一種新型的免疫球蛋白與辣根過氧化物酶交聯技術的製作方法

2023-12-12 22:04:12

專利名稱：一種新型的免疫球蛋白與辣根過氧化物酶交聯技術的製作方法
技術領域：
本發明適用於免疫組化技術領域，關鍵技術基於水溶性的聚合載體分子，它具有中到高分子量，可共價結合聯乙烯碸單體(在單體末端為游離且具有反應活性的乙烯基)。通過調節結合反應時間、聚合物載體分子濃度或反應體系pH值(或幾種因素綜合)，可以在更大限度內重複改變交聯程度，從而結合不同的功能分子種類(既可結合免疫球蛋白，又能結合果氧化物酶)。本發明中所涉及的試劑及結合物，在溶液中非常穩定。
背景技術：
近二十年來，免疫組化分析進展神速，尤其是抗原、半抗原或抗體的定性定量分析。一般一抗自身帶有合適的標記(同位素、酶、螢光基團或重金屬)便於檢測，還可以利用一抗與帶合適標記(同位素、酶、螢光基團或重金屬)的二抗(可與一抗反應)之間的免疫化學反應進行檢測。常規的標記系統有以下幾種酶標系統用顯色底物處理樣品，酶與底物反應會在酶及其周圍形成有色沉澱，光學顯微鏡檢測；重金屬標記系統用含銀的增強劑處理樣品，銀金屬在金及其周圍形成黑色沉澱，光學或電子顯微鏡檢測；螢光標記系統一般不需要其他試劑處理樣品，應用合適波長的激發光用螢光顯微鏡檢測；同位素標記系統不許其它試劑處理，X光處理觀察。

發明內容
(一)發明目的由於同位素對人體的傷害，非放射性標記逐漸替代同位素標記，但是其靈敏度不如同位素高。人們通過選用不同的抗體、酶、螢光標記分子以及載體(聚合物載體)提高免疫分析的靈敏度。本發明即建立在利用可溶性載體基礎上，提高免疫分析靈敏度。
可溶性載體(帶有免疫化學反應活性基團、酶/標記分子等)處於均一溶液中，與處於不均一相中相比，活性基團間反應速率會大大提高；可溶性載體還可以使組織中具有免疫化學反應的單體或抗原決定簇充分接觸並反應；而且易於去除(如通過衝洗)過量的未結合待測抗原的抗體(檢測抗原)或未結合待測抗體的抗原、二抗(檢測抗體)。
(二)發明的優勢本發明採用的技術大大提高了上述不同類型的檢測和分析過程的靈敏度和可靠性。本發明在保證靈敏度的前提下，進一步降低了免疫反應成分(抗原、抗體、二抗等)的連續層數量，而這些連續層在傳統的ELISA或組織化學反應中是必須的。
另外，利用本技術製備的水溶性試劑及結合物，在合適的pH值下具有非常高的穩定性/保存期，而與溫度關係不大(無論在低溫或者溫度高於周圍環境的情況下)。聚合物載體右旋糖苷可與多個聯乙烯碸單體通過末端的乙烯基結合在一起，而另一末端的游離乙烯基可以與合適的功能基團進行反應。乙烯自由基的固有反應活性會被中性pH值抑制，而在鹼性pH值如9-11下具有高反應活性，而在液體溶液中以及合適的pH條件下具有相似的高穩定性/保存期。這些特性使得利用本發明製成的產品非常適於商用。
另外，本發明採用的聚合物載體為右旋糖苷，可裝載分子的能力高。每個載體分子可以結合成千上萬的小分子量分子或上千個相對高分子量的分子，這取決於這些分子以及聚合載體分子的空間大小及分子量。

發明內容詳述本發明提供技術的關鍵是將水溶性聚合載體分子與多個聯乙烯碸單體通過乙烯基共價結合在一起，而後另一末端的游離乙烯基則與功能基團的「分子」進行反應，從而將不同的分子種類結合在一起，如可以將標記分子與被標記分子結合在一起完成分子標記。
此處提到的「分子」代表一些分子或離子，可以作為標記(如酶、螢光或冷光)或目標分子(半抗原或半抗原結合物、抗原、抗體、核酸序列或激素)，這些目標分子可以選擇性或特異性的結合到一個或多個目標分子、單體、受體或抗原決定簇。
其中作為標記的分子主要包括蛋白類(如鐵蛋白、藻紅蛋白、藻青蛋白、藻膽素)、酶類(如辣根過氧化物酶、鹼性磷酸酯酶、葡萄糖氧化酶、牛乳糖或脲酶)、毒素類、藥物類、染料類、螢光類、化學發光類、磷光以及其它發光類底物、金屬螯合類底物(如亞氨基乙醯乙酸、EDTA、DTPA或去鐵敏B)以及同位素或重金屬離子標記的底物；螢光標記為FITC、曙紅、赤蘚紅、桑色素、若單明，8-氨基-1-萘磺酸；放射性同位素標記為氫(氚，H3)、碳(C14)、磷(P32)、硫(S35)、碘(I131)、鉍(Bi212)釔(Y90)、鎝(Tc99)、鈀(Pd109)、釤(Sm153)；重金屬離子包括Mn，Fe，Co，Ni，Cu，Zn，Ga，In，Ag，Au，Hg，I，Bi，Y，La，Ce，Eu和Gd，其中Gold(Au)(可能是Ag合金)用途最廣。
另外，分子還包括抗原、半抗原、單克隆或多克隆抗體、基因探針、天然或合成的寡核苷酸或多聚核苷酸、凝集素、抗生物素蛋白或鏈黴胍、生物素、生長因子、激素、受體分子或蛋白A、蛋白G。合適的激素如固醇類激素(雌激素、黃體酮或可的松)、胺基酸激素(如甲狀腺素)或蛋白和肽類激素(如抗利尿激素、胃泌激素、胰島素)。
本發明中聚合物載體分子可以從下列物質中挑選天然或人工的聚多糖及其衍生物如右旋糖苷及右旋糖苷衍生物，澱粉及澱粉衍生物，纖維素衍生物，多糖及膠質或某些天然橡膠及其衍生物如阿拉伯膠，褐藻酸鹽；具有反應活性的同聚物如多熔素、多聚組氨酸及多聚鳥氨酸；天然和合成的多肽和蛋白如牛或其它哺乳動物血清白蛋白以及合成的有親核基團的聚合物如聚乙烯醇、聚丙烯醇、聚乙烯乙二醇及聚丙烯酸替代物。其中最適合的聚合物載體分子是多糖及其衍生物如右旋糖苷、羧基-甲基-右旋糖苷、羥乙基和羥丙酯澱粉、糖原、瓊脂糖衍生物以及羥乙基和羥丙酯纖維素。正如工作樣品證明，右旋糖苷最適合作聚合物載體分子。
由於淨的正負電荷會引起內部反應如結合物與底物及其它物質的非特異結合，因此本發明中所用的試劑及結合物無淨電荷，這可以通過使用不帶淨電荷的載體分子製備得到。這些聚合物載體分子在單體狀態下，pH值約在4-10範圍內是線性、不帶電的，這一pH值範圍實踐證明適於絕大多數免疫化學反應、雜交反應以及本發明結合物適用的其它反應。
本發明中不同種類的試劑及結合物，都基於從低到很高分子量水溶性的聚合載體之上，這些聚合載體分子量在1,000-40,000,000之間，這裡給出的工作例子選用的合適載體的最大分子量在1,000-80,000和80,000-2,000,000之間，而右旋糖苷的最大分子量約在500,000。
說明書中使用的「最大分子量」(又名最大平均分子量)表示給定樣品中含最多數量的單體分子時的分子量。目前市場上有數目眾多的聚合物適用於本發明，如右旋糖苷，製造商或發行人可以提供可靠的最大分子量(由凝膠過濾或色譜柱確定)數據，這些數據又為選擇合適聚合載體分子製備試劑及結合物提供依據。
吸附的分子，按其分子量大小可分為2000以下的和2000以上的兩種。在前一種情況下，結合物的聚合物載體分子可共價吸附1-10000分子，第二種情況下，則可共價吸附1-1000個分子。分子通過聯乙烯碸衍生的基團與聚合載體分子共價吸附在一起。
具體實施例方式
(一)具體步驟1.右旋糖苷的聯乙烯碸(DVS)活化(最大分子量500000)溶液5％w/v右旋糖苷；0.25M磷酸氫二鉀/氫氧化鈉(pH 11.5)；0.25mg/mL硼氫化鈉；10％v/v聯乙烯碸。
在25℃下活化15分鐘，接著用5M HCl調節反應液pH值為7，所有樣品進行水透析以去除過量的試劑。
2.DVS-活化的右旋糖苷與辣根過氧化物酶(HRP)共價交聯第一步的右旋糖苷製備物與辣根過氧化物酶混合，其反應緩衝體系如下2.75mg/mLDVS-活化的右旋糖苷；10mg/mL辣根過氧化物酶；0.2M磷酸氫二鉀/氫氧化鈉(pH 10.0)。在37℃下交聯16小時，接著用1M HCl調節反應液pH值為6-7以中止反應。
3.辣根過氧化物酶右旋糖苷與兔抗鼠免疫球蛋白共價交聯第二步的辣根過氧化物酶-右旋糖苷製備物與兔抗鼠免疫球蛋白(RAM)交聯，反應體系為1.9mg/mL兔抗鼠免疫球蛋白；HRP-右旋糖苷相當於0.25mg/mL右旋糖苷；0.5M磷酸氫二鉀(用鹽酸或氫氧化鈉調節至pH 8.5)。在42℃下孵育20小時，期間不要攪拌。
(二)實施結果免疫組化分析結果顯示，基於HRP-右旋糖苷-RAM複合物的一步法比LASB三步分析法操作簡易，比基於普通結合物的一步法具有明顯優勢。這又一次證明了本發明複合物的優點。
權利要求
1.本發明涉及到不同標記分子的結合方法，可以用於酶免疫分析(EIA)如ELISA，免疫組化分析，細胞化學分析，膜雜交技術(即在膜或紙上發生雜交反應如硝酸纖維素膜，包括Southern和Northern雜交技術)。關鍵技術基於水溶性的聚合載體分子—右旋糖苷，它可共價結合多個聯乙烯碸單體(在單體末端為游離且具有反應活性的乙烯基)，自由的乙烯基可以結合有功能基團的分子。這些功能分子包括標記分子(酶、螢光、重金屬離子等)，以及抗原、半抗原、抗體、核苷酸等被標記物質。
全文摘要
本發明適用於免疫組化技術領域。鑑於同位素標記對人體的傷害，本發明採用新型的標記分子結合技術以提高非同位素標記檢測靈敏度，從而替代同位素標記。本發明的關鍵技術基於水溶性的聚合載體分子—右旋糖苷，它可共價結合多個聯乙烯碸單體(在單體末端為游離且具有反應活性的乙烯基)，自由的乙烯基可以結合有功能基團的分子。這些分子包括標記分子(酶、螢光、重金屬離子等)，以及抗原、半抗原、抗體、核苷酸等被標記物質。本技術可以將被標記物質標記進行定性和定量分析。基於本技術的HRP－右旋糖苷－RAM複合物一步免疫分析法比LASB三步分析法操作簡易，比基於普通結合物的一步法具有明顯優勢。
文檔編號G01N33/53GK1595157SQ0315089
公開日2005年3月16日 申請日期2003年9月10日 優先權日2003年9月10日
發明者肖國偉 申請人:上海長島生物技術有限公司