCTCTCC CGCGGACTCT AAGAGA0GTC2280 GA0GCAGTTTCGATATCGTCAACAGCGAGCGCAGACGAGC ACTGCCCGAG CAGTGAACGA2340 0GACGAGCTCTGTACGAAGCGATCGGATCC GCCGCCTTOG CTCGCGACAT GCTCGAGCTT2400 TCCTGATCACCTTGTCTGAGTTGCTCAGGC TCTGCTAAGT CAGTCGTGCG CATCGGAGTT2460 TGCTGAGG0GCGAGAAGGATATTACAGCTC GTACGAAGGA CGGOGACTCT GGCT0GCTGT2520 CCGTCACA0GAGACAGAGGCCAGCCTOGAC CTCGTCAGOG AGTOGGTCTG TCCATGACGG2580 CTMCTMTGAGGGTGGCTGAACAGATTGA ATGGC261權利要求
1.乳清酸磷酸核糖轉移酶啟動子，簡寫為pRtura5，其核苷酸序列具有如SEQIDNO=I 所示DNA序列的全部序列或包含該DNA序列自3，-末端起SOObp以內的部分序列，或具有可與如SEQ ID NO 1所示序列的全部或其DNA序列3，-末端起SOObp以內的部分序列雜交的、且保持轉錄啟動子活性的序列，或對SEQ IDNO 1所示的脫氧核苷酸序列進行一個或多個鹼基的取代、缺失或添加所獲得的，與SEQ ID NO :1所示序列具有50%以上同源性、且具有啟動子活性的序列。
2.—種權利要求1所述乳清酸磷酸核糖轉移酶啟動子的應用，其特徵在於SEQ ID NO 1所示的脫氧核苷酸序列可作為啟動子用於構建新型酵母遺傳作業系統及新的重組工程菌株，所得到的基因工程菌株攜帶相應的PRtura5序列。
3.按照權利要求2所述乳清酸磷酸核糖轉移酶啟動子的應用，其特徵在於所述基因工程菌株為紅冬孢酵母屬(Miodosporidium)基因工程菌株，所述新型酵母遺傳作業系統為圓紅冬孢酵母遺傳作業系統。
4.一種DNA構建體，含有權利要求1所述SEQ ID NO :1所示的脫氧核苷酸序列，或同時含有權利要求1所述SEQ ID NO :1所示的脫氧核苷酸序列和如SEQ ID NO :2所示的脫氧核苷酸序列，且SEQ ID NO 1所示序列位於SEQ IDNO 2所示序列的上遊，SEQ ID NO 1和 SEQ ID NO :2之間為一編碼基因的開放閱讀框架。
5.按照權利要求4構建體，其特徵在於所述的SEQID NO :2所示序列為一種乳清酸磷酸核糖轉移酶終止子Rtura5t。
6.按照權利要求4構建體，其特徵在於所述開放閱讀框架為位於SEQIDNO :1和SEQ ID NO :2之間的乳清酸磷酸核糖轉移酶基因的開放閱讀框架，其cDNA序列具有如SEQ ID NO :3所示的脫氧核苷酸序列，其基因組DNA具有SEQID NO :5所示的脫氧核苷酸序列，其胺基酸序列如SEQ ID NO 4所示。
7.一種攜帶權利要求1啟動子PRtFBA或權利要求4構建體的載體。
8.按照權利要求7載體，其特徵在於所述載體為質粒載體。
全文摘要
通過擴增圓紅冬孢酵母乳清酸磷酸核糖轉移酶基因組DNA上下遊序列，進行生物學信息分析和功能驗證，獲得可有效表達目的基因於圓紅冬孢酵母，並因此能夠用於圓紅冬孢酵母遺傳工程操作和菌株改良的啟動子和終止子。本發明還涉及包含這些元件的DNA構建體和載體。
文檔編號C12R1/645GK102268432SQ20101018972
公開日2011年12月7日 申請日期2010年6月2日 優先權日2010年6月2日
發明者張素芳, 趙宗保, 林心萍 申請人:中國科學院大連化學物理研究所