一種美人蕉莖尖組織培養的方法

2023-12-02 20:32:31 1

專利名稱：一種美人蕉莖尖組織培養的方法
技術領域：
本發明涉及植物組織培養技術、植物莖尖培養技術，主要是一種美人蕉莖尖組織培養的方法。
背景技術：
美人蕉(Canna indica)，別名蘭蕉、曇華，為美人蕉科、美人蕉屬植物，多年生球根草本花丼，原產於美洲熱帶和非洲等地。美人蕉株高可達100 180cm,叢生,葉片大、葉片顏色豐富，花大，花色豔麗、顏色多樣，花期長，是一種非常優良的園林綠化、景觀美化植物。美人蕉葉片可吸收二氧化硫、氯化氫等有害物質，葉片雖易受害，但可重新長出新葉，很快恢復生長，也因此可作為監視有害氣體汙染指示植物，具有淨化空氣、保護環境作用。另外，美人蕉還可以用作藥物治療瘡瘍腫毒、子宮出血、白帶、急性黃膽等疾病。現在已有一些城市將美人蕉作為主要綠化植物進行種植，但是由於傳統繁殖方式種苗生產速度慢，嚴重限制了美人蕉大規模的應用。目前，美人蕉的繁殖主要通過種子及塊莖分株繁殖方式進行。但是目前市場需求大的品種基本上結實率很低、甚至不結實，種子數量有限，而通過塊莖分株方式繁殖受到材料本身狀態、生產季節及土地的限制，每年產量遠遠滿足不了市場的需求。同時，由于美人蕉長期繁殖材料長期處地下，容易 受到各種病毒的感染，由于美人蕉多採用無性繁殖，一旦感染便很難通過化學藥物根除。已有研究表明，美人蕉主要感染病毒包括美人蕉黃斑駁病毒、黃瓜花葉病毒、菜豆黃花葉病毒、西紅柿不育病毒及美人蕉黃色條紋病毒，嚴重降低了美人蕉的觀賞價值。植物莖尖培養被認為是目前最有效的植物脫毒材料獲得手段，目前國內外關于美人蕉不同品種快速繁殖報導極少，且增值效率低，最高僅為1.67，至于美人蕉莖尖培養研究，尚未見相關報導。

發明內容
本發明的目的在於克服現有技術存在的不足，而提供一種美人蕉莖尖組織培養的方法，解決美人蕉通過莖尖培養建立良好的美人蕉組培再生體系，為美人蕉脫毒培養、新品種培養及遺傳改良等做好技術支持。本發明的目的是通過如下技術方案來完成的。這種美人蕉莖尖組織培養的方法，該方法包括以下幾個步驟:I)、外植體的選取及處理:選取美人蕉地下帶有芽的根莖，將根莖表面根切除、附著物洗淨，然後將帶芽的根莖帶基部切成約Icm見方，基部厚度約0.5cm大小，作為組培用外植體。2)、莖尖剝離:無菌環境下，將經過消毒的外植體在解剖鏡下，先用低倍鏡一層一層剝離芽鱗，然後逐步增大放大倍數，繼續剝離芽鱗，最後在40 45倍鏡下切下0.2
0.5mm長的莖尖部分，最後切取莖尖的刀必須無菌且沒有切過任何植物材料。
3)、美人蕉莖尖培養:將切取的莖尖材料接種在莖尖培養用培養基為MS+6-BA0.1 0.5mg/L+NAA0.05 0.2mg/L+ 脯氨酸 50 200mg/L 中，培養條件為:24 + 2V,暗培養7 10d，然後將材料轉移至25±2°C，光照時間為12 14h/d，光照強度為45 60 μ.mol.m 2.s、4)、不定芽誘導及增殖:莖尖培養獲得的不定芽利用無菌的解剖刀將芽基部輕輕造成一些傷口，接種於不定芽誘導培養基中進行不定芽的誘導及增殖，不定芽誘導及增殖培養基為MS+6-BA2.0 6.0mg/L+CaCl250 800mg/L，培養溫度25±2°C，光照時間為12 14h/d,光照強度為 45 60 μ.mol.m 2.s 1O5)、不定芽生根誘導:從基部將高生長到3 5cm的叢生不定芽分開成單個不定芽，接入生根培養基中進行不定根的誘導，生根培養基為MS+IBA0 0.5mg/L或1/2MS+IBA0 0.5mg/L,培養溫度25±2°C，光照時間為12 14h/d，光照強度為45 60 μ.mo I^m2-S10 6)、組培苗馴化及移栽:不定芽基部長出2 3條I 2cm的不定根後，將組培移至溫室，散射光培養5d後打開瓶蓋，再培養I 2d，完成組培苗移栽前馴化，然後將組培苗從培養瓶取出，洗淨組培苗表面瓊脂，栽入基質中，保溼90 %以上培養15d，然後在溫室中正常培養。莖尖培養、不定芽誘導及增殖、不定芽生根誘導基本培養基均為MS培養基，蔗糖用量為25 30g/L，凝固劑為瓊脂粉，用量為8 9g/L，培養基pH分裝前調整為5.7 5.8 ;莖尖培養用培養基為MS+6-BA0.1 0.5mg/L+NAA0.05 0.2mg/L+脯氨酸50 200mg/L ;不定芽誘導及增殖培養基為MS+6-BA2.0 6.0mg/L+CaCl250 800mg/L ;生根培養基為MS+IBA0 0.5mg/L 或 1/2MS+IBA0 0.5mg/L ;莖尖培養環境為:24±2°C，暗培養 7 10d，然後將材料轉移至25±2°C,光照時間為12 14h/d,光照強度為45 60 μ *mol.πΓ2 s—1 ；不定芽誘導及增殖、不定芽生根培養條件為，培養溫度25±2°C，光照時間為12 14h/d，光照強度為45 60 μ.mol.m 2.s、起始外植體的選擇及處理，莖尖剝離、莖尖培養、不定芽誘導及增殖培養中CaCl2的應用、移栽前馴化過程及移栽後保溼90%以上培養15d。本發明有益的效果是:1、通過組織培養技術進行美人蕉種苗快繁，生產可以不受地區、季節及氣候限制，便於工廠化育苗，可根據訂單進行生產，生產時間及規模可控，為美人蕉的推廣應用提供充足的優質種苗保障。2、利用莖尖培養技術，可有效獲得無對美人蕉生長有嚴重影響病毒的脫毒植株，提高美人蕉的觀賞價值及經濟價值。3、繁殖係數達到不低於2.5，達到花卉種苗工廠化育苗生產的要求，目前已有關于美人蕉組織培養的文獻中，尚未見美人蕉增殖係數達到2的報導。4、美人蕉不定芽誘導採用直接器官發生，無愈組織傷誘導及愈傷分化誘導環節，減少植物組培過程中後代變異的發生，後代種苗遺傳背景一致，最大限度保持母本的優良性狀。5、有利於結實率低、甚至不結實的優良美人蕉品種的推廣。6、建立良好的組培快繁體系，為今後利用植物生物技術對美人蕉進行新品種培育、遺傳改良等研究工作奠定基礎。
具體實施例方式下面通過具體實施方式
對本發明作進一步闡述，實施例將幫助更好地理解本發明，但本發明並不僅僅局限於下述實施例。本發明所述的這種美人蕉莖尖組織培養的方法，該方法包括以下幾個步驟:1、培養基及培養條件:莖尖培養、不定芽誘導及增殖、不定芽生根誘導基本培養基均為MS培養基，蔗糖用量為25 3·0g/L，凝固劑為瓊脂粉，用量為8 9g/L，培養基pH分裝前調整為5.7 5.8 ;莖尖培養用培養基為MS+6-BA0.1 0.5mg/L+NAA0.05 0.2mg/L+脯氨酸50 200mg/L ;不定芽誘導及增殖培養基為MS+6-BA2.0 6.0mg/L+CaCl250 800mg/L ;生根培養基為MS+IBA0 0.5mg/L或1/2MS+IBA0 0.5mg/L ;莖尖培養環境為:24±2°〇，暗培養7 10(1，然後將材料轉移至25±21:，光照時間為12 14h/d，光照強度為45 60μ.mol.πΓ2.s_1 ;不定芽誘導及增殖、不定芽生根培養條件為，培養溫度25±2°C,光照時間為12 14h/d,光照強度為45 60 μ.mol.m_2.s'2、外植體的處理與消毒:選取美人蕉地下帶有芽的根莖，將根莖表面根切除、附著物洗淨，然後將帶芽的根莖帶基部切成約Icm見方，基部厚度約0.5cm大小，處理好的外植體用洗潔精溶液清洗20min，期間不斷輕輕攪拌，然後流水衝洗經洗潔精清洗的外植體材料20 30min，在已經過消毒的超淨工作檯上將流水清洗過的外植體轉移至無菌錐形瓶中，用75%酒精浸泡60s，期間不斷輕輕晃動錐形瓶，再用0.l%HgCl2溶液浸泡8 lOmin，或用有效氯濃度為l%NaC10溶液浸泡10 15min,浸泡期間不斷輕輕晃動錐形瓶,然後用無菌水清洗經過消毒處理的外植體4 5次，用無菌水浸泡、備用。3、美人蕉莖尖剝離:消過毒的超淨工作檯上，將經過消毒的外植體取出放在有無菌濾紙的接種盤中，在解剖鏡下，先用低倍鏡一層一層剝離芽鱗，逐步增大放大倍數，最後在40倍鏡下切下0.2 0.5mm長的莖尖部分，最後切取莖尖的刀必須沒有切過任何植物材料，將剝離莖尖培養到培養基後再從錐形瓶中挑取下一個外植體。4、美人蕉莖尖培養:將切取的莖尖材料接種在莖尖培養用培養基為MS+6-BA0.1 0.5mg/L+NAA0.05 0.2mg/L+ 脯氨酸 50 200mg/L 中，培養條件為:24 + 2V,暗培養7 10d，然後將材料轉移至25±2°C，光照時間為12 14h/d，光照強度為45 60 μ.mol.πΓ2.s_1,至莖尖長至I 2cm後進行不定芽誘導及增殖。5、不定芽誘導及增殖:莖尖培養獲得的不定芽利用無菌的解剖刀將芽基部輕輕造成一些傷口，接種於不定芽誘導培養基中進行不定芽的誘導及增殖，不定芽誘導及增殖培養基為MS+6-BA2.0 6.0mg/L+CaCl250 800mg/L，培養溫度25±2°C，光照時間為12 14h/d,光照強度為 45 60 μ.mol.m 2.s 1O6、不定芽生根誘導:從基部將高生長到3 5cm的叢生不定芽分開成單個不定芽，接入生根培養基中進行不定根的誘導，生根培養基為MS+IBA0 0.5mg/L或1/2MS+IBA0
0.5mg/L,培養溫度25±2°C,光照時間為12 14h/d,光照強度為45 60 μ.mol.πΓ2.s'7、組培苗馴化及移栽:不定芽基部長出2 3條I 2cm的不定根後，將組培移至溫室，散射光培養5d後打開瓶蓋，再培養I 2d，完成組培苗移栽前馴化，然後將組培苗從培養瓶取出，洗淨組培苗表面瓊脂，栽入基質中，保溼90%以上培養15d，然後在溫室中正常培養，成活率100%。最後，應當指出，以上實例僅是本發明較有代表性的例子。顯然，本發明的技術方案並不限於上述實例，還可以有許多變形，本領域的普通技術人員能從本發明公開的內容直接導出或聯想到的所有變形，均應認為是本發明的保護範圍。
權利要求
1.一種美人蕉莖尖組織培養的方法，其特徵在於:該方法包括以下幾個步驟: 1)、外植體的選取及處理:選取美人蕉地下帶有芽的根莖，將根莖表面根切除、附著物洗淨，然後將帶芽的根莖帶基部切成Icm見方，基部厚度0.5cm大小，作為組培用外植體； 2)、莖尖剝離:無菌環境下，將經過消毒的外植體在解剖鏡下，先用低倍鏡一層一層剝離芽鱗，然後逐步增大放大倍數，繼續剝離芽鱗，最後在40 45倍鏡下切下0.2 0.5mm長的莖尖部分，最後切取莖尖的刀必須無菌且沒有切過任何植物材料； 3)、美人蕉莖尖培養:將切取的莖尖材料接種在莖尖培養用培養基為MS+6-BA0.1 0.5mg/L+NAA0.05 0.2mg/L+ 脯氨酸 50 200mg/L 中，培養條件為:24±2 °C，暗培養7 10d，然後將材料轉移至25±2°C，光照時間為12 14h/d，光照強度為45 60 μ.mol.m 2.s 1 ； 4)、不定芽誘導及增殖:莖尖培養獲得的不定芽利用無菌的解剖刀將芽基部造成傷口，接種於不定芽誘導培養基中進行不定芽的誘導及增殖，不定芽誘導及增殖培養基為MS+6-BA2.0 6.0mg/L+CaCl250 800mg/L,培養溫度 25±2°C，光照時間為 12 14h/d,光照強度為45 60 μ.mol.πΓ2.s_1 ； 5)、不定芽生根誘導:從基部將高生長到3 5cm的叢生不定芽分開成單個不定芽,接入生根培養基中進行不定根的誘導，生根培養基為MS+IBA0 0.5mg/L或1/2MS+IBA0 0.5mg/L,培養溫度25±2°C,光照時間為12 14h/d,光照強度為45 60 μ.mol.πΓ2 *s_1 ； 6)、組培苗馴化及移栽:不定芽基部長出2 3條I 2cm的不定根後，將組培移至溫室，散射光培養5d後打開瓶蓋，再培養I 2d，完成組培苗移栽前馴化，然後將組培苗從培養瓶取出，洗淨組培苗表面瓊脂，栽入基質中，保溼90%以上培養15d，然後在溫室中正常培養。
2.根據權利要求1所述的美人蕉莖尖組織培養的方法，其特徵在於:莖尖培養、不定芽誘導及增殖、不定芽生根 誘導基本培養基均為MS培養基，蔗糖用量為25 30g/L，凝固劑為瓊脂粉，用量為8 9g/L，培養基pH分裝前調整為5.7 5.8。
全文摘要
本發明涉及一種美人蕉莖尖組織培養的方法，包括如下步驟培養基的配製、外植體的選取與消毒、莖尖剝離、莖尖培養、不定芽誘導及增值、不定芽生根誘導、組培苗馴化及移栽。基本培養基選用MS培養基，蔗糖25～30g/L，瓊脂粉8～9g/L，培養基pH5.7～5.8；莖尖培養用培養基為MS+6-BA0.1～0.5mg/L+NAA0.05～0.2mg/L+L-脯氨酸50～200mg/L；不定芽誘導及增殖培養基為MS+6-BA2.0～6.0mg/L+CaCl250～800mg/L；生根培養基為MS+IBA0～0.5mg/L或1/2MS+IBA0～0.5mg/L。本發明的優點建立的美人蕉組培快繁技術體系種苗繁殖速度快，健壯均勻，移栽成活率高，適合優良美人蕉種苗脫毒及規模化生產。
文檔編號A01H4/00GK103141389SQ20131007407
公開日2013年6月12日 申請日期2013年3月8日 優先權日2013年3月8日
發明者陳志 , 汪一婷, 牟豪傑, 呂永平, 周迪江, 陳劍平 申請人:浙江省農業科學院