一種多肽、蛋白類藥物口腔黏膜吸收劑型的組方及製備方法和應用的製作方法

2023-12-02 15:02:46

專利名稱：一種多肽、蛋白類藥物口腔黏膜吸收劑型的組方及製備方法和應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種多肽、蛋白類等大分子藥物經口腔黏膜遞藥的藥劑組方及製備方 法和應用。
背景技術：
隨著基因工程藥物研究的進展，蛋白和多肽藥物作為很有潛力的一類藥物，在臨 床治療中發揮著越來越重要的作用。然而，由於胃腸道蛋白酶對蛋白和多肽藥物的水解作 用，這些藥物基本口服無效。臨床上蛋白和和多肽類藥物最常用的給藥方式是注射給藥。當 蛋白和多肽藥物用於治療慢性疾病時，如用胰島素治療糖尿病，長期注射給藥很不方便，給 患者帶來極大的不便和痛苦。因此，研發蛋白和多肽類藥物的各種非注射給藥劑型是藥物 研發領域的的熱點，受到高度重視。蛋白和多肽藥物的非注射給藥途徑大都屬於透黏膜吸 收，主要包括肺吸入劑、口服製劑、黏膜給藥製劑。其中口腔頰黏膜給藥製劑以其突出的優 勢，受到研究者的關注。頰黏膜吸收表面積大，通透性良好，蛋白酶活性較低，血管豐富，是 多肽、蛋白類藥物較適合的給藥途徑；頰黏膜給藥可避免多肽、蛋白類藥物在胃腸道的降解 和在肝臟的首過效應；口腔黏膜遞藥系統方便給藥，且病人易於接受，具有較高的順應性。 然而，由於多肽、蛋白類藥物分子量較大，如胰島素分子量接近6000，親水性強，正常生理條 件下很難透過口腔黏膜吸收入血，因此如何提高該類藥物在頰黏膜處的通透性，提高藥物 的生物利用度，是研發多肽、蛋白類藥物口腔頰黏膜製劑首先需要解決的關鍵問題。影響藥物經口腔黏膜滲透吸收的口腔黏膜滲透障礙主要包括口腔黏膜膜包裹顆 粒、蛋白酶、唾液三方面的因素。口腔頰黏膜上皮的滲透障礙主要源自上皮的上三分之一到四分之一。有報導稱藥 物(包括大分子如辣根過氧化酶和小分子如鑭鹽)通過口腔黏膜滲透吸收的主要阻礙，是 從膜包裹顆粒排出的物質，這些物質主要包括極性脂質(磷脂、膽固醇脂和糖基神經醯胺)寸。對於酶不穩定的藥物(蛋白質及肽類)，口腔內存在的酶對藥物滲透吸收也有一 定的影響。與鼻腔給藥、陰道給藥和直腸給藥相比，藥物對口腔黏膜內的蛋白水解酶敏感性 低很多。但是，有文獻報導，口腔黏膜中的酶確實限制了蛋白質及肽類物質的吸收，比如在 正常狀態下，倉鼠口腔內胰島素的降解顯著大於糖尿病狀態時的降解，且廣譜酶抑制劑杆 菌肽可以抑制各種蛋白水解酶活性。到目前為止，陸續發現的存在於動物口腔黏膜的酶主 要有氨基肽酶、二肽基肽酶和二肽基羧肽酶、羧肽酶、醯胺酶、肽鏈內切酶、亮氨酸氨肽酶和 一些特異性的酯酶。有報導指出氨基肽酶是口腔黏膜裡唯一具有活性的肽酶，而肽鏈內切 酶和羧肽酶沒有活性。正常口腔內唾液由99. 5%的水和少量蛋白質、糖蛋白和電解質組成，其中鉀離子 濃度為血漿的7倍，碳酸氫鹽、鈣、磷濃度為血漿的3倍，鈉離子濃度為血漿的十分之一。正 常唾液的PH是5. 6-7，分泌速率約為l-2mL/min。唾液中含有a_澱粉酶(可裂解1_4糖苷
3鍵)、溶解酵素(溶解細菌細胞壁)和舌脂肪酶(分解脂肪)。口腔黏膜60%表面與唾液相 接觸，其厚度大約為70 ym，是口腔黏膜表面的不流動層。由於唾液的清除吞咽作用，使藥物 在口腔內的滯留時間太短，限制了藥物的滲透吸收量。因此，唾液對藥物的清除作用也不容 忽視。藥物的理化性質也是影響藥物經口腔黏膜滲透吸收的另一主要因素。口腔黏膜吸 收遵循PH分配學說，而大部分藥物屬於弱電解質。藥物的相對分子質量、解離度及脂溶性 大小都會影響藥物的滲透吸收。細胞間隙的非薄層狀液相脂質和細胞膜的脂溶性，使脂溶 性較高的藥物幾乎可以暢通無阻的滲透，但是對於肽、蛋白類等親水性藥物，其吸收速度與 分子量大小有關，分子量小於100D的物質可以快速滲透吸收，滲透性隨藥物分子量增大而 急劇下降。因此，由於口腔內環境的滲透障礙和多肽、蛋白類藥物本身的影響，該類藥物通過 口腔黏膜滲透吸收非常有限。如何提高大分子親水性藥物的滲透吸收程度是口腔黏膜遞藥 系統研究領域面臨的重大困難，目前最常用的方法是加入促吸收劑。一個理想的促滲透吸收劑應該具備以下特點有效、安全、化學惰性、無生物活性、 作用可逆性等。傳統的促滲透吸收劑可分為表面活性劑、非離子型表面活性劑、膽汁酸鹽、 螯合劑等等，詳見表1。新型促吸收劑也層出不窮，包括殼聚糖衍生物、各種小分子肽、氨基 酸等。促吸收劑的作用大小受很多因素的影響，如藥物的理化性質、遞藥載體的組成、黏膜 組織是否用促吸收劑預處理過等。現在的研究認為，促滲透吸收劑發揮促吸收作用的機制 有以下幾點(1)減少粘液層的粘滯性，有助於藥物經旁細胞轉運，增加藥物進入組織的比例。 如月桂氮卓酮(Azone)。(2)提取但不破壞細胞間隙的脂質，與上皮的蛋白質區域相互作 用，提高膜流動性有助於藥物的跨細胞轉運。如十二烷基硫酸鈉(SDS)。(3)增加藥物在口 腔黏膜的滯留時間。如殼聚糖是一種生物相容性好，可降解的高分子聚合物，具有良好的生 物粘附性，可增加藥物在口腔黏膜表面的滯留時間，並可幹擾細胞間隙脂質的結構排列，進 而減少唾液對藥物的清除，增加藥物滲透吸收的能力。(4)幹擾細胞間脂質的排列，瞬間增 加細胞間隙。乙醇具有吸取口腔黏膜脂質的功能，油酸可增加細胞間隙脂質的流動性，促進 藥物在皮膚的滲透吸收。然而到現在，仍沒有任何一個含有促滲透吸收劑的口腔黏膜藥物 上市。這主要是因為促滲透吸收劑刺激性問題，還缺乏令人滿意的研究結果。促滲透吸收 劑的長期安全性實驗，包括作用是否可逆性，有無毒性，作用靶點的選擇性等等，都需要研 究者們做進一步的研究。對於多肽、蛋白類藥物，一方面需要提高其在口腔黏膜的滲透吸收能力，另一方 面，不能忽視藥物對口腔內蛋白水解酶的敏感性。口腔內蛋白水解酶的活性大小與迴腸中 的差不多。有研究指出，在白兔的口腔黏膜組織勻漿中，0.01%抑酞酶可減少70%-80%胰 島素和胰島素前體藥的降解。目前，研究中使用的酶抑制劑主要有抑酞酶(屈來塞多)、 抑氨肽酶素、嘌呤黴素、牛膽酸鈉鹽和苄澤35等。另外口腔黏膜給藥劑型的研究也日趨白熱化，包括片劑、貼劑、粉劑、噴霧劑、水凝 膠、脂質體、溶液劑、微球和咀嚼膠等。硝酸甘油舌下片需要在口腔內溶解後才能被吸收， 這使得藥物在口腔內停留時間較短，易被唾液清除，且因為味覺而影響病人的順應性。噴 霧劑、咀嚼膠作用時間短暫，若不加入理想的促滲透吸收劑則多肽、蛋白類藥物很難發揮療效。傳統的片劑採用壓片法製備，結構緻密，不利於藥物的釋放，限制了藥物的吸收。貼劑 載藥量受限，應用不廣。基於上述理論和實踐，我們通過TR146 口腔黏膜上皮細胞滲透轉運模型，篩選了 一系列安全有效的促滲透吸收劑，可顯著促進多肽、蛋白類藥物經口腔黏膜的滲透吸收，有 望提高該類藥物經口腔黏膜吸收的生物利用度。凍幹法製備口腔粘附雙層片，其海綿樣多 孔狀結構有利於藥物的釋放，粘附片防水層和粘附層的雙層設計，避免了藥物的損失，且該 法製備的肽、蛋白類藥物口腔粘附片方便保存，穩定性好。

發明內容
本發明的目的是提供一種新型的多肽、蛋白類藥物口腔粘附雙層片，粘附層由多 肽及蛋白類藥物、促滲透吸收劑、蛋白酶抑制劑、生物粘附劑、添加劑組成，防水層由乙基纖 維素組成，使得該粘附片可避免藥物在口腔環境內的損失，提高肽類、蛋白類藥物經口腔粘 膜遞藥的生物利用度。該口腔粘附雙層片通過凍幹法製備，不損失該類藥物的生物活性，且 其海綿樣多孔狀結構有利於藥物的釋放，使得該口腔粘附片的穩定性增加。為了實現上述目的，本發明採取如下的技術解決方案。粘附層的組方為多肽及蛋白類藥物、促滲透吸收劑、蛋白酶抑制劑、生物粘附劑、 添加劑。防水層的組方組成乙基纖維素。所述的多肽及蛋白類藥物為天然提取的、人工合成的、基因重組的多肽及蛋白類 藥物。所述的促滲透吸收劑為以下幾類(1)藥物及食物成分類，包括N-乙醯-L-半胱 氨酸(NAC)、滅特復星、18-0-甘草次酸(GA)、刺嫩芽中的皂苷類成分、辣椒素、啤酒花提 取物、毛果槭及高良姜；(2)小分子短肽類，包括蜂毒素、產氣莢膜梭菌腸毒素(CPE)、酪蛋 白磷酸肽(CPPs)、霍亂孤菌編碼的第二毒素Zot毒素、還原型穀胱甘肽(GSH)、跨膜蛋白 occludin的兩個胞外泮多肽及脂肽類衍生物如C14-0P90-103 ； (3)殼聚糖及其衍生物類； (4) 一氧化氮供體，包括硝普鈉(SNP)、L-精氨酸(L-Arg)、N0C5和N0C12 ； (5)膽酸鹽類，包 括脫氧膽酸鈉(SDC)、甘氨膽酸鈉、甘氨脫氧膽酸鈉；(6)脂肪酸及其衍生物，包括肉豆蔻酸 酯，月桂酸酯、軟脂基肉毒鹼；(7)螯合劑，包括水楊酸鈉、EDTA ； (8)表面活性劑，包括合成 表面活性劑如月桂基硫酸鈉、各種烷基糖苷，非離子型表面活性劑如月桂氮酮(Azone)、月 桂醇聚醚_9、月桂醇聚醚-4、吐溫80、吐溫20、PEG-8月桂酸酯、PEG-4月桂酸酯、甘油單月 桂酸酯、4-椰纖維烷基嗎啉衍生物；(9)其他，包括大豆卵磷脂(SPC)、糖酯、月桂醯胺丙基 甜菜鹼、磷脂醯肌醇、磷酸卵磷酯、氨基已酸、聚丙烯酸、透明質酸酶、軟骨素酶、卵清酸、環 糊精。所述的蛋白酶抑制劑為抑酞酶(屈來塞多)、抑氨肽酶素、嘌呤黴素、牛膽酸鈉鹽和苄澤35。所述的生物粘附劑為天然高分子材料明膠、果膠、阿拉伯膠、海藻酸鈉、殼聚糖及 其衍生物等，合成高分子材料有丙烯酸聚合物卡波姆、羧甲基纖維素鈉、羥丙基甲基纖維 素、羥乙基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇。所述的添加劑為矯味劑、抗氧劑、抑菌劑、著色劑。所述的矯味劑為薄荷醇、木糖醇、山梨醇。
所述的抗氧劑為生育酚、2，6-叔丁基-4-甲基-苯酚。所述的抑菌劑為尼泊金甲酯和尼泊金乙酯。所述的著色劑為天然著色劑辣椒紅、甜菜紅、紅曲紅、胭脂蟲紅、高粱紅、葉綠素銅 鈉、薑黃、桅子黃、胡蘿蔔素、藻藍素、可可色素、焦糖色素；合成色素胭脂紅、莧菜紅、日落 黃、赤蘚紅、檸檬黃、新紅、靛藍、亮藍、二氧化鈦(白色素)。所述的防水層乙基纖維素為用乙醇或丙酮溶解的適當濃度的乙基纖維素溶液。本發明所設計的多肽、蛋白類藥物口腔粘附片組方成分比例為藥物_5%，促 滲透吸收劑_5%，蛋白酶抑制劑_5%，矯味劑0. 1% _2%，抗氧劑0. 1% -2%、著色 劑0. _2%，生物粘附劑80% -96%。本發明所設計的多肽、蛋白類藥物口腔粘附片，每片80-100mg，厚度3_5mm，主藥 2mg。藥物及輔料粉末平均顆粒在0. 2-150um時較好，0. 5-100um更好，l_20um之間最好。生產過程稱取並且過篩材料，將各種輔料溶液混合均勻，倒入模具中。將模具放 入_20°C冰箱預凍24h，然後用冷凍乾燥機凍幹24h，去除溶液中的溶劑成分，即得到口腔粘 附片粘附層。接著，在其上面塗抹防水層，防水層為10%乙基纖維素溶液(用無水乙醇或者 製備)，室溫下放置至無水乙醇完全蒸發，即得到口腔粘附雙層片，置於乾燥器皿中4°C冰 箱保存。本發明優選的促滲透吸收劑為N-乙醯-L-半胱氨酸、水溶性殼聚糖及其衍生物、 一氧化氮供體、小分子肽還原型穀胱甘肽、月桂氮酮、大豆卵磷脂及上述任意兩種的混合 物。N-乙醯-L-半胱氨酸使用量為1. 25 % -8 %，最優為5 %，不能少於1 %，不能超過10 %。 水溶性殼聚糖及其衍生物使用量為0. 5 % -5 %，最優為3 %，不能少於0. 1 %，不能超過5 %。 一氧化氮供體使用量為1 % _6 %，最優為3 %，不能少於1 %，不能超過10 %。還原型穀胱甘 肽和月桂氮酮使用量均為_5%，最優為5%，不能少於1%，不能超過6%。大豆卵磷脂 使用量為3% -8%，最優為5%，不能少於3%，不能超過10%。本發明優選的粘附層生物粘附材料為殼聚糖及其衍生物、果膠、海藻酸鈉、卡 波姆934P及其不同比例的混合物。殼聚糖及其衍生物、果膠可單用，也可混合，比例為 1:4-4: 1，最佳為1 4。海藻酸鈉與殼聚糖的比例為1 4-4 1，最佳為4 1。卡 波姆934P可單用，也可與海藻酸鈉混合，最優為與海藻酸鈉混合，最佳比例為1 3。本發明優選的蛋白酶抑制劑為抑酞酶，使用量為_5%，最優為2.5%。本發明優選的矯味劑為薄荷醇，使用量為0. 1% _2%，最優為1%。本發明優選的抗氧劑為生育酚，使用量為0. 1% _2%，最優為0. 5%。本發明優選的著色劑為二氧化鈦，使用量為0. 1% _2%，最優為1%。本發明優選的抑菌劑為尼泊金乙酯，使用量為0. 1% -0. 3%，最優為0. 2%。本發明設計的多肽、蛋白類藥物口腔粘附片的製備中，對藥物混合溶液的pH值有 一定規定，應根據藥物的穩定性來確定，最佳PH為6. 5，最好不要超過8，不要低於5。本發明所設計的多肽、蛋白類藥物口腔粘附片，可用於多種疾病的治療，長期用 藥，安全可靠。本發明的特點是所述的多肽、蛋白類藥物口腔粘附片，適應於多種藥物，新穎的 處方設計及備工藝，提高了該類藥物經口腔黏膜吸收的生物利用度和該類藥物製劑的穩定 性。其優點是(1)本發明選擇的促滲透吸收劑安全有效，可顯著促進該類藥物經口腔黏膜的吸收；(2)該口腔粘附片處方組成簡單，原料易得，成本低廉，凍幹法製備工藝簡單；(3) 雙層設計及多孔結構避免了藥物損失，利於藥物的釋放。由此可見，本發明所述的多肽、蛋 白類藥物口腔粘附片既保留了該類藥物的生物活性，又解決了該類藥物穩定性差、生物利 用度低的問題，並首次採用凍幹法製備口腔粘附片，為該類藥物非注射製劑的研究奠定了 ■石出。因此，本發明所述的多肽、蛋白類藥物口腔粘附片，是一種新型的口腔黏膜遞藥系 統，可用於各種多肽及蛋白類藥物，為該類藥物非注射製劑的研究提供了新的思路，具有廣 闊的市場開發前景和臨床應用前景。


下面結合實施例附圖對本發明做進一步說明。圖1為不同濃度N-乙醯基-L-半胱氨酸(NAC)對胰島素經TR146 口腔黏膜上皮 細胞滲透轉運的影響。圖2為不同濃度一氧化氮供體硝普鈉(SNP)對胰島素經TR146 口腔黏膜上皮細胞 滲透轉運的影響。圖3為不同濃度還原型穀胱甘肽(GSH)對胰島素經TR146 口腔黏膜上皮細胞滲透 轉運的影響。圖4為不同濃度L-精氨酸(Arg)對胰島素經TR146 口腔黏膜上皮細胞滲透轉運 的影響。圖5為不同濃度殼聚糖(CS)、殼聚糖(CS)/月桂氮酮(Azone)混合物對胰島素經 TR146 口腔黏膜上皮細胞滲透轉運的影響。圖6為不同濃度大豆卵磷脂(SPC)、大豆卵磷脂(SPC)/月桂氮酮(Azone)、大豆卵 磷脂(SPC)/殼聚糖(CS)混合物對胰島素經TR146 口腔黏膜上皮細胞滲透轉運的影響。圖7為胰島素口腔粘附雙層片的製備方法示意圖。圖8為胰島素口腔粘附雙層片的掃描電鏡照片。圖9為F1、F2、F3、F4組胰島素口腔粘附片的體外釋放度。表1為各促滲透吸收劑對胰島素經TR146 口腔黏膜上皮細胞滲透轉運的影響。表2為不同濃度的各促滲透吸收劑對TR146細胞相對酶活性的影響。表3為F1、F2、F3、F4組胰島素口腔粘附片的體外粘附力。表4為F1、F2、F3、F4組胰島素口腔粘附片的體外溶脹率。
具體實施例方式下列實施例用以幫助描述如何實施本發明的各種實施方案。這些實施例是為了舉 例說明，而不是以任何方式限定本發明的範圍。本發明提供了篩選促滲透吸收劑的方法。本發明還提供了製備多肽、蛋白類藥物口腔粘附片的方法。本發明還提供了評價多肽、蛋白類藥物口腔粘附片的方法。以下實施例均是以胰島素作為實驗藥物，其他多肽、蛋白類藥物口腔粘附片同樣 按照以下方法進行實驗。
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第1步，通過146 口腔黏膜上皮細胞滲透轉運模型和豬口腔黏膜滲透轉運模型篩 選可促進胰島素經口腔黏膜滲透的促滲透吸收劑。第2步，通過MTT實驗和MTS/PMS實驗，檢測各種所篩選的促滲透吸收劑對TR146 細胞的毒作用，以評價各種促滲透吸收劑的安全性。第3步，按照設計的處方比例，製備胰島素的混合溶液，控制溶液的pH值。第4步，凍幹法製備胰島素口腔粘附片。將胰島素混合溶液倒入模具中，-20°C冰 箱預凍24h，然後凍幹24h，去除溶液中的溶劑成分，即得到胰島素口腔粘附片粘附層。接 著，在其上面塗抹防水層，防水層為10%乙基纖維素溶液(用無水乙醇或者製備)，室溫下 放置至無水乙醇完全蒸發，即得到口腔粘附雙層片，置於乾燥器皿中4°C冰箱保存。第5步，測定胰島素口腔粘附片的粘附力和體外釋放度。第6步，胰島素口腔粘附片藥效學檢測實施例1篩選促滲透吸收劑採用TR146 口腔黏膜上皮細胞滲透轉運模型進行促吸收研究。吸去插入式培養 皿上下各室的DMEM培養液，用HBSS緩衝液清洗TR146細胞。然後在上、下腔室分別加入 HBSS溶液，平衡lh後，吸出上室HBSS溶液，加入2mL供試液(含有不同濃度的促滲透吸 收劑)。按設定時間從下室取樣100 yL，並立即補充等量HBSS溶液。採用色譜方法，進樣 分析，記錄得到的峰面積(A)，計算各時間點胰島素的累積滲透量。根據得到的數據計算 以下指標①胰島素表觀滲透係數Papp = dQ/dtXl/(AXC0)；②胰島素通過插入式培養皿 (無細胞時)的滲透係數Pins = dQ/dtXl/(AXCQ)；③胰島素回收率Recovery)= (XKeceiver+XD。n。r+XFilter) X 100/X0 ；④細胞滲透係數1/Papp= 1/P。+1/Pins ；⑤促吸收增強比率 ER = Pc(enhancer)/Pc(control)。其中dQ/dt表示穩態的滲透速率，A是指滲透面積(cm2)，C0是指 上腔室胰島素的起始濃度，XEeceiver指實驗結束時下腔室累計的胰島素量，XDonor指實驗結束 時上腔室剩餘的胰島素量，XFiltCT指實驗結束後插入式培養皿上殘餘的胰島素量，Pc指胰島 素通過細胞的滲透係數，Pins指無細胞時插入式培養皿的滲透係數，Pc(enhancer)和P。(。。ntraU分 別指NAC存在和不存在時，胰島素跨越細胞TR146的細胞滲透係數。結果見圖1、圖2、圖3、 圖4、圖5、圖6、表1。圖1為不同濃度N-乙醯基-L-半胱氨酸(NAC)對胰島素經TR146 口腔黏膜上皮細 胞滲透轉運的影響。從圖中可以看出，10%、5% NAC均可顯著促進胰島素經口腔黏膜上皮 細胞的滲透轉運，與對照組相比具有統計學差異，且其促吸收作用具有明顯的濃度依賴性。圖2為不同濃度一氧化氮供體硝普鈉(SNP)對胰島素經TR146 口腔黏膜上皮細胞 滲透轉運的影響。從圖中可看出，5%、1% SNP均可顯著促進胰島素經口腔黏膜上皮細胞的 滲透轉運，與對照組相比具有統計學差異。圖3為不同濃度還原型穀胱甘肽(GSH)對胰島素經TR146 口腔黏膜上皮細胞滲透 轉運的影響。從圖中可看出，5% GSH均可顯著促進胰島素經口腔黏膜上皮細胞的滲透轉 運，與對照組相比具有統計學差異。圖4為不同濃度L-精氨酸(Arg)對胰島素經TR146 口腔黏膜上皮細胞滲透轉運 的影響。從圖中可看出，5% Arg均可顯著促進胰島素經口腔黏膜上皮細胞的滲透轉運，與 對照組相比具有統計學差異。圖5為不同濃度殼聚糖(CS)、殼聚糖(CS)/月桂氮酮(Azone)混合物對胰島素經TR146 口腔黏膜上皮細胞滲透轉運的影響。從圖中可看出，5% CS,5% CS/1 % Azone,5% CS/5% Azone均可顯著促進胰島素經口腔黏膜上皮細胞的滲透轉運，與對照組相比具有統 計學差異。圖6為不同濃度大豆卵磷脂(SPC)、大豆卵磷脂(SPC)/月桂氮酮(Azone)、大豆卵 磷脂(SPC)/殼聚糖(CS)混合物對胰島素經TR146 口腔黏膜上皮細胞滲透轉運的影響。從 圖中可看出，5% SPC,5% SPC/1% Azone,5% SPC/1% CS均可顯著促進胰島素經口腔黏膜 上皮細胞的滲透轉運，與對照組相比具有統計學差異。表1為各促滲透吸收劑對胰島素經TR146 口腔黏膜上皮細胞滲透轉運的影響。實施例2促滲透吸收劑的細胞毒作用用指數增長期的TR146細胞，製備2 X 104cells/mL單細胞懸液，每孔100 u L接種 於96孔板。48h後補充培養液80 u L，然後給予20 y L不含胰島素的供試液，供試液製備方 法同2. 2。孵育48h後，進行MTT檢測，檢測波長490nm。以未被處理的細胞酶活性為100%， 計算供試液處理過的細胞酶活性。計算公式相對酶活性(％) = (ODrOD^/^-OD^^D! 是指用供試液處理過的細胞0D值，0D2是指沒有細胞僅有供試液的0D值，0D3指未處理過 的細胞0D值，0D4是指無細胞無供試液時空白孔的0D值。本實驗每組重複6孔。結果見表 2。表2為不同濃度的各促滲透吸收劑對TR146細胞相對酶活性的影響。從表中可以 看出，SDC、Arg 組、5% Gin、Azone、SDC、SNP、Arg 組禾口 5% CS/5% Azone 混合組均顯著 降低TR146細胞的相對酶活性，與對照組相比，具有統計學差異。其餘各組細胞相對酶活性 變化不大，與對照組相比無統計學意義，表明對TR146細胞的毒性較小，可作為安全有效地 促滲透吸收劑用於藥物製劑的研發。實施例3胰島素口腔粘附片的製備胰島素口腔粘附片的處方組成(mg/片) 按照表中處方設計，將各種輔料溶液混合均勻，倒入模具中。將模具放入-20°C冰 箱預凍24h，然後用冷凍乾燥機凍幹24h，去除溶液中的溶劑成分，即得到胰島素口腔粘附 片粘附層。接著，在其上面塗抹防水層，防水層為10%乙基纖維素溶液(用無水乙醇製備)， 室溫下放置至無水乙醇完全蒸發，即得到胰島素口腔粘附雙層片，置於乾燥器皿中4°C冰箱 保存。製備流程見圖7。圖7為胰島素口腔粘附雙層片的製備方法示意圖。圖8為胰島素口腔粘附雙層片的掃描電鏡照片。如圖8C所示，胰島素口腔粘附雙 層片具有多孔狀結構，這與傳統藥片的緻密非孔狀結構相比，有顯著的差異。粘附層表面孔 徑直徑在30iim-120iim之間(見圖8A)，內部孔徑直徑較為均一，約150 y m。防水層乙基
9纖維素和粘附層緊密結合，有效封閉了粘附層表面的孔狀結構，使胰島素單向釋放成為可 能(如圖8B所示)。實施例4胰島素口腔粘附片體外粘附力、體外溶脹率、體外釋放度的測定採用自製裝置測定粘附力，選用雞蛋殼膜作為生物膜材，取新鮮生雞蛋傾出內容 物後小心剝去外面的硬殼，所得的新鮮雞蛋殼膜即可作為供試膜材。所測粘附力結果見表 3。取各處方粘附片6片，放入溶出度儀的轉籃中，稱定各初始重量^。然後，把轉籃 放入900mL人工唾液的溶出杯中，用水浴保持恆溫37士0. 1°C，轉速lOOr/min。於開始實驗 後0. 5、1、2、3、4、6、8h時取出，用濾紙吸乾網籃周圍的水分，稱量重量W，計算不同時間各粘 附片的溶脹百分率。溶脹百分率Ep的計算公式為Ep= [(W-WJ/WJXIOO^。以溶脹百分 率Ep對時間t進行線性回歸計算溶脹速率。所測體外溶脹率見表4。將待測處方片劑按中國藥典(2005年版II部附錄XC)規定的槳法進行實驗。溫 度為(37士0. 5) °C，溶出介質為lOOmL人工唾液，轉速100r/min，於0. 5、1、2、4、6、8、10h定 時取樣lmL，濾過同時立即補加等量同溫溶出介質。取出的樣品液於214nm處測定吸收度， 用標準曲線計算累積釋放度。所測體外釋放度見圖9。表3為F1、F2、F3、F4組胰島素口腔粘附片的體外粘附力。表4為F1、F2、F3、F4組胰島素口腔粘附片的體外溶脹率。圖9為F1、F2、F3、F4組胰島素口腔粘附片的體外釋放度。 表1.各促滲透吸收劑對胰島素滲透吸收的影響(x士s，n = 3)
與對照組相比*P < 0. 05
表2.促滲透吸收劑對TR146細胞相對酶活性的影響(x士s，n = 6)
與對照組相比*P < 0. 05
表3.胰島素口腔黏附片體外黏附力(x士s，n = 3)
表4.胰島素口腔黏附片的體外溶脹百分率和溶脹速率(x士s，n = 3)
權利要求
本發明涉及一種多肽、蛋白類等大分子藥物經口腔黏膜遞藥的藥劑組方及製備方法和應用。此種藥劑由下列組分組成多肽、蛋白類藥物、促滲透吸收劑、生物黏附劑、蛋白酶抑制劑、添加劑。此種藥劑是具有粘附層、防水層的口腔粘附雙層片，製備工藝為冷凍乾燥法。
2.根據權利要求1所述的藥物，其特徵在於所述的多肽和蛋白類藥物，可為天然提 取、人工合成、基因重組的各種分子量的多肽和蛋白類藥物。
3.根據權利要求1所述的促滲透吸收劑，其特徵在於所述的促滲透吸收劑為①藥物 及食物成分類，包括N-乙醯-L-半胱氨酸(NAC)、滅特復星、18- 0 -甘草次酸(GA)、刺嫩芽 中的皂苷類成分、辣椒素、啤酒花提取物、毛果槭及高良姜；②小分子肽類，包括蜂毒素、產 氣莢膜梭菌腸毒素(CPE)、酪蛋白磷酸肽(CPPs)、霍亂孤菌編碼的第二毒素Zot毒素、還原 型穀胱甘肽(GSH)、跨膜蛋白occludin的兩個胞外泮多肽及脂肽類衍生物如C14-0P9(l_1(l3及 人工合成的短肽；③殼聚糖及其衍生物類；④一氧化氮供體，包括硝普鈉(SNP)、L-精氨酸 (L-Arg)、N0C5和N0C12 ；⑤膽酸鹽類，包括脫氧膽酸鈉(SDC)、甘氨膽酸鈉、甘氨脫氧膽酸鈉； ⑥脂肪酸及其衍生物，包括肉豆蔻酸酯，月桂酸酯、軟脂基肉毒鹼；⑦螯合劑，包括水楊酸 鈉、EDTA ；⑧表面活性劑，包括合成表面活性劑如月桂基硫酸鈉、各種烷基糖苷，非離子型表 面活性劑如月桂氮酮(Azone)、月桂醇聚醚_9、月桂醇聚醚-4、吐溫80、吐溫20、PEG_8月桂 酸酯、PEG-4月桂酸酯、甘油單月桂酸酯、4-椰纖維烷基嗎啉衍生物；⑨其他，包括大豆卵磷 脂(SPC)、糖酯、月桂醯胺丙基甜菜鹼、磷脂醯肌醇、磷酸卵磷酯、氨基己酸、聚丙烯酸、透明 質酸酶、軟骨素酶、卵清酸、環糊精等。
4.根據權利要求1所述的生物粘附劑，其特徵在於所述的生物粘附劑分為天然高分 子材料明膠、果膠、阿拉伯膠、海藻酸鈉、殼聚糖及其衍生物等，合成高分子材料丙烯酸聚合 物卡波姆、羧甲基纖維素鈉、羥丙基甲基纖維素、羥乙基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二
5.根據權利要求1所述的蛋白酶抑制劑為抑酞酶(屈來塞多)、抑氨肽酶素、嘌呤黴 素、牛膽酸鈉鹽和苄澤35。
6.根據權利要求1所述的添加劑為矯味劑、著色劑、抗氧劑、抑菌劑。所述的矯味劑為 薄荷醇、木糖醇、山梨醇。所述的著色劑分為天然著色劑辣椒紅、甜菜紅、紅曲紅、胭脂蟲紅、 高粱紅、葉綠素銅鈉、薑黃、桅子黃、胡蘿蔔素、藻藍素、可可色素、焦糖色素；合成色素胭脂 紅、莧菜紅、日落黃、赤蘚紅、檸檬黃、新紅、靛藍、亮藍、二氧化鈦(白色素)。所述的抗氧劑 為生育酚，2，6-叔丁基-4-甲基-苯酚。所述的抑菌劑為尼泊金甲酯和尼泊金乙酯。
7.根據權利要求1所述的多肽、蛋白類藥物口腔粘附片的製備方法，其特徵在於所述 的粘附片為雙層結構，所述的製備方法為冷凍乾燥法。生產過程稱取並且過篩材料，將各種 輔料溶液混合均勻，倒入模具中。將模具放入-20°C冰箱預凍24h，然後凍幹24h，去除溶液 中的溶劑成分，即得到口腔粘附片粘附層。接著，在其上面塗抹防水層，防水層為10%乙基 纖維素溶液(用無水乙醇或者製備)，室溫下放置至無水乙醇完全蒸發，即得到口腔粘附雙 層片，置於乾燥器皿中4°C冰箱保存。
8.根據權利要求1所述的多肽、蛋白類藥物口腔粘附片的應用，其特徵在於根據所制 備藥物的不同，可用於多種疾病的治療，長期用藥，安全可靠。
全文摘要
本發明涉及一種多肽、蛋白類等大分子藥物經口腔黏膜遞藥的藥劑組方及製備方法和應用。此種藥劑由下列組分組成多肽、蛋白類藥物、促滲透吸收劑、生物黏附劑、蛋白酶抑制劑、添加劑。此種藥劑是具有粘附層、防水層的口腔粘附雙層片，製備工藝為冷凍乾燥法。此種藥劑適於各種蛋白、多肽類藥物。其要解決的關鍵問題是提高多肽、蛋白類藥物經口腔黏膜吸收的生物利用度，增加多肽、蛋白類藥物製劑的穩定性，為開發新型多肽、蛋白類藥物非注射給藥製劑奠定基礎。
文檔編號A61K38/02GK101843595SQ200910023349
公開日2010年9月29日 申請日期2009年7月16日 優先權日2009年7月16日
發明者侯徵, 周穎, 孟靜茹, 羅曉星, 薛小燕, 陳瑛瑛 申請人:中國人民解放軍第四軍醫大學