血清微小核糖核酸試劑盒及其在B肝早期診斷中的應用的製作方法

2023-05-14 05:45:41 1

專利名稱：：血清微小核糖核酸試劑盒及其在B肝早期診斷中的應用的製作方法
技術領域：
：本發明屬於生物技術製藥
技術領域：
，具體涉及血清/血漿微小核糖核酸在B型肝炎的診斷、預測、療效評價、藥物活性成分的篩選、藥效評價等方面的應用。二
背景技術：
：B肝病毒(H印atitisBvirus:HBV)是全世界最常見的致病微生物之一。據統計，目前全世界約有4億B型肝炎病毒(HBV)攜帶者。慢性B型肝炎可能導致嚴重的併發症(如肝硬化和肝癌)，統計數據表明，全世界約80%的原發性肝癌與B型肝炎病毒感染有關。流行病學調查顯示，我國約有1.3億人長期攜帶B肝病毒。專家推算，我國現有慢性B肝病人約2000多萬，每年約有28萬人死於與B肝病毒感染相關的肝硬化或肝癌。目前對B型肝炎進行臨床診斷的傳統生物化學及分子生物學技術方法主要包括反向被動血凝、酶聯免疫吸附試驗、基因診斷等，這些方法還比較繁瑣和粗糙，在靈敏度、特異性、效率性、普及性、樣品準備和保存方面都會存在各種缺陷或不足。由於B肝病毒感染尚無理想的早期診斷方法，因此開發有效的B肝檢測方法是當務之急，這樣才能實現B肝患者的早診斷、早治療。微小核糖核酸，英文名為microRNA，是一類長約19至23個核苷酸的非編碼單鏈小核糖核酸分子。它們在進化上高度保守，並與動物的許多正常生理活動，如生物個體發育、組織分化、細胞調亡以及能量代謝等密切相關，同時也與許多疾病的發生及發展存在著緊密的聯繫。最近的研究發現慢性淋巴細胞性白血病以及Burkitt淋巴瘤中的幾種微小核糖核酸的表達水平均有不同程度的下調；分析比較人肺癌、乳腺癌組織中的微小核糖核酸表達時，發現有若干組織特異性微小核糖核酸的表達水平相對於正常組織發生了變化。也有研究證明微小核糖核酸影響了心肌肥厚、心衰、動脈粥樣硬化等心血管疾病的發生和發展，並且與II型糖尿病等代謝性疾病有密切關聯。這些實驗結果提示微小核糖核酸表達及特異性變化與疾病發生和發展之間存在著必然聯繫。由於微小核糖核酸在基因轉錄後的表達調控中起著超乎想像的重要作用，因此它與疾病存在以下的關聯性首先，微小核糖核酸的變化可能是病因，這是因為疾病的抑制因子以及促進因子都可能是微小核糖核酸的靶位點，當微小核糖核酸本身先發生了紊亂表達，比如本來抑制疾病促進因子的微小核糖核酸表達量降低了，或者抑制疾病抑制因子的微小核糖核酸表達量升高了，其最終結果都會導致下遊一系列基因表達的變化以及某些通路的整體紊亂，進而誘發疾病發生；其次，微小核糖核酸的變化也可能是疾病的結果，這是因為當疾病(如癌症)發生時，會導致染色體片段的丟失、基因的突變或者染色體片段的劇烈擴增，若微小核糖核酸正好位於這一變化區段內，那麼其表達量將發生極其顯著的變化。因此，理論上微小核糖核酸分子完全可以作為一類新的疾病標誌物，它的特異性變化必然與疾病產生發展相關聯。同時微小核糖核酸還可以作為潛在的藥物作用靶點，通過抑制疾病過程中上調的微小核糖核酸和過表達下調的微小核糖核酸，將有可能極大地緩解疾病的發生和發展。本發明人巳經開展了以微小核糖核酸作為疾病標誌物的相關領域的研究，例如我們發現大部分的血清微小核糖核酸來自於血清中的細胞微粒子(micr叩articles)。血清中的細胞膜微粒子來自人體不同的細胞(不僅是血細胞)且包含和特定細胞/組織相關的微小核糖核酸，檢測血清中細胞膜微粒子內微小核糖核酸的變化就可以得到整個機體的病變情況；更重要的是細胞微粒子帶有源頭細胞表面特有的受體蛋白或膜脂結構，與對應的靶細胞有高親和性，因而可以選擇性地遞送微小核糖核酸到靶細胞/組織，從而大大提高微小核糖核酸調控細胞功能的作用。顯然，由於細胞微粒子(或類似微粒子的膜脂囊泡結構)本身具有和特定組織及細胞結合的特異性，其所載微小核糖核酸也呈現較強的靶向性、穩定性及高效率，它在疾病的診斷及治療方面有重大應用前景。另外我們還選取B型肝炎作為研究對象，經研究發現，在正常人、B型肝炎攜帶者、B型肝炎病人之間，一些微小核糖核酸分子都存在著特異性變化，並據此通過測定微小核糖核酸的特異性變化已經建立起一種更敏感、更精確的早期確診、治療B型肝炎的方法。三
發明內容目前，對B型肝炎的診斷僅僅局限於血清/血漿中的各種生化指標，還沒有關於血清/血槳微小核糖核酸用於B型肝炎診斷與治療方面的任何報導。基於微小核糖核酸的這一發現，本發明人將研究目光鎖定在血清/血漿微小核糖核酸在B型肝炎診斷與治療方面的重大應用前景。本發明人通過分離和研究正常人、B肝攜帶者和B肝患者血清中的微小核糖核酸，尋找一類可用於B型肝炎治療的靶向高效率的微小核糖核酸。我們採用了兩種試驗手段一是分別取40ral若千正常人、B肝攜帶者、B肝病人的血清，提取總RNA進行Solexa測序。二是分別將各個正常人、B肝攜帶者和B肝患者的血清除蛋白，上清進行定量PCR檢測。由於微小核糖核酸分子是一類新型疾病標誌物，因此希望通過對血清/血槳微小核糖核酸是否存在，個體之間的差別及其與B肝的相關性的研究，建立一種利用血清/血漿中穩定存在的微小核糖核酸及其特異性變化來進行B型肝炎的早期診斷，病程監控，併發症發生的預測，藥效判定，用藥指南，個體化治療，中藥有效成份篩選，種群分類等研究的新技術。本發明需要解決的問題包括(l)分析鑑定正常人、B肝攜帶者、B肝患者血清/血漿中微小核糖核酸分子分布及其特異性；(2)研究B肝的發病過程中血清/血漿微小核糖核酸的特異性變化；(3)將篩選到的在B肝患者、B肝攜帶者及正常生理狀態下差異表達程度大的一類血清/血漿微小核糖核酸分子用於血清/血漿微小核糖核酸檢測技術的研製，來製備應用於B肝診斷的生物晶片或診斷試劑盒。(4)在體外將特定的微小核糖核酸傳遞到特定細胞/組織，從而達到組織功能改善或疾病治療的效果。本發明提供一種具有較高靶向性、靈敏性、穩定性及高效率並在B型肝炎的診斷和治療方面具有重大應用前景的微小核糖核酸。其研究的技術方案主要包括以下幾個部分l,Solexa測序(1)收集血清/血漿樣本收集正常人、B肝攜帶者、B肝患者血清若干份，從每份正常人血清中取出一部分混成40ml的混合血清用於總RNA的提取。B肝攜帶者和B肝患者也是如此。(2)通過Trizol試劑提取血清/血漿總RNA:a每lml血清加入lml的Trizol(solexa需要約40ml的血清)，用手震蕩混勻；b相分離15-3(TC孵化勻漿物5分鐘，致使核蛋白複合體充分解離，lml/200ul氯仿，蓋緊蓋子，用力震蕩15秒，15-3(TC孵化2-3分鐘，2-8。C(4'C)10000rcf(132,000rpm)離心15分鐘，離心後混合物分為三層下層苯酚氯仿相、中間相、無色的上層水相一含RNA,RNA完全溶解於上層水相，上層水相佔總體積的60%;c多歩酚-氯仿抽提去掉多餘蛋白1/3體積苯酚(除DNA蛋白)震蕩，10000g離心5分鐘，轉移上清；1/6體積苯酚+1/6體積氯仿震蕩，10000g離心5分鐘，轉移上清；1/3體積氯仿震蕩，10000g離心5分鐘，轉移上清，除掉多餘的酚；dRNA沉澱將上層水相轉移，按每lmlTrizol/500ul異丙醇的量加入異丙醇(一般過量的異丙醇，可以加到離心管的容量範圍)，冰浴或者4。C放置1小時，2-8°C(4°C)10000rcf離心1小時，則RNA粗提物將沉降在官底，將異丙醇用槍吸掉；注意異丙醇加過量(25ml+15ml沉澱在光下可見，薄膜狀)e用lml的Trizol溶解沉澱(此時可以更加清晰地看到沉澱，為露珠狀)吹打直到沉澱溶解，冰上靜置一會，轉移至EP管中；f重複2-3步，如果蛋白雜質少，可以省略掉步驟3;gRNA沉澱將上層水相轉移，按每lmlTrizol/500ul異丙醇的量加入異丙醇，在15-30'C孵化(冰浴)10分鐘，在2-8°C(4°C)10000rcf(132，000rpm)離心10分鐘則RNA粗提物將沉降在管底;h衝洗RNA:倒掉上清，用75%的乙醇衝洗沉澱一次，用量為lmlTrizol/lml乙醇，用震蕩器重懸乳白色沉澱，沉澱從管底脫落漂浮起來，在在2-8。C(4°C)10000rcf(132，OOOrpm)離心5分鐘;i溶解RNA:用槍吸掉上清，略離心一下，將上清徹底吸乾淨，晾乾5分鐘(透明或半透明的狀態)，切勿使RNA完全乾燥，否則RNA很難溶解。溶解後(20ul左右)於一70。C保存；j測量濃度。(3)進行PAGE電泳回收17-27ntRNA分子；(4)將adaptorprime酶聯在小RNA分子的3'與5'端；(5)進行RT-PCR反應後並進行測序；(6)數據分析與處理。根據上述方法所檢測到的存在差異表達的正常人、B肝攜帶者、B肝患者血清/血漿中的微小核糖核酸包括let-7c、miR-1、miR-10a、miR-122、miR-125b、miR-128a、miR-128b、miR-150、miR-197、miR-221、miR-222、miR-223、miR-23a、miR-23b、miR-27a、miR-27b、miR-30a、miR-342-3p、miR-361_5p、miR-423-5p、miR-532-5p、miR-574-3p、miR-629、miR-92a、miR-92b、miR-99a、miR-139-5p、miR-193a-5p、miR-193b、miR_365、miR-375、miR-455-3p、miR-483-3p、miR-483-5p、miR-486-3p、miR-885-5p、miR-99b、let-7f、let-7g、let-7i、miR-101、miR-103、miR-106a、miR-106b、miR-107、miR-126、miR—130a、miR—130b、miR—142—3p、miR-142—5p、miR-144、miR-146a、miR—146b—5p、miR-148b、miR-151-5p、miR-15a、miR-16、miR-17、miR-182、miR_183、miR_185、miR-186、miR-18a、miR—191、miR-19b、miR-20a、miR-20b、miR-21、miR—210、miR—26a、miR-26b、miR-29c、miR-30e、miR-340、miR-362-5p、miR-363、miR-374a、miR-378、miR—424、miR-451、miR-454、miR—532_5p、miR_652、miR_660、miR-7、miR-923、miR_93、miR-96、miR-98。2.Real-timePCR方法(1)提取受試者的血清/血漿總RNA，通過RNA逆轉錄反應得到cDNA樣品；或者收集受試者的血清/血漿樣本，以血清/血漿作為緩衝液進行逆轉錄反應來製備cDNA樣品；(2)用微小核糖核酸設計引物；(3)加入螢光探針進行PCR反應；(4)檢測並比較正常人、B肝攜帶者、B肝患者血清/血漿樣本中微小核糖核酸的量的變化。根據solexa結果我們選擇了正常人與B肝攜帶者和B肝患者之間具有較大差異的let-7c、miR—10a、miR-122、miR-125b、miR-150、miR-223、miR-23a、miR-23b、miR-27a、miR-342-3p、let-7f、miR-423_5p、miR-574_3p、miR-92a、miR-99a、miR-139-5p、miR-375、miR-483-5p、miR-885-5p、miR-101、miR-106b、miR-16、miR-185、miR-451用Real-timePCR方法所檢測到的B肝攜帶者與正常人血清/血漿中存在差異表達的微小核糖核酸包括let-7c、miR-10a、miR_122、miR-125b、miR_150、miR-223、miR-23a、miR-23b、miR-27a、miR-342-3p、miR-423-5p、miR-92a、miR-99a、miR-139-5p、miR-375、miR-483-5p、miR-885-5p，B肝患者與正常人血清/血漿中存在差異表達的微小核糖核酸包括let-7c、miR-10a、miR-122、miR-125b、miR-150、miR-223、miR-23a、miR-23b、miR-27a、miR-342_3p、miR-423-5p、miR-92a、miR-99a、miR-139-5p、miR-375、miR-483-5p、miR-885_5p，B肝攜帶者與B肝患者血清/血槳中存在差異表達的微小核糖核酸包括let-7c、miR-423-5p、miR-139_5p。3.本發明還提供一種用於評價受試者是正常人、B肝攜帶者還是B肝患者的試劑盒，所述試劑盒可以包含正常人、B肝攜帶者、B肝患者血清/血漿中存在差異表達的全部成熟體微小核糖核酸的引物，具體包括let-7c、miR-10a、miR_122、miR-125b、miR-150、miR-223、miR-23a、miR-23b、miR-27a、miR-342-3p、miR-423-5p、miR-92a、miR-99a、miR-139-5p、miR-375、miR-483_5p和miR-885_5p的引物。具體而言，上述組合、方法、試劑盒中，用於診斷和/或鑑別受試者的生理和/或病理狀態、用於篩選待測物的預防和/或治療B型肝炎的活性、評價對受試者進行治療的有效性、對受試者發生併發症進行預測。目前對B型肝炎進行臨床診斷的傳統生物化學及分子生物學技術方法主要包括反向被動血凝、酶聯免疫吸附試驗、基因診斷等，這些方法還比較繁瑣和粗糙，在靈敏度、特異性、效率性、普及性、樣品準備和保存方面都會存在各種缺陷或不足。傳統的B肝治療方法主要包括抗病毒、免疫調節、抗炎保肝、抗纖維化和對症治療等，其中抗病毒治療是關鍵，主要包括幹擾素治療、核苷類似物治療、免疫調節治療和其他抗病毒藥物和中藥治療。但因為B肝病毒具有個體特異性，這些傳統的治療方法都存在一定的副作用、造成機體的耐藥性且療效均比較低。血清/血漿微小核糖核酸檢測技術，基於血清/血漿微小核糖核酸的生物晶片和診斷試劑盒巧妙地將血清/血漿微小核糖核酸的獨特性質和常規分子生物學檢測技術結合為一體，它們可以快速地高通量地分析B肝攜帶者或病人血清/血漿中微小核糖核酸的組成，臨床適用性極強。由於器官組織的生理狀態變化會引起血清/血漿微小核糖核酸組成的改變，因此血清/血漿微小核糖核酸可以作為"疾病指紋"，用於B型肝炎的早期診斷。血清/血漿微小核糖核酸檢測技術的優越性(1)血清/血漿微小核糖核酸作為新型的疾病標誌物，具有檢出譜系廣、靈敏度高、檢測成本低、取材方便、樣本易存放(血清/血漿-2(TC存放即可)等優點，該方法可廣泛用於B肝普査等相關工作，成為早期診斷B肝的有效手段。(2)血清/血漿微小核糖核酸作為新的疾病標記物將改進單一的標記物所難以克服的個體差異所帶來的低特異性和低靈敏度，顯著提高B肝的臨床檢出率和實現B肝的早期診療。(3)血清/血漿微小核糖核酸檢測技術的優勢在於其檢測的是一系列疾病相關標記物，因而能夠克服病人個體之間的差異(即年齡、性別、種族、飲食和環境等)，而這正是單一疾病標記物所無法逾越的一個主要問題。四具體實施例方式實施例1正常人、B肝攜帶者、B肝患者血清/血漿中微小核糖核酸的Solexa測序，具體步驟為(1)收集血清/血漿樣本收集正常人、B肝攜帶者、B肝患者血清若干份，從每份正常人血清中取出一部分混成40ml的混合血清用於總RNA的提取。B肝攜帶者和B肝患者也是如此。(2)通過Trizol試劑提取血清/血漿總RNA:a每lml血清加入lml的Trizol(solexa需要約40ml的血清)，用手震蕩混勻；b相分離15-3(TC孵化勻漿物5分鐘，致使核蛋白複合體充分解離，lml/200ul氯仿，蓋緊蓋子，用力震蕩15秒，15-3(TC孵化2-3分鐘，2-8°C(4°C)10000rcf(132,000rpm)離心15分鐘，離心後混合物分為三層下層苯酚氯仿相、中間相、無色的上層水相一含RNA，RNA完全溶解於上層水相，上層水相佔總體積的60%;c多步酚-氯仿抽提去掉多餘蛋白1/3體積苯酚(除DNA蛋白)震蕩，10000g離心5分鐘，轉移上清；1/6體積苯酚+1/6體積氯仿震蕩，10000g離心5分鐘，轉移上清；1/3體積氯仿震蕩，10000g離心5分鐘，轉移上清，除掉多餘的酚；dRNA沉澱將上層水相轉移，按每lmlTrizol/500ul異丙醇的量加入異丙醇(一般過量的異丙醇，可以加到離心管的容量範圍)，冰浴或者4。C放置l小時，2-8'C(4'C)10000rcf離心1小時，則RNA粗提物將沉降在官底，將異丙醇用槍吸掉；注意異丙醇加過量(25ml+15ml沉澱在光下可見，薄膜狀)e用lml的Trizol溶解沉澱(此時可以更加清晰地看到沉澱，為露珠狀)吹打直到沉澱溶解，冰上靜置一會，轉移至EP管中；f重複2-3步，如果蛋白雜質少，可以省略掉步驟3;gRNA沉澱將上層水相轉移，按每lmlTrizol/500ul異丙醇的量加入異丙醇，在15-30。C孵化(冰浴)10分鐘，在2-8°C(4°C)10000rcf(132,000rpm)離心10分鐘則RNA粗提物將沉降在管底；h衝洗RNA:倒掉上清，用75%的乙醇衝洗沉澱一次，用量為lmlTrizol/lml乙醇，用震蕩器重懸乳白色沉澱，沉澱從管底脫落漂浮起來，在在2-8。C(4°C)10000rcf(132,000rpm)離心5分鐘;i溶解RNA:用槍吸掉上清，略離心一下，將上清徹底吸乾淨，晾乾5分鐘(透明或半透明的狀態)，切勿使RNA完全乾燥，否則RNA很難溶解。溶解後(20ul左右)於一70'C保存；(3)進行PAGE電泳回收17-27ntRNA分子；(4)將adaptorprime酶聯在小RNA分子的3'與5'端；(5)進行RT-PCR反應後並進行測序；(6)數據分析與處理具體實驗結果見下表，其中的數值表示microRNA的相對拷貝數。tableseeoriginaldocumentpage9tableseeoriginaldocumentpage10tableseeoriginaldocumentpage11tableseeoriginaldocumentpage12實施例2正常人、B肝攜帶者、B肝患者血清/血漿中部分存在差異表達的微小核糖核酸的real-timePCR實驗定量PCR的實驗步驟如下(1)提取受試者的血清/血漿總RNA，通過RNA逆轉錄反應得到cDNA樣品；或者收集受試者的血清/血漿樣本，以血清/血漿作為緩衝液進行逆轉錄反應來製備cDNA樣品；(2)用微小核糖核酸設計引物；(3)加入螢光探針進行PCR反應；(4)檢測並比較正常人、B肝攜帶者、B肝患者血清/血漿樣本中微小核糖核酸的量的變化。定量PCR實驗用的染料是EvaGreen，儀器使用的是ABIPrism7500螢光定量PCR儀，反應條件為95X:、5分鐘進行1個循環一95°C、15秒，60°C、1分鐘進行40個循環。將正常人、攜帶者、B肝病人血清/血漿樣本與正常人血清/血漿樣本用酚和氯仿除蛋白後直接進行逆轉錄反應，通過定量PCR反應比較其中所含微小核糖核酸的量。我們根據solexa結果選取let-7c、miR-10a、miR-122、niR-125b、miR-150、miR-223、miR-23a、miR-23b、miR-27a、miR-342-3p、let-7f、miR-423-5p、miR-574-3p、miR-92a、miR-99a、miR-139-5p、miR-375、miR-483-5p、miR-885-5p、miR-101、miR-106b、miR-16、miR-185、miR-451進行實驗，實驗結果見下表1，2:表1攜帶者與正常人的比較tableseeoriginaldocumentpage12tableseeoriginaldocumentpage13tableseeoriginaldocumentpage14正常人平均值的計算方法為首先每個樣品求2—"'wnaX100000，所得的值求平均值，然後每個樣品的2—eti"iRNAX100000除以平均值，所得的值再求平均值，因此都為1。攜帶者平均值的計算方法為首先求每個樣品的2—"，miRNA，求得的值除以正常人2—"^miRNAX100000的平均值，然後再算平均值。患者平均值的計算方法為首先求每個樣品的2—"患者週，求得的值除以正常人2-"正常^腿><100000的平均值，然後再算平均值。從表中我們看出與Solexa結果相符的microRNA是let-7c、miR-10a、miR-122、miR-125b、miR-150、miR—223、miR-23a、miR-23b、miR-27a、miR—342-3p、miR-423-5p、miR-92a、miR-99a、miR-139-5p、miR-375、miR-483-5p和miR-885-5p，其中，攜帶者和患者之間存在差異的為let-7c、miR-423-5p和miR-139-5p。實施例3用於B肝診斷與預測的微小核糖核酸試劑盒的製作微小核糖核酸試劑盒的製作工藝和操作流程是基於solexa測序技術、Realtime-PCR技術和生物晶片技術。首先通過測序的方法或PCR方法確定正常人血清/血漿中的微小核糖核酸。然後通過定量PCR技術和生物晶片技術篩選B肝攜帶者、B肝患者與正常人表達量差異程度大的一類血清/血漿微小核糖核酸，作為預測是否發生疾病以及診斷病變程度的指標。最後篩選出的對應B肝攜帶者和B肝患者的血清/血漿微小核糖核酸的數量控制在十幾條，這是在晶片探針庫的基礎上做出的最優化的精簡。此試劑盒包括一批血清/血漿微小核糖核酸引物，Taq酶、dNTP等試劑，其中微小核糖核酸的引物包括let-7c、miR-10a、miR_122、miR-125b、miR_150、miR-223、miR-23a、miR-23b、miR-27a、miR-342-3p、miR-423_5p、miR-92a、miR-99a、miR-139_5p、miR-375、miR-483-5p和miR-885-5p的引物。此試劑盒的價值在於只需要血清/血漿而不需要其它組織樣品，通過最精簡的探針庫檢測微小核糖核酸的變化趨勢，再通過該變化趨勢預測B肝發生的可能性或診斷B肝的病理階段。因此此試劑盒投入生產實踐，可在B肝診斷、治療、療效評價、預後中應用。權利要求1.一種正常人、B肝攜帶者、B肝患者血清/血漿中存在差異表達的微小核糖核酸組合，其特徵是該組合具體包含let-7c、miR-1、miR-10a、miR-122、miR-125b、miR-128a、miR-128b、miR-150、miR-197、miR-221、miR-222、miR-223、miR-23a、miR-23b、miR-27a、miR-27b、miR-30a、miR-342-3p、miR-361-5p、miR-423-5p、miR-532-5p、miR-574-3p、miR-629、miR-92a、miR-92b、miR-99a、miR-139-5p、miR-193a-5p、miR-193b、miR-365、miR-375、miR-455-3p、miR-483-3p、miR-483-5p、miR-486-3p、miR-885-5p、miR-99b、let-7f、let-7g、let-7i、miR-101、miR-103、miR-106a、miR-106b、miR-107、miR-126、miR-130a、miR-130b、miR-142-3p、miR-142-5p、miR-144、miR-146a、miR-146b-5p、miR-148b、miR-151-5p、miR-15a、miR-16、miR-17、miR-182、miR-183、miR-185、miR-186、miR-18a、miR-191、miR-19b、miR-20a、miR-20b、miR-21、miR-210、miR-26a、miR-26b、miR-29c、miR-30e、miR-340、miR-362-5p、miR-363、miR-374a、miR-378、miR-424、miR-451、miR-454、miR-532-5p、miR-652、miR-660、miR-7、miR-923、miR-93、miR-96和miR-98。2.根據權利要求l所述微小核糖核酸組合製備的試劑盒，其特徵是所述試劑盒包含let-7c、miR-10a、miR-122、miR-125b、miR-150、miR-223、miR-23a、miR-23b、miR-27a、miR-342-3p、miR-423-5p、miR-92a、miR-99a、miH39-5p、miR-375、miR-483_5p和miR-885-5p的引物以及Taq酶和d證試劑。3.根據權利要求2所述的微小核糖核酸試劑盒的製備方法，其特徵是由以下集合步驟構成(1)通過Solexa測序法初步確定正常人、B肝攜帶者、B肝患者血清/血漿中存在差異表達的微小核糖核酸；(2)根據測序的結果再進行實時定量PCR方法進一步確定正常人、B肝攜帶者、B肝患者血清/血漿中存在差異表達的微小核糖核酸；(3)根據PCR結果，最終確定可以作為區別正常人、B肝攜帶者、B肝患者的標誌microRNA;(4)設計試劑盒，試劑盒由標誌microRNA的引物、實時定量PCR試劑構成。4.根據權利要求1所述的微小核糖核酸組合或權利要求2所述的微小核糖核酸組合試劑盒在B肝診斷、治療、預後中的應用。全文摘要血清微小核糖核酸試劑盒及其在B型肝炎早期診斷中的應用屬於生物技術製藥
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。本發明提供一種用於評價正常人、B肝攜帶者和B肝患者生理和/或病理狀態的微小核糖核酸的組合，所述組合包含正常人、B肝攜帶者和B肝患者血清/血漿中存在差異表達的全部微小核糖核酸，由此製備了一種能用於B肝早期診斷的診斷試劑盒。所述組合、方法能夠用於B型肝炎的早期檢測及指導治療，該組合、方法具有高特異性、高效性、高靈敏度、檢測成本低、取材方便、樣本易存放等優點。文檔編號C12Q1/68GK101368213SQ20081019677公開日2009年2月18日申請日期2008年10月13日優先權日2008年10月13日發明者楨卞,張峻峰,張辰宇,科曾,李麗民,蕊白,熹陳,陳江寧申請人:南京大學