低質量樣本dna高通量測序文庫的構建方法
2023-12-11 08:40:02
低質量樣本dna高通量測序文庫的構建方法
【專利摘要】本發明公開了一種低質量樣本DNA的高通量測序文庫的構建方法，該構建方法包括：對低質量樣本DNA進行電泳分離，無需經過純化處理的步驟直接獲得樣本DNA；對無需經過純化處理的步驟直接獲得的上述樣本DNA直接進行片段化文庫構建，獲得上述高通量測序文庫。本發明的上述構建方法通過電泳分離後對樣本DNA直接進行片段化文庫構建的步驟，不僅實現了純化樣本DNA的目的，還減少了樣本DNA的損失，提高了樣本DNA的得率，使低質量的樣本DNA的量能夠滿足構建高通量測序文庫的需求，而且使構建的高通量測序文庫有效地避免了蛋白、細菌基因組DNA或其他雜質DNA的汙染，進而避免了對後續序列組裝的影響。
【專利說明】低質量樣本DNA高通量測序文庫的構建方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物【技術領域】，具體而言，涉及一種低質量樣本DNA高通量測序文庫的構建方法。
【背景技術】
[0002]隨著高通量測序技術的發展，越來越多的生命科學領域的研究都涉及到測序文庫構建以及高通量測序。測序文庫是含有某種生物體全部基因組DNA的隨機片段的重組DNA克隆群體，是進行全基因組測序、構建物理圖譜、染色體步移、基因篩選及基因圖位克隆的基礎，為基因組學的研究提供了強有力的技術平臺。
[0003]測序文庫質量的高低決定了測序文庫作用的大小，而測序文庫質量的高低直接取決於樣本DNA的質量，即高通量測序文庫對樣本DNA的純度和量都有一定的要求。對於有雜質的樣本DNA，通常採用電泳凝膠分離，對帶有目標片段的DNA凝膠進行割取，然後再把目標DNA凝膠塊進行溶化後，經電透析或其他手段進行純化，從而得到較純的樣本DNA。通過這些常規方法提純得到的DNA的量至少要達到Iug時，才能滿足高通量測序文庫構建的要求。
[0004]然而，對於一些混有其他DNA雜質的樣本DNA、含有蛋白雜質的樣本DNA或者容易受宿主基因組DNA汙染的樣本DNA如細菌人工染色體(Bacterial Artificial Chromosome,BAC) DNA而言，往往由於難以提純或提純步驟過於複雜致使提純後的樣本DNA量低於Iug而無法完成高通量測序文庫的構建，尤其是量少而又比較珍貴的樣本DNA。
[0005]因此，對於這類含有雜質而經純化分離後又因總量低於Iug而難以進行測序文庫構建的低質量樣本DNA，仍需要開發一種新的方法來進行高通量測序文庫的構建。
【發明內容】
[0006]本發明旨在提供一種低質量樣本DNA的高通量測序文庫的構建方法，以彌補難以通過現有的構建方法完成一些低質量樣本DNA高通量測序文庫構建的不足。
[0007]為了實現上述目的，根據本發明的一個方面，提供了一種低質量樣本DNA的高通量測序文庫的構建方法，上述構建方法包括:對上述低質量樣本DNA進行電泳分離，無需經過純化處理的步驟直接獲得樣本DNA ;對無需經過純化處理的步驟直接獲得的上述樣本DNA直接進行片段化文庫構建，獲得上述高通量測序文庫。
[0008]進一步地，上述低質量樣本DNA為細菌人工染色體樣本DNA、含蛋白雜質的樣本DNA或含其它DNA雜質的樣本DNA。
[0009]進一步地，上述低質量樣本DNA中目標DNA片段長度為15Kb~200Kb的大片段DNA。
[0010] 進一步地，上述的構建方法中的電泳分離的步驟包括:對上述低質量樣本DNA進行電泳分離，得到凝膠塊式的樣本DNA ;對凝膠塊式的上述樣本DAN進行溶膠處理，得到凝膠液式的樣本DNA。[0011]進一步地，上述片段化文庫構建的步驟包括:對上述凝膠液式的樣本DNA進行片段化處理，得到片段化DNA ;對片段化DNA進行末端修復，得到修復DNA ;對修復DNA進行接頭連接，得到帶接頭DNA ;對上述帶接頭DNA進行擴增，得到上述高通量測序文庫。
[0012]進一步地，上述片段化處理的步驟中採用超聲破碎的方法對上述樣本DNA進行片段化，得到上述片段化DNA。
[0013]進一步地，上述片段化處理的步驟中採用自動聚焦聲波樣本處理儀Covaris S220對上述樣本DNA進行破碎。
[0014]進一步地，上述構建方法在獲得上述高通量測序文庫之後，還包括對高通量測序文庫進行上機前質檢的步驟，包括:檢測高通量測序文庫中所攜帶的樣本DNA片段的濃度；當上述樣本DNA片段的濃度不小於2nmol時，則進行後續步驟。
[0015]進一步地，上述上機前質檢的步驟還包括:在檢測上述高通量測序文庫中所攜帶的樣本DNA片段的濃度的步驟後，進一步檢測上述高通量測序文庫中所攜帶的樣本DNA片段的長度；當上述樣本DNA片段的長度在400~600bp時，則進行後續步驟。
[0016]進一步地，上述上機前質檢的步驟採用安捷倫2100DNA檢測儀進行檢測和採用實時螢光定量PCR方 法進行檢測。
[0017]應用本發明的技術方案，通過採用電泳分離得到相對乾淨的樣本DNA，然後對所得的具有大片段的樣本DNA無需經過純化步驟直接進行片段化文庫構建，從而完成高通量測序文庫的構建。本發明的上述構建方法通過對電泳分離後對樣本DNA直接進行片段化文庫構建的步驟，不僅實現了純化樣本DNA的目的，還減少了樣本DNA的損失，提高了樣本DNA的得率，使低質量的樣本DNA的量能夠滿足構建高通量測序文庫的需求，而且使構建的高通量測序文庫有效地避免了蛋白、細菌基因組DNA或其他雜質DNA的汙染，進而避免了對後續序列組裝的影響。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0018]構成本申請的一部分的說明書附圖用來提供對本發明的進一步理解，本發明的示意性實施例及其說明用於解釋本發明，並不構成對本發明的不當限定。在附圖中:
[0019]圖1示出了本發明實施例的高通量測序文庫的構建流程；
[0020]圖2示出了本發明實施例中含有蛋白、細菌基因組汙染的細菌人工染色體樣本的電泳圖；
[0021]圖3示出了本發明實施例中使用Covaris S220進行破碎結果的電泳圖；
[0022]圖4示出了本發明實施例中使用安捷倫2100檢測所構建文庫包含接頭的插入片段的大小；
[0023]圖5示出了本發明實施例中所構建文庫GC或AT分離度與GC含量；以及
[0024]圖6示出了本發明實施例中所構建文庫上機檢驗最終插入片段大小(insert-size)分布圖。
【具體實施方式】
[0025]需要說明的是，在不衝突的情況下，本申請中的實施例及實施例中的特徵可以相互組合。下面將參考附圖並結合實施例來詳細說明本發明。[0026]正如【背景技術】中所提到的，在現有技術中，對那些含有雜質而提純後DNA量又低於Iug的低質量樣本DNA，無法通過現有的方法進行高通量測序文庫的構建。為了解決這一技術問題，本發明提供了一種低質量樣本DNA高通量測序文庫的構建方法，該構建方法包括:步驟SI，對所述低質量樣本DNA進行電泳分離，獲得樣本DNA ;步驟S2，對所述樣本DNA進行片段化文庫構建，獲得所述高通量測序文庫。
[0027]本發明的上述構建方法，通過採用電泳分離得到相對乾淨的樣本DNA，然後對所得的具有大片段的樣本DNA無需經過純化步驟直接進行片段化文庫構建，從而完成高通量測序文庫的構建。本發明的上述構建方法通過對電泳分離後對樣本DNA直接進行片段化文庫構建的步驟，不僅實現了純化樣本DNA的目的，還減少了樣本DNA的損失，提高了樣本DNA的得率，使低質量的樣本DNA的量能夠滿足構建高通量測序文庫的需求，而且使構建的高通量測序文庫有效地避免了蛋白、細菌基因組DNA或其他雜質DNA的汙染，進而避免了對後續序列組裝的影響。
[0028]低質量樣本DNA包括細菌人工染色體樣本DNA、含蛋白雜質的樣本DNA、含其它DNA雜質的樣本DNA。以細菌人工染色體樣本DNA為例，目前，對於細菌人工染色體樣本DNA樣本進行提取的常用的方法有鹼裂解法和樣本提取試劑盒，比如Qiagen公司的大構建載體試劑盒(large-construct kit)。但是這些方法都存在一個共同的缺點:很難避免宿主中細菌基因組、蛋白等雜質的汙染。蛋白等雜質汙染對後續文庫構建以及數據產出有很大的影響，而細菌基因組的汙染會嚴重影響後續細菌人工染色體序列的組裝效果。
[0029]想要得到相對純淨的細菌人工染色體樣本DNA，主要有兩種思路:一、細菌基因組的清除；二、細菌人工染色體樣本區域的回收。目前對細菌基因組汙染的處理比較好的方法就是使用線性DNA消化酶，但是這樣處理一方面會導致細菌人工染色體樣本的損失，另一方面就是消化效果並不好，導致大量的細菌基因組的殘留。對於細菌人工染色體樣本區域的回收，目前最好的辦法就是利用電泳切膠加電透析的方式，但是這種方法操作繁瑣，回收效率低，成本高等缺點，而對於高通量文庫構建需要大量的DNA樣本，採用這種方法進行回收根本不適合高通量文庫的大規模構建。因此，本發明所提供的高通量測序文庫的構建方法,尤其適合上述的低質量樣本DNA的高通量測序文庫的構建。
[0030]上述低質量樣本DNA，無論DNA長度大小均可採用本發明的上述構建方法。當DNA長度較小，比如低於500bp時，無需破碎處理即可直接進入建庫流程。而當上述低質量樣本DNA的長度為15kb~200Kb的大片段DNA時，更適合採用本發明的上述構建方法進行高通量測序文庫構建，這樣把極難回收的大片段轉化成了很容易回收的短片段進行回收，回收效率高且簡化了文庫構建步驟。
[0031]在本發明一種優選的實施例中，上述電泳分離的步驟包括:對低質量樣本DNA進行電泳分離，得到凝膠塊式的樣本DNA ;對凝膠塊式的樣本DAN進行溶膠處理，得到凝膠液式的樣本DNA。先通過凝膠電泳的方法對目標DNA片段進行分離，對分離在凝膠上的目標DNA片段進行割膠，然後利用自製的或市售的DNA回收試劑盒中的溶膠液進行溶膠，使得含有目標片段的樣本DNA 從固體凝膠中釋放出來，以利於後續對該樣本DNA的片段化。
[0032]在上述實施例中，在得到含有目標片段的凝膠液樣本DNA後，直接取凝膠液中的DNA進行後續片段化文庫構建的步驟。片段化文庫構建的步驟按照本領域常用的文庫構建方法即可。在本發明一種優選的實施例中，上述片段化文庫構建的步驟包括:對凝膠液式的樣本DNA進行片段化處理，得到片段化DNA ;對片段化DNA進行末端修復，得到修復DNA ;對修復DNA進行接頭連接，得到帶接頭DNA ;對帶接頭DNA進行擴增，即可得到高通量測序文庫。上述末端修復和接頭連接步驟中利用市售的相關文庫構建試劑盒，如Illumina公司的TrueseqDNA文庫構建試劑盒，中的試劑或接頭即可。
[0033]上述片段化文庫構建的步驟中通過對凝膠液式的樣本DNA進行破碎，不僅完成了建庫流程中對大片段DNA的片段化，而且在對這些片段化的小片段進行回收純化的過程中，同時實現了對樣本DNA的回收純化。這種處理方式大大減低了樣本DNA的損失，提高了樣本DNA高通量測序文庫的質量。同時也簡化了建庫流程,縮短了建庫時間。
[0034]對上述步驟S21中破碎通常採用物理破碎的方式將大片段DNA破碎成200~600bp大小，最常用的物理破碎方式是超聲破碎。在本發明中，優選採用自動聚焦聲波樣本處理儀Covaris S220進行破碎。自動聚焦聲波樣本處理儀Covaris S220具有對DNA濃度測量更精確且操作簡單方便的優點。
[0035]在高通量測序領域，通常在測序文庫構建好之後，還需要對高通量測序文庫進行質檢的步驟。質檢的內容包括帶有樣本DNA小片段的濃度大小以及插入片段的大小。首先對文庫中帶有樣本DNA小片段的濃度大小進行檢測，當文庫中樣本DNA小片段的濃度過低時，比如，對於Hiseq2000的測序平臺而言，文庫中樣本DNA小片段的濃度通常需要達到2nmol,低於2nmol時,則無法進行後續的高通量測序。在濃度達到至少2nmol時,進一步檢測文庫中樣本DNA小片段的大小，當文庫中樣本DNA的插入片段大小過大或過小，都無法達到高通量測序的目的。對於Hiseq2000的測序平臺而言，文庫中樣本DNA的插入片段大小通常小於600bp。大於600bp時，因Hiseq的讀長較短,無法讀取文庫中的樣本DNA小片段的全長，進而導致後續拼接過程難度加大或無法完成拼接。而小於200bp時又使得重複測序的片段增多，造成數據的浪費。
[0036]在對帶有樣本DNA小片段的文庫進行檢測時，最常用的是安捷倫2100。安捷倫2100不僅能夠很好地顯示待檢測樣品的濃度的高低，而且還可以直觀地顯示樣品插入片段大小的分布範圍，是目前高通量測序領域常用的檢測儀器。同時對待檢測文庫進行實時螢光定量PCR進行檢測，能夠更準確地體現各文庫的濃度值，對構建好的高通量測序文庫能夠進行多少次測序實驗具有更準確的指導意義。
[0037]能夠通過上述質檢的高通量測序文庫，通常質量都比較高，對得到的後續的測序數據的質量也有較高的保證。若再取少量高通量測序文庫進行上機質檢，得到的測序數據更能直接反映出所構建的文庫的質量。
[0038]下面將結合具體的實施例來說明本發明的有益效果。
[0039]需要說明的是，下列實施例是按照圖1所示高通量測序文庫的構建流程進行構建的。下列實施例所提供的高通量測序文庫的構建方法中如無特別說明均為常規方法，所用接頭序列來自於Illumina公司的IlluminaTruseq文庫構建試劑盒,所用試劑如無特別說明均為NEB公司的產品，所用水為超純水。
[0040]下列實施例的樣品為攜帶酵母基因組片段的細菌人工染色體樣本DNA，總體積15ul，經 檢測0D26Q/0D28Q值為1.23，說明樣本DNA中有蛋白質汙染；0D26(I值為60ug/ml，可算出樣本DNA的總量為0.9ug，若再經常規的方法純化後，得到的樣本DNA的總量會遠低於lug，無法按照常規的純化後再片段化的高通量測序文庫構建方法進行文庫構建。[0041]實驗一、細菌人工染色體(BAC)DNA樣本的破碎和回收
[0042]I)樣品檢測
[0043]在0.8%瓊脂糖凝膠中，120v的電壓下，電泳I小時，檢測樣品質量，確定目的條帶位置以及汙染的細菌基因組位置，如圖2所示，其中，最左側泳道為trans2kplus (全式金)Marker,從上到下片段大小依次為 5kbp、3kbp、2kbp、lkbp、750bp、500bp、250bp、IOObp ；最右側泳道為Lambda細菌DNA被HindIII酶切後的片段，從上到下片段大小依次為:23k、
9.5k,6.5k、2.3k、2k，中間泳道為酵母細菌人工染色體樣本DNA。從圖2上可以看出，與右側對照大小接近的23kb的條帶為細菌基因組汙染，中間最亮的條帶為細菌人工染色體樣本，點樣孔處為蛋白汙染。
[0044]2)細菌人工染色體DNA條帶凝膠溶解、打斷、回收
[0045]對步驟I)檢測的有基因組汙染的樣本採用美國的Qubit儀器進行定量，取I μ g進行電泳並切取BAC樣本對應條帶，使用天平進行稱重，按lug對應IOOul溶膠液計算，添加3倍膠重量所對應的體積。溶膠液採用Qiagen試劑盒中的QG溶液室溫直至膠完全溶解，將溶解的產物加入300 μ I體系的Covaris管中，補水至300 μ I。使用Covaris S220設備進行物理破碎至片段大小500bp，片度化結果如圖3所示，圖3中的IOObp DNA Marker (全式金)表示的條帶大小分別是 1.5kbp、l.2kbp、lkbp、900bp、800bp、700bp、600bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp。上述片段化的參數如下:
【權利要求】
1.一種低質量樣本DNA的高通量測序文庫的構建方法，其特徵在於，所述構建方法包括: 對所述低質量樣本DNA進行電泳分離，無需經過純化處理的步驟直接獲得樣本DNA ；對無需經過純化處理的步驟直接獲得的所述樣本DNA直接進行片段化文庫構建，獲得所述高通量測序文庫。
2.根據權利要求1所述的構建方法，其特徵在於，所述低質量樣本DNA為細菌人工染色體樣本DNA、含蛋白雜質的樣本DNA或含其它DNA雜質的樣本DNA。
3.根據權利要求1所述的構建方法，其特徵在於，所述低質量樣本DNA中目標DNA片段長度為15Kb~200Kb的大片段DNA。
4.根據權利要求1所述的構建方法，其特徵在於，所述電泳分離的步驟包括: 對所述低質量樣本DNA進行電泳分離，得到凝膠塊式的所述樣本DNA ； 對所述凝膠塊式的所述樣本DAN進行溶膠處理，得到凝膠液式的所述樣本DNA。
5.根據權利要求4所述的構建方法，其特徵在於，所述片段化文庫構建的步驟包括: 對所述凝膠液式的所述樣本DNA進行片段化處理，得到片段化DNA ； 對所述片段化DNA進行末端修復，得到修復DNA ； 對所述修復DNA進行接頭連接，得到帶接頭DNA ； 對所述帶接頭DNA進行擴增，得到所述高通量測序文庫。
6.根據權利要求5所述的構建方法，其特徵在於，所述片段化處理的步驟中採用超聲破碎的方法對所述樣本DNA進行片段化，得到所述片段化DNA。
7.根據權利要求6所述的構建方法，其特徵在於，所述片段化處理的步驟中採用自動聚焦聲波樣本處理儀Covaris S220對所述樣本DNA進行破碎。
8.根據權利要求1所述的構建方法，其特徵在於，所述構建方法在獲得所述高通量測序文庫之後，還包括對所述高通量測序文庫進行上機前質檢的步驟，所述上機前質檢的步驟包括: 檢測所述高通量測序文庫中所攜帶的樣本DNA片段的濃度； 當所述樣本DNA片段的濃度不小於2nmol時，則進行後續步驟。
9.根據權利要求8所述的構建方法，其特徵在於，所述上機前質檢的步驟還包括: 在檢測所述高通量測序文庫中所攜帶的樣本DNA片段的濃度的步驟後，進一步檢測所述高通量測序文庫中所攜帶的樣本DNA片段的長度； 當所述樣本DNA片段的長度在400~600bp時，則進行後續步驟。
10.根據權利要求8或9所述的構建方法，其特徵在於，所述上機前質檢的步驟採用安捷倫2100DNA檢測儀進行檢測和採用實時螢光定量PCR方法進行檢測。
【文檔編號】C40B50/06GK104005090SQ201410232606
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2014年5月28日 優先權日:2014年5月28日
【發明者】王大偉, 劉運超, 朱海浩, 曹志生, 劉倩, 王苗英 申請人:北京諾禾致源生物信息科技有限公司