用於操縱蜜蜂行為和生理學的穩定的合成幼蜂信息素的製作方法

2023-12-08 06:01:01

專利名稱：：用於操縱蜜蜂行為和生理學的穩定的合成幼蜂信息素的製作方法用於操縱蜜蜂行為和生理學的穩定的合成幼蜂信息素髮明領域本發明涉及穩定的蜜蜂信息素和穩定蜜蜂幼蜂信息素的方法，由此能夠產生和持續應用基於信息素的商品。穩定的信息素可以用於操縱工蜂行為並且改善其性能，導致蜂房的火力總體增加。受到應用於惰性物質的穩定信息素影響的具體行為包括首次覓食的年齡，為覓食者的職蟲的比例，花粉對花蜜覓食者的定額，各蜜蜂的花粉荷載，目標作物的傳粉效率，增補食品成分和抗生素的消耗，職蟲的飼養和蜂群的習性。穩定的信息素還可以用於影響咽下食物腺體的發育和該腺體產生蛋白質。穩定的覓食信息素還可以與蜜蜂王后下頜腺信息素聯用，特別是影響目標作物植物的傳粉。
背景技術：
：Pankiw等(1998)測試並且驗證了蜜蜂幼蟲產生刺激覓食的信息素的推定(Filmer1932:Free1967)，他們發現在使用2，000個蜜蜂幼蟲的己烷提取物提供具有l，OOO個幼蟲的蜂群體時，花粉覓食者的數量增加了2.5倍。在不使用幼蟲的蜂群體中，提取物取代了幼蟲作為信息素來源。Pankiw和Page(2001)以及Page和Pankiw(2002)測試了包括如下百分比的脂肪酸酯類的合成信息素摻合物(LeConte等，1990):亞油酸乙酯1%，亞麻酸乙酯13%，油酸乙酯8%，棕櫚酸乙酯3%，硬脂酸乙酯7%，亞油酸甲酯2%,亞麻酸曱酯21%,油酸曱酯25°/。，棕櫚酸甲酯3%和硬脂酸甲酯17°/。。該摻合物減少了工蜂中對蔗糖的感覺神經反應閾值。具有低蔗糖反應閾值的工蜂最可能覓食花粉，而具有高反應閾值的那些最可能覓食花蜜(Pankiw和Page2000;Pankiw2003;Pankiw等，2004a)。在置於蜂群體中心1小時內，幼蟲提取物或合成幼蜂信息素摻合物使杏仁果園中蜂群體花粉與非花粉覓食者之比增加。Pankiw和Page(2001)提示"幼蜂信息素調節前覓食者中的反應閾值，使它們對花粉覓食者敏感並且釋放覓食花粉行為，，。Pankiw等(2004b)揭示出每日達到2，000幼蟲當量(1.12mg)的合成幼蜂信息素的蜜蜂蜂群體，持續28天。除增加花粉覓食者外，幼蜂信息素還顯著增加返回到蜂房中的花粉荷載的重量。信息素-處理的蜂群體中飼養了明顯更多的幼蜂且從該幼蜂中出現的成年蜜蜂增加。在2，000個幼蟲當量的生物現實劑量下，幼蜂信息素補充了工蜂以便在早於對照蜂群的年齡下成為莧食者(Pankiw等，2004a);在6,200個幼蟲等量劑量下，幼蜂信息素延緩了職蟲成為覓食者的補充(LeConte等，2000)。儘管接觸幼蜂信息素一般降低了首次覓食的年齡，但是在在其咽下腺體中具有極高蛋白質含量的專門組工蜂中延緩了覓食的開始(Pankiw等，2004a)。這種高蛋白質水平表示與對照蜂群體相比幼蜂飼養行為的可能性和相應對幼蟲飼餵幼蟲的較高蛋白質質量增加。Pankiw(2004b)發現在接觸2，000個幼蟲當量的合成幼蜂信息素1小時內花粉覓食者蔚非花粉覓食者之比增加。來自信息素-處理的風蜂群體的覓食者恢復的花粉荷載重於來自對照風插盤的覓食者，並且這種花粉43%以上可能來源於這些蜂群體置於其中確保傳粉的目標作物。可以探訪和傳粉的花多於花粉覓食者的花蜜覓食者在其體上具有多於來自未處理的對照風蜂群體的花蜜覓食者的花粉粒。這些非花粉覓食者具有的花粉可能有54%以上來源於非來自對照蜂群體的花蜜覓食者具有的花粉的目標作物。通過增加花粉覓食者和非花粉覓食者的活動，幼蜂信息素具有顯著增加用於對目標作傳粉的蜂群體有效性的潛能。養蜂人通常在冬季或春季早期提供蛋白質補充劑以便促進蜂群體生長(Herbert1992)。通常將抗生素與蛋白質補充劑作為對細菌性疾病的預防劑。因為產生信息素的幼蟲在冬季晚期和春季早期不存在或水平最低，在蜂群體中施用幼蜂信息素抗禦刺激蛋白質和抗生素食物補充劑的消耗以及咽下腺體發育和蛋白質生物合成。Page和Pankiw(2002)教導了"合成幼蜂信息素易於氧化並且必須儲存在低氧條件下，優選在-20"C下並且最優選在-70。C下，條件是將其儲存任意長的時間期限"。甚至冷凍也不可能穩定信息素。例如，蜜蜂幼蟲的粗提取物在實驗室冷藏箱內僅3個月後就失去了所有的信息素活性(T.Pankiw，TexasA&MUniversity,未公布的觀察結果)。因此，儘管是在冷凍條件下，但是摻入天然或合成信息素的任何商品幾乎不具有貯存期限。由於認為合成信息素存在不穩定性，所以研究人員通常每天提供其通常在玻璃平板上使用新鮮信息素的實驗蜜蜂(Pankiw等，1998;Pankiw和Page2001;Page和PanHw2002;Pankiw和Rubink2002;Pankiw等，2004b)。在操作應用中，每日施用信息素不切實際和昂貴並且不會消除對儲存過程中冷凍的需求。發明概述本發明涉及穩定蜜蜂幼蜂信息素的方法，所述的幼蜂信息素由由成分組成兩種或更多種長鏈羧酸，例如C16-C2G長度的羧酸或其曱酯類或乙酯類，特別是長鏈羧酸或其甲酯類或乙酯類，特別是亞油酸乙酯，亞麻酸乙酯，油酸乙酯，棕櫚酸乙酯，硬脂酸乙酯，亞油酸曱酯，亞麻酸甲酯，油酸曱酯，棕櫚酸甲酯和硬脂酸曱酯中的兩種或更多種，該方法通過將抗氧化劑摻入信息素來進行。所述的抗氧化劑可以為食品級抗氧化劑。特別地，所述的食品級抗氧化劑可以選自(但不限於)丁羥茴醚，丁羥甲苯，叔丁基氫醌，聚丙二醇，檸檬酸和維生素E及其衍生物(生育酚類)或所述抗氧化劑中兩種或更多種的任意組合。在該方法中，所述的抗氧化劑通過抑制亞油酸甲酯，亞麻酸曱酯，亞油酸乙酯，亞麻酸乙酯，油酸甲酯和油酸乙酯分解起作用。本發明在另一個方面中涉及用於對蜜蜂或蜜蜂群體施用的組合物，它由亞油酸乙酯，亞麻酸乙酯，油酸乙酯，棕櫚酸乙酯，硬脂酸乙酯，亞油酸甲酯，亞麻酸曱酯，油酸曱酯，棕櫚酸曱酯，硬脂酸甲酯中的兩種或更多種和選自(但不限於)丁羥茴醚，丁羥甲苯，叔丁基氫醌，聚丙二醇，檸檬酸和維生素E及其衍生物(生育酚類)的一種或6多種食品級抗氧化劑組成。組合物中成分的重量比可以為亞油酸乙酯(O.1-50%)，亞麻酸乙酯(1.3-50%),油酸乙酯(0.8-50%)，棕櫚酸乙酯(O.3-50%)，硬脂酸乙酯(0.7-50%),亞油酸甲酯(0.2-50%),亞麻酸甲酯(0.2-50%)，油酸曱酯(0.3-50%)，棕櫚酸曱酯(0.3-50%)，硬脂酸甲酯(1.7-50%)和抗氧化劑(0.001-50%)。可以將如所述的組合物對蜜蜂，蜜蜂群體或惰性物質中的傳粉單元施用，所述的惰性物質選自石蠟，植物蠟，蜂蠟，二氧化矽，氧化鋁，纖維素，改性纖維素(紙和紙製品)，乾燥的植物組織，木材或合成聚合物。所述的方法和組合物可以用於增加工蜂之間花粉與非花粉覓食者之比，或用於降低或延緩工蜂首次覓食的年齡，或可以用於增加返回到覓食花粉的工蜂群體中的花粉荷載重量，或用於增加非覓食花粉工蜂體攜帶的花粉粒數量，或用於增加接近放置蜜蜂群體或傳粉單元或其內的目標作物的傳粉，或用於刺激工蜂幼蜂食物咽下腺發育和腺體蛋白質產生，或用於刺激蜜蜂消耗食物蛋白或其它食物成分和抗生素^卜充劑。在該方法中，將所述的組合物連續施用於蜜蜂群體約2周或2周以上期限可以用於增加所述蜂群體內飼養的蜜蜂數量或用於抑制蜜蜂從蜂群體中逃逸(分蜂)。在該方法中，可以將所述的組合物與施用於蜜蜂，蜜蜂群體或傳粉單元或需要增強傳粉的開花植物的合成蜜蜂王后下頜腺信息素一起施用於蜜蜂，蜜蜂群體或傳粉單元。附圖圖1例證了與在20'C下接觸2周後的額外相同未穩定製品相比，在室溫(約20°C)下接觸空氣後0時和2周時使用抗氧化劑穩定劑配製的油酸甲酯(1)，亞油酸甲酯(2)和亞麻酸曱酯(3)摻合物的氣相色譜描記圖。圖2例證了與在20C下接觸2周後的額外相同未穩定製品相比，在室溫(約2ox:)下接觸空氣後0時和2周時使用抗氧化劑穩定劑叔丁基氫醌配製的油酸乙酯(1)，亞油酸乙酯(2)和亞麻酸乙酯(3)摻合物的氣相色鐠描記圖。圖3例證了與在2ox:下接觸20周後的額外相同未穩定製品相比，在室溫(約20。C)下接觸空氣後20周後使用抗氧化劑穩定劑叔丁基氫醌配製的油酸乙酯(1)，亞油酸乙酯(2)和亞麻酸乙S旨(3)摻合物的氣相色鐠描記圖。圖4例證了與在20X:下接觸72周後的額外相同未穩定製品相比，在室溫(約20C)下接觸空氣後72周後使用抗氧化劑穩定劑叔丁基氫醌配製的油酸乙酯(l),亞油酸乙酯(2)，亞麻酸乙酯(3)，棕櫚酸乙酯(4)和硬脂酸乙酯(5)摻合物的氣相色譜描記圖。發明詳述蜜蜂覓食信息素易於氧化並且在室溫下不穩定，快速失活並且如果將其長期儲存，那麼必須保存在低氧條件下且優選保存在極低溫度，例如-70X:下。在正常條件下，任何基於信息素的產品幾乎均沒有貯存期限並且缺乏商業活力。因此，處在研究中使用信息素外，信息素無法在商業上應用。我們發現可以通過將抗氧化劑，特別是食品級抗氧化劑摻入信息素將蜜蜂幼蜂信息素穩定較長時間期限。可以將穩定的幼蜂信息素製品遞送至惰性物質上的蜂房。如果單獨使用或與蜜蜂王后下頜腺信息素一起使用，那麼幼蜂信息素可以改善工蜂的性能並且增強蜂房的總體活力。本發明在一般意義上涉及使用一種或多種可接受的抗氧化劑，尤其是一種或多種食品級抗氧化劑，包括(但不限於)丁羥茴醚，丁羥甲苯，叔丁基氫醌，聚丙二醇，檸檬酸和維生素E及其衍生物穩定蜜蜂幼蜂信息素的方法。可以以連續方式將包括抗氧化劑的IO種成分信息素製品遞送至惰性物質上的蜂房。通過使用抗氧化劑穩定劑叔丁基氫醌，我們發現明顯不穩定的信息素成分，特別是亞油酸曱酯，亞麻酸甲酯，亞油酸乙酯和亞麻酸乙酯，而且包括油酸甲酯和油酸乙酯保持72個月完整。我們還發現使用叔丁基氫醌穩定的製品保持了231天的生物活性，而未穩定的制刑在123天後幾乎失去了所有生物活性。我們進一步發現穩定的幼蜂信息素增加工蜂中的覓食花粉並且刺激花粉食物消耗。最後，我們發現使用工業級成分的穩定的幼蜂信息素製劑與試劑級製品具有相同的生物作用，其中該組合物與使用試劑級成分獲得的天然組合物稍有不同。這類耐久性和堅固性能夠研發和持續利用基於使用食品級抗氧化劑穩定的幼蜂信息素的商品。本發明還涉及組合物，其中將由棕櫚酸曱酯，棕櫚酸乙酯，硬脂酸甲酯，硬脂酸乙酯，油酸甲酯，油酸乙酯，亞油酸甲酯，亞油酸乙酯，亞麻酸甲酯和亞麻酸乙酯中的兩種或更多種組成的IO種信息素成分以有效量與食品級抗氧化劑，包括(但不限於)丁羥茴醚，丁羥甲苯，叔丁基氫醌，聚丙二醇，檸檬酸和維生素E及其衍生物一起配製。可以將這些組合物遞送至惰性物質上的蜜蜂蜂房內的蜜蜂，所述的惰性物質包括(但不限於)石蠟，植物蠟，蜂蠟，二氧化矽，氧化鋁，纖維素，改性纖維素(紙和紙製品)，乾燥的植物組織，木材或合成聚合物。這些組合物可以用於操縱工蜂的行為，包括(但不限於)增加花粉與非花粉覓食者之比，降低首次覓食的年齡，誘導覓食行為，刺激花粉釆集和將花粉轉運回蜂房，刺激補充食物成分和抗生素消耗，抑制分蜂和改善目標作物傳粉。穩定的信息素組合物還可以用於刺激咽下食物腺體發育和產生蛋白質。穩定的幼蜂信息素組合物與蜜蜂往後下頜腺信息素聯合應用可以用於改善蜂房內的條件並且增強目標作物的傳粉。實施例1製品由於汙染蜂蜜的可能性，所以僅將食品級抗氧化劑視為可能的穩定劑。使用叔丁基氫醌作為測試穩定劑配製如下比例(重量/重量百分比)和如下用量的幼蜂信息素棕櫚酸甲酯3%(0.0225g)，棕櫚酸乙酯3%(0.0225g)，硬脂酸甲酯17%(0.1275g),油酸曱酯924.95%(0.1871g)，硬脂酸乙酯7%(0.0525g)，油酸乙酯8%(0.0600g)，亞油酸曱酯2%(0.0150g)，亞油酸乙酯1%(0.0075g),亞麻酸甲酯21%(0.1575g),亞麻酸乙酯13°/。(0.0975g)和叔丁基氫醌0.05%(0.0004g)。在約20。C下以上述次序使用磁攪拌器混合成分並且摻合至均勻，產生O.75g產品。實施例2化學穩定性進行短期和長期穩定性研究，其中按照與實施例l近似相同比例混合可能不穩定的幼蜂信息素成分的簡化摻合物。對油酸曱酯，亞油酸甲酯和亞麻酸曱酯和油酸乙酯，亞油酸乙酯和亞麻酸乙酯的摻合物進行2周期限的短期評價，它們各自包含和不包含叔丁基氫醌。照2周實驗所述，使用相同的摻合物進行20周測試，但72-周測試向其相應摻合物中添加了適當比例的棕櫚酸曱酯和棕櫚酸乙酯和硬脂酸甲酯和硬脂酸乙酯。將約250mg摻合物放入安裝了具有1mm直徑孔的擴散插入螺旋帽(AgilentTechnologies)的4mL(15x45mm)塑料瓶(ChromatographicSpecialties)中，以使空氣在樣品上循環。將所有摻合物連續保存在30X:的恆溫下。為了通過毛細管氣相色i普法進行分析，將約lmg摻合物溶於lmL乙醚並且分析1pL每種提取物的等分部分。在0時並且在30'C下接觸空氣指定期限後，使用安裝了火焰離子化檢測器和30m長BPX-70毛細管柱(J&WScientific)的HewlettPackardHP5890氣相色鐠儀進行分析。注射器和檢測器溫度分別為260。C和285°C。溫度程序為以5。C/分鐘從80。C24分鐘升至200。C且然後以20。C/分鐘3分鐘升至260°C。對甲酯類和乙酯類給出2周結果(圖1和2)，而僅對乙酯類給出長期20-周和72-周結果(圖3和4)。對甲酯類的長期結果實際上與乙酯類的那些結果相同。2周後，使用叔丁基氫醌穩定的摻合物中的甲酯類的比例組成與在0時未穩定的摻合物中相同(圖1)。然而，在未穩定的摻合物中，210周後，亞油酸曱酯的量下降了85°/。並且亞麻酸甲酯的量減少了90%。由於其它成分分解，所以油酸甲酯的比例組成從佔總摻合物的48%升至82%。使用乙酯類在2周後獲得了類似的結果。亞油酸乙酯的量下降了74%，並且亞麻酸乙酯的量減少了94%，而油酸乙酯從佔總摻合物的40%升至66%(圖2)。這些結果表明亞油酸甲酯和亞油酸乙酯和亞麻酸甲酯和亞麻酸乙酯在室溫下快速分解並且在2-4周後可能導致整個信息素摻合物的生物活性完全缺失。結果還表明如不進行穩定，那麼任何幼蜂信息素產品的貯存期限均可能是不可接受的短暫。在20。C下20和72周後，在穩定的摻合物中油酸乙酯，亞油酸乙酯和亞麻酸乙酯的比例組成(分別為圖3和4)基本上保持與2周接觸後穩定的摻合物相同(圖2)。相反，在20周後，儘管完全不存在其它兩種主要成分，但是在未穩定的摻合物中無亞油酸乙酯和亞麻酸乙酯保留，且油酸乙酯的量僅從佔總摻合物的37%適度升至43%(圖3)。這表明亞油酸乙酯和亞麻酸乙酯在20周接觸後完全分解並且還提示油酸乙酯部分分解。正如根據圖3中的結果預計的，在接觸室溫72周後無亞油酸乙酯或亞麻酸乙酯保留，表明這兩種信息素成分完全分解(圖4)。棕櫚酸乙酯和硬脂酸乙酯的百分比組成分別從8%和23%升至20%和57°/。，提示72周後無分解。然而，油酸乙酯的百分比從24%下降至10°/。。這種下降與20周後的結果共同證實油酸乙酯在未穩定的製品中緩慢分解。這些結果表明使用叔丁基氫醌穩定幼蜂信息素在1年以上未導致任何不穩定的信息素成分分解。即使在72周後也缺乏分解的輕度指示(圖4)提示穩定的信息素製品的貯存期限至少為2年。這是證明商品研發的足夠長的期限。實施例3通過蔗糖反應閾值測定的穩定的幼蜂信息素的壽命在將1滴蔗糖溶液施用於觸角時蜜蜂通過伸展吻突作出反射性反應。這稱作對蔗糖的吻突伸展反應閾值(PER-RT)測定法。該測定法由0.1，0.3，1,3，IO和30。/。(wt/vol)的蔗糖濃度系列組成，相當於-l，-0.5，0,0.5，l和l.5的對數系列。使每隻蜜蜂的觸角於1滴蔗糖接觸一次。將導致吻突伸展的最低濃度解釋為各蔗糖反應閾值的估計值(Page等，1998;Pankiw和Page1999)。將來自使用遞增濃度蔗糖的PER測定的結果轉化成蔗糖得分。PER得分與各蜜蜂的反應閾值直接相關，因為大部分蜜蜂在開始的反應後持續對所有增加濃度的蔗糖起反應。PER得分為6(其中每隻蜜蜂在PER測定中從0，1°/。蔗糖開始對所有6種蔗糖濃度起反應)代表反應閾值低於得分為1(其中每隻蜜蜂僅對30°/。蔗糖起反應)300倍。每隻蜜蜂的反應閾值(RT)為進入與莧食行為(Pankiw和Page2000)和年齡(Pankiw和Page1999;Pankiw2003)相關的感覺神經系統的"窗口"並且受到幼蜂信息素調節(Pankiw和Page2001，2003)。我們使用針對蔗糖的PER-RT測定法作為評價在室溫下儲存不同期限的穩定幼蜂信息素的生物活性的一種方法。來自至少6個不相關的"野生型"來源的蜜蜂在維持在33'C和55%RH下的孵育箱內從其幼蜂中形成3h。將300隻新形成的蜜蜂隨機放入有機玻璃金屬絲網籠(14.6x10x7.7cm)。給籠子提供30%蔗糖溶液，可隨意飲水並且在上述孵育箱條件下伺養。隨機選擇各個籠子用於下列處理1)在室溫下儲存的未穩定的幼蜂信息素，2)使用叔丁基氫醌穩定並且儲存在室溫下的幼蜂信息素，3)新鮮製備的未穩定的幼蜂信息素和4)不使用信息素的對照品。製備的信息素的組成為亞油酸乙酯1%，亞麻酸乙酯13%,油酸乙酯8%，棕櫚酸乙酯3%，硬脂酸乙酯7%，亞油酸甲酯，2%，亞麻酸甲酯21°/。，油酸甲酯25%,棕櫚酸甲酯3%和硬脂酸甲酯17%。信息素-處理的籠子接受300個幼蟲當量(LEq)/天(1:1的幼蜂信息素與蜜蜂之比)。用異丙醇配製信息素，使得以約15^L溶液遞送300LEq。對照籠子每日接受等體積的異丙醇。每日在蒸發異丙醇後在玻璃平板(7x8cm)上遞送相應的處理。將蜜蜂如上述銅養6天且然後如上所述測試其蔗糖反應闊值。在製備未穩定和穩定的幼蜂信息素製品後48，123和231天時實施該方案。在處理之間，4吏用Kruskal-Wal1is和Mann—WhitneyU檢驗比較得分。穩定的幼蜂信息素表現出與新鮮配製的幼蜂信息素無差別的生物活性(表1)。接觸穩定幼蜂信息素的蜜蜂始終表現出高於對照籠子中未接觸蜜蜂至少1.75倍的蔗糖反應閾值。另外，接觸未穩定幼蜂信息素的在室溫下儲存48，123和231天的蜜蜂的蔗糖反應性與未基礎信息素的蜜蜂的蔗糖反應性無顯著性差異。這些結果表明穩定的幼蜂信息素在室溫下儲存時表現出長期生物活性。這種生物活性在統計學上與使用新鮮配製的幼蜂信息素誘導的生物活性相同。這些結果還表明向IO種信息素成分中添加叔丁基氫醌對信息素的生物活性無影響。表1.儲存在室溫下的未穩定和穩定的幼蜂信息素與新鮮配製的幼蜂信息素作為保持在無信息素對照環境中的蜜蜂的蔗糖反應性百分比的生物活性。低於各值的概率表示蔗糖反應性與無信息素的對照環境中蜜蜂的蔗糖反應性類似。在室溫下的天未穩定的幼蜂穩定的幼蜂信新鮮配製的未穩數信息素％息素％定的幼蜂信息素4817.088.178.7(p>0.05)(p<0.01)(p0,05)(p<0.001)(p0.05)(p<0.0001)(p<0.0001)實施例4由試劑級和工業級脂肪酸酯類配製的幼蜂信息素釋放蜜蜂花粉覓食所有在先的幼蜂信息素製品均由大於99%純度的由Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)提供的試劑級化合物組成。試劑級化合物最常用作化學鑑定中，用於化學合成或任意其它純度必不可少的應用中的標準品。然而，純度的量與化合物的成本成正比。降低幼蜂13信息素的成本的一種方式在於使用較低純度工業級成分配製它。儘管使用工業級成分使得成本顯著下降，但是需要權衡。工業級成分衍生自含脂肪酸摻合物的天然來源，但它們並非天然幼蜂信息素的確切比例。我們推斷接觸由試劑級或工業級成分配製的幼蜂信息素的蜜蜂對花粉的覓食水平高於不接觸信息素的蜜蜂。本實驗在2005年6月7日重複6次。隨機選擇典型蜜蜂蜂群體接受如下處理之一1)對照組，空白玻璃平板，2)使用叔丁基氫醌穩定的試劑級幼蜂信息素，或3)類似穩定的工業級幼蜂信息素。使用叔丁基氫醌按照表2中指定的比例配製信息素摻合物。將總計1.I2mg總酯類施用於玻璃平板(20cmx10cm)並且將平板放入蜂群體的幼蜂群體區域中心。1小時後，我們進行5分鐘返回花粉和非花粉覓食者的進入計數。可觀察到花粉覓食者非常明顯，因為在稱作冬孢的後足專門區域上的體外攜帶有花粉。在作物中內部攜帶有液體載荷，諸如花蜜和水，但未明顯觀察到。當載荷的類型，存在或不存在未明顯觀察到時，將這類返回的蜜蜂歸類為非花粉覓食者。觀察者使用手提式計數器，一隻手用於花粉覓食者，而一隻手用於非花粉覓食者。每小時由兩個不同的人對每一蜂群體測定兩次，共2小時，每個蜂群體總計45分鐘計數。進行計數的人對處理方式並不了解。使用列聯表分析分析計數的數據。與不使用信息素的空白對照相比，工業級(義2=7.0，df-l，P<0.01)和試劑級(5C2=15.0，df-l，P<0.Q001)製品顯著誘導進入蜂群體的較高的花粉與非花粉覓食者之比(表3)。試劑級製品釋放的花粉覓食者比例稍高於工業級製品(x2=3.9,df=1，P=0.048)。兩個相關發現來源於本研究。第一，兩個等級的穩定的幼蜂信息素均能夠誘導覓食花粉增強。第二，工業級配製的幼蜂信息素增加的花粉覓食者比例超過了不使用信息素的對照處理約116°/。，僅低於由試劑級製品誘導的3.5%。因此，以僅7%的試劑級製品的成本，工業級配製的使用叔丁基氫醌穩定的幼蜂信息素看起來為有效和經濟的富有活力產品。表2.試劑級和工業級幼蜂信息素製品tableseeoriginaldocumentpage153.5分鐘內進入蜂群體的花粉與非花粉覓食者之比tableseeoriginaldocumentpage151列聯表分析概率，其中檢驗假設在於對照組與處理組之比相等。實施例5花粉食物消耗的剌激本實驗從2004年3月1日到15日進行。隨機選擇來自TexasA&MUniversity養蜂廠的12個典型蜂群體。通過使用分成正方形部分6.45cm2的格估計蜂群體測量值。將蜜蜂覆蓋的面積轉化成蜜蜂數量；約1.5隻蜜蜂/cm2(Pankiw和Page2001;Pankiw和Rubink2002)。測定稱作共同幼蜂的卵，幼蟲和蛹佔據的幼蜂面積。隨機選擇6個蜂群體每日接受3個幼蟲當量/蜜蜂/天(1.55pg/蜜蜂/天)的幼蜂信息素處理並且6個蜂群體接受空白玻璃平板。已知3個幼蟲當量/蜜蜂/天的劑量可增加大蜂群體中覓食花粉的量(Pankiw和Page2001)。給每個蜂群體供應商購花粉食物補充劑形狀如兩片刻痕蠟紙之間漢堡包樣小餡餅的450g幼蜂Builder(Dadant&Sons,Hamilton,IL)。將新鮮的小餡餅放置在上述消耗的餡餅上。對15天蜂群體而言每隔3天檢查一次小餡餅的消耗。給完全消耗上述小餡餅的蜂群體提供新的小餡餅。在7和15天時進行蜂群體測定。所有蜂群體均接受新鮮花粉補充劑小餡餅，與第7天時所用的量無關。除去未消耗的舊小餡餅並且稱重以便估計消耗量。方差分析用於比較信息素處理的和對照蜂群體。不必進行協方差分析，因為在實驗開始時蜜蜂的數量和幼蜂，花粉，蜂蜜和空單元格所用的幼蜂空間的量在處理組之間無顯著性差異(P〉0.0"。在第l和第2周中使用幼蜂信息素處理的蜂群體消耗的花粉補充劑明顯多於對照蜂群體(表4)。在第1周中處理之間的幼蜂面積無差異化,=0.3,P>0.05)。在第2周中，在幼蜂信息素處理組中幼蜂面積明顯較大(F:，u=10.6，P<0.01;表2)。這些結果表明穩定的幼蜂信息素可以用於刺激食物消耗，導致幼蜂產生增加，由此可以導致蜂群體活力更強。還可以通過將食物補充劑或抗生素摻入花粉小餡餅或其它食物來源來利用增加的食物消耗。16表4.接觸幼蜂信息素的蜜蜂蜂群體與未基礎的對照蜂群體之間花粉消耗和幼蜂面積的比較tableseeoriginaldocumentpage17參考文獻美國專利文獻Page,R.E.Jr.andT.Pankiw.2002.Syntheticbeepollenforagingpherorao加andusesthereof.U.S.Pal,No.2002/0182977Al.其它公開文獻Filmer,ItS.1932.Broodareaandcolonysizeasfactorsinactivityofpollinationunits.J.Econ.Entomol.25:336>343.Free,J.B.1967.Factorsdetermmingthecollectionofpollenbyhoneybeeforagers.Anhn，Behav.15:13"44.HerbertE.W.1992.Honeybeenutrition.Pp.197-233.In:Grah柳，J,M.(ed.).Thehiveandthehoneybee.Rev.Ed.Dadant&Sons,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