介導除蟲菌素b2b1比例的除蟲鏈黴菌基因的製作方法

2023-10-21 07:18:17 1

專利名稱：介導除蟲菌素b2b1比例的除蟲鏈黴菌基因的製作方法
技術領域：
本發明申請是申請號為99805027.X，發明名稱為「介導除蟲菌素B2∶B1比例的除蟲鏈黴菌基因」，申請日為1999年1月25日的國際申請PCT/IB99/00130的分案申請。
1.發明領域本發明涉及除蟲菌素的組合物及除蟲菌素的生產方法，主要應用於動物健康領域。更具體地，本發明涉及包含有編碼aveC基因產物的核苷酸序列的多核苷酸分子，該多核苷酸分子可被用於調整除蟲鏈黴菌培養物發酵所產生的除蟲菌素2類∶1類的比例，本發明還涉及篩選該多核苷酸分子的組合物及方法。本發明進一步涉及到載體，轉化的宿主細胞，除蟲鏈黴菌的新型突變株(其中aveC基因已經被突變以調整所產生的除蟲菌素2類∶1類的比例)。
2.發明背景2.1.除蟲菌素鏈黴菌可產生各種各樣的次級代謝產物，其中包括除蟲菌素，其含有一系列八種相關的能產生有效的抗蠕蟲和殺昆蟲活性的十六員的大環內脂類化合物，這八種截然不同但又密切相關的化合物主要指A1a，A1b，A2a，A2b，B1a，B1b，B2a及B2b。「a」系列化合物指的是天然除蟲菌素，其在C25位的取代基為(S)-仲丁基，「b」系列化合物指的是C25位的取代基為異丙基的那些化合物。代號「A」及「B」指的是C5位取代基分別為甲氧基和羥基的除蟲菌素；數字「1」指的是在C22位及C23位為雙鍵的除蟲菌素。而數字「2」為C22位有一個氫原子及在C23位有一個羥基的除蟲菌素；在這些相關的除蟲菌素中，B1型的除蟲菌素被公認為具有最強的抗寄生蟲和殺害蟲活性，因而也是最具商業前景的除蟲菌素。
除蟲菌素及其通過除蟲鏈黴菌菌株需氧發酵的生產方法在美國專利4,310,519及4,429,042中都已有描述。天然除蟲菌素的生物合成被認為可以通過異丁酸及S-(+)-2-甲基丁酸的輔酶A硫代脂類似物內源性起始。
經過隨機誘變進行菌株改進並聯合使用外源提供的脂肪酸可以有效生產除蟲菌素類似物。支鏈二氧酸脫氫酶缺陷的除蟲鏈黴菌的突變體(bkd缺陷突變體)只有在補充有脂肪酸發酵時才能產生除蟲菌素。篩選和分離支鏈脫氫酶活性缺陷的突變體(如除蟲鏈黴菌，ATCC 53567)在歐洲專利(EP)276103中已有描述。在有外源提供的脂肪酸存在下發酵這些突變體的結果為對應於所使用的脂肪酸僅產生四種除蟲菌素。因此，用S-(+)-2-甲基丁酸補充除蟲鏈黴菌(ATCC 53567)發酵，結果產生天然除蟲菌素A1a，A2a，B1a及B2a；用異丁酸補充發酵，結果產生天然除蟲菌素A1b，A2b，B1b及B2b；而用環戊烷羧酸補充發酵，結果產生四種新型的環戊基除蟲菌素A1，A2，B1及B2。
如果用其它脂肪酸補充發酵可以產生新的除蟲菌素。通過篩選800多種潛在的前體，已經鑑定出60多種其它新的除蟲菌素(例見Dutton等，1991，抗生素雜誌，44357-365；和Banks等，1994，Roy.Soc.Chem.14716-26)。此外，5-O-甲基轉移酶活性缺陷的除蟲鏈黴菌突變體實際上只能產生B類除蟲菌素，因而，同時缺少支鏈二氧酸脫氫酶及5-O-甲基轉移酶活性的除蟲鏈黴菌的突變體對應於補充發酵所用的脂肪酸僅生產出B類除蟲菌素。因此，用S-(+)-2-甲基丁酸補充該雙重突變體發酵，結果僅產生天然除蟲菌素B1a及B2a，而用異丁酸或環戊烷羧酸補充發酵則可以分別產生天然除蟲菌素B1b及B2b或新型環戊基B1及B2除蟲菌素。而用環己烷羧酸補充該雙重突變體菌是產生商業上重要的新型除蟲菌素環己基除蟲菌素B1(doramectin)的首選方法。該雙重突變體如除蟲鏈黴菌(ATCC53692)的分離及特性描述在歐洲專利申請EP 276103中。
2.2.參與除蟲菌素生物合成的基因在很多情況下，涉及次生代謝產物生產的基因及編碼一特定抗菌素的基因在染色體上的位置常常是簇集在一起的，例如，鏈黴菌聚酮化合物合成酶基因簇(PKS)(見Hopwood和Sherman，1990，遺傳學年評，2437-66)。這樣，通過生物合成途徑進行基因克隆的一個策略是分離抗藥性基因及然後檢測染色體上相鄰區域中其它與特定抗生素生物合成相關的基因。另外一種克隆重要代謝產物生物合成之相關基因的策略是突變體互補。例如，來自能產生特定代謝產物之生物的DNA文庫部分被導入不產生該代謝產物的突變體和篩選產生該代謝產物的轉化株。另外，利用來自於其它鏈黴菌的探針進行文庫雜交已被用於鑑別及克隆生物合成途徑中的基因。
涉及除蟲菌素生物合成的基因(ave基因)，就象其它鏈黴菌次生代謝產物(例如，PKS)生物合成所需基因一樣，同樣簇集於染色體上。使用載體已成功克隆了許多ave基因以補充除蟲菌素生物合成受阻的除蟲鏈黴菌突變體。這些基因的克隆在美國專利5,252,474中已有描述。此外，Ikeda等，1995，抗生素雜誌48532-534，描述了涉及C22，C23脫水步驟的染色體區域(aveC)定位在除蟲鏈黴菌4.82Kb BamHI酶切片斷上，並描述了產生單一組份B2a生產者的aveC基因突變。既然雙氫除蟲菌素，一潛在抗蠕蟲化合物，能由除蟲菌素B2a化學合成，該除蟲菌素B2a的單一組分生產者被認為在商業上生產雙氫除蟲菌素是比較有用的。
可以使除蟲菌素生產的複雜度最小化的aveC基因突變，例如，降低除蟲菌素B2∶B1比率的突變的鑑定可以簡化商業上重要的除蟲菌素的生產及純化。
3.發明簡述本發明提供了分離的多核苷酸分子，其含有除蟲鏈黴菌完整的aveC ORF基因或其實質性部分，該分離的多核苷酸分子缺少位於除蟲鏈黴菌染色體上aveC ORF所處位置下遊的下一個完整的ORF。本發明分離的多核苷酸分子優選包括同質粒pSE 186(ATCC 209604)的除蟲鏈黴菌aveC基因產物編碼序列相同的核苷酸序列，或者同圖1(SEQ ID NO1)aveC ORF或其實質性部分相同的核苷酸序列。
本發明進一步提供了多核苷酸分子，其具有的核苷酸序列與質粒pSE186(ATCC 209604)的除蟲鏈黴菌aveC基因產物編碼序列同源或者同圖1(SEQ ID NO1)中存在的aveC ORF的核苷酸序列或其實質性部分同源。
本發明進一步提供了多核苷酸分子，其含有的核苷酸序列編碼的多肽的胺基酸序列與質粒pSE 186(ATCC 209604)的aveC基因產物編碼序列編碼的胺基酸序列同源或者同圖1(SEQ ID NO2)的胺基酸序列或其實質性部分同源。
本發明進一步提供了分離的多核苷酸分子，其含有一編碼AveC同系物基因產物的核苷酸序列。在優選的實施方案中，分離的多核苷酸分子含有編碼吸水鏈黴菌AveC同系物基因產物的核苷酸序列，其中的同系物基因產物含有如SEQ ID NO4的胺基酸序列或其實質性部分。在優選的實施方案中，編碼吸水鏈黴菌AveC同系物基因產物的本發明分離的多核苷酸分子含有SEQ ID NO3的核苷酸序列或其實質性部分。
本發明進一步提供了多核苷酸分子，其含有與SEQ ID NO3所示的吸水鏈黴菌核苷酸序列同源的核苷酸序列。本發明還提供了多核苷酸分子，其含有的核苷酸序列編碼的多肽與具有SEQ ID NO4所示胺基酸序列的吸水鏈黴菌AveC同系物基因產物同源。
本發明還提供了寡核苷酸，其與具有圖1(SEQ ID NO1)或SEQ IDNO3所示核苷酸序列的多核苷酸分子雜交，或與具有圖1(SEQ ID NO1)或SEQ ID NO3所示核苷酸序列的互補核苷酸序列的多核苷酸分子雜交。
本發明進一步提供了重組克隆載體及表達載體，它們可用於克隆或表達本發明的多核苷酸，包括含有除蟲鏈黴菌的aveC ORF或者aveC同系物的ORF的多核苷酸分子。在一非限制性的實施方案中，本發明所提供的質粒pSE186(ATCC 209604)含有除蟲鏈黴菌aveC基因完整的ORF。本發明進一步提供了轉化宿主細胞，其含有本發明的多核苷酸分子或重組載體及由此得到的新的菌株或細胞系。
本發明進一步提供了基本上純化或分離的重組表達的AveC基因產物或AveC同系物基因產物或其實質性部分及其同系物。本發明進一步提供了產生重組AveC基因產物的方法，所述方法包括在有利於生產重組AveC基因產物或AveC同系物基因產物的條件下，培養用重組表達載體轉化的宿主細胞，並從細胞培養物中回收AveC基因產物或AveC同系物基因產物，其中所述重組表達載體所含有的多核苷酸分子的核苷酸序列可以編碼AveC基因產物或AveC同系物基因產物，該多核苷酸分子與控制多核苷酸分子在宿主細胞中表達的一個或多個調控元件可操作相連。
本發明進一步提供了多核苷酸分子，其包含的核苷酸序列同質粒pSE186(ATCC 209604)的除蟲鏈黴菌AveC基因產物編碼序列相同，或同如圖1(SEQ ID NO1)所示的除蟲鏈黴菌aveC ORF的核苷酸序列相同，但是其進一步包含一個或多個突變以使其中野生型的aveC等位基因已經失活且其表達的多核苷酸分子含有突變的核苷酸序列的除蟲鏈黴菌菌株(ATCC53692)的細胞相對於僅表達野生型的aveC等位基因的除蟲鏈黴菌菌株(ATCC 53692)細胞而言，產生不同比例或量的除蟲菌素。根據本發明，可使用這種多核苷酸分子生產除蟲鏈黴菌新菌株，其與僅表達野生型的aveC等位基因的相同菌株相比較，除蟲菌素的產量有可測的改變。在優選的實施方案中，這種多核苷酸分子可用於生產除蟲鏈黴菌新菌株(其與僅表達野生型的aveC等位基因的相同菌株相比以減少的2類∶1類比例生產除蟲菌素)。在進一步優選的實施方案中，這種多核苷酸分子可用於生產除蟲鏈黴菌新菌株(其與僅表達野生型的aveC等位基因的相同菌株相比可以生產增加水平的除蟲菌素)。在進一步優選的實施方案中，這種多核苷酸分子可用於生產除蟲鏈黴菌新菌株(其中aveC基因已經失活)。
本發明提供了鑑別能夠改變所產生的除蟲菌素的比例和/或量的除蟲鏈黴菌aveC ORF突變的方法。在優選的實施方案中，本發明提供了鑑別能夠改變所產生的除蟲菌素2類∶1類比例的aveC ORF突變的方法，所述方法包括(a)測定除蟲鏈黴菌菌株細胞產生的除蟲菌素2類∶1類的比例，所述細胞中的野生型aveC等位基因已失活，包含有編碼突變的AveC基因產物的核苷酸序列的多核苷酸分子被導入該細胞並在其中被表達；(b)測定與步驟(a)的除蟲鏈黴菌相同的菌株細胞產生的除蟲菌素2類∶1類的比例，但不同的是該細胞僅表達具有如圖1(SEQ 1D NO1)所示的ORF的核苷酸序列或者與其同源的核苷酸序列的aveC等位基因；及(c)比較步驟(a)的除蟲鏈黴菌菌株細胞產生的除蟲菌素2類∶1類的比例與步驟(b)的除蟲鏈黴菌菌株細胞產生的除蟲菌素2類∶1類的比例，如果二者不同的話，則鑑定出能夠改變除蟲菌素2類∶1類比例的aveC ORF突變存在，在優選的實施方案中，除蟲菌素2類∶1類的比例因突變而減少。
在另一個優選的實施方案中，本發明提供了一種鑑定能夠改變所產生的除蟲菌素量的aveC ORF突變或者包含有aveC ORF的基因構建體突變的方法，所述方法包括(a)測定除蟲鏈黴菌菌株細胞產生的除蟲菌素的量，所述細胞中的野生型aveC等位基因已失活，包含有編碼突變的AveC基因產物的核苷酸序列或含有編碼AveC基因產物的核苷酸序列的基因構建體的多核苷酸分子被導入該細胞並在其中表達；(b)測定與步驟(a)的除蟲鏈黴菌相同的菌株細胞產生的除蟲菌素的量，但不同的是該細胞僅表達具有如圖1(SEQ 1D NO1)所示的ORF的核苷酸序列或者與其同源的核苷酸序列的aveC等位基因；及(c)比較步驟(a)的除蟲鏈黴菌菌株細胞產生的除蟲菌素的量與步驟(b)的除蟲鏈黴菌菌株細胞產生的除蟲菌素的量，如果二者不同的話，則鑑定出能夠改變除蟲菌素量的aveC ORF突變或基因構建體突變存在。在優選的實施方案中，除蟲菌素的量因突變而增加。
本發明進一步提供了重組載體，該載體可用於製備具有改變的除蟲菌素產量的除蟲鏈黴菌新菌株。例如，本發明提供了這樣一種載體，其可用於將任一個包含有本發明的突變核苷酸序列的多核苷酸分子靶向除蟲鏈黴菌染色體上的aveC基因位點，或者插入，或者以同源重組的方式取代aveCORF或其部分。然而，根據本發明，當插入到除蟲鏈黴菌染色體上除aveC基因以外的位點時或者在除蟲鏈黴菌細胞中以附加體的形式出現時，包含有本發明的突變核苷酸序列的多核苷酸分子在調控除蟲菌素生物合成方面也起到一定作用。因此，本發明也提供了這樣一種載體，其含有的多核苷酸分子含有本發明的突變核苷酸序列，可使用該載體將多核苷酸分子插入到除蟲鏈黴菌染色體上除aveC基因以外的位點處，或者該載體可以附加體的形式出現。在優選實施方案中，本發明所提供的基因取代載體可被用於將突變的aveC等位基因插入到除蟲鏈黴菌染色體上以產生新型的細胞株，其可以較僅表達野生型aveC等位基因的相同菌株細胞以減少的2類∶1類比例生產除蟲菌素。
本發明進一步提供了一種製備除蟲鏈黴菌新菌株的方法，所述菌株包含有能夠表達突變的aveC等位基因的細胞，其與僅表達野生型aveC等位基因的除蟲鏈黴菌相同菌株細胞相比，所產生的除蟲菌素的比例和/或量發生改變。在優選的實施方案中，本發明進一步提供了一種製備除蟲鏈黴菌新菌株的方法，所述菌株包含有能夠表達突變的aveC等位基因的細胞，其與僅表達野生型aveC等位基因的除蟲鏈黴菌相同菌株細胞相比，所產生的除蟲菌素的2類∶1類比例發生改變，所述方法包括用攜有突變的aveC等位基因的載體轉化除蟲鏈黴菌菌株細胞，該突變的aveC等位基因編碼的基因產物使得表達突變的aveC等位基因的除蟲鏈黴菌菌株細胞與僅表達野生型aveC等位基因的除蟲鏈黴菌相同菌株細胞相比，所產生的除蟲菌素的2類∶1類比例發生改變，選擇轉化細胞，該轉化細胞產生的除蟲菌素2類∶1類比例較僅表達野生型aveC等位基因的菌株細胞有所改變。在優選實施方案中，在新菌株細胞中，所產生的除蟲菌素2類∶1類的比例有所減少。
在進一步優選的實施方案中，本發明提供了製備除蟲鏈黴菌新菌株的方法，所述菌株包括能產生改變量的除蟲菌素的細胞，所述方法包括用攜有突變aveC等位基因或者含有該aveC等位基因的基因構建體的載體轉化除蟲鏈黴菌菌株細胞，其表達的結果使表達突變aveC等位基因或基因構建體的除蟲鏈黴菌菌株細胞所生產的除蟲菌素量較僅表達野生型aveC等位基因的除蟲鏈黴菌相同菌株細胞產生的除蟲菌素的量有所改變，挑選已轉化的細胞，該轉化細胞產生的除蟲菌素量較僅表達野生型aveC等位基因的菌株細胞產生的除蟲菌素量有所改變。在優選實施方案中，在新菌株細胞中，所產生的除蟲菌素的量有所增加。
在進一步優選的實施方案中，本發明提供了一種製備除蟲鏈黴菌新菌株的方法，這些除蟲鏈黴菌細胞中含有失活的aveC等位基因，所述方法包括用使得aveC等位基因失活的載體轉化表達野生型aveC等位基因的除蟲鏈黴菌菌株細胞，並且挑選其中aveC等位基因已經失活的轉化細胞。
本發明進一步提供了除蟲鏈黴菌新菌株，其含有的細胞已被任一含有本發明的突變核苷酸序列的多核苷酸分子或載體轉化。在優選的實施方案中，本發明提供了除蟲鏈黴菌新菌株，其含有的細胞表達了突變的aveC等位基因而不是野生型的aveC等位基因，或者同時表達突變的aveC等位基因和野生型的aveC等位基因，其中該新菌株細胞產生的除蟲菌素的2類∶1類比例相對於僅表達野生型aveC等位基因的相同菌株細胞而言有所改變。在更優選的實施方案中，新菌株細胞產生的除蟲菌素的2類∶1類比例相對於僅表達野生型aveC等位基因的相同菌株細胞而言有所降低。這種新菌株可用於大規模生產有商業應用價值的除蟲菌素例如doramectin。
在另一個優選的實施方案中，本發明提供了除蟲鏈黴菌新菌株，其含有的細胞可以表達突變的aveC等位基因或者含有aveC等位基因的基因構建體，而不是野生型的aveC等位基因，或者同時表達這兩者，其結果是相對於僅表達野生型的aveC等位基因的相同菌株細胞產生的除蟲菌素的量而言，含有該突變的aveC等位基因的細胞產生的除蟲菌素的量有所改變。在優選的實施方案中，新細胞產生的除蟲菌素的量有所增加。
在另一個優選的實施方案中，本發明提供了除蟲鏈黴菌新菌株，其含有的細胞中aveC基因已失活。這種菌株不僅對它們產生的與野生型菌株所產生的不同譜的除蟲菌素有用，對於本文所述的測定靶向或隨機誘變的aveC基因是否影響除蟲菌素產量的互補篩選試驗也是非常有用的。
本發明進一步提供了生產除蟲菌素的方法，所述方法包括在允許或者誘導除蟲菌素生產的條件下，在培養基中培養除蟲鏈黴菌菌株細胞，並從培養物中回收除蟲菌素，所述細胞表達突變的aveC等位基因，與不表達突變aveC等位基因而僅表達野生型的aveC等位基因的相同菌株細胞相比，該突變等位基因編碼的基因產物改變了表達突變的aveC等位基因的除蟲鏈黴菌菌株細胞產生的除蟲菌素的2類∶1類的比例。在優選的實施方案中，表達突變的細胞產生的除蟲菌素的2類∶1類的比例有所減少。該方法提供了商業上有價值的除蟲菌素例如doramectin的高效率的生產方法。
本發明進一步提供了生產除蟲菌素的方法，所述方法包括在允許或者誘導除蟲菌素生產的條件下，在培養基中培養除蟲鏈黴菌菌株細胞，並從培養物中回收除蟲菌素，所述細胞表達突變的aveC等位基因或含有aveC等位基因的基因構建體，與不表達突變aveC等位基因或基因構建體而僅表達野生型的aveC等位基因的相同菌株細胞相比，表達突變的aveC等位基因或基因構建體的除蟲鏈黴菌菌株細胞產生的除蟲菌素的量有所改變。在優選的實施方案中，表達突變或基因構建體的細胞產生的除蟲菌素的2類∶1類的量有所減少。
本發明進一步提供了由表達本發明的突變的aveC等位基因的除蟲鏈黴菌菌株細胞產生的除蟲菌素的新的組合物，其中與僅表達野生型的aveC等位基因而不表達突變的aveC等位基因的除蟲鏈黴菌的相同菌株細胞所產生的除蟲菌素的2類∶1類的比例相比，其以減少的2類∶1類比例生產除蟲菌素。這種新型的除蟲菌素組合物可以存在於發酵培養液中或者從培養液中獲得，並且可以部分或基本上純化。
4.


圖1.含有除蟲鏈黴菌aveC ORF的DNA序列(SEQ ID NO1)及其推定的胺基酸序列(SEQ ID NO2)。
圖2.含有除蟲鏈黴菌aveC基因完整的ORF的質粒載體pSE186(ATCC209604)。
圖3.含有插入除蟲鏈黴菌aveC ORF中的Sacc.Erythraea之ermE基因的基因取代載體pSE180(ATCC 209605)。
圖4.用五種重疊的粘粒(即pSE65，pSE66，pSE67，pSE68，PSE69)克隆識別的，來自於除蟲鏈黴菌的除蟲菌素聚酮化合物合成酶基因簇的BamHI限制性酶切圖譜。通時指出了pSE118及pSE119的關係。
圖5.除蟲鏈黴菌菌株的發酵產物的HPLC分析。通過與環己基B1的標準量比較進行峰定量。環己基B2的保留時間是7.4-7.7分鐘，環己基B1的保留時間是11.9-12.3分鐘。FIG.5A.除蟲鏈黴菌菌株SE180-11，其具有失活的aveC ORF；FIG.5B.用pSE186(ATCC 209604)轉化的除蟲鏈黴菌菌株SE180-11；FIG.5C.用pSE187轉化的除蟲鏈黴菌菌株SE180-11；FIG.5D.用pSE188轉化的除蟲鏈黴菌菌株SE180-11。
圖6.由除蟲鏈黴菌aveC ORF編碼的推定胺基酸序列(SEQ IDNO2)，灰產色鏈黴菌的aveC同系物的部分ORF(SEQ ID NO5)，及來自於吸水鏈黴菌的aveC同系物ORF(SEQ ID NO4)的比較。以粗體表示的纈氨酸殘基是該蛋白質推定的起始位點。以大寫字母表示的保守殘基顯示出全部三種序列中的同源性，以小寫字母表示的保守殘基顯示出3種序列中的2種的同源性。這些胺基酸序列有近50％的序列同一性。
圖7.含有來自於吸水鏈黴菌aveC同系物基因(其插入在除蟲鏈黴菌的aveC ORF的BsaAI/KpnI位點)的564 bp的BsaAI/KpnI片段的雜合質粒構建體。
5.發明詳述本發明涉及鑑定及表徵具有編碼除蟲鏈黴菌AveC基因產物的核苷酸序列的多核苷酸分子，構建可用於篩選突變的AveC基因產物對生產除蟲菌素的影響的除蟲鏈黴菌新菌株，並且發現某些突變的AveC基因產物可以降低除蟲鏈黴菌產生的除蟲菌素B2∶B1的比例。作為例子，本發明將在下文中描述具有與質粒pSE186(ATCC 209604)的除蟲鏈黴菌AveC基因產物編碼序列相同的核苷酸序列，或者具有圖1(SEQ ID NO1)的ORF的核苷酸序列的多核苷酸分子，及具有由此得來的突變核苷酸序列的多核苷酸分子。然而，本發明闡明的原理可被類似地應用於其它的多核苷酸分子，包括來自於其它鏈黴菌例如吸水鏈黴菌及灰產色鏈黴菌等的aveC同系物基因。
5.1.編碼除蟲鏈黴菌aveC基因產物的多核苷酸分子本發明提供了一種分離的多核苷酸分子，其包含有除蟲鏈黴菌完整的aveC ORF或其實質性部分，該分離的多核苷酸分子缺少處於除蟲鏈黴菌染色體中aveC ORF所處位置下遊的下一個完整的ORF。
本發明分離的多核苷酸分子優選包括的核苷酸序列與質粒pSE186(ATCC 209604)的除蟲鏈黴菌AveC基因產物的編碼序列相同，或者與圖1(SEQ ID NO1)的ORF的核苷酸序列或其實質性部分相同。本文所用的含有編碼除蟲鏈黴菌AveC基因產物的核苷酸序列的分離的多核苷酸分子的「實質性部分」指的是分離的多核苷酸分子，其至少包括圖1(SEQ IDNO1)所示的完整的aveC ORF序列的約70％，並且編碼功能等同的AveC基因產物。這裡，「功能等同」的AveC基因產物被定義為基因產物，當其在其中天然aveC等位基因失活的除蟲鏈黴菌菌株ATCC 53692中表達時，結果產生的除蟲菌素與僅表達除蟲鏈黴菌菌株ATCC 53692天然的野生型功能性aveC等位基因的除蟲鏈黴菌菌株ATCC 53692產生的除蟲菌素具有基本上相同的比例及量。
除了aveC ORF的核苷酸序列外，本發明分離的多核苷酸分子可以進一步包括天然側翼於除蟲鏈黴菌原位aveC基因的核苷酸序列，例如圖1(SEQ ID NO1)所示的側翼核苷酸序列。
本文所用的術語「多核苷酸分子」，「多核苷酸序列」，「編碼序列」，「開放閱讀框」及″ORF′″都意指出DNA分子和RNA分子，其可以是單鏈或者雙鏈，其可以被轉錄或者翻譯(DNA)，或者被翻譯(RNA)成AveC基因產物，或者，如下所述，被翻譯為AveC同系物基因產物，或被翻譯成多肽(當置於適當調控元件的控制之下時，在適當宿主細胞表達系統中其與AveC基因產物或者AveC同系物基因產物同源)。編碼序列包括但不限於原核序列，cDNA序列，基因組DNA序列，及化學合成的DNA和RNA序列。
如圖1(SEQ ID NO1)所示的核苷酸序列在bp位置42，174，177及180包含四個不同的GTG密碼子。如下面第9部分所示，可構建aveC ORF(圖1SEQ ID NO1)5′區域的多個缺失以幫助確定這些密碼子中的哪些能在aveC ORF中用作蛋白質表達的起始位點。bp 42位置處第一個GTG位點的缺失並不能消除AveC的活性。此外，再缺失bp位置174，177及180的所有GTG密碼子才能消除AveC的活性，這表明該區域對於蛋白質表達是必須的。本發明因此包括了不同長度的aveC ORF及其相應的多肽，所述aveCORF可以在如圖1(SEQ ID NO1)所示的bp 174，177或者180 bp的任一GTG位點啟動翻譯。
本發明進一步提供了多核苷酸分子，其包含的核苷酸序列同質粒pSE186(ATCC 209604)的除蟲鏈黴菌AveC基因產物編碼序列同源，或與圖1(SEQ ID NO1)所示的除蟲鏈黴菌aveC ORF核苷酸序列或其實質性部分同源。術語「同源」當用於指與除蟲鏈黴菌AveC基因產物編碼序列同源的多核苷酸分子時，意味著該多核苷酸分子具有的核苷酸序列(a)編碼與質粒pSE186(ATCC 209604)的除蟲鏈黴菌AveC基因產物編碼序列相同的AveC基因產物，或編碼與圖1(SEQ ID NO1)所示的除蟲鏈黴菌的aveC ORF核苷酸序列所編碼的相同的AveC基因產物，但其根據遺傳密碼的簡併性對核苷酸序列作了一個或多個沉默改變；或者(b)在中度嚴緊的條件下，與下述多核苷酸分子的互補序列雜交，該多核苷酸分子含有的核苷酸序列編碼由質粒pSE186(ATCC 209604)AveC基因產物編碼序列所編碼的胺基酸序列，或者編碼圖1(SEQ ID NO2)所示的胺基酸序列，並編碼如上文所定義的功能等同的AveC基因產物。所述中度嚴緊的條件也即在65℃下，0.5M NaHPO4，7％十二烷基硫酸鈉(SDS)，1mM EDTA中與結合於濾膜上的DNA雜交，及在42℃下，在0.2×SSC/0.1％SDS中洗滌(例見Ausubel等(編)，1989，分子生物學最新方法，Vol.1，GreenPublishing Associates公司，和John Wiley Sons公司，紐約，p.2.10.3)。在優選的實施方案中，同源的多核苷酸分子在高度嚴緊的條件下與質粒pSE186(ATCC 209604)中編碼AveC基因產物的核苷酸序列的互補序列雜交，或者與圖1(SEQ ID NO1)所示的核苷酸序列或其實質性部分的互補序列雜交，並編碼如上文所定義的功能等同的AveC基因產物。高度嚴緊的條件指的是在65℃，0.5M NaHPO4，7％十二烷基硫酸鈉(SDS)，1mM EDTA中與結合於濾膜上的DNA雜交，及在68℃下，在0.1×SSC/0.1％SDS中洗滌(Ausubel等，1989，見上文)。
如下文實施例所述，AveC基因產物及其潛在的功能等同物的活性可以通過用HPLC分析發酵產物的方式來測定。不管是天然的還是人工合成的，多核苷酸分子(其含有的核苷酸序列編碼除蟲鏈黴菌AveC基因產物的功能等同物)包括天然存在於除蟲鏈黴菌其它菌株的AveC基因，存在於鏈黴菌其它種的aveC同系物基因及突變的aveC等位基因。
本發明進一步提供了多核苷酸分子，其包含的核苷酸序列所編碼的多肽含有的胺基酸序列與質粒pSE186(ATCC 209604)的AveC基因產物編碼序列編碼的胺基酸序列，或與圖1(SEQ ID NO2)所示的胺基酸序列或其實質性部分有同源性。本文所用的圖1(SEQ ID NO2)的胺基酸序列的「實質性部分」指的是該多肽至少包括約70％的如圖1(SEQ ID NO2)所示的胺基酸序列，並且組成了如上所定義的功能等同的AveC基因產物。
本文用於指與來自於除蟲鏈黴菌的AveC基因產物的胺基酸序列有同源性的胺基酸序列的術語「同源性」指的是質粒pSE186(ATCC 209604)的AveC基因產物編碼序列編碼的多肽，或含有如圖1(SEQ ID NO2)所示的胺基酸序列(但其中一個或多個胺基酸殘基被不同的胺基酸殘基保守取代，該保守取代的結果產生了如上所述的功能等同的基因產物)的多肽。保守的胺基酸取代是本領域眾所周知的。進行這樣的取代的規則描述於Dayhof，M.D.，1978，Nat.Biomed.Res.Found.，Washington，D.C.，Vol.5，Sup.3等。更具體地，保守的胺基酸取代一般發生在與酸性，極性，其側鏈大小相關的胺基酸家族中。基因編碼的胺基酸一般分為四組(1)酸性＝天冬氨酸，穀氨酸；(2)鹼性＝賴氨酸，精氨酸，組氨酸；(3)非極性＝丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，蛋氨酸，色氨酸；及(4)不帶電的極性＝甘氨酸，天冬醯胺，穀氨醯胺，半胱氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，酪氨酸。苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸也可以被通稱為芳香的胺基酸。在任何特定組中的一個或多個取代，例如，用異亮氨酸或纈氨酸取代亮氨酸，或者用穀氨酸取代天冬氨酸，或者用絲氨酸取代蘇氨酸，或用結構相關的胺基酸殘基取代任一個其它胺基酸殘基。例如，具有相似的酸性，極性，側鏈大小或其某些結合的相似性的胺基酸殘基進行取代對於整個多肽的功能沒有顯著的影響。
本發明進一步提供了分離的多核苷酸分子，其包括的核苷酸序列編碼aveC同系物基因產物。本文所用的「AveC同系物基因產物」被定義為一基因產物，其與含有由質粒pSE186(ATCC 209604)的AveC基因產物編碼序列編碼的胺基酸序列的除蟲鏈黴菌AveC基因產物至少具有50％的胺基酸序列同一性，或者與圖1(SEQ ID NO2)所示的胺基酸序列至少具有50％的胺基酸序列同一性。在一個非限制性的實施方案中，AveC同系物基因產物來自於吸水鏈黴菌(歐洲專利申請0298423已有描述；保藏號為FERM BP-1901)，其包含有SEQ ID NO4的胺基酸序列或其實質性部分。SEQ IDNO4的胺基酸序列的「實質性部分」指的是至少含有70％的SEQ ID NO4胺基酸序列的多肽，其構成功能等同的AveC同系物基因產物。「功能等同的」AveC同系物基因產物被定義成基因產物，當在吸水鏈黴菌菌株FERMBP-1901中表達時(其中天然的AveC同系物等位基因已經失活)，導致所產生的米爾倍黴素的比例和量基本上同於僅表達吸水鏈黴菌菌株FERM BP-1901天然的野生型功能性aveC同系物等位基因的吸水鏈黴菌菌株FERM BP-1901所產生的比例和量。在一個非限制性實施方案中，本發明分離的多核苷酸分子(其編碼吸水鏈黴菌AveC同系物基因產物)含有SEQ ID NO3的核苷酸序列或其實質性部分。在這點上，含有SEQ ID NO3之核苷酸序列的分離的多核苷酸分子的「實質性部分」指的是該分離的多核苷酸分子至少包括70％的如SFQ ID NO3所示的核苷酸序列，並且編碼如上所定義的功能相當的AveC同系物基因產物。
本發明進一步提供了多核苷酸分子，其包含的核苷酸序列同SEQ IDNO3所示的吸水鏈黴菌核苷酸序列同源。術語「同源」當用於指含有與SEQ ID NO3的吸水鏈黴菌AveC同系物基因產物編碼序列同源的核苷酸序列的多核苷酸分子時，意味著該多核苷酸分子具有的核苷酸序列(a)編碼與SEQ ID NO3的核苷酸序列或其實質性部分相同的基因產物，但其根據遺傳密碼的簡併性對核苷酸序列作了一個或多個沉默變化；或者(b)在中度嚴緊的條件下，與具有編碼SEQ ID NO4之胺基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸分子的互補序列雜交並編碼上述功能等同的AveC同系物基因產物，所述中度嚴緊的條件也即在65℃下，0.5M NaHPO4，7％十二烷基硫酸鈉(SDS)，1mM EDTA中與結合於濾膜上的DNA雜交，及在42℃下，0.2×SSC/0.1％SDS中洗滌(例見Ausubel等，文獻同上)。在優選的實施方案中，同源的多核苷酸分子在高度嚴緊的條件下與SEQ ID NO3中編碼AveC同系物基因產物的核苷酸序列或其實質性部分的互補序列雜交，並編碼上述功能等同的AveC同系物基因產物，所述高度嚴緊條件指的是在65℃，0.5M NaHPO4，7％十二烷基硫酸鈉(SDS)，1mM EDTA中與結合於濾膜上的DNA雜交，及在68℃下，0.1×SSC/0.1％SDS中洗滌(Ausubel等，1989，見上文)。
本發明進一步提供了一多核苷酸分子，其包含的核苷酸序列所編碼的多肽與吸水鏈黴菌AveC同系物基因產物具有同源性。本文用於指與來自於吸水鏈黴菌的SEQ ID NO4的AveC同系物基因產物具有同源性的多肽的術語「同源性」指的是含有如SEQ ID NO4所示胺基酸序列(但其中一個或多個胺基酸殘基被不同的胺基酸殘基保守取代，該保守取代的結果在於產生了如上所述的功能等同的同系物基因產物)的多肽。
本發明進一步提供了寡核苷酸分子，其與具有如圖1(SEQ ID NO1)或者SEQ ID NO3之核苷酸序列的多核苷酸分子雜交，或者與具有如圖1(SEQ ID NO1)或者SEQ ID NO3之核苷酸序列的互補序列的核苷酸序列的多核苷酸分子雜交。該寡核苷酸的長度至少約為10個核苷酸，且優選約為15-30個核苷酸，其在高度嚴緊的條件下與前述之一種多核苷酸分子雜交，即在37℃左右，6×SSC/0.5％焦磷酸鈉中洗滌14個鹼基左右的寡核苷酸，在48℃左右洗滌17個鹼基左右的寡核苷酸，在55℃左右洗滌20個鹼基左右的寡核苷酸，及在60℃左右洗滌23個鹼基左右的寡核苷酸。在一個優選實施方案中，該寡核苷酸與前述多核苷酸分子之一的部分互補。這些寡核苷酸分子可用於不同目的，包括編碼，或用作基因調控所用的反義核酸分子，或用作擴增編碼aveC或aveC同系物的多核苷酸分子的引物。
此外，可以結合已知技術，使用本文公開的多核苷酸分子或寡核苷酸在鏈黴菌的其它種或菌株中鑑定其它aveC同系物基因。例如，含有圖1(SEQ ID NO1)的除蟲鏈黴菌核苷酸序列的一部分或者SEQ ID NO3的吸水鏈黴菌核苷酸序列的一部分的寡核苷酸分子可被可測地標記及用於篩選由來源於相關生物體的DNA所構建的基因組文庫)。雜交條件嚴緊性的選擇是基於所涉及生物體的相互關係，在這個例子中，指的是除蟲鏈黴菌或者吸水鏈黴菌與其它相關生物體的關係。對不同嚴緊條件的要求是本領域技術人員眾所周知的，這樣的條件將根據衍生得到文庫及標記序列的特定生物體的不同而進行可預測的改變。優選所述寡核苷酸的長度至少約為15個核苷酸，其包括，如下述實施例描述的那些。可以利用這些或其它的寡核苷酸通過應用聚合酶鏈反應(PCR)等標準技術進行同系物基因擴增，但也可使用本領域已知的其它擴增技術，如連接酶鏈反應。
可以檢測被鑑定為包含有aveC同系物核苷酸序列的克隆編碼功能AveC同系物基因產物的能力。為此，可對該克隆進行序列分析以鑑別適當的閱讀框以及起始和終止信號。或者或另外，可將克隆的DNA序列插入合適的表達載體，即含有轉錄及翻譯插入的蛋白質編碼序列所必需的元件的載體。可按下述使用多種宿主/載體系統中的任一種，包括但不局限於如質粒，噬菌體，或粘粒表達載體等的細菌系統。可以如下面第7部分所述，通過使用如HPLC分析發酵產物來分析用含有潛在aveC同系物編碼序列的載體轉化的適當宿主細胞的AveC型活性。
本文所述的多核苷酸分子的生產和操作是本領域技術人員易於做到的，其可以依下述的重組技術進行操作，例如，Maniatis等，1989，分子克隆實驗指南，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約；Ausubel等，1989，現代分子生物學教程，Greene Publishing Associates WileyInterscience，紐約；Sambrook等，1989，分子克隆實驗指南，(第二版)，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約；Innis等(編)，1995，PCR策略，Academic Press公司，San Diego；和Erlich(編)，1992，PCR技術，牛津大學出版社，紐約(列入本文作為參考)。編碼AveC基因產物或AveC同系物基因產物的多核苷酸克隆可以通過本領域已知的任何方法進行鑑別，包括但不限於下面第7部分所列舉的方法。通過使用如Benton和Davis，1977，科學196180中所述的篩選噬菌體文庫的方法和Grunstein及Hogness，1975，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，723961-3965所述的篩選質粒文庫的方法，可以從基因組DNA文庫中篩選aveC及aveC同系物編碼序列。存在於質粒pSE186(ATCC 209604)，或質粒pSE119中，且具有已知包含有aveC ORF之核苷酸序列的多核苷酸分子(在下面第7部分進行描述)可以用作這些篩選實驗的探針。或者，可以合成對應由純化的AveC同系物基因產物的部分或全部胺基酸序列推出的核苷酸序列的寡核苷酸探針。
5.2.重組系統5.2.1.克隆與表達載體本發明進一步提供了重組克隆載體與表達載體，其可用於克隆及表達本發明的，包括有除蟲鏈黴菌aveC ORF或任一aveC同系物ORF的多核苷酸分子。在一非限制性實施方案中，本發明提供了質粒pSE186(ATCC209604)，其包含有除蟲鏈黴菌aveC基因完整的ORF。
除非特別說明，所有下面有關除蟲鏈黴菌aveC ORF或包含有除蟲鏈黴菌aveC ORF或其部分的多核苷酸分子，或除蟲鏈黴菌AveC基因產物的描述，同時也指的是AveC同系物和AveC同系物基因產物。
已研製出多種不同的具體用於鏈黴菌的載體，包括噬菌體，高拷貝數質粒，低拷貝數質粒，及大腸桿菌-鏈黴菌穿梭質粒等，其中任一個都可以用來實踐本發明。也從鏈黴菌中克隆了大量藥物抗性基因，其中某些基因被摻入載體作為選擇性標記。在其它文獻如Hutchinson，1980，應用生物化學與生物技術，16169-190中已經列舉了在鏈黴菌中使用這些載體的例子。
優選構建出的本發明的重組載體，尤其是表達載體使得本發明多核苷酸分子的編碼序列與轉錄或翻譯編碼序列所必需的一個或多個調控元件可操作相連以生產多肽。本文所用術語「調控元件」包括但不限於這樣的核苷酸序列，其編碼可誘導的及不可誘導的啟動子，增強子，操作子，及本領域已知的用於驅動和/或調控多核苷酸編碼序列的表達的其它元件。同時，如本文所用，該編碼序列與一個或多個調控元件「可操作相連」，其中這些調控元件有效地調節並允許轉錄編碼序列或翻譯其mRNA，或者既轉錄也翻譯。
可被加工成包含有本發明的多核苷酸分子的典型的質粒載體包括pCR-Blunt，pCR2.1(Invitrogen)，pGEM3Zf(Promega)，及其穿梭載體pWHM3(Vara等，1989，細菌學雜誌，1715872-5881)等。
構建包含有特殊編碼序列(其與合適的調控元件可操作相連)的重組載體的方法是本領域眾所周知的，可使用這些方法實踐本發明。這些方法包括體外重組技術，合成技術，體內基因重組。例見Maniatis等，1989，文獻同上；Ausubel等，1989，文獻同上；Sambrook等，1989，文獻同上；Innis等，1995，文獻同上；及Erlich，1992，文獻同上中描述的技術。
這些載體的調控元件的強度和特異性可以不同。根據所用的宿主/載體系統，可使用多種適當的轉錄及翻譯元件中的任一種。對於細菌來說，轉錄調控區或啟動子的非限制性例子包括有；β-gal啟動子，T7啟動子，TAC啟動子，λ左及右啟動子，trp及lac啟動子，trp-lac融合啟動子，對於鏈黴菌來說則較特殊，啟動子為ermE，melC，及tipA等。在下面第11部分所述的具體的實施方案中，一個包含有aveC ORF的表達載體得以產生，所述ORF被克隆在與紅色糖多孢菌的強組成型ermE啟動子相鄰的位置。將該載體轉化到除蟲鏈黴菌中，隨後用HPLC分析發酵產物顯示所產生的除蟲菌素的滴度相對於僅表達野生型aveC等位基因的相同菌株的產量有所增加。
融合蛋白表達載體可被用於表達AveC基因產物-融合蛋白。純化的融合蛋白可被用於提高抗AveC基因產物的抗血清，用於研究AveC基因產物的生化特性，用不同的生化活性加工AveC融合蛋白，或有助於鑑定及純化表達的AveC基因產物。可能的融合蛋白表達載體包括但不局限於這樣的載體，其整合有編碼β-半乳糖苷酶及trpE融合子，麥芽糖結合蛋白融合子，穀胱甘肽-S-轉移酶融合子及多組氨酸融合子(運載區域)的序列。在一個可替代的實施方案中，AveC基因產物或其部分可與AveC同系物基因產物或其部分融合，該AveC同系物基因產物來源於鏈黴菌的其它種或菌株，例如吸水鏈黴菌或灰產色鏈黴菌。在下面第12部分及圖-7所述的特定實施方案中，構建了嵌合質粒，其含有吸水鏈黴菌aveC同系物ORF的564bp的區域，其替代了除蟲鏈黴菌aveC ORF的同源564bp的區域。將該雜合載體轉化至除蟲鏈黴菌細胞中，並且檢測其對所產生的除蟲菌素2類∶1類之比例的影響。
AveC融合蛋白可被設計成包含有對純化有用的區域。例如，可以使用直鏈澱粉樹脂純化AveC-麥芽糖結合蛋白融合子；可以使用穀胱甘肽瓊脂糖珠純化AveC-穀胱甘肽-S-轉移酶融合蛋白；可以使用二價鎳樹脂純化AveC-多組氨酸融合子。或者，抗載體蛋白或多肽的抗體可被用於融合蛋白的親和層析純化。例如，可將與調控元件可操作相連的編碼單克隆抗體靶表位的核苷酸序列插入表達載體的適當位置處，以使表達的表位與AveC多肽融合。例如，可通過標準技術將編碼FLAGTM表位標記(InternationalBiotechnologies Inc.)(其為親水性標記肽)的核苷酸序列插入表達載體中對應於AveC多肽羧基末端的位點。可以利用商購的抗FLAGTM抗體檢測及親和純化表達的AveC多肽FLAGTM表位融合產物。
編碼AveC融合蛋白的表達載體同樣也可以被設計成包含有編碼特殊的蛋白酶裂解位點的多接頭序列，以使表達的AveC多肽經用特定的蛋白酶處理可以從載體區域或融合配對物中釋放。例如，該融合蛋白載體可以包括編碼凝血酶或Xa因子酶切位點等的DNA序列。
利用已知的方法將aveC ORF上遊和框內的信號序列插入表達載體中以介導表達的基因產物的運輸和分泌。信號序列的非限制性例子包括得自α因子，免疫球蛋白，外膜蛋白，青黴素酶和T細胞受體等的信號序列。
為了幫助選擇用本發明的克隆或表達載體轉化或轉染的宿主細胞，該載體也可被設計為進一步包括報導基因產物或其它可選擇標記的編碼序列。優選所述編碼序列與上述調控元件編碼序列可操作相連。對本發明有用的報導基因是本領域眾所周知的，其包括那些編碼綠螢光蛋白，螢光素酶，xylE及酪氨酸酶等的報導基因。編碼可選擇標記的核苷酸序列是本領域眾所周知的，其包括那些編碼賦予抗生素抗性，抗代謝物抗性，或提供營養缺陷型需求之基因產物的序列。這些序列包括例如編碼紅黴素，硫鏈絲菌肽或卡那黴素等抗性的核苷酸序列。
5.2.2宿主細胞的轉化本發明進一步提供轉化的宿主細胞，其含有本發明的多核苷酸分子或重組載體，或由該宿主細胞衍生的新菌株或細胞系。可用於本發明實施中的宿主細胞優選為鏈黴菌細胞，但其它的原核細胞或真核細胞同樣也可被使用。該轉化的宿主細胞一般包括但不局限於微生物，例如用重組噬菌體DNA，質粒DNA，或粘粒DNA載體轉化的細菌，或用重組載體等轉化的酵母。
本發明的多核苷酸分子欲在鏈黴菌細胞中發揮作用，其也可以因克隆及表達目的轉化至其它細菌或真核細胞中。例如一般使用大腸桿菌菌株，如DH5α菌株，可得自美國典型培養物保藏中心(ATCC)，Rockville，MD，USA(保藏號31343)，或可商購(Stratagene)。優選的真核宿主細胞包括酵母細胞，但哺乳動物細胞或昆蟲細胞也可被有效使用。
本發明的重組表達載體最好被轉化或轉染至基本上均一培養的一個或多個宿主細胞中。一般根據已知技術，例如，通過原生質體轉化，磷酸鈣沉澱，氯化鈣處理，微量注射，電穿孔，通過與重組病毒接觸進行轉染，脂質體介導的轉染，DEAE-葡聚糖轉染，轉導，接合，或微粒轟擊將表達載體導入宿主細胞中。可以通過標準方法選擇轉化子，例如，選擇表達與上述重組載體相關的選擇性標記，如抗生素抗性的細胞。
一旦將表達載體導入宿主細胞，可以通過檢測預期基因產物的標準技術證實aveC編碼序列已整合併維持在宿主染色體上或以游離體的形式存在，所述技術如Southern雜交分析，限制性酶切分析，PCR分析，包括逆轉錄酶PCR(rt-PCR)或者免疫測定法。含有和/或表達重組aveC編碼序列的宿主細胞可以通過至少四種公知的一般方法中的任一種來證實，所述方法包括(i)DNA-DNA，DNA-RNA，或者RNA-反義RNA雜交；(ii)檢測標記基因功能的存在；(iii)通過測定宿主細胞中aveC特異性mRNA轉錄物的表達來評估轉錄水平，及(iv)通過免疫測定法或AveC生物活性的存在(例如，特定比例和量的除蟲菌素的產生表示除蟲鏈黴菌宿主細胞中存在AveC活性)檢測成熟多肽產物的存在。
5.2.3.重細AveC基因產物的表達及鑑定一旦aveC編碼序列被穩定導入合適的宿主細胞，該轉化的宿主細胞被無性增殖，可以在有助於AveC基因產物最大量生產的條件下培養所得細胞。所述條件一般包括將細胞培養至高密度。當表達載體含有可誘導的啟動子時，在需要誘導表達時可使用合適的誘導條件例如，溫度變化，營養耗盡，添加義務誘導物(例如，碳水化合物的類似物，例如異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG))，過量的代謝副產物的積累等。
當表達的AveC基因產物保留在宿主細胞內部時，收集細胞並裂解，在本領域已知的提取條件下，例如，在4℃或有蛋白酶抑制劑的存在，或二者共存的條件下，從裂解物中分離及純化產物以使蛋白質的降解最小化。當表達的AveC基因產物從宿主細胞中分泌時，只需收集耗盡的營養培養基並從中分離產物。
利用標準方法，可從細胞裂解物或培養基(適當時)中分離或基本上純化表達的AveC基因產物，所述方法包括但不局限於下列方法的任何組合硫酸銨沉澱，大小分級分離，離子交換層析，HPLC，密度離心及親和層析。當表達的AveC基因產物表現出生物活性時，可使用適當的檢測方法監測純化方法的每一步中製品純度的提高。不管表達的AveC基因產物是否表現出生物活性，都可以依據其大小，與抗體或特異於AveC的抗體的反應性，或者在融合標記的存在下檢測該基因產物。
因此，本發明提供了重組表達的除蟲鏈黴菌AveC基因產物及其同系物，所述基因產物含有可以被質粒pSE186(ATCC 209604)的AveC基因產物編碼序列所編碼的胺基酸序列，或圖1(SEQ ID NO2)所示的胺基酸序列或其實質性部分。
本發明進一步提供了重組表達的吸水鏈黴菌AveC同系物基因產物及其同系物，所述基因產物含有如SEQ ID NO4所示的胺基酸序列或其實質性部分。
本發明進一步提供了生產AveC基因產物的方法，所述方法包括在有助於產生重組AveC基因產物的條件下，培養用重組表達載體轉化的宿主細胞，並從細胞培養物中回收AveC基因產物，其中所述載體含有具有編碼AveC基因產物之核苷酸序列的多核苷酸分子，所述多核苷酸分子與一個或多個控制多核苷酸分子在宿主細胞中的表達的調控元件可操作相連。
重組表達的除蟲鏈黴菌AveC基因產物可用於不同的目的，其中包括篩選可以改變AveC基因產物功能的化合物，及因此調製除蟲菌素的生物合成以及產生針對AveC基因產物的抗體。
一旦獲得純度足夠高的AveC基因產物，通過下列標準方法就可以鑑定基因產物，所述方法如SDS-PAGE，大小排阻層析，胺基酸序列分析，在除蟲菌素生物合成途徑中產生合適產物的生物活性等等。例如，可以使用標準的肽測序技術測定AveC基因產物的胺基酸序列。可以用親水性分析(例見Hopp和Woods，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 783824)，或者類似的軟體運算法則鑑定AveC基因產物的親水區及疏水區，籍此進一步鑑定AveC基因產物。可進行結構分析以鑑定AveC基因產物中具有特殊二級結構的區域，例如可使用如X-射線結晶學的生物物理法(Engstrom，1974，Biochem.Exp.Biol.117-13)，計算機模型製作法(Fletterick及Zoller(編)，1986，分子生物學最新通訊，冷泉港實驗室，冷泉港，紐約)和核磁共振(NMR)作圖及研究AveC基因產物及其底物之間相互作用的位點。通過研究所取得的信息可被用於選擇aveC ORF的新突變位點，以幫助開發具有更合適的除蟲菌素生產特性的除蟲鏈黴菌新菌株。
5.3.AveC突變體的構建及應用本發明進一步提供了多核苷酸分子，其或者具有與質粒pSE186(ATCC209604)的除蟲鏈黴菌AveC基因產物編碼序列相同的核苷酸序列，或具有如圖1(SEQ ID NO1)所示的除蟲鏈黴菌aveC ORF的核苷酸序列，但其進一步包含有一個或多個突變，以致於除蟲鏈黴菌菌株ATCC 53692(其中野生型aveC等位基因已經失活並表達含有突變的核苷酸序列的多核苷酸分子)較僅表達野生型aveC等位基因的除蟲鏈黴菌菌株ATCC 53692的細胞產生了不同比例及量的除蟲菌素。
按照本發明，所述多核苷酸分子可被用於生產除蟲鏈黴菌新菌株，所述新菌株與僅表達野生型aveC等位基因的除蟲鏈黴菌相同菌株比較，除蟲菌素的生產發生可測的改變。在優選的實施方案中，所述多核苷酸分子可用於生產除蟲鏈黴菌新菌株(其與僅表達野生型aveC等位基因的相同菌株相比，以減少的2類∶1類比例生產除蟲菌素)。在另一個優選的實施方案中，所述多核苷酸分子可用於生產除蟲鏈黴菌新菌株(其與僅表達野生型aveC等位基因的相同菌株相比可以產生增加水平的除蟲菌素)。在進一步優選的實施方案中，所述多核苷酸分子可用於生產除蟲鏈黴菌新菌株(其中aveC基因已經失活)。
AveC編碼序列的突變包括將胺基酸缺失，添加或取代導入AveC基因產物，或導致AveC基因產物截短或其任何組合併產生所需結果的任何突變。例如，本發明提供了多核苷酸分子，其包含質粒pSE186(ATCC 209604)的AveC基因產物編碼序列或如圖1(SEQ ID NO1)所示的除蟲鏈黴菌aveCORF核苷酸序列，但其進一步包含有一個或多個突變，其編碼用不同的胺基酸殘基在AveC基因產物的選定位點對胺基酸殘基進行的取代。在下文例舉的幾個非限制性的實施方案中，該取代發生在胺基酸殘基第55，138，139，或230位，或其中幾個位點。
通過多種已知方法的任一種可以進行aveC編碼序列的突變，包括使用易錯聚合酶鏈式反應，或通過盒式誘變。例如，可以使用寡核苷酸介導的誘變以一種確定的方式例如在aveC ORF序列的特定區域導入一個或多個限制性位點或終止密碼子來改變aveC ORF序列。正如美國專利5,605,793所述，也可使用包括隨機片斷化，重複誘變循環及核苷酸改組的方法產生較大的具有編碼aveC突變的核苷酸序列的多核苷酸文庫。
靶向突變是有用的，對於改變AveC基因產物的一個或多個保守的胺基酸殘基尤其有用。例如，如圖6所示，通過將AveC基因產物與來自除蟲鏈黴菌(SEQ ID NO2)、灰產色鏈黴菌(SEQ ID NO5)及吸水鏈黴菌(SEQ ID NO4)的AveC同系物基因產物推定的胺基酸殘基序列相比較，顯示了這些種之間顯著保守的胺基酸殘基位點。導致一個或多個所述保守的胺基酸殘基改變的靶向誘變對於產生可以顯示所需的除蟲菌素產量改變的新突變株是非常有效的。
隨機誘變也是有用的，可以通過將除蟲鏈黴菌細胞暴露於紫外線或X-射線照射，或者暴露於如N-甲基-N′-亞硝基胍，甲烷磺酸乙酯，亞硝酸或者氮芥子類的化學誘變劑進行誘變。有關誘變技術的綜述可參見Ausubel，1989，文獻同上。
一旦產生突變的多核苷酸分子，可進行篩選以測定其是否可調製除蟲鏈黴菌中的除蟲菌素生物合成。在優選的實施方案中，通過互補除蟲鏈黴菌菌株(其中aveC基因已經失活從而給出aveC-背景)檢測具有突變的核苷酸序列的多核苷酸分子。在非限制性方法中，突變的多核苷酸分子被剪接成與一個或多個調控元件可操作相連的表達質粒，其中質粒優選包括一個或多個藥物抗性基因以選擇轉化細胞。使用已知技術將該載體轉化至aveC-宿主細胞，選擇轉化細胞並在允許或者誘導除蟲菌素產生的條件下在合適的發酵培養基中進行培養。然後通過HPLC分析發酵產物以測定突變的多核苷酸分子互補宿主細胞的能力。在下面8.3部分要舉例說明攜有能降低除蟲菌素B2∶B1比例的突變的多核苷酸分子的幾個載體，其包括pSE188，pSE199及pSE231。
本發明提供了鑑定除蟲鏈黴菌aveC ORF突變(其可以改變所產生的除蟲菌素的比例和/或產量)的方法。在優選的實施方案中，本發明提供了鑑定除蟲鏈黴菌aveC ORF突變(其可以改變所產生的除蟲菌素的B2∶B1比例)的方法，所述方法包括(a)測定除蟲鏈黴菌菌株細胞產生的除蟲菌素2類∶1類的比例，所述細胞中的野生型aveC等位基因已失活，包含有編碼突變的AveC基因產物的核苷酸序列的多核苷酸分子被導入該細胞並在其中被表達；(b)測定與步驟(a)的除蟲鏈黴菌相同的菌株細胞產生的除蟲菌素2類1類的比例，但不同的是該細胞僅表達具有如圖1(SEQ ID NO1)所示的ORF的核苷酸序列或者與其同源的核苷酸序列的aveC等位基因；及(c)比較步驟(a)的除蟲鏈黴菌菌株細胞產生的除蟲菌素2類∶1類的比例與步驟(b)的除蟲鏈黴菌菌株細胞產生的除蟲菌素2類∶1類的比例，如果二者不同的話，則鑑定出有能夠改變除蟲菌素2類∶1類比例的aveC ORF突變存在。在優選的實施方案中，除蟲菌素2類∶1類的比例因突變而減少。
在另一個優選的實施方案中，本發明提供了一種方法，該方法用於鑑定aveC ORF或者包含有aveC 0RF的基因構建體中能夠改變所產生的除蟲菌素量的突變，所述方法包括(a)測定除蟲鏈黴菌菌株細胞產生的除蟲菌素的量，所述細胞中的野生型aveC等位基因已失活，包含有編碼突變的AveC基因產物的核苷酸序列或含有編碼AveC基因產物的核苷酸序列的基因構建體的多核苷酸分子被導入該細胞並在其中表達；(b)測定與步驟(a)的除蟲鏈黴菌相同的菌株細胞產生的除蟲菌素的量，但不同的是該細胞僅表達具有如圖1(SEQ ID NO1)所示的ORF的核苷酸序列或者與其同源的核苷酸序列的aveC等位基因；及(c)比較步驟(a)的除蟲鏈黴菌菌株細胞產生的除蟲菌素的量與步驟(b)的除蟲鏈黴菌菌株細胞產生的除蟲菌素的量，如果二者不同的話，則鑑定出有能夠改變除蟲菌素量的aveC ORF突變或基因構建體突變存在。在優選的實施方案中，除蟲菌素的量因突變而增加。
上述的任一用於鑑定突變的方法可以通過使用發酵培養基進行，優選在該培養基中添加環己烷羧酸，但其它合適的脂肪酸前體，例如，如表1所列的脂肪酸前體中的任一種也可以被使用。
一旦鑑定出按所需方向調製除蟲菌素生產的突變的多核苷酸分子，也可以確定核苷酸序列上發生突變的位置。例如，可以通過PCR分離含有編碼突變的AveC基因產物的核苷酸序列的多核苷酸分子並使用已知方法對其進行DNA序列分析。通過比較突變的及野生型的aveC等位基因的DNA序列，可以確定負責改變除蟲菌素生產的突變。在本發明具體的、但非限制性的實施方案中，含有第55(S55F)，138(S138T)，139(A139T)或230(G230D)位殘基單個胺基酸取代或者第138(S138T)及139(A139T)位殘基雙重取代的除蟲鏈黴菌AveC基因產物的AveC基因產物功能發生改變，使得所產生的除蟲菌素2類∶1類的比例發生改變(參見下文第8部分)。因此，本發明包括多核苷酸分子，其含有的核苷酸序列所編碼的突變的除蟲鏈黴菌AveC基因產物包含第55，138，139或230位胺基酸殘基或其任意組合處發生的一個或多個胺基酸取代。
本發明進一步提供了製備新的除蟲鏈黴菌菌株的組合物，該菌株的細胞含有突變的aveC等位基因而導致除蟲菌素生產的變化。例如，本發明提供了重組載體，可使用該載體將任何含有本發明的突變核苷酸序列的多核苷酸分子靶向除蟲鏈黴菌染色體上的aveC基因位點，以通過同源重組插入或取代aveC ORF或其部分。然而，按照本發明，此處提供的含有本發明突變的核苷酸序列的多核苷酸分子也可以在插入到除蟲鏈黴菌染色體上除aveC基因外的位點，或在除蟲鏈黴菌細胞中保持游離狀態時，同樣起到調製除蟲菌素生物合成的作用。因此，本發明還提供了具有含有本發明突變的核苷酸序列的多核苷酸分子的載體，可使用這些載體將多核苷酸分子插入到除蟲鏈黴菌染色體上除aveC基因位點以外的位置，或保持游離狀態。
在優選的實施方案中，本發明提供了基因取代載體，其可以用於將突變的aveC等位基因插入除蟲鏈黴菌菌株中，籍此產生新的除蟲鏈黴菌菌株，所述菌株的細胞與僅表達野生型的aveC等位基因的相同菌株細胞相比，產生的除蟲菌素2類∶1類比例有所改變。在優選的實施方案中，該細胞產生的除蟲菌素2類∶1類比例減少。可使用本文提供的表達載體如pSE188，pSE199，及pSE231(這些表達載體在下面第8.3部分將舉例說明)中存在的突變的多核苷酸分子構建所述基因取代載體。
在進一步優選的實施方案中，本發明提供了載體，可使用該載體將突變的aveC等位基因插入除蟲鏈黴菌菌株細胞中以產生新細胞株，所述新細胞與僅表達野生型的AveC等位基因的相同菌株細胞相比，產生的除蟲菌素的量有所改變。在優選的實施方案中，所述新細胞產生的除蟲菌素的量增加。在具體的、非限制性實施方案中，該載體進一步包含本領域已知的強啟動子，例如，來自Saccharopolyspora erythraea的強組成型ermE啟動子，其位於aveC ORF上遊並與aveC ORF可操作相連。所述載體可以是如下面實施例11所描述的質粒pSE189，或可通過使用質粒pSE189的突變的aveC等位基因進行構建。
在進一步優選的實施方案中，本發明提供了基因取代載體，該載體可用於滅活野生型除蟲鏈黴菌菌株中的aveC基因。在非限制性的實施方案中，可以通過使用質粒pSE180(ATCC 209605)中存在的突變的多核苷酸分子構建所述基因取代載體，其在下面第8.1部分舉例說明(圖3)。本發明進一步提供了包含有多核苷酸分子的基因取代載體，所述多核苷酸分子包含天然側翼於除蟲鏈黴菌染色體上原位aveC基因的核苷酸序列或由該序列組成，例如，包括那些如圖1(SEQ ID NO1)所示的側翼核苷酸序列，可使用所述載體缺失除蟲鏈黴菌aveC ORF。
本發明進一步提供了製備除蟲鏈黴菌新菌株的方法，所述新菌株含有表達突變的aveC等位基因的細胞，其與僅表達野生型aveC等位基因的除蟲鏈黴菌相同菌株的細胞比較，所產生的除蟲菌素的比例和/或量發生改變。在優選的實施方案中，本發明進一步提供了製備除蟲鏈黴菌新菌株的方法，所述新菌株含有表達突變的aveC等位基因的細胞，其與僅表達野生型aveC等位基因的除蟲鏈黴菌相同菌株的細胞比較，所產生的除蟲菌素2類∶1類比例發生改變，所述方法包括用攜有突變的aveC等位基因的載體轉化除蟲鏈黴菌菌株細胞，該突變的aveC等位基因編碼的基因產物使得與僅表達野生型aveC等位基因的除蟲鏈黴菌相同菌株的細胞比較，表達突變的aveC等位基因的除蟲鏈黴菌菌株細胞產生的除蟲菌素的2類∶1類比例有所改變；選擇所產生的除蟲菌素2類∶1類的比例較僅表達野生型aveC等位基因的菌株細胞有所改變的轉化細胞。在優選實施方案中，除蟲菌素2類∶1類的比例有所減少。
在進一步優選的實施方案中，本發明提供了製備除蟲鏈黴菌新菌株的方法，所述菌株含有生產改變量的除蟲菌素的細胞，所述方法包括用攜有突變aveC等位基因的載體或者含有該aveC等位基因的基因構建體轉化除蟲鏈黴菌菌株細胞，所述突變的aveC等位基因的表達使得表達突變aveC等位基因或基因構建體的除蟲鏈黴菌菌株細胞所產生的除蟲菌素的量較僅表達野生型aveC等位基因的除蟲鏈黴菌相同菌株細胞產生的除蟲菌素的量有所改變；選擇所產生的除蟲菌素的量較僅表達野生型aveC等位基因的菌株細胞有所改變的轉化細胞。在優選實施方案中，轉化細胞中所產生的除蟲菌素的量有所增加。
在進一步優選的實施方案中，本發明提供了製備除蟲鏈黴菌新菌株的方法，所述菌株的細胞含有失活的aveC等位基因，所述方法包括用失活的aveC等位基因的載體轉化表達野生型aveC等位基因的除蟲鏈黴菌菌株細胞；選擇其中aveC等位基因已失活的轉化細胞。在優選的、非限制性的實施方案中，除蟲鏈黴菌菌株細胞被基因取代載體轉化，該載體所攜帶的aveC等位基因已經因突變或用異源基因序列取代AveC等位基因的一部分而失活，其中選擇天然aveC等位基因已經被失活的aveC等位基因所取代的轉化細胞。如下所述，AveC等位基因的失活可以通過用HPLC分析發酵產物來測定。在如下面第8.1部分所述的具體的、非限制性的實施方案中，通過在aveC ORF中插入來自紅色糖多孢菌的ermE基因而使aveC等位基因失活。
本發明進一步提供了除蟲鏈黴菌的新菌株，其含有用本發明的任一多核苷酸分子或載體轉化的細胞。在優選的實施方案中，本發明提供了除蟲鏈黴菌新菌株，其含有表達突變的aveC等位基因以取代野生型的aveC等位基因或含有同時表達這兩種等位基因的細胞，其中新菌株細胞以相對於僅表達野生型的aveC等位基因的相同菌株細胞而言有所改變的2類∶1類的比例生產除蟲菌素。在優選的實施方案中，新細胞產生的除蟲菌素的2類∶1類比例降低。該新菌株對於商用除蟲菌素如doramectin的大規模生產是非常有用的。
本文描述的篩選試驗的根本目的是鑑定突變的aveC等位基因，其在除蟲鏈黴菌細胞中的表達改變了，特別是降低了所產生除蟲菌素的2類∶1類的比例。在優選的實施方案中，本發明的表達可降低所產生的除蟲菌素的2類∶1類比例的突變的aveC等位基因的除蟲鏈黴菌新菌株細胞所產生的除蟲菌素的B2∶B1的比例減小的範圍是1.6∶1～0∶1以下；在更優選的實施方案中，比例約為1∶1～0∶1；在最優選的實施方案中，比例約為0.84∶1～0∶1。在下面描述的具體實施方案中，本發明的新細胞所產生的環己基B2∶環己基B1除蟲菌素的比例小於1.6∶1。在下面描述的另一個不同的具體實施方案中，本發明的新細胞所產生的環己基B2∶環己基B1除蟲菌素的比例大約是0.94∶1。在下面描述的另一個不同的具體實施方案中，本發明的新細胞所產生的環己基B2∶環己基B1除蟲菌素的比例大約是0.88∶1。在下面描述的另一個不同的具體實施方案中，本發明的新細胞所產生的環己基B2∶環己基B1除蟲菌素的比例大約是0.84∶1。
在更優選的實施方案中，本發明提供了除蟲鏈黴菌新菌株，其含有表達突變的aveC等位基因，或含有aveC等位基因的基因構建體以取代野生型aveC等位基因或含有同時表達突變的和野生型aveC等位基因的細胞，其中新菌株細胞以相對於僅表達野生型aveC等位基因的相同菌株細胞而言有所改變的量生產除蟲菌素。在優選的實施方案中，新菌株產生的除蟲菌素的量增加。在非限制性的實施方案中，基因構建體進一步包括強啟動子，例如，來自紅色糖多孢菌的強組成型ermE啟動子，其位於aveC ORF上遊並與aveC ORF可操作相連。
在進一步優選的實施方案中，本發明提供了除蟲鏈黴菌新菌株，其含有其中aveC基因已經失活的細胞。所述菌株可用於產生與野生型菌株相比有不同譜的除蟲菌素，在本文所述的互補篩選試驗中還可測定aveC基因靶向或隨機誘變是否影響除蟲菌素的生產。在下文所述的具體實施方案中，除蟲鏈黴菌宿主細胞經基因改造後含有失活的aveC基因。例如，下面實施例中所述的菌株SE180-11就是使用基因取代質粒pSE180(ATCC209605)(圖3)產生的，通過在aveC基因編碼區插入ermE抗性基因而使除蟲鏈黴菌aveC基因失活。
本發明進一步提供了重組表達的，突變的除蟲鏈黴菌AveC基因產物及其製備方法，所述基因產物由本發明上述多核苷酸分子的任一種編碼。
本發明進一步提供了生產除蟲菌素的方法，所述方法包括在允許或者誘導除蟲菌素生產的條件下，在培養基中培養除蟲鏈黴菌菌株細胞，並從培養物中回收所述除蟲菌素，所述細胞表達編碼基因產物的突變的aveC等位基因，與僅表達野生型的aveC等位基因的相同菌株細胞相比，所述突變的等位基因改變了表達突變的aveC等位基因的除蟲鏈黴菌菌株細胞產生的除蟲菌素的2類∶1類的比例。在優選的實施方案中，表達突變的aveC等位基因的細胞產生的除蟲菌素的2類∶1類的比例有所減少。該方法提供了商業上有價值的除蟲菌素例如doramectin的高效率的生產方法。
本發明進一步提供了生產除蟲菌素的方法，所述方法包括在允許或者誘導除蟲菌素生產的條件下，在培養基中培養除蟲鏈黴菌菌株細胞，並從培養物中回收所述除蟲菌素，所述細胞表達突變的aveC等位基因或含有aveC等位基因的基因構建體，與不表達突變aveC等位基因或基因構建體而僅表達野生型的aveC等位基因的相同菌株細胞相比，表達突變的aveC等位基因或基因構建體的除蟲鏈黴菌菌株細胞產生的除蟲菌素的量有所改變。在優選的實施方案中，在培養物中表達突變aveC等位基因或基因構建體的細胞產生的除蟲菌素的量有所增加。
本發明進一步提供了由表達突變的aveC等位基因的除蟲鏈黴菌菌株產生的除蟲菌素的新的組合物，其中，突變的aveC等位基因所編碼的基因產物使表達突變的aveC等位基因的除蟲鏈黴菌菌株細胞所產生的除蟲菌素2類∶1類的比例與僅表達野生型aveC等位基因的除蟲鏈黴菌相同菌株的細胞相比有所降低，其中，與僅表達野生型aveC等位基因的除蟲鏈黴菌相同菌株的細胞產生的除蟲菌素2類∶1類比例相比，新組合物中的除蟲菌素以降低的2類∶1類比例產生。這種新型的除蟲菌素組合物可以存在於耗盡的發酵培養液中或者從中回收，並且可以通過已知的生化純化技術如硫酸銨沉澱，透析，大小分級分離，離子交換層析，HPLC等從培養液中部分純化或基本純化。
5.4.除蟲菌素的用途除蟲菌素是一種非常有效的抗寄生蟲藥劑，特別是作為驅蟲劑、外寄生物殺死藥、殺蟲劑及殺蟎劑。按照本發明的方法所產生的除蟲菌素化合物均可用於這些用途。例如，按照本發明的方法所產生的除蟲菌素化合物可用於治療人類的各種疾病或症狀，尤其是本領域已知的由寄生蟲感染造成的那些疾病。參見Ikeda and Omura，1997，Chem.Rev.97(7)2591-2609。更為具體的是，按照本發明的方法所產生的除蟲菌素化合物對於由內寄生蟲所導致的各種疾病或症狀能產生有效的治療作用，所述內寄生蟲例如寄生性線蟲類可以感染人體，家畜，豬，綿羊，家禽，馬或者牛。
更具體的是，按照本發明的方法所產生的除蟲菌素化合物對於抵抗感染人體的線蟲以及感染各種動物的線蟲均有效。這樣的線蟲包括腸胃寄生蟲如鉤蟲，線蟲，蛔蟲，類圓線蟲，旋毛蟲，毛細線蟲，鞭蟲，蟯蟲，惡絲蟲病及在血管、其它組織或器官中發現的寄生蟲如絲蟲性蠕蟲及類園屬及旋毛蟲的腸道提取物。
按照本發明的方法所產生的除蟲菌素化合物也可用於治療外寄生物感染，包括例如由螺、蟎、蝨子、跳蚤、綠頭蒼蠅、咬人的昆蟲、或者騷擾馬、牛的移棲雙翅目幼蟲等引起的哺乳類或鳥類等的節肢感染。
按照本發明的方法所產生的除蟲菌素化合物也可用作家用殺蟲劑，如殺滅蟑螂、衣蛾、地毯甲蟲、及家蠅等，以及對儲存穀物和農作物有害的昆蟲，包括革蟎、蚜蟲、毛蟲、和鱗翅類幼蟲如蝗蟲等。
用按照本發明的方法所產生的除蟲菌素化合物能夠治療的動物包括綿羊、牛、馬、鹿、山羊、豬、鳥類包括家禽、狗和貓。
按照本發明的方法所產生的除蟲菌素化合物可以配製成適合於特定用途的劑型，這與被治療的宿主動物的特定種類、所涉及的寄生蟲及昆蟲有關。對於作為一種驅蟲劑使用的話，按照本發明的方法所產生的除蟲菌素化合物可以以膠囊、丸劑、片劑、液體獸用頓服劑的形式口服，或者傾注，注射或植入的形式進行給藥。這種製劑可以以傳統的方式按標準的獸醫學實踐進行製備。這樣，膠囊、丸劑或片劑可以通過將活性成分與適當精製的稀釋劑或載體混合，另外含有崩解劑和/或粘合劑如澱粉、乳糖、滑石、硬脂酸鎂等。獸用頓服劑的配製是將活性成分分散在分散劑或潤溼劑等的水溶液中。注射劑可配製成消毒液，其中可含其它物質如足夠的鹽和/或葡萄糖使該溶液與血液等滲。
這些製劑中有關活性成分的用量依照患者、被治療的宿主動物的種類、感染的嚴重性及類型、寄主的體重等的不同而變化。一般來講，對於口服給藥的製劑，活性組分的劑量可以從0.001到10mg/kg患者或動物的體重，在1天到5天內以單一劑量或分劑量服用均可。然而，在有些情況下，內科醫生或獸醫可依照臨床症狀給予較高或較低的劑量。
或者，按照本發明的方法所產生的除蟲菌素化合物也可以與動物飼料一起給藥，對於這種目的，動物飼料中也可混和有濃縮的食物添加劑或預混劑。對於作為一種殺蟲劑及處理農業害蟲來說，按照本發明的方法所產生的除蟲菌素化合物也可以以噴霧，撒粉，乳劑及類似方式按農業上標準的方法進行使用。
6.實施例除蟲鏈黴菌的發酵及除蟲菌素B2∶B1的分析同時缺少支鏈2-氧酸-脫氫酶及5-0-轉甲基酶活性物質的菌株如果在發酵介質中不補充脂肪酸的話，其將不產生除蟲菌素。該實施例證明了在這樣的突變株中，在有不同脂肪酸存在下引發生物合成時，可獲得B2∶B1的比例範圍很寬的除蟲菌素。
6.1.材料及方法除蟲鏈黴菌ATCC 53692儲存在-70℃的全肉湯種子培養基中，培養基的組成為澱粉(Nadex，Laing National)-20g；藥介質(Trader′s Protein，Memphis，TN)-15g；Ardamine pH(YeastProducts Inc.)-5g；碳酸鈣-1g。用自來水調整最終的體積為1升，pH調整至7.2，在121℃下高壓滅菌25分鐘。
取2ml上述準備的解凍的懸浮液接種到一個含有50ml同樣培養基的燒瓶中。在28℃在180rpm的旋轉振蕩器上將其培養48小時後，用2ml肉湯接種到一個含有50ml生產培養基的燒瓶中，該培養基含有澱粉-80g碳酸鈣-7g；Pharmamedia-5g；磷酸氫二鉀-1g；硫酸鎂-1g；穀氨酸-0.6g；七水合硫酸亞鐵-0.01g；硫酸鋅-0.001g；硫酸亞鎂-0.001g。用自來水調整最終的體積為1升，pH調整至7.2，在121℃下高壓滅菌25分鐘。
不同的羧酸酶底物(參見表1)在甲醇中溶解並添加到發酵的肉湯基中接種24小時後最終濃度為0.2g/1。發酵的肉湯培養基在28℃培養14天，然後將其離心(2,500rpm，2分鐘)，去除上清液。用丙酮(15ml)，然後用二氯甲烷(30ml)萃取菌絲沉澱，分離有機相，過濾，然後蒸發乾燥。殘餘物用1ml甲醇吸收，並用配有240nm的掃描二極體組檢測器的Hewlett-Packard 1090A液相色譜進行HPLC分析，所用柱子是BeckmanUltrasphere C-18，5μm，4.6mm×25cm的柱子，保持在40℃。將上述甲醇溶液25μm注入柱子中。在0.85/毫升分鐘下，用甲醇-水線性梯度從80∶20到95∶5進行洗脫超過40分鐘。環己基B1的兩種標準濃度用於校準檢測器的反應，測量對應於除蟲菌素B2及B1的曲線的面積。
6.2.結果所觀察到的除蟲菌素B2和B1的HPLC保留時間，及2∶1比例如表1所示。
表1
表1所列數據證明了產生的除蟲菌素的B2∶B1的比例有一個很寬的範圍，表明了2類化合物與1類化合物脫水轉化的結果有很大的差異，這取決於所提供的脂肪酸側鏈啟動單元的性質。這表明B2∶B1比例的改變(由aveC蛋白的改變所產生)對於特定的底物具有特異性。因此，用特定的底物獲得的展示B2∶B1比例變化的突變子的篩選也需要在該底物的存在下進行。下面這些例子描述了使用環己烷羧酸作為篩選底物。然而，該底物僅用於舉例說明本發明潛在的實用性，而不是有意要限制本發明。
7.實施例aveC基因的分離本實施例描述了編碼AveC基因產品的除蟲鏈黴菌染色體一個區域的分離及鑑定，正如下所描述的，aveC基因被鑑定為能夠改變所產生的除蟲菌素環己基B2與B1的比例(B2∶B1)。
7.1.材料與方法7.1.1.用於DNA分離的鏈黴菌的生長下面的方法用於培養鏈黴菌。除蟲鏈黴菌ATCC 31272株單菌落(單菌落分離物#2)在1/2濃度的YPD-6中分離，YPD-6包含有Difco YeastExtract-5g；Difco Bacto-腖-5g；葡萄糖-2.5g；MOPS-5g；Difco Bacto瓊脂-15g.，最終的體積用dH2O調整至1升，pH調整至7.0，培養基在121℃下高壓滅菌25分鐘。
上述培養基培養的菌絲體用於接種到10ml TSB培養基(DifcoTryptic Soy Broth-30g，在1升dH2O中，在121℃下高壓滅菌25分鐘)，在一個25mm×150mm試管中以300rpm振蕩，在28℃下培養48-72小時。
7.1.2.從鏈黴菌中分離染色體DNA將上述生長的等分菌絲體(0.25ml或0.5ml)放置於一個1.5ml的微量離心試管並將該細胞在12,000×g離心60秒而濃縮。去除上清液，使細胞懸浮於0.25ml TSE緩衝液中(20ml 1.5M蔗糖，2.5ml 1MTris-HCl，pH8.0，2.5ml 1M EDTA，pH8.0，和75ml dH2O)，其含有2mg/ml溶菌酶。樣品在37℃下振蕩培養20分鐘，運載至一個AutoGen540TM自動的核酸分離裝置(Integrated Separation Systems，Natick，MA)，基因組DNA用Cycle 159(儀器軟體)按照操作手冊進行分離。
或者，將5ml的菌絲體置於一個17mm×100mm的試管中，通過在3,000rpm下離心5分鐘進行細胞濃縮，去除上清液。細胞重新懸浮在1ml TSE緩衝液中，通過在3,000rpm下離心5分鐘進行細胞濃縮，去除上清液。細胞重新懸浮在1ml含有2mg/ml溶菌酶的TSE緩衝液中，並在37℃振蕩孵育30-60分鐘。經過培養後，加入0.5ml 10％十二烷基硫酸鈉(SDS)，將細胞在37℃下孵育，直到裂解完成。裂解產物在60℃下孵育10分鐘，冷卻至室溫，分到兩個1.5ml Eppendorf試管中，並用0.5ml苯酚/氯仿(50％苯酚，預先用0.5M Tris平衡，pH8.0；50％氯仿)萃取1次。去除水相，用氯仿∶異戊醇(24∶1)萃取2到5次。通過加入1/10體積3M醋酸鈉，pH4.8沉降DNA，在冰中孵育混合物10分鐘，在15,000rpm，5℃將混合物離心10分鐘，將上清液移至一乾淨的試管，並在其中加入1體積的異丙醇。然後將上清液與異丙醇一起在冰中孵育20分鐘，在15,000rpm，5℃將混合物離心20分鐘，將上清液移除，用70％乙醇洗滌DNA粒狀沉澱物1次。在粒狀沉澱物乾燥後，將DNA再懸浮於TE緩衝液中(10mM Tris，1mM EDTA，pH8.0)。
7.1.3.從鏈黴菌中分離質粒DNA將一部分菌絲體(1.0ml)放置於一個1.5ml的微量離心試管，其在12,000xg下離心60秒濃縮細胞。去除上清液，細胞再懸浮於1.0ml10.3％蔗糖中，在12,000×g下離心濃縮60秒，去除上清液。然後將細胞重懸浮於0.25ml TSE緩衝液中，其含有2mg/ml溶菌酶，在37℃下振蕩孵育20分鐘，然後載至AutoGen 540TM自動的核酸分離裝置中。按照操作手冊，使用Cycle 106(儀器軟體)分離質粒DNA。
或者，將1.5ml的菌絲體放置於1.5ml微型離心試管中，在12,000xg下離心60秒濃縮細胞。去除上清液，細胞再懸浮於1.0ml 10.3％蔗糖，在12,000×g下離心濃縮60秒，去除上清液。細胞重懸浮於0.5ml TSE緩衝液中，其含有2mg/ml溶菌酶，在37℃孵育15-30分鐘。孵育後，加入0.25ml鹼性SDS(0.3N NaOH，2％SDS)，在55℃下孵育15-30分鐘或直到溶液變清。將醋酸鈉(0.1ml，3M，pH4.8)加入到DNA溶液中，將其在冰中孵育10分鐘。DNA樣品在5℃下在14,000rpm離心10分鐘。將上清液移至一乾淨的試管，並在其中加入0.2ml的苯酚/氯仿(50％苯酚50％氯仿)並輕輕混和。DNA溶液在5℃下以14,000rpm離心10分鐘，上清液移至一乾淨的Eppendorf試管。加入異丙醇0.75ml，將溶液輕輕混和，然後在室溫下孵育20分鐘。將該DNA溶液在5℃下以14,000rpm離心15分鐘，移除上清液，用70％乙醇洗滌DNA沉澱顆粒，乾燥，再在TE緩衝液中重懸浮。
7.1.4.從大腸桿菌中分離質粒DNA將單一的轉化的大腸桿菌菌落在5ml Luria-Bertani(LB)培養基中(Bacto-腖-10g，Bacto-yeast extract-5g，和NaCl-10g在1升dH2O中，pH7.0，在121℃下高壓滅菌25分鐘，並用100μg/ml氨卡青黴素補充)孵育。將培養物過夜培養，將1μm等分試樣置於1.5ml微型離心試管中，將培養樣品載至AutoGen 540TM自動核酸分離器中，按照操作手冊，使用Cycle 3(儀器軟體)分離質粒DNA。
7.1.5.除蟲鏈黴菌原生質體的製備及轉化將除蟲鏈黴菌的單一菌落在1/2濃度的YPD-6中分離。菌絲體用於接種到25mm×150mm試管中的10ml TSB培養基中，並且在28℃下以300rpm振蕩培養48小時。用1ml菌絲體接種50ml YEME培養基。每升YEME培養基含有Difco Yeast Extract-3g；Difco Bacto-棟-5g；DifcoMalt Extract-3g；蔗糖-300g。經過在121℃下高壓滅菌25分鐘後，加入下列物質2.5M MgCl2·6H2O(分別在121℃下高壓滅菌25分鐘)-2ml；及甘氨酸(20％)(過濾滅菌)-25ml。
將菌絲體在30℃下培育48-72小時，然後在50ml離心管(Falcon)中在3,000rpm下離心20分鐘收穫。去除上清液，菌絲體在P緩衝液中重懸浮，P緩衝液含有蔗糖-205g；K2SO4-0.25g；MgCl26H2O-2.02g；H2O-600ml；K2PO4(0.5％)-10ml；痕量元素溶液-20ml；CaCl22H2O(3.68％)-100ml；及MES緩衝液(1.0M，pH6.5)-10ml(*痕量元素溶液每升含有ZnCl2-40mg；FeCl3·6H2O-200mg；CuCl2·2H2O-10mg；MnCl2·4H2O-10mg；Na2B4O7·10H2O-10mg；(NH4)6Mo7O24·4H2O-10mg)。pH調至6.5，最終體積調至1升，用0.45微米的篩子熱過濾培養基。
菌絲體以3,000rpm離心20分鐘得到粒狀沉澱，去除上清液，將菌絲體在含有2mg/ml溶菌酶的20ml P緩衝液中重懸浮。菌絲體在35℃下振蕩孵育15分鐘，在顯微鏡下觀察以確定形成原生質體的範圍。當原生質體形成結束時，將其在8,000rpm下離心10分鐘。去除上清液，將原生質體在10ml P緩衝液中重懸浮。將原生質體在8,000rpm離心10分鐘，去除上清液，將其在2ml P緩衝液中重懸浮，大約有1×109個原生質體分布在2.0ml低溫小瓶(Nalgene)中。
裝有1×109個原生質體的小瓶在8,000rpm下離心10分鐘，去除上清液，原生質體在0.1ml P緩衝液中重懸浮。將2～5μg轉化的DNA加入到原生質體中，接著加入0.5ml工作T緩衝液。T緩衝基含有PEG-1000(Sigma)-25g；蔗糖-2.5g；H2O-83ml.。用1N的NaOH將pH調節至8.8(過濾消毒後)，T緩衝基是過濾殺菌並在40℃下保存。工作T緩衝液(當天製作使用)是T緩衝基-8.3ml；K2PO4(4mM)-1.0ml；CaCl2·2H2O(5M)-0.2ml；及TES(1M，pH8)-0.5ml.。該工作T緩衝液的每一組分都是分別過濾殺菌的。
在20秒鐘內將T緩衝液加入到原生質體，同時加入1.0ml P緩衝液，然後將原生質體在8,000rpm離心10分鐘。去除上清液後將原生質體在0.1ml P緩衝液中重懸浮。然後將原生質體在RM14培養基平板培養，該培養基含有蔗糖-205g；K2SO4-0.25g；MgCl2·6H2O-10.12g；葡萄糖-10g；Difco Casamino Acids-O.1g；Difco Yeast Extract-5g；Difco Oatmeal瓊脂-3g；Difco Bacto瓊脂-22g；dH2O-800ml。溶液在121℃下高壓滅菌25分鐘。經過滅菌，加入下列消過毒的組分K2PO4(0.5％)-10ml；CaCl2·2H2O(5M)-5ml；L-脯氨酸(20％)-15ml；MES緩衝液(1.0M，pH6.5)-10ml；痕量元素(同上)-2ml；環己醯亞胺原液(25mg/ml)-40ml；及1N NaOH-2ml。將25ml RM14培養基等分在每個平板上，這些平板在使用前都要乾燥24小時。
原生質體在溼度95％，溫度30℃下孵育20-24小時。為了選擇硫鏈絲菌肽抗性轉化子，將含有125μg/ml硫鏈絲菌的1ml重複緩衝液均勻地平鋪在RM14再生板上，每100ml重複緩衝液含有蔗糖-10.3g；痕量元素溶液(與上相同)-0.2ml；及MES(1M，pH6.5)-1ml。原生質體在溼度95％，溫度30℃下孵育7-14天直到硫鏈絲菌肽抗性(ThiO』)菌落出現。
7.1.6.鏈黴菌紫原生質體的轉化在某些情況下，鏈黴菌紫原生質體(S.lividans)TK64(由JohnInnes研究所，Norwich，U.K提供)被用於轉化。S.lividans生長、原生質化及轉化的方法和組分在Hopwood等人，1985，鏈黴菌的基因操作(Genetic Manipulation of Streptomyces，A Laboratory Manual，JohnInnes Foundation，Norwich，U.K.中已有描述，並如其中所述地進行。質粒DNA從S.lividans轉化株中的分離如上述7.1.3中所描述。
7.1.7.除蟲鏈黴菌株的發酵分析除蟲鏈黴菌的菌絲體在1/2濃度的YPD-6上培養4-7天後，接種到1×6英寸的試管中，其中含有8ml預製成的培養基及兩個5mm玻璃珠子，預製成的培養基含有可溶性澱粉(或者低沸點的澱粉或者KOSO，JapanCom Starch Co.，Nagoya)-20g/L；Pharmamedia-15g/L；ArdaminepH-5g/L(Champlain Ind.，Clifton，NJ)；CaCO3-2g/L；2x bcfa(″bcfa′″指的是支鏈脂肪酸)在培養基中含有一最終濃度為50ppm 2-(+/-)-甲基丁酸，60ppm異丁酸，及20ppm異戊酸。將pH調至7.2，培養基在121℃下高壓滅菌25分鐘。
試管以17°角在29℃下以215rpm振蕩培養3天。將用2-ml種子培養的等分試樣接種到一個300ml Erlenmeyer燒瓶中，其中含有25ml生長培養基，該培養基含有澱粉(或者低沸點的澱粉或者KOSO)-160g/L；Nutrisoy(Archer Daniels Midland，Decatur，IL)10g/L；Ardamine pH-10g/L；K2HPO4-2g/L；MgSO4·4H2O-2g/L；FeSO4·7H2O-0.02g/L；MnCl2-0.002g/L；ZnSO4·7H2O-0.002g/L；CaCO3-14g/L 2x bcfa(同上)；及環己烷羧酸(CHC)(在pH7.0下製成20％的溶液)-800ppm。pH調至6.9，培養基在121℃下高壓滅菌25分鐘。
接種後，將燒瓶在29℃下以200rpm振蕩培養12天。經過培養，從燒瓶中抽取2ml的樣品，用8ml甲醇稀釋，混合，混合物在1,250×g下離心10分鐘沉澱碎片。用Beckman Ultrasphere ODS柱子(25cm×4.6mm ID)通過HPLC分析上清液，流速為0.75毫升/分鐘，並通過在240nm下的吸光度檢測。流動相為86/8.9/5.1甲醇/水/乙腈。
7.1.8.除蟲鏈黴菌PKS基因的分離除蟲鏈黴菌(ATCC 31272，SC-2)染色體DNA的粘粒文庫用由紅色多孢菌聚酮合成酶(PKS)基因片段製成的酮合成酶(KS)探針進行製備及雜交。有關粘粒文庫製備的詳細描述在下列文獻可以找到；Sambrook等人，1989，同上。有關鏈黴菌染色體DNA文庫製備的詳細描述在下列文獻可以找到；Hopwood等人，1985，同上。含有酮合成酶-雜交區域的粘粒菌落可以通過與一個2.7Kb的來自pEX26(由Dr.P.Leadlay，Cambridge，UK提供)的Ndel/Eco47III片段雜交識別。使用Ndel及Eco47III，大約有5ng pEX26被消化。反應混合物被載於0.8％SeaPlaque GTG瓊脂糖凝膠(FMC BioProducts，Rockland，ME上。經過電泳後從凝膠中切除2.7KbNdel/Eco47III片段，並使用Fast Protocol的GELaseTM(EpicentreTechnologies)從凝膠中回收DNA。2.7Kb的Ndel/Eco47III片段用[α-32P]dCTP(脫氧胞苷5′-三磷酸鹽，四(三乙胺)鹽，[alpha-32P]-)(NEN-Dupont，Boston，MA)按照提供者的指導使用BRL Nick翻譯系統(BRL生命技術公司，Gaithersburg，MD)進行標記。在0.05ml體積中進行典型的反應。加入5μl終止緩衝液後，按照廠商指導，將標記的DNA分子用G-25 Sephadex Quick SpinTMColumn(Boehringer Mannheim)從尚未整合的核酸分子中分離。
大約1,800粘粒菌落通過菌落雜交進行篩選。鑑定出10個與紅色多孢菌KS探針強力雜交的菌落。包含有粘粒DNA的大腸桿菌菌落在LB液體培養基中生長，按照操作說明用Cycle 3(儀器軟體)在AutoGen 540TM自動核酸分離器中從每一培養物中分離粘粒DNA。限制性核酸內切酶圖譜及DNA印跡雜交分析揭示了五種菌落中含有重疊的染色體區域。五種粘粒(也即pSE65，pSE66，pSE67，pSE68，pSE69)的除蟲鏈黴菌基因組BamHl酶切圖譜通過分析重疊的粘粒及雜交法進行構建(圖4)。
7.1.9.調控除蟲菌素B2∶B1比例的DNA鑑定及aveC ORF的鑑定下面的方法用於測試來自於pSE66粘粒克隆的亞克隆片段調控AveC突變株中除蟲菌素B2∶B1比例的能力。用Sacl及BamHl消化pSE66(5μg)。反應混合物載於0.8％SeaplaqueTMGTG瓊脂糖凝膠(FMC BioProducts)，2.9Kb Sacl/BamHl片段切自電泳後的凝膠，並使用Fast Protocol的GELaseTM(Epicentre Technologies)從凝膠中回收DNA。大約有5μg的穿梭載體pWHM3(Vara等人，1989，J.Bacteriol.17158 72-5881)被Sacl及BamHI所消化。有0.5μg的2.9Kb插入子及0.5μg消化的pWHM3被一起混合，並按照廠商說明用1單位的連接酶(New England Biolabs，Inc.，Beverly，MA)在15℃、總體積為20μl條件下孵育過夜。經過孵育，5μl的連接混合物在70℃下孵育10分鐘，冷卻至室溫，按照操作手冊用於轉化感受態的E.coli DH5α細胞(BRL)。質粒DNA從氨卡青黴素抗性轉化子中分離，通過限制性酶切分析可以證實2.9Kb Sacl/BamHI插入子的存在。該質粒被命名為pSE119。
如上7.1.5部分所描述的，除蟲鏈黴菌菌株1100-SC38(Pfizer內部菌株)的原生質體用pSE119進行製備和轉化。株1100-SC38是一個突變子，當用環己烷羧酸進行補充時，與除蟲菌素環己基-B1形式比較，其產生明顯多的除蟲菌素環己基-B2形式(B2∶B1的比例大約是30∶1)。用於轉化除蟲鏈黴菌原生質體的pSE119從E.coli株GM2163(得自Dr.B.J.Bachmann，Curator，E.coli Genetic Stock Center，YaleUniversity)、E.coli株DM1(BRL)、或者S.lividans株TK64中分離。分離菌株1100-SC38的硫鏈絲菌肽抗性轉化子並通過HPLC分析發酵產品來進行分析。含有pSE119的除蟲鏈黴菌株1100-SC38的轉化子產生比例改變的除蟲菌素環己基B2環己基-B1，該比例大約是3.7∶1(表2)。
確定了pSE119能夠調控AveC突變子中的除蟲菌素B2∶B1的比例後，測出插入的DNA序列。按照操作手冊，使用質粒DNA分離試劑盒(Qiagen，Valencia，CA)，大約有10μg的pSE119被分離，然後用ABI 373A自動DNA測序儀(Perkin Elmer，Foster City，CA)進行測序。用遺傳學計算機組程序(GCG，Madison，WI)組合和編輯測序數據。DNA序列及aveC ORF在圖1(SEQ ID NO1)中已經列出。
如下構建一種新的質粒，命名為pSE118。用SphI及BamHI消化大約5μg的pSE66。將反應混合物載在0.8％SeaPlaque GTG瓊脂糖凝膠(FMCBioProducts)上，2.8Kb的SphI/BamHI片段經過電泳從凝膠中切除，使用Fast Protocol的GELaseTM(Epicentre Technologies)從凝膠中回收DNA。大約有5μg的穿梭載體pWHM3被SphI及BamHI所消化。有0.5μg的2.8Kb插入子及0.5μg消化的pWHM3被一起混合，並在15℃、總體積為20μl條件下按照廠商說明用1單位的連接酶(New England Biolabs，Inc.，Beverly，MA)與其一起孵育過夜。經過孵育，5μl的連接混合物在70℃下孵育10分鐘，冷卻至室溫，按照操作手冊用於轉化受感態的E.coliDH5α細胞。質粒DNA從氨卡青黴素抗性轉化子中分離，通過限制性酶切分析可以證實2.8Kb SphI/BamHI插入子的存在。該質粒被命名為pSE118。在pSE118及pSE119中的插入子DNA中大約有838個核苷酸重疊(表4)。
除蟲鏈黴菌株1100-SC38的原生質體用pSE118進行如上轉化。分離菌株1100-SC38的硫鏈絲菌肽抗性轉化子並通過HPLC分析發酵產品來進行分析。含有pSE118的除蟲鏈黴菌株1100-SC38的轉化株相對於株1100-SC38在除蟲菌素環己基B2環己基-B1的比例上並未改變(表2)。
7.1.10.來自除蟲鏈黴菌染色體DNA的aveC基因的PCR擴增一個含有aveC ORF的-1.2Kb片段通過PCR擴增法從除蟲鏈黴菌染色體DNA中分離，其使用的引物按照從上所獲的aveC核苷酸序列進行設計。PCR引物由Genosys Biotechnologies，Inc.(Texas)提供。向右引物是5′-TCACGAAACCGGACACAC-3(SEQ ID NO6)；向左引物是5′-CATGATCGCTGAACCGAG-3′(SEQ ID NO7)。在由生產商所提供的緩衝液中用Deep VentTM聚合酶(New England-Biolabs)進行PCR反應，並存在300μM dNTP，10％甘油，200pmol每種引物，0.1μg模板及2.5單位酶，最終體積為100μl，使用Perkin-Elmer Cetus熱交換器。第一個循環的熱分布圖為95℃5分鐘(變性步驟)，60℃2分鐘(退火步驟)，72℃下2分鐘(延伸步驟)。隨後的24循環有一個相似的熱譜圖，但變性步驟的時間縮短至45秒種以及退火時間縮短至1分鐘。
PCR產品在1％瓊脂糖凝膠中電泳後，檢測到一個-1.2Kb的單DNA帶。從凝膠中純化該DNA，並按照操作手冊用25ng線性的鈍的PCR-鈍性載體(Invitrogen)在一個比例為1∶10摩爾的載體插入子進行連接。按照操作手冊將連接混合物用於轉化ShotTM感受態的E.coil細胞(Invitrogen)。質粒DNA從氨苄青黴素抗性轉化子中分離，該～1.2Kb插入子的存在可以通過限制性酶切分析證實。該質粒被命名為pSE179。
來自pSE179的插入子DNA通過用BamHI/XbaI進行消化分離，用電泳法進行分離，從凝膠中純化，並用穿梭載體pWHM3進行連接(也已被BamHI/XbaI消化)，其在一個以比例為1∶5摩爾的載體與插入子存在的1μg總DNA濃度中進行。按照操作手冊連接混合物用於轉化感受態的E.coilDH5α細胞。質粒DNA從氨苄青黴素抗性轉化體中分離，該～1.2Kb插入子的存在可以通過限制性酶切分析證實。該質粒(被命名為pSE186(圖2，ATCC 209604))被轉化至E.coil DM1中，並且質粒DNA從氨苄青黴素抗性轉化子中分離。
7.2.結果鑑定出來自pSE119的2.9Kb SacI/BamHI酶切片段，當其轉化至除蟲鏈黴菌株1100-SC38中時，顯著地改變了B2∶B1除蟲菌素的產量比。一般情況下，除蟲鏈黴菌株1100-SC38 B2∶B1的比例約為30∶1，但當用含有2.9Kb SacI/BamHI酶切片段的載體轉化時，除蟲菌素B2∶B1的比例減少至大約3.7∶1。對轉化體培養物進行後發酵分析證實了轉化DNA的存在。
對2.9Kb pSE119片段進行測序，並鑑定了約0.9Kb的ORF(圖1)(SEQ ID NO1)，其包含一個PstI/SphI片段，以前在其它地方發生突變時其僅產生B2產物(Ikeda等人，1995，同上)。該ORF或者其相應誘導的多肽，與已知資料庫(GenEMBL，SWISS-PROT)相比，並不表明其與已知DNA或者蛋白序列有任何的同源性。
表2表示用不同質粒進行轉化的除蟲鏈黴菌株1100-SC38的發酵分析表2
8.實施例除蟲鏈黴菌Avec突變株的構建本實施例描述了利用上述組分及方法構建幾種不同的除蟲鏈黴菌AveC突變株。將突變株引入至鏈黴菌基因中的技術可以參見Kieser及Hopwood，1991，Meth.Enzym.204430-458的一般描述。一個更加詳細的說明可以參見Anzai等人，1988，J.Antibiot XLI(2)226-233及Stutzman-Engwall等人，1992，J.Bacteriol.174(1)144-154。這些參考資料在此都被全文引用。
8.1.除蟲鏈黴菌AveC基因的失活含有失活的AveC基因的AveC突變株可以通過如下所述的幾種方法進行構建。
在第一種方法中，一個在pSE119(如上第7.1.9所描述的質粒)aveC基因內部的640bp的SphI/PstI片段被來自於Sacc.erythraea的ermE基因所取代(對於紅黴素抗性來說)。用Bg/II及EcoRI通過限制性酶切消化，從pIJ4026(來自John Innes Institute，Norwich，U.K.；還參見Bibb等人，1985，Gene 41357-368)中分離ermE基因，然後進行電泳，並從凝膠中純化。該約1.7Kb片段連接到pGEM7Zf(Promega)，其用BamHI及EcoRI進行消化，並依照操作手冊，將連接混合物轉化到感受態的E.coli DH5α細胞中。將質粒DNA從氨苄青黴素抗性轉化子中分離，該約1.7Kb插入子的存在可以通過限制性酶切分析證實。該質粒被命名為pSE27。
pSE118(如上第7.1.9部分描述)用SphI及BamHI進行消化，將消化物進行電泳，並將該約2.8Kb SphI/BamHI插入子從凝膠中純化。pSE119用PstI及EcoRI進行消化，然後進行電泳，並將該約1.5Kb PstI/EcoRI插入子從凝膠中純化。將穿梭載體pWHM3用BamHI及EcoRI進行消化。pSE27用PstI及SphI進行消化。然後進行電泳，並將該約1.7Kb的PstI/SphI插入子從凝膠中純化。所有這四個片段(即約2.8Kb，約1.5Kb，約7.2Kb，約1.7Kb)以四種形式連接在一起。依照操作手冊，將連接混合物轉化到感受態的E.coli DH5α細胞中。從氨苄青黴素抗性轉化子中分離質粒DNA，通過限制性酶切分析證實校正插入子的存在。該質粒被命名為pSE180(圖3；ATCC209605)。
pSE180被轉化入S.lividans TK64細胞，通過抗硫鏈絲菌肽及紅黴素抗生素鑑定已轉化的菌落。從S.Lividans中分離pSE180，並且用於轉化除蟲鏈黴菌的原生質體。鑑定四種硫鏈絲菌肽抗性除蟲鏈黴菌轉化體，並製備原生質體並將其在非選擇性條件的RM14培養基中進行鋪板。原生質體再生後，篩選有紅黴素抗性及無硫鏈絲菌肽抗性的單菌落，表明了失活aveC基因的染色體整合及自由複製子的缺失。鑑定ErmrThios轉化體，並將其命名為SE180-11菌株。將整個染色體DNA從SE180-11株中進行分離，並用限制性酶BamHI，HindIII，PstI或者SphI進行消化，並在0.8％瓊脂糖凝膠中進行電泳分離，然後轉移至尼龍膜上，並與ermE探針進行雜交。這些分析顯示，ermE抗性基因的染色體整合及伴隨的640bpPstI/SphI片段的缺失是由一個雙重交換的過程發生的。SE180-11株發酵產品的HPLC分析顯示一般的除蟲菌素不再產生(圖5A)。
在使aveC基因失活的第二種方法中，1.7Kb ermE基因從除蟲鏈黴菌SE180-11株的染色體上除去，在aveC基因中留下一個640bp PstI/SphI缺失。如下構建基因取代質粒用XbaI部分消化pSE180，將約11.4Kb片段從凝膠中純化。該約11.4Kb帶缺少1.7Kb ermE抗性基因。然後該DNA連接並轉化進E.coli DH5α細胞。從氨苄青黴素抗性轉化體中分離質粒DNA，校正插入子的存在可以通過限制性酶切分析證實。該質粒(被命名為pSE184)被轉化進E.coli DM1中，從氨苄青黴素抗性轉化體中分離質粒DNA。該質粒用於轉化除蟲鏈黴菌SE180-11株的原生質體。從SE180-11株的硫鏈絲菌肽抗性轉化體中製備原生質體，並在RM14上作為單菌落進行鋪板。原生質體再生後，篩選出無紅黴素抗性及硫鏈絲菌肽抗性的單菌落，表明了失活aveC基因的染色體整合及含有ermE基因的自由複製子的缺失。鑑定出ErmrThios並命名為SE184-1-13。對SE184-1-13的發酵分析顯示一般的除蟲菌素不再產生，SE184-1-13具有與SE180-11相同的發酵特徵。
在第三種使aveC基因失活的方法中，使用PCR方法在核苷酸位置471的C後加入兩個G將一個移碼引進染色體aveC基因上，因此產生一個BspEl位點。加工的EspEl位置的存在對於檢測基因替代過程是有用的。設計PCR引物以在aveC基因中引進移碼突變，該引物由GenosysBiotechnologies公司所提供。向右引物為5′-GGTTCCGGATGCCGTTCTCG-3′(SEQ ID NO8)向左引物為5′-AACTCCGGTCGACTCCCCTTC-3′(SEQ IDNO9)。進行PCR的條件如上第7.1.10部分所描述。用Sphl消化666bp的PCR產品，分別給出兩個278 bp及388 bp的片段。從凝膠中純化388bp片段。
基因替代的質粒如下構建用EcoRI及BamHI消化穿梭載體pWHM3。用BamHI及SphI消化pSE119，然後進行電泳，從凝膠中分離約840bp的片段。用EcoRI及XmmI消化pSE119，然後進行電泳分離，並從凝膠中純化約1.7Kb的片段。四種片段(也即～7.2Kb，～840bp，～1.7Kb及388bp)以四種不同方式連接在一起。連接混合物被轉化進感受態的E.coliDH5α細胞中。從氨苄青黴素抗性轉化體中分離質粒DNA，通過限制性酶切分析及DNA序列分析證實校正插入子的存在。該質粒(命名為pSE185)轉化進入E.coli DM1細胞，從氨苄青黴素抗性轉化體中分離質粒DNA。該質粒用於轉化除蟲鏈黴菌株1100-SC38的原生質體。分離菌株1100-SC38的硫鏈絲菌肽抗性轉化體，並通過HPLC分析發酵產品來分析。當pSE185轉化入除蟲鏈黴菌株1100-SC38中時，並未明顯改變除蟲菌素B2∶B1的比例(表2)。
pSE185用於轉化除蟲鏈黴菌原生質體以在染色體aveC基因中產生一個移碼突變。從硫鏈絲菌肽抗性轉化株製備原生質體，並在RM14培養基上作為單菌落鋪板。原生質體再生後，篩選無硫鏈絲菌肽抗性的單菌落。通過PCR分離和篩選來自硫鏈絲菌肽敏感的菌落的染色體DNA的整合至染色體中的移碼突變的存在。該PCR引物是以aveC核苷酸序列為基礎設計的，由Genosys Biotechnologies(Texas)公司提供。向右的PCR引物為5′-GCAAGGATACGGGGACTAC-3′(SEQ ID NO10)，向左的PCR引物為5′-GAACCGACCGCCTGATAC-3′(SEQ ID NO11)，進行PCR的條件如上第7.1.10部分所述。所獲得的PCR產品為543bp，當用BspE1進行消化時，可以檢測到三個片段368bp，96bp，及79bp，表明了失活aveC基因的染色體整合及自由複製子的缺失。
在aveC基因上含有移碼突變的除蟲鏈黴菌突變株發酵分析表明一般的除蟲菌素不再產生，這些突變株具有與株SE180-11及SE184-1-13相同的HPLC發酵特徵。Thios轉化株被鑑定並命名為SE185-5a。
此外，aveC基因上產生突變，使核苷酸位置520由G變為A，其結果是在位置116上編碼色氨酸(W)的密碼子改變為一個終止密碼子。有這種突變的除蟲鏈黴菌株不產生一般的除蟲菌素並具有與株SE180-11、SE184-1-13、及SE185-5a相同的發酵特徵。
此外，在aveC基因產生的突變改變了兩個位置(i)核苷酸位置970由G變為A，使胺基酸位置256從甘氨酸(G)變為天冬氨酸(D)，及(ii)核苷酸位置996由T變為C，使胺基酸位置275從酪氨酸(Y)變為組氨酸(H)。具有這些突變(G256D/Y275H)的除蟲鏈黴菌株並不產生一般的除蟲菌素並具有與株SE180-11、SE184-1-13、及SE185-5a相同的發酵特徵。
除蟲鏈黴菌aveC失活突變株SE180-11、SE184-1-13、SE185-5a，及此處所提的其它株，提供了篩選工具用於評估aveC基因其它突變的影響。含有aveC基因的野生型拷貝的pSE186轉化入E.coil DM1細胞中，使質粒DNA從氨苄青黴素抗性轉化株中分離。該pSE186 DNA用於轉化除蟲鏈黴菌的SE180-11株。分離SE180-11株的硫鏈絲菌肽抗性轉化體，測定紅黴素抗性的存在，通過HPLC分析發酵產品來分析ThiorErmr轉化體。反位的功能性aveC基因的存在就能將正常的除蟲菌素產量恢復到SE180-11株(圖5B)。
8.2改變B2∶B1比例的AveC基因的突變分析如上所述，含有失活的aveC基因的除蟲鏈黴菌菌株SE180-11通過用一含有功能性aveC基因的質粒(pSE186)轉化而補充。SE180-11株也可用作宿主菌株來鑑定aveC基因的其它突變，如下所述。
從菌株1100-SC38中分離染色體DNA，並用作aveC基因進行PCR擴增的模板。通過PCR擴增分離1.2Kb ORF，擴增所使用的引物是以aveC核苷酸序列為基礎而設計的。向右的引物為SEQ ID NO6，向左的引物為SEQ IDNO7(參見上述第7.1.10部分所述)。PCR及亞克隆條件如第7.1.10部分所述。1.2Kb ORF的DNA序列分析顯示了在核苷酸位置337由C變為T的aveC基因突變，在位置55處的胺基酸由絲氨酸(S)變為苯基丙氨酸(F)。含有S55F突變的aveC基因亞克隆入pWHM3以產生一個質粒，其被命名為pSE187，並用於轉化除蟲鏈黴菌菌株SE180-11的原生質體。分離SE180-11株的硫鏈絲菌肽抗性轉化體，以確定紅黴素抗性的存在，通過HPLC分析發酵產品來分析ThiorErmr轉化體。編碼胺基酸殘基55(S55F)上發生改變的aveC基因的存在，能夠將正常的除蟲菌素產量恢復到SE180-11株(圖5C)；然而，環己基B2環己基B2的比例大約是26∶1，與用pSE186進行轉化的SE180-11株相比，其B2∶B1的比例大約是1.6∶1(表3)，顯示了單一的突變(S55F)調控了相對於環己基B1的環己基B2的產量。
鑑定出在aveC基因中的另一個突變，使核苷酸位置862由G變為A，位置230處的胺基酸由甘氨酸(G)變為天冬氨酸(D)。含有該突變(G230D)的除蟲鏈黴菌株產生的除蟲菌素B2∶B1的比例大約是30∶1。
8.3.減少B2∶B1比例的突變可以如下構建減少環己基-B2對環己基-B1比例的幾種突變。
鑑定出aveC基因的突變，使核苷酸位置588由G變為A，位置139處的胺基酸由丙氨酸(A)變為蘇氨酸(T)。含有A139T突變的aveC基因被亞克隆入pWHM3中以產生一個質粒，其命名為pSE188，其被用於轉化除蟲鏈黴菌SE180-11株的原生質體。分離SE180-11株的硫鏈絲菌肽抗性轉化體，測定紅黴素抗性株的存在，通過HPLC分析發酵產品來分析ThiorErmr轉化體。編碼胺基酸殘基139(A139T)變化的突變的aveC基因的存在能夠將除蟲菌素產量恢復至SE180-11株(表5D)；然而，B2∶B1的比例約是0.94∶1，這表明該突變減少了環己基B2相對於環己基B1的產量。該結果並不是預期的，因為公布的結果以及上述突變的結果僅僅證明了aveC基因的失活或者增加除蟲菌素B2形式相對於B1形式的產量(見表3)。
因為A139T突變以更加適宜的B1方向改變了B2∶B1的比例，因此構建編碼胺基酸位置138的蘇氨酸而非絲氨酸的突變。這樣，用EcoRI消化pSE186並克隆入已經被EcoRI消化的pGEM3Zf(Promega)中。該被命名為psE186a的質粒用ApaI及KpnI進行消化，在瓊脂糖凝膠中分離DNA片段，從凝膠中純化兩個片段～3.8Kb及～0.4Kb。來自pSE186的～1.2Kb插入的DNA片段被用作一個PCR模板以誘發在核苷酸位置585上發生單一鹼基的改變。將PCR引物設計成在核苷酸位置585能引進一個突變，該引物是由GenosysBiotechnologies公司(Texas)提供。向右的PCR引物為5′-GGGGGCGGGCCCGGGTGCGGAGGCGGAAATGCCCCTGGCGACG-3′(SEQ ID NO12)；向左的PCR引物為5′-GGAACCGACCGCCTGATACA-3′(SEQ ID NO13)。使用先進的GC基因組PCR試劑盒(Clonetech Laboratories，Palo Alto，CA)在由廠商提供的緩衝液中在存在200μM dNTPs，200pmol每種引物，50ng模板DNA，1.0M GC-Melt及1單位的KlenTaq多聚酶混合物下，最終體積為50μl，進行PCR反應。第一循環的熱學曲線為94℃1分鐘，接下來25個循環都是以94℃30秒鐘及68℃2分鐘進行，及一個循環68℃3分鐘。將295bp的PCR產品用ApaI及KpnI進行消化以釋放一個254bp的片段，其通過電泳進行分辨並從凝膠中純化。所有三種片段(～3.8Kb，-0.4Kb及254bp)用三種方式連接在一起。將連接混合物轉化入完整的E.coil DH5α細胞中。質粒DNA從氨苄青黴素抗性轉化株中分離，校正插入子的存在可以通過限制性酶切分析確認。該質粒被命名為pSE198。
pSE198用EcoRI進行消化，克隆進入已經用EcoRI消化的pWHM3中，並將其轉化進入E.coil DH5α細胞中。從氨苄青黴素抗性轉化株中分離質粒DNA，通過限制性酶切分析及DNA序列分析確認校正插入子的存在。該質粒DNA轉化進入E.coil DM1，從氨苄青黴素抗性轉化株中分離質粒DNA，通過限制性酶切分析確認校正插入子的存在。該質粒，被命名為pSE199，可以用於轉化除蟲鏈黴菌株SE180-11原生質體。分離菌株SE180-11的硫鏈絲菌肽抗性轉化株，確定紅黴素抗性的存在，通過用HPLC法分析發酵產品而分析ThiorErmr轉化株。編碼在胺基酸殘基138(S138T)位發生改變的突變aveC基因的存在能夠將正常的除蟲菌素產量恢復至株SE180-11；然而，B2∶B1的比例為0.88∶1，表明了該突變減少了環己基-B2相對於環己基-B1的數量(見表-3)。該B2∶B1的比例甚至低於0.94∶1(這是用pSE188轉化菌株SE180-11而產生的A139T突變所觀察到的比例，如上所述)。
構建另一個突變以同時在胺基酸位置138及139處引進一個蘇氨酸。來自於pSE186的約1.2Kb插入的DNA被用做PCR的模板。將PCR引物設計成能在核苷酸位置585及588處誘發突變，該引物由Genosys Biotechnologies公司(Texas)提供。向右的PCR引物為5』-GGGGGCGGGCCCGGGTGCGGAGGCGGAAATGCCGCTGGCGACGACC-3′(SEQ ID NO14)；向左的PCR引物為5′-GGAACATCACGGCATTCACC-3′(SEQ ID NO15)。使用本部分上述的條件進行PCR反應。用Apal及Kpnl消化449bp的PCR產物以釋放254bp的片段，其通過電泳進行分辨並從凝膠中純化。將pSE186a用ApaI及KpnI進行消化，在瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段，及將3.8Kb與0.4Kb的兩個片段從凝膠中提純。所有這三個片段(～3.8Kb，～0.4Kb及254bp)以三種方式進行連接，連接混合物被轉化進入活性的E.coliDH5α細胞中。從氨苄青黴素抗性轉化體中分離質粒DNA，通過限制性酶切分析確認校正插入子的存在。該質粒被命名為pSE230。
用EcoRI消化pSE230，克隆進已經被EeoRI消化的pWHM3質粒中，並且轉化進入E.coli DH5α細胞中。從氨苄青黴素抗性轉化體中分離質粒DNA，通過限制性酶切分析及DNA序列分析確認校正插入子的存在。該質粒DNA被轉化進入E.coli DM1細胞中，從氨苄青黴素抗性轉化體中分離質粒DNA，通過限制性酶切分析確認校正插入子的存在。該質粒，其被命名為pSE231，用於轉化除蟲鏈黴菌株SE180-11的原生質體。分離SE180-11的硫鏈絲菌肽抗性轉化體，確定紅黴素抗性株的存在，然後通過發酵分析ThiorErmr。編碼S138T/A139T的雙重突變的aveC基因的存在能夠使正常的除蟲菌素產量恢復到SE180-11株；然而，B2∶B1的比例為0.84∶1，顯示了與用pSE188或者pSE199轉化SE180-11株所提供的減少量相比，該突變進一步減少了環己基-B2相對於環己基B1的產量(見表3)。
表3
這些結果第一次證明了發生在aveC基因上特定的突變提高了商業上所需要的1類除蟲菌素相對於2類除蟲菌素的產量。
9.實施例5′端缺失突變子的構建如上面第5.1部分所解釋的那樣，如圖1(SEQ ID NO1)所顯示的除蟲鏈黴菌核苷酸序列在為潛在的起始位點的四個bp位置42，174，177及180處有四個不同的GTG密碼子。本部分將要描述aveC ORF(圖1；SEQ IDNO1)5′區多重缺失的構建，以幫助確定這些密碼子中哪個在aveC ORF中用作蛋白表達的起始位點。
在5』端有各種缺失的aveC基因片段可以通過PCR擴增從除蟲鏈黴菌染色體DNA中分離。PCR引物以aveC DNA序列為基礎進行設計，其由GenosysBiotechnologies公司提供。向右的引物為5′-AACCCATCCGAGCCGCTC-3′(SEQ ID NO16)(D1F1)；5′-TCGGCCTGCCAACGAAC-3』(SEQ ID NO17)(D1F2)；5′-CCAACGAACGTGTAGTAG-3′(SEQ ID NO18) (D1F3)；及5′-TGCAGGCGTACGTGTTCAGC-3′(SEQ ID NO19)(D2F2)。向左的引物為5′-CATGATCGCTGAACCGA-3′(SEQ ID NO20)；5′-CATGATCGCTGAACCGAGGA-3′(SEQ ID NO21)；及5′-AGGAGTGTGGTGCGTCTGGA-3′(SEQ ID NO22)。PCR反應如上述第8.3部分進行。
通過在1％瓊脂糖凝膠中進行電泳來分離PCR產品，檢測到的單一DNA帶為1.0Kb或者1.1Kb。從凝膠中純化PCR產品，並依照操作手冊用25ng線性化的pCR2.1載體(Invitrogen)以1∶10摩爾載體-插入片段的比例進行連接。依照操作手冊將連接混合物用於轉化One ShotTM感受態的E.coli細胞(Invitrogen)。從氨苄青黴素抗性轉化體中分離出質粒DNA，該插入片段的存在通過限制性酶切分析及DNA序列分析確認。這些質粒被命名為pSE190(用引物D1F1獲得)、pSE191(用引物D1F2獲得)、pSE192(用引物D1F3獲得)及pSE193(用引物D2F2獲得)。
將插入的DNA分別用BamHI/XbaI進行消化，通過電泳進行分離，從凝膠中純化，並用在一個總DNA濃度為1μg以1∶5摩爾載體-插入片段比例時分別與已經用BamHI/XbaI消化的穿梭載體pWHM3連接。連接混合物被用於轉化活性的E.coli DH5α細胞。從氨苄青黴素抗性轉化體中分離出質粒DNA，插入片段的存在可以通過限制性酶切分析進行確認。這些質粒被命名為pSE194(D1F1)、pSE195(D1F2)、pSE196(D1F3)及pSE197(D2F2)，被分別轉化進入E.Coli株DM1中，從氨苄青黴素抗性轉化體中分離質粒DNA，通過限制性酶切分析確認校正插入片段的存在。該DNA被用於轉化除蟲鏈黴菌株SE180-11的原生質體。分離菌株SE180-11的硫鏈絲菌肽抗性轉化體，確定紅黴素抗性轉化體的存在，通過HPLC分析發酵產品來分析Thior Errnr轉化體以確定哪一個GTG位點為aveC表達所必需。結果指出在位置42處的GTG密碼子可以被消除，並不影響aveC的表達，因為pSE194、pSE195及pSE196每一個都缺乏位置42處的GTG位點，但在位置174、177及180處有三個GTG位點，當轉化進SE180-11時，每一個都能恢復正常的除蟲菌素產量。只有當SE180-11株用缺少所有這四種GTG位點的pSE197進行轉化時，其才不能恢復正常的除蟲菌素產量(表4)。
表4
10.實施例克隆吸水鏈黴菌及產灰色鏈黴菌的aveC同系物本發明鑑定和克隆了鏈黴菌的其它產生除蟲菌素或比蜜黴素菌種的aveC同系物基因。例如，吸水鏈黴菌(FERM BP-1901)基因組DNA的粘粒文庫與上述除蟲鏈黴菌的1.2Kb aveC探針雜交。鑑定出幾種有很強的雜交的粘粒菌落。將染色體DNA從這些粘粒中分離，並鑑定出4.9Kb KpnI片段與aveC探針雜交。測定該DNA的序列，鑑定出與除蟲鏈黴菌的aveC ORF有很明顯的同源性的ORF(SEQ ID NO3)。從吸水鏈黴菌aveC同系物ORF推導出來的胺基酸序列(SEQ ID NO4)如圖6所示。
此外，將產灰色鏈黴菌基因組DNA的粘粒文庫與來自上述的除蟲鏈黴菌的1.2Kb aveC探針進行雜交。鑑定出幾種強烈雜交的粘粒克隆。從這些粘粒中分離染色體DNA，鑑定出一個與aveC探針雜交的5.4Kb的PstI片段。對該DNA進行測序，並鑑定出與除蟲鏈黴菌的aveC ORF有很明顯的同源性的aveC同系物的部分ORF。推導出來的部分胺基酸序列(SEQ ID NO5)如圖6所示。
來自吸水鏈黴菌和產灰色鏈黴菌的aveC同系物的DNA與胺基酸序列分析顯示這些區域彼此之間共有明顯的同源性(在胺基酸水平上約有50％的序列同一性)或者與除蟲鏈黴菌aveC ORF及AveC基因產物也有明顯的同源性(圖6)。
11.實施例在ermE啟動子後用aveC基因構建質粒pSE186的1.2Kb aveC ORF被亞克隆在pSE34中，其為一個穿梭載體pWHM3，具有300bp ermE啟動子，該啟動子作為一個KpnI/BamHI片段被插入在pWHM3的KpnI/BamHI位點(參見Ward等人，1986，Mol.Gen.Genet 203468478)。用BamHI及HindIII消化pSE186，通過電泳分辨消化物，將1.2Kb片段從瓊脂糖凝膠中分離並與已經用BamHI及HindIII消化的pSE34進行連接。依照操作說明，該連接混合物被轉化進入感受態的E.coil DH5α細胞中。從氨苄青黴素抗性轉化體中分離出質粒DNA，通過限制性酶切分析確認1.2Kb插入片段的存在。該質粒(被命名為pSE189)被轉化進入E.coli DM1中，並從氨苄青黴素抗性轉化體中分離出質粒DNA。用pSE189轉化除蟲鏈黴菌菌株1100-SC38的原生質體。分離菌株1100-SC38的硫鏈絲菌肽抗性轉化體，並通過HPLC分析發酵產品來進行分析。
含有pSE189的除蟲鏈黴菌株1100-SC38轉化體所產生的除蟲菌素的環己基-B2與環己基-B1的比例(大約是3∶1)相對於菌株1100-SC38所產生的上述物質的比例(大約是34∶1)已經改變，但與用pSE119進行轉化的菌株1100-SC38相比，總的除蟲菌素產量增加了約2.4倍(表5)。
pSE189也可以轉化進入野生型除蟲鏈黴菌菌株的原生質體中。分離硫鏈絲菌肽抗性轉化株，並通過HPLC分析發酵產物來進行分析。用pSE189轉化的除蟲鏈黴菌野生型的除蟲菌素總產量與用pSE119轉化的野生型除蟲鏈黴菌株相比增加了2.2倍(表5)。
表5
12.實施例含有除蟲鏈黴菌aveC ORF及吸水鏈黴菌aveC同系物序列的嵌合質粒如下所述，構建命名為pSE350的雜合質粒，其含有564bp部分的吸水鏈黴菌aveC同系物，取代除蟲鏈黴菌aveC ORF的564bp的同系物部分(見圖7)。使用BsaAI限制性位點和KpnI限制性位點構建pSE350，BsaAI限制性位點存在於兩個序列中(aveC 225位)，KpnI限制性位點存在於除蟲鏈黴菌aveC基因中(aveC 810位)。用上述第7.1.10部分所述的PCR條件，通過PCR將kpnI位點引入吸水鏈黴菌DNA中，其所用的向右引物為5』-CTTCAGGTGTACGTGTTCG-3』(SEQ ID NO23)，向左引物為5』-GAACTGGTACCAGTGCCC-3』(SEQ ID NO24)(由Genosys Biotechnologies公司提供)。將PCR產物用BsaAI及KpnI進行消化，通過在1％瓊脂糖凝膠中進行電泳來分離這些片段，從凝膠中分離564bp的BsaAI/KpnI片段。將pSE179(如上述第7.1.10部分所述)用KpnI及HindIII消化，通過在1％瓊脂糖凝膠中進行電泳以分離這些片段，並將約4.5Kb的片段從凝膠中分離。用HindIII及BsaAl消化pSE179，通過在1％瓊脂糖凝膠中進行電泳來分離這些片段，並從凝膠中分離一個約0.2Kb的BsaAI/HindIII片段。該4.5Kb的HindIII/kpnI片段、0.2Kb BsaAl/HindIII片段及來自於吸水鏈黴菌的564 bp的BsaAI/KpnI片段以三種方式連接在一起，該連接混合物轉化進感受態的E.coli DH5α細胞中。從氨苄青黴素抗性轉化體中分離出質粒DNA，通過使用KpnI及AvaI限制性酶切分析確認該校正插入片段的存在。該質粒用HindIII及XbaI進行消化以釋放1.2Kb插入片段，然後與pWHM3(其已經用HindIII及XbaI消化)進行連接。將該連接混合物轉化進感受態的E.coli DH5α細胞中。從氨苄青黴素抗性轉化體中分離出質粒DNA，並用HindIII及AvaI限制性酶切分析確認校正插入片段的存在。該質粒DNA轉化進入E.coli DM1中，從氨苄青黴素抗性轉化體中分離出質粒DNA，通過限制性酶切分析及DNA序列分析確認校正插入片段的存在。該質粒被命名為pSE350，並用於轉化除蟲鏈黴菌株SE180-11的原生質體。將菌株SE180-11的硫鏈絲菌肽抗性轉化體分離，確定有紅黴素抗性存在，並通過HPLC分析發酵產物對Thior Ermr轉化體進行分析。結果顯示出含有除蟲鏈黴菌/吸水鏈黴菌雜合質粒的轉化體的平均B2∶B1比例約為109∶1(參見表6)。
表6
生物材料的保藏1998年1月29日，下列生物材料保藏在美國典型培養物保藏中心(ATCC)，12301 Parklawn Drive，Rockville，MD，20852，USA，給出下列保藏號質粒保藏號質粒pSE180 209605質粒pSE186 209604以上所引用的全部的專利，專利申請，及公開文獻在此全面引作參考。
本發明並不局限於本文所描述的具體實施方案的範圍，這些僅為本發明各個方面的個別舉例，功能上相當的方法及組合物都屬於本發明的範圍。實際上，除了上述說明及示例外，從上述說明和附圖，本發明的各種變化對於本領域技術人員來說都是很明顯的。這些變化都將落入所附權利要求書的保護範圍之內。
序列表110輝瑞產品公司(非美國申請)120介導除蟲菌素B2∶B1比例的除蟲鏈黴菌基因130PC9916A140
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15060/074,6361511998-02-1316024170PatentIn Ver.2.0-beta21012111229212DNA213除蟲鏈黴菌220
221CDS222(174)..(1085)4001tcacgaaacc ggacacacca cacacacgaa ggtgagacag cgtgaaccca tccgagccgc 60tcggcctgcc caacgaacgt gtagtagaca cccgaccgtc cgatgccacg ctctcacccg 120aggccggcct gaacaggtca ggagcgctgc cccgtgaact gctgtcgttg ccg gtg 176Val1gtg gtg tgg gcc ggg gtc ggc ctg ctg ttt ctg gcc ctg cag gcg tac224Val Val Trp Ala Gly Val Gly Leu Leu Phe Leu Ala Leu Gln Ala Tyr5 10 15gtg ttc agc cgc tgg gcg gcc gac ggt ggc tac cgg ctg atc gag acg272Val Phe Ser Arg Trp Ala Ala Asp Gly Gly Tyr Arg Leu Ile Glu Thr20 25 30gcg ggc cag ggt cag ggc ggc agc aag gat acg ggg act acc gat gtg320Ala Gly Gln Gly Gln Gly Gly Ser Lys Asp Thr Gly Thr Thr Asp Val35 40 45gtc tat ccc gtg att tcc gtc gtc tgc atc acc gcc gcg gcg gcg tgg368
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權利要求
1.分離的多核苷酸分子，其包含除蟲鏈黴菌完整的aveC ORF或其實質性部分，該分離的多核苷酸分子缺少位於除蟲鏈黴菌染色體中aveC ORF原位下遊的下一個完整的ORF。
2.如權利要求1所述的分離的多核苷酸分子，其包括與質粒pSE186(ATCC 209604)的除蟲鏈黴菌AveC基因產物編碼序列相同的核苷酸序列，或者與圖1(SEQ ID NO1)所示的aveC ORF核苷酸序列或其實質性部分相同的核苷酸序列。
3.如權利要求2所述的分離的多核苷酸分子，其進一步包括天然側翼於除蟲鏈黴菌中的原位AveC基因的核苷酸序列。
4.分離的多核苷酸分子，其包括與質粒pSE186(ATCC 209604)的除蟲鏈黴菌AveC基因產物編碼序列，或者與圖1(SEQ ID NO1)所示的aveCORF的核苷酸序列或其實質性部分具有同源性的核苷酸序列。
5.分離的多核苷酸分子，其包括編碼多肽的核苷酸序列，所述多肽具有的胺基酸序列與質粒pSE186(ATCC 209604)的AveC基因產物編碼序列所編碼的胺基酸序列，或者與圖1(SEQ ID NO2)所示的胺基酸序列或其實質性部分具有同源性。
6.分離的多核苷酸分子，其包括SEQ ID NO3的核苷酸序列或其實質性部分，或者與SEQ ID NO3的核苷酸序列具有同源性的核苷酸序列。
7.分離的多核苷酸分子，其包括編碼多肽的核苷酸序列，該多肽與SEQ ID NO4的胺基酸序列具有同源性。
8.寡核苷酸分子，其在高度嚴緊的條件下，與具有圖1(SEQ ID NO1)或者SEQ ID NO3的核苷酸序列的多核苷酸分子進行雜交，或者與具有與圖1(SEQ ID NO1)或者SEQ ID NO3的核苷酸序列互補的核苷酸序列的多核苷酸分子進行雜交。
9.如權利要求8所述的寡核苷酸分子，其與圖1(SEQ ID NO1)或者SEQ ID NO3的核苷酸序列互補，或者與具有與表1(SEQ ID NO1)或者SEQ ID NO3的核苷酸序列互補的核苷酸序列的多核苷酸分子互補。
10.重組載體，其包括多核苷酸分子，該多核苷酸分子含有選自下列的核苷酸序列(a)核苷酸序列，其與質粒pSE186(ATCC 209604)的除蟲鏈黴菌AveC基因產物編碼序列相同，或者與圖1(SEQ ID NO1)的aveC ORF的核苷酸序列或其實質性部分相同；(b)核苷酸序列，其與質粒pSE186(ATCC 209604)的除蟲鏈黴菌AveC基因產物編碼序列，或者與圖1(SEQ ID NO1)的aveC ORF的核苷酸序列或其實質性部分具有同源性；(c)核苷酸序列，其編碼的多肽具有的胺基酸序列與質粒pSE186(ATCC 209604)的AveC基因產物編碼序列所編碼的胺基酸序列，或者與圖1(SEQ ID NO2)的胺基酸序列或其實質性部分具有同源性。
11.如權利要求10所述的重組載體，其進一步包括編碼一個或多個調控元件的核苷酸序列，該編碼調控元件的核苷酸序列與如權利要求10所述的核苷酸序列可操作相連。
12.如權利要求11所述的重組載體，其進一步包括編碼選擇性標記的核苷酸序列。
13.如權利要求12所述的重組載體，其為質粒PSE186(ATCC209604)。
14.包括如權利要求12所述的重組載體的宿主細胞。
15.如權利要求14所述的宿主細胞，其為除蟲鏈黴菌。
16.重組載體，其包括含有核苷酸序列的多核苷酸分子，所述核苷酸序列選自下列序列SEQ ID NO3的核苷酸序列或其實質性部分，與SEQID NO3所示的核苷酸序列具有同源性的核苷酸序列，編碼與SEQ IDNO4所示的胺基酸序列具有同源性的多肽的核苷酸序列。
17.如權利要求16所述的重組載體，進一步包括編碼一個或多個調控元件的核苷酸序列，該編碼調控元件的核苷酸序列與如權利要求16所述的核苷酸序列可操作相連。
18.如權利要求17所述的重組載體，進一步包括編碼選擇性標記的核苷酸序列。
19.包括如權利要求18所述的重組載體的宿主細胞。
20.如權利要求19所述的宿主細胞，其為吸水鏈黴菌。
21.重組表達的除蟲鏈黴菌AveC基因產物或其同源性多肽，所述基因產物具有由質粒pSE186(ATCC 209604)的除蟲鏈黴菌AveC基因產物編碼核苷酸序列所編碼的胺基酸序列，或者具有SEQ ID NO2所示的胺基酸序列或其實質性部分。
22.重組表達的吸水鏈黴菌AveC同系物基因產物或其同源多肽，所述基因產物具有SEQ ID NO4所示胺基酸序列。
23.用於生產重組AveC基因產物的方法，其包括在利於重組AveC基因產物生產的條件下培養用重組表達載體轉化的宿主細胞，並從細胞培養物中回收AveC基因產物，所述重組表達載體包括具有核苷酸序列的多核苷酸分子，所述核苷酸序列編碼由質粒pSE186(ATCC 209604)的除蟲鏈黴菌AveC基因產物編碼核苷酸序列所編碼的胺基酸序列，或者編碼SEQ IDNO2所示的胺基酸序列或其實質性部分，所述多核苷酸分子與一個或多個控制多核苷酸分子在宿主細胞中的表達的調控元件可操作相連。
24.用於生產重組AveC同系物基因產物的方法，其包括在利於重組AveC同系物基因產物生產的條件下培養用重組表達載體轉化的宿主細胞，並從培養物中回收AveC同系物基因產物，所述重組表達載體包括具有核苷酸序列的多核苷酸分子，所述核苷酸序列編碼SEQ ID NO4所示的胺基酸序列或其實質性部分，所述多核苷酸分子與一個或多個控制多核苷酸分子在宿主細胞中的表達的調控元件可操作相連。
25.多核苷酸分子，其具有的核苷酸序列或者與質粒pSE186(ATCC209604)的除蟲鏈黴菌AveC基因產物編碼序列相同，或者與如圖1(SEQ IDNO1)所示的除蟲鏈黴菌的aveC ORF的核苷酸序列相同；但是該核苷酸序列進一步包括一個或多個突變，從而使得其中野生型aveC等位基因已經失活並且表達含有突變的核苷酸序列的多核苷酸分子的除蟲鏈黴菌菌株ATCC53692的細胞產生的除蟲菌素的比例和量與僅表達野生型aveC等位基因的除蟲鏈黴菌菌株ATCC 53692的細胞所產生的比例和量有所不同。
26.如權利要求25所述的多核苷酸分子，其調製除蟲菌素的生產，使得其中野生型aveC等位基因已經失活並且表達權利要求25所述的多核苷酸分子的除蟲鏈黴菌菌株ATCC 53692的細胞與僅表達野生型aveC等位基因的除蟲鏈黴菌菌株ATCC 53692的細胞相比以降低的2類∶1類比例產生除蟲菌素。
27.如權利要求26所述的多核苷酸分子，其中2類∶1類除蟲菌素為環己基B2∶環己基B1除蟲菌素。
28.如權利要求27所述的多核苷酸分子，其中降低的環己基B2∶環己基B1比例小於1.6∶1。
29.如權利要求28所述的多核苷酸分子，其中降低的環己基B2∶環己基B1比例約為0.94∶1。
30.如權利要求29所述的多核苷酸分子，其中圖1(SEQ ID NO1)所示的除蟲鏈黴菌AveC ORF的突變編碼AveC基因產物的殘基139處由丙氨酸變為蘇氨酸的胺基酸取代。
31.如權利要求28所述的多核苷酸分子，其中降低的環己基B2∶環己基B1的比例大約為0.88∶1。
32.如權利要求31所述的多核苷酸分子，其中圖1(SEQ ID NO1)所示的除蟲鏈黴菌AveC ORF的突變編碼AveC基因產物的殘基138處由絲氨酸變為蘇氨酸的胺基酸取代。
33.如權利要求28所述的多核苷酸分子，其中降低的環己基B2∶環己基B1比例大約為0.84∶1。
34.如權利要求33所述的多核苷酸分子，其中圖1(SEQ ID NO1)所示的除蟲鏈黴菌AveC ORF的突變編碼AveC基因產物的殘基138處由絲氨酸變為蘇氨酸的第一胺基酸取代，和AveC基因產物的殘基139處由丙氨酸變為蘇氨酸的第二胺基酸取代。
35.如權利要求25所述的多核苷酸分子，其中圖1(SEQ ID NO1)所示的除蟲鏈黴菌AveC ORF的突變編碼AveC基因產物的殘基55處由絲氨酸變為苯丙氨酸的胺基酸取代。
36.如權利要求25所述的多核苷酸分子，其中圖1(SEQ ID NO1)所示的除蟲鏈黴菌AveC ORF的突變編碼AveC基因產物的殘基230處由甘氨酸變為天冬氨酸的胺基酸取代。
37.含有強啟動子的多核苷酸分子，所述啟動子與圖1(SEQ ID NO1)所示的除蟲鏈黴菌AveC ORF可操作相連。
38.如權利要求37所述的多核苷酸分子，其中所述強啟動子是來自紅色多孢菌的ermE啟動子。
39.多核苷酸分子，其包含的編碼AveC基因產物的核苷酸序列已通過將異源核苷酸序列插入所述核苷酸序列中而失活。
40.如權利要求25所述的多核苷酸分子，其包括aveC等位基因，該等位基因通過從圖1(SEQ ID NO1)的AveC ORF中缺失640bp的PstI/SphI片斷而失活。
41.如權利要求25所述的多核苷酸分子，其包括aveC等位基因，該等位基因通過向該等位基因中導入移碼突變而失活。
42.如權利要求41所述的多核苷酸分子，其中通過在圖1(SEQ IDNO1)的aveC ORF的471位核苷酸處的C核苷酸後增加兩個G核苷酸而導入移碼突變。
43.如權利要求25所述的多核苷酸分子，其包括aveC等位基因，其中通過在編碼除蟲鏈黴菌AveC基因產物的第116位胺基酸的核苷酸位置處導入終止密碼子而使該等位基因失活。
44.如權利要求25所述的多核苷酸分子，其包括aveC等位基因，其中通過在AveC基因產物的胺基酸位置258處導入由甘氨酸變為天冬氨酸的第一突變，並在AveC基因產物的胺基酸位置275處導入由酪氨酸變為組氨酸的第二突變而使aveC等位基因失活。
45.基因取代載體，其包括的多核苷酸分子含有天然側翼於除蟲鏈黴菌染色體中的原位AveC基因的核苷酸序列。
46.重組載體，其包括如權利要求25-44任一所述的多核苷酸分子。
47.重組載體，其含有如權利要求39所述的多核苷酸分子，所述載體為pSE180(ATCC 209605)。
48.含有如權利要求46所述的重組載體的鏈黴菌宿主細胞。
49.鑑別aveC ORF中能夠改變所產生的除蟲菌素2類∶1類比例的突變的方法，所述方法包括(a)測定除蟲鏈黴菌菌株細胞產生的除蟲菌素2類∶1類的比例，所述細胞中的野生型aveC等位基因已失活，包含有編碼突變的AveC基因產物的核苷酸序列的多核苷酸分子被導入該細胞並在其中被表達；(b)測定與步驟(a)的除蟲鏈黴菌相同的菌株細胞產生的除蟲菌素2類∶1類的比例，但不同的是該細胞僅表達具有如圖1(SEQ 1D NO1)所示的ORF的核苷酸序列或者與其同源的核苷酸序列的aveC等位基因；及(c)比較步驟(a)的除蟲鏈黴菌菌株細胞產生的除蟲菌素2類∶1類的比例與步驟(b)的除蟲鏈黴菌菌株細胞產生的除蟲菌素2類∶1類的比例，如果二者不同的話，則可以證實有能夠改變除蟲菌素2類∶1類比例的aveC ORF突變存在。
50.如權利要求49所述的方法，其中除蟲菌素2類∶1類的比例因突變而減少。
51.鑑定aveC ORF或者包含有aveC ORF的構建體中能夠改變所產生的除蟲菌素量的突變的方法，所述方法包括(a)測定除蟲鏈黴菌菌株細胞產生的除蟲菌素的量，所述細胞中的野生型aveC等位基因已失活，包含有編碼突變的AveC基因產物的核苷酸序列或含有編碼AveC基因產物的核苷酸序列的基因構建體的多核苷酸分子被導入該細胞並在其中表達；(b)測定與步驟(a)的除蟲鏈黴菌相同的菌株細胞產生的除蟲菌素的量，但不同的是該細胞僅表達具有如圖1(SEQ ID NO1)所示的ORF的核苷酸序列或者與其同源的核苷酸序列的aveC等位基因；及(c)比較步驟(a)的除蟲鏈黴菌菌株細胞產生的除蟲菌素的量與步驟(b)的除蟲鏈黴菌菌株細胞產生的除蟲菌素的量，如果二者不同的話，則可以證實有能夠改變除蟲菌素量的aveC ORF或基因構建體突變存在。
52.如權利要求51所述的方法，其中所產生的除蟲菌素的量因突變而增加。
53.製備除蟲鏈黴菌新菌株的方法，所述菌株包含有能夠表達突變的aveC等位基因的細胞，其與僅表達野生型aveC等位基因的除蟲鏈黴菌相同菌株細胞相比，所產生的除蟲菌素的2類∶1類比例發生改變，所述方法包括用攜有突變的aveC等位基因的載體轉化除蟲鏈黴菌菌株細胞，該突變的aveC等位基因編碼的基因產物使得表達突變的aveC等位基因的除蟲鏈黴菌菌株細胞與僅表達野生型aveC等位基因的除蟲鏈黴菌相同菌株細胞相比，所產生的除蟲菌素的2類∶1類比例發生改變，選擇轉化細胞，該轉化細胞產生的除蟲菌素2類∶1類比例較僅表達野生型aveC等位基因的菌株細胞有所改變。
54.如權利要求53所述的方法，其中除蟲菌素2類∶1類的比例因突變而減少。
55.製備除蟲鏈黴菌新菌株的方法，所述菌株包括能產生改變量的除蟲菌素的細胞，所述方法包括用含有突變aveC等位基因或者含有該aveC等位基因的基因構建體轉化除蟲鏈黴菌菌株細胞，其表達的結果使表達突變aveC等位基因或基因構建體的除蟲鏈黴菌菌株細胞所生產的除蟲菌素量較僅表達野生型aveC等位基因的除蟲鏈黴菌相同菌株細胞產生的除蟲菌素的量有所改變，挑選已轉化的細胞，該轉化細胞產生的除蟲菌素量較僅表達野生型aveC等位基因的菌株細胞產生的除蟲菌素量有所改變。
56.如權利要求55所述的方法，其中所產生的除蟲菌素的量因突變而增加。
57.製備除蟲鏈黴菌新菌株的方法，所述菌株細胞含有失活的aveC等位基因，所述方法包括用使該aveC等位基因失活的載體轉化除蟲鏈黴菌菌株細胞，並且選擇其中aveC等位基因已經失活的轉化細胞。
58.如權利要求57所述的方法，其中載體是pSE 180(ATCC209605)。
59.除蟲鏈黴菌菌株，其含有表達突變的aveC等位基因的細胞，結果產生2類∶1類比例有所改變的除蟲鏈黴菌細胞，所述的2類∶1類比例的改變是相對於僅表達野生型aveC等位基因的相同菌株細胞而言的。
60.如權利要求59所述的菌株，其中除蟲菌素2類∶1類的比例因突變而減少。
61.如權利要求60所述的細胞株，其中細胞所產生的環己基B2∶環己基B1除蟲菌素的比例小於1.6∶1。
62.如權利要求61所述的菌株，其中細胞所產生的環己基B2∶環己基B1除蟲菌素的比例大約是0.94∶1。
63.如權利要求61所述的菌株，其中細胞所產生的環己基B2∶環己基B1除蟲菌素的比例大約是0.88∶1。
64.如權利要求61所述的菌株，其中細胞所產生的環己基B2∶環己基B1除蟲菌素的比例大約是0.84∶1。
65.除蟲鏈黴菌菌株，其含有表達突變的aveC等位基因或者基因構建體的細胞，結果產生量有所增加的除蟲菌素，所述的量增加是相對於僅表達野生型aveC等位基因的相同菌株細胞而言的。
66.除蟲鏈黴菌菌株，其含有aveC基因已經失活的細胞。
67.生產除蟲菌素的方法，所述方法包括在允許或者誘導除蟲菌素生產的條件下，在培養基中培養除蟲鏈黴菌菌株細胞，並從培養物中回收除蟲菌素，所述細胞表達突變的aveC等位基因，與不表達突變aveC等位基因而僅表達野生型的aveC等位基因的相同菌株細胞相比，該突變等位基因編碼的基因產物改變了表達突變的aveC等位基因的除蟲鏈黴菌菌株細胞產生的除蟲菌素的2類∶1類的比例。
68.如權利要求67所述的方法，其中除蟲菌素的2類∶1類的比例因突變而減少。
69.生產除蟲菌素的方法，所述方法包括在允許或者誘導除蟲菌素生產的條件下，在培養基中培養除蟲鏈黴菌菌株細胞，並從培養物中回收除蟲菌素，所述細胞表達突變的aveC等位基因或含有aveC等位基因的基因構建體，與不表達突變aveC等位基因或基因構建體而僅表達野生型的aveC等位基因的相同菌株細胞相比，表達突變的aveC等位基因或基因構建體的除蟲鏈黴菌菌株細胞產生的除蟲菌素的量有所改變。
70.如權利要求69所述的方法，其中所產生的除蟲菌素的量通過表達突變的aveC等位基因或基因構建體而增加。
71.由除蟲鏈黴菌菌株細胞所產生的除蟲菌素組合物，所述細胞表達編碼基因產物的突變的aveC等位基因，所述基因產物減少了表達突變的aveC等位基因的除蟲鏈黴菌菌株細胞所產生的除蟲菌素2類∶1類比例，所述除蟲菌素2類∶1類比例的減少是相對於不表達突變的aveC等位基因而僅表達野生型aveC等位基因的相同菌株細胞而言的，其中相對於不表達突變的aveC等位基因而僅表達野生型aveC等位基因的除蟲鏈黴菌相同菌株細胞所產生的除蟲菌素2類∶1類比例而言，以減少的2類∶1類比例生產除蟲菌素。
全文摘要
本發明涉及包含有編碼aveC基因產物的核苷酸序列的多核苷酸分子，該多核苷酸分子可被用於改變除蟲鏈黴菌發酵培養物中所產生的除蟲菌素2類∶1類的比例或量。本發明進一步涉及載體、宿主細胞和除蟲鏈黴菌的突變菌株，其中aveC基因已經被失活或突變以改變所產生的除蟲菌素2類∶1類的比例或量。
文檔編號C12P19/62GK1521180SQ20041000541
公開日2004年8月18日 申請日期1999年1月25日 優先權日1998年2月13日
發明者金·J·施圖茨曼-恩格沃爾, 加藤芳弘, 哈米什·A·I·麥克阿瑟, A I 麥克阿瑟, 弘, 金 J 施圖茨曼-恩格沃爾 申請人:輝瑞產品公司