胰島的分離方法

2023-05-29 11:26:46

專利名稱：胰島的分離方法
技術領域：
本發明涉及胰島移植中的重要技術的胰島的分離方法。進一步涉及在胰島的分離中能夠很好地使用的胰管內注入用保護液、二層法用胰臟保存液及胰島純化溶液。
背景技術：
對於處在不給與胰島素就不能維持生命的、所謂的胰島素依賴狀態的1型糖尿病患者，胰島移植技術備受社會的關注，主要在歐美，該技術正被確立為臨床的治療方法。
胰島移植是將生物體內在調節血糖方面發揮中心作用的細胞集團的胰島通過點滴注入到門靜脈內的細胞組織移植。胰島移植對接受移植者的侵襲小，被看成對於1型糖尿病患者來說是最近乎理想的治療方法。
2000年，報導了在Canada Edmonton的Alberta大學，臨床胰島移植的治療成功。自該報導以來，在4年多裡，以歐美為中心進行了約300例的胰島移植。這些胰島移植以在Alberta大學確立的、所謂的「Edmonton Protocol」為基礎來實施。
然而，在以往的技術中，即使在歐美進行的來自腦死亡供體的胰島移植中，也不能得到穩定的胰島收穫量，所移植的胰島有時也不能有效地發揮功能。進而，來自於較腦死亡供體條件差的心臟停止供體的胰島移植在世界上幾乎沒有成功例，來自心臟停止供體的胰島移植以往在事實上是不可能的。
為了提高胰島移植的成功率，而且為了使來自於心臟停止供體的胰島移植成功，大量移植適於移植的胰島是重要的。因此，為了使適於移植的胰島的收穫量提高，強烈要求改善胰島的分離技術。
另一方面，在移植醫療中，報導有向臟器移植後的臟器移植患者給予烏司他丁(Ulinastatin)或其替代物的方法(參照特開2002-20309號公報)。
此外，還報導有用於灌流或保存移植用臟器的溶液，在肺移植中確認了優異的效果(特開平6-40801號公報)。
然而，在胰島移植、特別是胰島的分離和純化技術中，能夠優選使用的方法尚不清楚。

發明內容
本發明的主要目的在於，提供能夠使適於移植的胰島的收穫量提高的、胰島的分離技術。
本發明人等以提高胰島的收穫量為主要目的，進行了各種研究，結果發現，通過使用特定的溶液和方法，適於移植的胰島的收穫量得到提高，進一步反覆進行精心研究，從而完成了本發明。
即，本發明涉及下述的分離方法和溶液。
第1項是胰島的分離方法，其包括如下工序將含有蛋白酶抑制劑的保護液注入到離體的胰臟的胰管內的工序(1)；將酶溶液注入到該注有保護液的胰臟中，將胰臟分解的工序(3)；以及將該分解得到的胰組織用含有密度梯度劑的純化溶液來純化的工序(4)。
第2項是如第1項所述的分離方法，其中，在工序(1)中，以每1克臟器重量為約0.1～10ml的量將上述保護液注入到胰管內。
第3項是如第1項或第2項所述的分離方法，其中，含有蛋白酶抑制劑的保護液的鉀濃度為約4～50mmol/L。
第3A項是如第1～3項中任一項所述的分離方法，其中，含有蛋白酶抑制劑的保護液進一步含有海藻糖。
第4項是如第1～3A項中任一項所述的分離方法，其中，進一步具有通過二層法保存注有保護液的胰臟的工序(2)。
換言之，胰島的分離方法包括如下工序將含有蛋白酶抑制劑的保護液注入到離體的胰臟的胰管內的工序(1)；通過二層法保存注有該保護液的胰臟的工序(2)；在保存後的胰臟中注入酶溶液，將胰臟分解的工序(3)；以及將該分解得到的胰組織用含有密度梯度劑的純化溶液來純化的工序(4)。
第5項是如第4項所述的分離方法，其中，工序(2)的二層法使用含有(i)全氟化碳(perfluorocarbon)液體和(ii)蛋白酶抑制劑的、鉀濃度為約4～50mmol/L的保存液。
第5A項是如第5項所述的分離方法，其中，(ii)的保存液進一步含有海藻糖。
第6項是如第1～5A項中任一項所述的分離方法，其中，工序(4)中的純化溶液進一步含有海藻糖。
第7項是如第1～6項中任一項所述的分離方法，其中，工序(4)中的密度梯度劑是碘克沙醇(Iodixanol)。
第8項是如第1～7項中任一項所述的分離方法，其中，工序(4)中的純化溶液進一步含有蛋白酶抑制劑。
第8A項是如第1～8項中任一項所述的分離方法，其中，蛋白酶抑制劑是選自烏司他丁、甲磺酸加貝酯和甲磺酸萘莫司他中的一種以上。
第9項是含有蛋白酶抑制劑的胰管內注入用保護液。
換言之，將含有蛋白酶抑制劑的保護液在胰島分離中注入到胰管內來使用的方法。
優選的是，蛋白酶抑制劑是選自烏司他丁、甲磺酸加貝酯和甲磺酸萘莫司他中的一種以上。
第10項是如第9項所述的保護液，其中，鉀濃度為約4～50mmol/L。
第10A項是如第9項或第10項所述的保護液，其中，進一步含有海藻糖。
第11項是二層法用胰臟保存液，其中，含有蛋白酶抑制劑，鉀濃度為約4～50mmol/L。
換言之，將含有蛋白酶抑制劑、鉀濃度為約4～50mmol/L的保存液用於胰島分離中利用二層法的胰臟保存的方法。
優選的是，蛋白酶抑制劑是選自烏司他丁、甲磺酸加貝酯和甲磺酸萘莫司他中的一種以上。
第11A項是如第11項所述的保存液，其中，進一步含有海藻糖。
第12項是含有密度梯度劑和海藻糖的胰島的純化溶液。
換言之，將含有密度梯度劑和海藻糖的溶液用於胰島分離中的胰島純化的方法。
第13項是如第12項所述的純化溶液，其中，密度梯度劑是碘克沙醇。
換言之，含有碘克沙醇和海藻糖的純化溶液。
第14項是如第12項或第13項所述的純化溶液，其中，進一步含有蛋白酶抑制劑。
換言之，如第12項或第13項所述的純化溶液，其中，含有密度梯度劑、海藻糖和蛋白酶。
優選的是，蛋白酶抑制劑是選自烏司他丁、甲磺酸加貝酯和甲磺酸萘莫司他中的一種以上。
本發明進一步包括如下方式。
第15項是具有下述工序的胰島的分離方法將含有胰蛋白酶抑制劑的組織保護或保存液注入到離體的胰臟的胰管內的工序(1)；將膠原酶溶液注入到上述注有保護或保存液的胰臟中，使胰臟膨脹的工序(2)；使該膨脹的胰臟內的溶液溫度升高，將膠原酶活化，將胰組織分解的工序(3)；
將分解得到的胰組織回收的工序(4)；從回收所得的胰組織中將胰島分離，並純化胰島的工序(5)。
第16項是如第15項所述的分離方法，其中，上述工序(5)具有下述工序(5-1)～(5-3)在將密度梯度劑添加到組織保護或保存溶液而成的純化溶液中，製作密度梯度的工序(5-1)；在製成密度梯度的純化溶液中，添加所回收得到的胰組織的工序(5-2)；將添加有胰組織的純化溶液離心分離，從胰組織中分離胰島，將胰島純化的工序(5-3)。
第17項是如第16項所述的分離方法，其中，上述工序(5-1)是下述工序(5-1』)在將胰蛋白酶抑制劑和密度梯度劑添加到組織保護或保存溶液而成的純化溶液中，製作密度梯度的工序(5-1』)。
第18項是如第16項或第17項所述的分離方法，其中，密度梯度劑是碘克沙醇。
第19項是如第15～18項中任一項所述的分離方法，其中，進一步具有下述工序將上述注有保護或保存液的胰臟保存在形成2層的容器中的工序(1-2)，所述2層為含有全氟化碳(perfluorocarbon)的層和含有含胰蛋白酶抑制劑的組織保護或保存液的層。
第20項是如第15～19項中任一項所述的分離方法，其中，胰蛋白酶抑制劑是烏司他丁。
第21項是如第15～20項中任一項所述的分離方法，其中，組織保護或保存液的鉀濃度為約4～50mmol/L。
第22項是將碘克沙醇添加到鉀濃度為4～50mmol/L的組織保護或保存液中而成的胰島純化溶液。
第23項是如第22項所述的純化溶液，其中，進一步添加胰蛋白酶抑制劑。
第24項是如第23項所述的純化溶液，其中，胰蛋白酶抑制劑是烏司他丁。
以下，對本發明進行更詳細的說明。
1.胰島的分離方法本發明的胰島的分離方法包括下述工序將含有蛋白酶抑制劑的保護液注入到離體的胰臟的胰管內的工序(1)；將酶溶液注入到該注有保護液的胰臟中，將胰臟分解的工序(3)；將該分解得到的胰組織用含有密度梯度劑的純化溶液來純化的工序(4)。
此外，本發明還包括進一步含有下述工序的方法通過二層法來保存注有保護液的胰臟的工序(2)。
I(1).將保護液注入到胰管內的工序本發明的分離方法包括將含有蛋白酶抑制劑的保護液注入到從供體摘出的胰臟的胰管內的工序。由於在胰管內注入含有蛋白酶抑制劑的保護液，所以確實地保護胰組織，使適於移植的胰島的收穫量得到提高。
保護液向胰管內的注入量可以根據臟器的狀態等進行適當設定，但每1克臟器重量為約0.1～10ml左右，優選為約0.1～2ml左右，進一步優選為約1～1.5ml左右。
注入該程度的量，能夠將保護液確實地遍及到胰臟整體的胰管，在提高質量好的胰島的收穫量方面是優選的。
蛋白酶抑制劑可以適當選定，但從胰島的收穫量更優異的觀點出發，特別優選選自烏司他丁、甲磺酸加貝酯和甲磺酸萘莫司他中的一種以上。
此外，從提高適於移植的胰島的收穫量的觀點出發，優選保護液為低鉀濃度。
具體而言，優選每1000ml保護液的鉀濃度為4～50mM，特別優選為10～50mM左右。
此外，從提高適於移植的胰島的收穫量的觀點出發，優選保護液含有海藻糖。
保護液注入的時刻可以適當設定，但優選儘量快，優選為胰臟離體後馬上注入。
保護液的注入方法可以適當設定，例如，將導管插入離體的胰臟中，在利用泵進行的調節注入壓的條件下，可以通過該導管進行注入。
插入的導管的數可以適當設定，優選為1根。由於設定為1根，所以能夠減少注入到臟器內的溶液的漏液，能夠更正確地進行液體的注入，還能夠減少臟器的損傷。
I(2).通過二層法保存的工序將保護液注入到胰管內之後的胰臟優選通過二層法來保存。
二層法可以如下進行將全氟化碳液體和保存液裝入容器內，形成二層後，將氧供給到容器內，在該容器中，將胰臟浸漬保存。全氟化碳液體與保存液的比例按體積比計為1∶1左右。氧的供給優選進行至少30分鐘以上。
由於通過二層法保存胰臟，可以高度維持組織的生存力。
二層法中使用的保存液優選含有蛋白酶抑制劑。由於設定為含有蛋白酶抑制劑的保存液，所以能夠使胰島的收穫量提高。
蛋白酶抑制劑可以適當選定，但從胰島的收穫量更優異的觀點出發，特別優選選自烏司他丁、甲磺酸加貝酯和甲磺酸萘莫司他中的一種以上。
此外，保存液優選為低鉀濃度。具體優選為4～50mmol/L左右，特別優選為10～50mmol/L左右。
由於保存液為低鉀濃度，所以能夠進一步使胰島的收穫量提高。
此外，保存液優選含有海藻糖。由於保存液含有海藻糖，所以能夠進一步使胰島的收穫量提高。
I(3).分解胰臟的工序注有保護液的胰臟或通過二層法保存的胰臟接著被分解胰組織。
分解、換言之為消化，例如，可以如下進行將酶溶液注入到胰臟的胰管內，使胰臟膨脹之後，提高酶溶液的溫度，從而使酶活化。
酶溶液的注入，例如可以如下進行在使用泵調節注入壓的條件下，將酶溶液注入到主胰管中。酶溶液的注入可以通過與注入保護液中所用的相同的導管來進行。
作為酶溶液，可以使用例如膠原酶溶液等。
將酶溶液注入到胰臟中之後，使用適當的裝置使溶液的溫度上升，從而可以開始分解。
例如，使用膠原酶溶液時，將膨脹而得的胰臟裝入Ricordi腔中，用溶液填滿用於分解的迴路，製成封閉系統。用泵使溶液循環，使溶液的溫度上升到體溫附近、37℃左右。由於溫度上升，注入到胰組織中的膠原酶活化，將形成細胞與細胞結合的組織的膠原酶溶解，從而分解胰組織。
分解的停止在如下時刻原樣保持構成胰島的細胞凝聚的形態，只有胰外分泌腺組織從胰島的周圍解離的時刻。
分解的停止也可以通過降低溶液的溫度來進行。此外，還可以通過添加血清蛋白、將酶滅活來進行。
例如，可以通過把迴路設為開放系統，將含有人清蛋白的室溫的溶液通過迴路內來進行。由於室溫的溶液通過，所以能夠降低溶液的溫度，還能夠稀釋酶，而且，由於加有血清蛋白，所以能夠降低酶的活性。
停止分解之後，回收胰組織。所回收的胰組織優選在純化之前用離心分離器進行離心洗淨，進行濃縮處置。
I(4).純化工序純化可以利用胰島的比重比胰外分泌腺組織的比重輕的性質來進行。例如，在形成密度梯度、換言之形成比重濃度梯度的溶液中，添加經分解的胰組織，用比重離心沉澱法將胰島和胰外分泌腺組織分離，從而可以進行胰島的純化。
例如，可以通過以下的步驟進行。
首先，在含有密度梯度劑的純化溶液中，形成密度梯度。
接著，在形成密度梯度的純化溶液中，添加經分解的胰組織。
接著，通過比重離心沉澱法，將添加有分解胰組織的純化溶液離心分離。通過離心分離，將胰島和外分泌腺組織分離，從回收的胰組織中分離胰島。
密度梯度劑優選可以製作粘度低的溶液的物質。優選的密度梯度劑可以舉出碘克沙醇(OptiprepTM)和N，N』-雙(2，3-二羥基丙基)-5-[N-(2，3-二羥基丙基)乙醯胺]-2，4，6-三碘代-間苯二甲醯胺(NycodenzR)。
此外，純化溶液優選進一步含有蛋白酶抑制劑。由於純化溶液含有蛋白酶抑制劑，所以能夠進一步提高胰島的收穫量。
密度梯度可以是連續密度梯度，也可以是非連續密度梯度，但從能夠回收更多的胰島的觀點出發，優選連續密度梯度。
密度梯度可以根據公知方法適當形成。此外，還可以使用適當的裝置，例如連續比重製作裝置。
此外，對於純化，也可以利用COBE2991那樣的血球洗淨裝置。
例如，在COBE2991內，利用密度梯度劑製作密度梯度，向其中添加經洗淨濃縮而得的分解胰組織，用連續比重離心沉澱法分離為胰島和外分泌腺組織之後，可以採取COBE2991內的溶液的各部份。用顯微鏡檢查分離後的液體，判定在哪部份中存在胰島，將胰島回收。
回收經純化的胰島後，一系列的分離操作結束。
II.胰管內注入用保護液本發明的保護液可以在胰島移植的胰島分離中、注入到胰管內來使用。此外，本發明的保護液可以優選用作上述本發明的分離方法中的含有蛋白酶的保護液。
本發明的保護液可以通過將蛋白酶抑制劑添加到組織保護或保存液中來得到。
II-1.蛋白酶抑制劑本發明中使用的蛋白酶抑制劑只要具有蛋白酶抑制活性，其由來和種類就不受特別限定，可以適當使用公知的物質，特別優選具有胰蛋白酶抑制活性的胰蛋白酶抑制劑。
蛋白酶抑制劑的例子包括選自烏司他丁(MiraclidTM)、4-[2-氨基乙基苯磺醯基]氟化物(AEBSF、PefablocTM)、甲磺酸加貝酯(FOYTM)、甲磺酸萘莫司他(FusanTM)中的一種以上。其中，從胰島的收穫量更優異的觀點出發，優選使用選自烏司他丁、甲磺酸加貝酯和甲磺酸萘莫司他中的一種以上。此外，從具有抗炎作用的觀點出發，優選烏司他丁和甲磺酸加貝酯。
蛋白酶抑制劑在保護液中的添加比例可以在發揮本發明效果的範圍內根據抑制劑的種類來適當設定。蛋白酶抑制劑如果是烏司他丁，則每1升為10000～100000U左右，優選為50000～100000U左右。此外，如果是甲磺酸加貝酯，則每1升為100～10000mg左右，優選為500～2000mg左右。
II-2.組織保護或保存液組織保護或保存液可以從用於保護或保存組織(包括臟器和細胞)的公知溶液中適當選擇。
例如，可以使用Euro-Collins液、UW液(University of Wisconsin液)、ET-Kyoto液、Low-Potassium Dextran Glucose液、HTK溶液(CustodiolTM)等。
此外，可以舉出具有下述組成的液體。
組織保護或保存液(例1)鈉(Na+)10～140mmol/L鉀(K+)4～140mmol/L鎂(Mg2+)0～4mmol/L鈣(Ca2+)0～2mmol/L磷酸(H2PO4-或HPO42-)12～65mmol/LCl-、HCO3-、CO32-、有機酸或有機酸陰離子15～150mmol/L羥乙基澱粉0～80g/L海藻糖0～240mmol/L組織保護或保存液(例2)鈉(Na+)10～140mmol/L鉀(K+)4～140mmol/L羥乙基澱粉0～80g/L穀胱甘肽0～10mmol/L腺苷0～10mmol/L乳糖酸鹽(Lactobionate)0～140mmol/L棉子糖(Raffinose)0～50g/L組織保護或保存液(例3)鈉(Na+)80～120mmol/L鉀(K+)4～50mmol/L葡糖酸鹽15～150mmol/L磷酸20～40mmol/L海藻糖80～160mmol/L(27～55g/L)羥乙基澱粉(HES)20～60g/LDibutyryl cAMP 0～10mmol/L硝化甘油0～1g/L
在上述示例的組織保護或保存液中，特別優選使用ET-Kyoto液和例1或例3中記載的液體。
II-3.胰管內注入用保護液的方式胰管內注入用保護液優選為低鉀濃度。具體地說，優選每1000ml保護液的鉀濃度為4～50mM，特別優選為10～50mM。
鉀的濃度低時，不會使脈管痙攣，能夠防止胰島素從胰島釋放，能夠使溶液快速到達組織的各處。可以更加提高胰管保護作用，能夠使適於移植的胰島的收穫量提高。
此外，胰管內注入用保護液的滲透壓優選為270～450mOsm/l，特別優選300～400mOsm/l。如果為該範圍，則可以防止組織在保護或保存中發生膨脹或收縮。
此外，胰管內注入用保護液的pH優選為7～8左右，以防止細胞或組織的酸性分解等。
此外，胰管內注入用保護液優選含有海藻糖。由於含有海藻糖，所以對於胰管的保護作用更高，能夠使胰島的收穫量提高。海藻糖存在有α，α-海藻糖、α，β-海藻糖和β，β-海藻糖這3種，可以使用任何一種，也可以使用它們的混合物。優選使用天然存在的α，α-海藻糖。
海藻糖的濃度在1000ml保護液中為0～400mmol，特別是50～240mmol，進一步為80～160mmol左右。
進而，胰管內注入用保護液只要無損本發明的效果，則可以進一步含有其他成分。作為其他成分，可以舉出各種電解質、糖質、胺基酸、藥物製劑、維生素等。
此外，還可以含有dibutyryl cAMP等AMP或ATP等細胞賦活劑、前列腺素、硝化甘油等血管擴張劑、抗生物質、腺苷、N-乙醯基-L-半胱氨酸、甘氨酸、抗壞血酸、谷醯胺、煙醯胺、穀胱甘肽、棉子糖等。
本發明的胰管內注入用保護液優選方式的例子包括至少以下述比例含有下述成分的液體
鈉80～120mmol/L鉀4～50mmol/L葡糖酸鹽15～150mmol/L磷酸20～40mmol/L海藻糖80～160mmol/L羥乙基澱粉(HES)20～60g/L烏司他丁10000～100000U/L本發明的胰管內注入用保護液對胰管的保護作用高，能夠原樣維持組織的生存力，能夠穩定而確實地保護組織，能夠使適於移植的胰島的收穫量提高。
III.二層法用胰臟保存液本發明的保存液在胰島移植的胰島分離中、可以使用於利用二層法的胰臟保存。此外，本發明的二層法用胰臟保存液可以優選用作上述本發明的胰島分離方法中的二層法中使用的保存液。
本發明的保護液可以通過在低鉀濃度的組織保護或保存液中添加蛋白酶抑制劑來得到。
作為蛋白酶抑制劑，可以使用上述II-1中記載的抑制劑。
此外，作為組織保護或保存液，在上述II-2中記載的液體中，可以使用低鉀濃度的液體。特別優選使用ET-Kyoto液等。
III-2.-二層法用胰臟保存液的方式蛋白酶抑制劑在保存液中的添加比例可以在發揮本發明效果的範圍內根據抑制劑的種類來適當設定。
蛋白酶抑制劑如果是烏司他丁，則每1升為10000～100000U左右，優選為50000～100000U左右。此外，如果是甲磺酸加貝酯，則每1升為100～10000mg左右，優選為500～2000mg左右。
二層法用胰臟保存液的鉀濃度為4～50mM左右，特別為10～50mM。
鉀濃度低時，可以更加確切地發揮胰臟的保存作用，可以使適於移植的胰島的收穫量提高。
此外，保存液的滲透壓為270～450mOsm/l，特別優選300～400mOsm/l。如果為該範圍，則可以防止組織在保存中發生膨脹或收縮。
此外，保存液的pH優選為7～8左右，以防止細胞或組織的酸性分解等。
此外，保存液優選含有海藻糖。
海藻糖的濃度在1000ml保存液中優選為0～400mmol，特別優選50～240mmol，進一步優選為80～160mmol。由於含有海藻糖，所以對於胰臟的保護作用更高，能夠使胰島的收穫量提高。
進而，只要無損本發明的效果，則保存液中可以進一步含有其他成分。作為其他成分，可以舉出各種電解質、糖質、胺基酸、藥物製劑、維生素等。
此外，還可以含有dibutyryl cAMP等AMP或ATP等細胞賦活劑、前列腺素、硝化甘油等血管擴張劑、抗生物質、腺苷、N-乙醯基-L-半胱氨酸、甘氨酸、抗壞血酸、谷醯胺、煙醯胺、穀胱甘肽、棉子糖等。
本發明的二層法用保存液優選方式的例子可以舉出至少以下述比例含有下述成分的液體鈉80～120mmol/L鉀4～50mmol/L葡糖酸鹽15～150mmol/L磷酸20～40mmol/L海藻糖80～160mmol/L羥乙基澱粉(HES)20～60g/L烏司他丁10000～100000U/L由於使用本發明的保存液，胰臟的保護作用高，能夠原樣維持組織的生存力，能夠確實地保存這些組織，能夠使適於移植的胰島的收穫量顯著提高。
IV.胰島純化溶液在胰島移植的胰島分離中，胰島的純化中優選使用本發明的純化溶液。此外，本發明的純化溶液可以優選用作上述本發明的胰島的分離方法中的純化溶液。
本發明的純化溶液可以通過在含有海藻糖的組織保護或保存液中添加密度梯度劑來得到。作為含有海藻糖的組織保護或保存液，在上述II-2的記載中，可以使用含有海藻糖的液體。特別優選使用ET-Kyoto液。
IV-1.密度梯度劑密度梯度劑可以從用於調製溶液內的密度梯度的公知物質中來適當選擇。特別是，密度梯度劑優選可以製成粘度低的溶液的物質。此外，優選內毒素水平低的物質。
優選的密度梯度劑可以舉出碘克沙醇(OptiprepTM)和N，N』-雙(2，3-二羥基丙基)-5-[N-(2，3-二羥基丙基)乙醯胺]-2，4，6-三碘代-間苯二甲醯胺(NycodenzR)。特別優選碘克沙醇，通過使用這些物質作為密度梯度劑，可以得到粘度低的純化溶液，可以加快純化速度。進而，還可以製成內毒素水平低的溶液。
密度梯度劑相對於組織保護或保存液的混合比例，可以在純化前測定胰組織的密度、並考慮密度梯度劑與組織保護或保存液的比重來適當設定。
IV-2.海藻糖海藻糖存在有α，α-海藻糖、α，β-海藻糖和β，β-海藻糖這3種，可以使用任何一種，也可以使用它們的混合物。優選使用天然存在的α，α-海藻糖。
純化溶液中的海藻糖的濃度為0～400mmol/L左右，特別是50～240mmol/L，進一步為80～160mmol/L左右。
IV-3.蛋白酶抑制劑純化溶液優選進一步含有蛋白酶抑制劑。作為蛋白酶抑制劑，可以使用上述II-1中記載的物質。從胰島的收穫量更優異的觀點出發，特別優選使用選自烏司他丁、甲磺酸加貝酯和甲磺酸萘莫司他中的一種以上。
將蛋白酶抑制劑添加到純化溶液中的情況下，添加比例可以在發揮本發明效果的範圍內根據抑制劑的種類來適當設定。
蛋白酶抑制劑如果是烏司他丁，則每1升為10000～100000U左右，優選為50000～100000U左右。此外，如果是甲磺酸加貝酯，則每1升為100～10000mg左右，優選為500～2000mg左右。
IV-4.純化溶液的方式純化溶液優選為低鉀濃度，優選為4～50mmol/L左右，特別是10～50mmol/L左右。
純化溶液優選為低粘度。特別是在測定溫度為22℃的條件下，通過Brookfield法測得的粘度為5釐泊(cp)以下，優選3cp，特別優選2cp以下。
此外，只要無損本發明的效果，可以在純化溶液中適當添加其他成分。其他成分包括例如腺苷、葡聚糖、肝素等。
優選的純化溶液方式的例子可以舉出至少以下述的比例含有下述成分的液體鈉80～120mmol/L鉀4～50mmol/L葡糖酸鹽15～150mmol/L磷酸20～40mmol/L海藻糖80～160mmol/L羥乙基澱粉(HES)20～60g/L碘克沙醇100～500ml/L含有蛋白酶抑制劑的純化溶液優選的方式的例子可以舉出至少以下述的比例含有下述成分的液體
鈉80～120mmol/L鉀4～50mmol/L葡糖酸鹽15～150mmol/L磷酸20～40mmol/L海藻糖80～160mmol/L羥乙基澱粉(HES)20～60g/L碘克沙醇100～500ml/L烏司他丁10000～100000U/L在胰島移植的胰島純化中，以維持胰島三維結構的方式來進行純化是重要的，只要使用本發明的純化溶液，就能夠在確實地維持胰島的三維結構的狀態下使適於移植的胰島的收穫量提高。
V.胰島移植胰島移植可以通過將通過上述一系列分離操作而得到的的胰島注入到患者的門靜脈中來實施。
經分離的胰島在滿足規定基準的情況下被判斷為適於移植，而用於移植中。
從有效性的觀點出發，要求判斷移植中使用的胰島在移植後是否作為胰島發揮作用。進而，有必要極力排除病原體或有害物質等混入到受體中的危險性。
作為適於移植的分離胰島的基準，具體而言，可以使用以下的基準。
·胰島量≥4000 IE/kg(患者體重)·純度≥30％·組織量≤10ml·生存力≥70％·內毒素≤5IE/kg(患者體重)
·革蘭氏染色陰性為了更有效地實施胰島移植，胰島量≥5000 IE/kg(患者體重)是更優選的。
被判斷為適於移植的胰島保存至患者(受體)準備好為止。然後，在患者準備好之後，通過點滴被注入到門靜脈中。
本發明的胰島分離技術可以根據需要附加胰島移植和胰島分離中的各種公知技術。
根據本發明，適於移植的胰島的收穫量得到提高，於是，根據本發明，可以提高純化效率，還可以改善純化速度。由此，可以大量移植質量好的胰島，可以使移植後的胰島更有效地發揮功能。
由於使用本發明的分離方法和溶液，可以提高胰島移植的治療成績。
根據本發明的胰島的分離方法，適於移植的胰島的收穫量增加。進而，還可以在更短的時間內高效地進行胰島的分離。
本發明的分離方法具有如下特徵將含有蛋白酶抑制劑的保護液注入到胰管內。
由於將含有蛋白酶抑制劑的保護液注入到胰管內，所以在胰管內胰組織被確切地保護，適於移植的胰島的收穫量得到提高。
此外，本發明的分離方法還可包括利用二層法的胰臟的保存工序。優選通過使用含有(i)全氟化碳(perfluorocarbon)液體和(ii)蛋白酶抑制劑的、鉀濃度為約4～50mmol/L的保存液的二層法來保存。由此，適於移植的胰島的收穫量顯著提高。
進而，本發明的分離方法包括用含有密度梯度劑的純化溶液來進行純化的工序。優選用含有密度梯度劑和海藻糖的純化溶液來進行純化。更優選使用進一步含有蛋白酶抑制劑的純化溶液來進行純化。通過使用這樣的純化溶液，純化效率得到提高，進而，適於移植的胰島的細胞得到提高。
本發明的分離方法由於具有這樣的特徵，所以具有使適於移植的胰島的收穫量顯著提高的特徵。
此外，根據本發明，提供含有蛋白酶抑制劑的胰管內注入用保護液。該保護液對胰管的保護作用高，可以使胰島收穫量增加。
此外，根據本發明，提供含有蛋白酶抑制劑的、鉀濃度為4～50mmol/L的二層法用胰臟保存液。該保存液對胰管的保護作用高，維持組織的生存力，確切地保護組織，使適於移植的胰島的收穫量提高。
此外，根據本發明，提供含有密度梯度劑和海藻糖的胰島純化溶液。進而，提供含有密度梯度劑、海藻糖和蛋白酶抑制劑的純化溶液。這些純化溶液可以提高純化效率，還可以使適於移植的胰島的收穫量提高。進而，可以降低純化溶液的粘度，加快純化速度。進而，內毒素水平降低，可以使患者的危險性降低。
如此，本發明提供能夠使適於移植的胰島的收穫量增加的胰島的分離方法、胰管內注入用保護液、二層法用胰臟保存液和胰島純化溶液。
根據本發明，滿足適合移植標準的胰島的收穫量提高，由此，能夠使胰島移植的成功率提高。進而，可以實現用以往的方法事實上不能實現的來自心臟停止供體的胰島移植。
這樣，本發明能夠對胰島素依賴狀態糖尿病、特別是1型糖尿病患者提供更確實有效的治療方法，在胰島移植的臨床實施方面作出巨大貢獻。


圖1是表示將根據有無胰管保護的胰島收穫量進行比較研究而得的實驗結果的圖。圖1A表示純化前的胰島收穫量。圖1B表示純化後的胰島收穫量。IE/g表示每1克胰臟的收穫量胰島的平均個數。注入到胰管(-)表示沒有將保護液注入到胰管內的情況，注入到胰管(+)表示將保護液注入到胰管內的情況。
圖2是表示將根據二層法中使用的保存液的不同而對純化後的胰島收穫量進行比較研究所得的實驗結果的圖。IE/pancreas表示從每一個胰臟中取得的胰島的總收穫量。PFC表示全氟化碳液體(PFC)，UW表示UW液，M-UW表示UW+烏司他丁液，ET-Kyoto表示ET-Kyoto液，M-Kyoto表示ET-KYOTO+烏司他丁液。
圖3是表示比較每個方案後的豬胰島分離中的胰島收穫量的結果的圖。
圖3A表示純化前的結果。圖3B表示純化後的結果。IE/g表示每1克胰臟的收穫量胰島的平均個數。
圖4圖4A是表示來自心臟停止供體的胰島移植前後的6名患者的HbAlc值的變化的圖。各患者的數據用不同的記號來區別。圖4A的縱軸表示HbAlc相對於血紅蛋白整體的比例。虛線表示正常上限值。
圖4B表示胰高血糖素刺激試驗中的C-肽值(平均值)。■表示基礎值，□表示刺激後的值。
圖5圖5A是表示在胰島移植前後測定早餐前和晚餐前的血糖值而得的結果的圖。圖5A的兩條虛線表示正常範圍。◆表示早餐前的值，■表示晚餐前的值。
圖5B是表示胰島移植前後的患者每1天的胰島素量的圖。
具體實施例方式
以下，為了使本發明更加明確，用實施例和實驗例來進行說明，但本發明並不限於這些實施例。
材料和步驟·材料1(1)保護液或保存液使用UW液(ViaSpanTM、DuPont制)和ET-Kyoto液(KyotoSolution、Kyoto Biomedical Science公司)。
進而，在1升ET-Kyoto液中添加100000單位(U)的烏司他丁(Ulinastatin、MiraclidTM、持田製藥株式會社)，調製ET-Kyoto+烏司他丁液(以下也稱為M-Kyoto液)。
UW液、ET-Kyoto液和M-Kyoto液中含有的主要成分的組成和滲透壓示於下述表1中。
表1

此外，在1升ET-Kyoto液中添加0.4～8mM的4-[2-氨基乙基]苯磺醯基]氟化物·HCL(AEBSF、PefablocTM、Roche制)，調製ET-Kyoto+Pefabloc液。
此外，在1升ET-Kyoto液中添加1000mg的甲磺酸加貝酯(Gabexate mesilate、FOYTM、小野藥品工業制)，調製ET-Kyoto+FOY液。
1(2).純化溶液如下調製菲可液(Ficoll液)混合濃度不同的2種菲可(FicollTM、Pharmacia公司制)溶液(用Hanks』溶液稀釋而得的物質)，使得輕比重為約1.07-1.08，重比重為1.09-1.12。
此外，在ET-Kyoto液中混合60重量％的碘克沙醇(Iodixanol)水溶液(OptiPrepTM、AXIS-SHIELD公司制)，調製ET-Kyoto+碘克沙醇液(以下也稱為I-Kyoto液)。
此外，在M-Kyoto液中混合60重量％的碘克沙醇水溶液(OptiPrepTM、AXIS-SHIELD公司制)，調製ET-Kyoto+烏司他丁+碘克沙醇液(以下也稱為MI-Kyoto液)。此外，在ET-Kyoto液中混合4-[2-氨基乙基]苯磺醯基]氟化物·HCL(PefablocTM、Roche制)和60重量％的碘克沙醇水溶液(OptiPrepTM、AXIS-SHIELD公司制)，調製ET-Kyoto+Pefabloc+碘克沙醇液(Kyoto+AEBSF+Idx液)。
ET-KYOTO溶液的比重為約1.04，碘克沙醇溶液的比重為約1.32，將它們混合時，通過改變兩種液體的比率來進行調製，使得輕比重為約1.07-1.08，重比重為1.09-1.12。
2.豬胰島的分離步驟豬胰島的分離按照以下的步驟進行。
在京都市內的屠宰場獲得豬的胰臟。獲得胰臟後，(1)立即保存在通過二層法形成二層的容器中，或者，(2)在剛獲得的胰臟中插入1根導管，通過導管將胰管將胰管保護液注入到該胰臟的主胰管中之後，迅速地保存在通過二層法形成PFC和保存液這二層的容器中。在(2)中，胰管保護液的注入量相對於1克胰重量為1ml。
在此，把從心臟停止到胰臟被浸在保存液中的時間定義為熱缺血時間。從胰臟被浸在保存液中開始到胰臟分離開始的時間定義為冷缺血時間。
將上述用二層法保存而得的胰臟運送到京都大學的胰島分離設施後，進行滅菌。
接著，將冷膠原酶溶液(Liberase HITM、Roche MolecularBiochemicals公司制)注入到該胰臟的主胰管中，回流溶液，使胰臟膨脹。
將該膨脹後的胰臟切分成九份之後，裝入Ricordi腔(Ricordichamber)中。在該腔內，用溶液填滿迴路，製成封閉系統。邊用泵使溶液循環，邊使溶液的溫度上升到37℃，將膠原酶活化，通過Ricordi腔使膠原酶溶液反覆循環，進行胰組織的分解。原樣保持構成胰島的細胞凝聚的形態，只有胰外分泌腺組織從胰島的周圍解離的時刻，停止分解操作。
分解的停止如下進行把迴路製成開放系統，將含有人清蛋白的室溫的溶液通過迴路內，從而降低溶液的溫度，將膠原酶滅活。
將室溫的溶液通過迴路內，停止分解之後，回收胰組織。
把從在Ricordi腔內設置胰臟到開始回收所分解得到的胰臟為止的時間當作第1相。
此外，把從回收開始到結束的時間當作第2相。
回收的胰組織用離心分離器進行離心洗淨，收集濃縮。
在血球洗淨裝置(COBE2991 Cell Processor、Gambro公司)內，使用含有密度梯度劑的純化溶液，形成連續比重濃度梯度。
接著，將上述洗淨濃縮而得的胰組織添加到形成該密度梯度的溶液中。
使用連續比重離心沉澱法進行離心分離，使胰島和胰外分泌腺組織分離，從胰組織中分離胰島，進行純化。其後，採取血球洗淨裝置內的溶液各部份，通過顯微鏡檢查來判定在哪個部份中存在胰島，回收胰島。
3.評價方法胰島的收穫量和純度通過雙硫腙(dithizone)染色來進行評價。胰島收穫量如下計算雙硫腙(dithizone)染色之後，從懸濁為200ml的溶液中取出100μl的樣品，在顯微鏡下按大小計數。純度(purity)用胰島在含有胰島、胰島以外的外分泌組織、胰管等所有的整體中的比例來表示。
胰島的大小(Islet size)為按大小計數的胰島得平均值。
純化效率為純化後的胰島數除以純化前的胰島數而得的值。
形態分(整體的形態學評價)如下對於形狀(平坦vs.球狀)、邊緣(粗糙vs.具有良好的圓形)、整體性(斷片化vs.凝固/密集)、染色度(不均勻vs.均勻)和直徑(全部＜100μlvs.＞10％＞200μl)，採用兩名調查員進行評分，高質量地評價。將各個參數設定為從0到2，零為最低分，2為最高分。因此，胰島分離的總計的最低分為0分，最高分為10分。作為優選的胰島具有球狀的、有良好圓形的、凝固或密集的、均勻被染色的、直徑大的特徵，來進行評分。
胰島的生存力如下計算使用吖啶橙(acridine orange)(10μmol/L)和碘化丙啶(propidium iodide)(15μmol/L)(AO/PI)染色，將生存的細胞和死的細胞同時可視化，進行評價。調查50個胰島，視覺決定各自的生存力，接著計算它們的平均值。
刺激指數(Stimulation Index)由低葡萄糖濃度和高葡萄糖濃度中的胰島素分泌的比率導出。
胰島的功能根據Shapiro和Colleagues所寫的方法，通過監測純化胰島對於糖負荷的胰島素分泌反應來進行評價。簡單地說，在37℃和5％CO2的環境下，將100個胰島等同物(Islet Equivalents，IE)在CMRL溶液中進行培養，進而，用裝有2.8mM醚或20mM醚和20mM葡萄糖的RPMI1640溶液(GIBCO BRL公司)在37℃和5％CO2的環境下進行培養2小時之後，採取上清，利用採用ELISA試劑盒(森永生化學工業株式會社)的抗原抗體反應來進行胰島素值的測量。
由實施例和實驗例得到的值用平均值和標準偏差(means±SE)表示。3組間用mean of ANOVA和Fisher’s PLSD post-hoc test來進行比較。P值為小於0.05的有意義值。
實施例1關於胰管保護的研究為了進行關於有無胰管保護的比較研究，在上述步驟中，取得胰臟之後，(1)立即用二層法保存(無胰管保護)，或者，(2)在剛取得後立即將保護液注入到胰臟的主胰管中之後，通過二層法進行保存(有胰管保護)，除此之外，用同樣的步驟進行比較實驗。
在該實驗中，胰管保護液使用M-Kyoto液。二層法使用M-Kyoto液和PFC液。純化溶液使用Ficoll溶液。
該實驗中純化前後的胰島收穫量示於圖1(1A純化前、1B純化後)和下述表中。IE/g為每1克胰臟的胰島的平均個數。
表2

如表2所示，可知，即使在純化前後，進行了胰管保護的情況(有胰管保護)與沒有進行胰管保護的情況相比，胰島收穫量都有意義地高。
其他胰島的特點示於下述表3中。
表3

如表3所示，在其他胰島的特點中，兩組之間未見有意義的差異。
實施例2.關於二層法保存的比較研究為了將二層法中使用的溶液的差異進行比較研究，將二層法中使用的溶液設為下述表4中所示的溶液之外，用同樣的步驟，進行比較研究。此外，M-UW液是在1升UW液中添加100000單位(U)的烏司他丁而得到的。
實驗按以下的步驟進行。
胰島從重量為300到380g的近親交配雄Lewis大鼠(ChaelesRlver Laboratories，Wilmington，MA)中分離。大鼠試驗在京都大學大學院醫學研究科審查委員會中獲得承認。將共通的膽管用24規格導管(Baxter、Deerfield，IL)插入，固定，接著，繫緊末端。整體取出胰臟、脾臟和十二指腸，保存在各溶液中。胰臟在4℃下保存6小時。胰島使用Sawada(Transplantation.2003；75(12)1965-1969)的改變法進行分離。保存後，將各胰使用將2mg/ml的膠原酶溶液(24mg of Servacollagenase；Serva，Heidelberg，Germany)裝入到12mL的Hanks』平衡鹽類溶液(HBSS)中而得的溶液來進行膨脹。去除脾臟和十二指腸，將胰臟用50mL的圓錐管在37℃下不振動地孵育22分鐘。將分解得到的胰臟用UW溶液通過離心分離(150g、3分鐘、8℃)洗淨3次。接著，使用在M-Kyoto液中加有Iodixanol(OptiprepTM、Nycomed PharmaAS，Olso，Norway)的溶液，形成非連續密度梯度(1.030，1.095，1.105，1.125g/cm3)，進行純化。所得胰島收穫量通過雙硫腙(dithizone)染色來進行評價。
純化後的胰島收穫量的結果示於圖2和下述表4中。IE/pancreas表示從每一個胰臟中取出的胰島的總收穫量。
表4

如表4和圖2所示，可知，在二層法保存中使用M-Kyoto液時，純化後的胰島收穫量顯著增高。
實施例3關於分離方案的研究3-1.方案的概要在上述豬胰島分離步驟中，使用以下的3個分離方案來進行比較研究。
C1方案·不進行向胰管內的保護液的注入。
·二層法使用UW液和全氟化碳液體(PFC)。
·純化溶液使用菲可液。
C2方案
·向胰管注入保護液，進行胰管的保護。保護液使用M-Kyoto液。
·二層法使用M-Kyoto液和全氟化碳液體(PFC)。
·純化溶液使用菲可液。
Kyoto方案·在胰管中注入保護液，進行胰管的保護。保護液使用M-Kyoto液。
·二層法使用M-Kyoto液和全氟化碳液體(PFC)。
·純化溶液使用I-Kyoto液。
各方案的特點示於下述表5中。
表5

3-2.方案的比較3-2(1).分離過程的特點各方案中的分離過程的特點示於表6中。
表6

表中，*表示對於熱缺血時間來說，C1方案比C2方案(P＜0.01)、
Kyoto方案(P＜0.01)有意義地短。
**表示對於冷缺血時間來說，C1方案比C2方案(P＜0.01)、Kyoto方案(P＜0.01)有意義地長。
***表示對於第I相來說，C1方案比C2方案(P＜0.02)、Kyoto方案(P＜0.01)有意義地長。
胰臟的大小和操作時間在3個方案間沒有明顯的差異。
C1方案由於沒有胰管內注入工序，所以與其他方案相比，熱缺血時間有意義地短。然而，由於必須插入導管，所以C1方案與其他方案相比，冷缺血時間有意義地長。
對於第1相來說，C1方案特別長。然而，第2相在3個方案間大致相同。
3-2(2)胰島收穫量將各分離方案中純化前後的胰島收穫量示於下述表7以及圖3A和B中。IE/g為每1克胰臟的收穫量胰島的平均個數。
表7

如表7和圖3所示，對於純化前的胰島收穫量來說，C2方案和Kyoto方案較C1方案為有意義的高值(圖3A)。
對於純化後的胰島收穫量來說，Kyoto方案較C1方案和C2方案有意義地高(圖3B)。
3-2(3)胰島的特點分離後的胰島的特點示於下述表8中。
表8

表中，*表示對於形態分來說，Kyoto方案比C1方案(P＜0.03)有意義地高。
**表示對於純化效率來說，Kyoto方案較C1方案(P＜0.05)和C2方案(P＜0.01)有意義地高。
***表示對於純化後的胰島的大小來說，Kyoto方案較C2方案(P＜0.04)有意義地大。
如表8所示，刺激指數、生存力、純度和純化前的胰島的大小在3個方案間沒有有意義的差。
然而，可知在形態分和純化效率以及純化後的胰島的大小中，Kyoto方案的結果特別優異。
3-2(4).純化速度調查各分離方案中的純化速度，結果為，在Kyoto方案中，能夠將純化溶液以60ml/min的速度運送到COBE2991 Cell Processor中。
另一方面，在使用菲可溶液作為純化溶液的C1和C2方案中，純化溶液的運送速度為10～20ml/min。
由該結果可知，使用碘克沙醇作為密度梯度劑時，胰島的純化速度能夠加快3～6倍。認為使用了碘克沙醇的純化溶液的粘度低是主要的原因。
實施例4.關於蛋白酶抑制劑的研究為了研究蛋白酶抑制劑的種類，進一步進行了以下的試驗。
除了將注入到主胰管中的保護液和採用二層法的保存液設為表9中所記載之外，通過與上述Kyoto方案相同的步驟來評價胰島的收穫量。
表9

其結果可知，在注入到胰管中的保護液中添加有蛋白酶抑制劑時，胰島的收穫量得到提高。
特別是，蛋白酶抑制劑為烏司他丁和甲磺酸加貝酯時，胰島的收穫量得到顯著提高。
此外，使用ET-Kyoto+甲磺酸加貝酯液體作為注入到主胰管中的保護液和利用二層法的保存液時，對於分離胰島而言，純度為89％，對於生存力而言，得到90％的值。
實施例5.關於純化的研究改變純化溶液，進一步進行以下的研究。
在上述豬胰島分離步驟中，除了將純化溶液設為如表10所記載之外，與上述Kyoto方案同樣地操作，用上述方法評價純化效率。
表10

如表10所示，使用含有蛋白酶抑制劑的溶液作為純化溶液時，純化效率得到提高。
特別是，使用MI-Kyoto液時，換言之，使用烏司他丁作為蛋白酶抑制劑時，純化效率得到顯著提高。
此外，與使用I-Kyoto液的情況相同，使用MI-Kyoto液時，也能夠以60ml/min的速度將純化溶液運送到COBE2991 Cell Processor中。
實施例6人胰島分離6-1.人胰島分離步驟除了下述方面以外，用與豬胰島分離相同的步驟來進行人的胰島分離。
從日本臟器移植網絡的中日本支部和西日本支部，經過知情同意，從心臟停止後的供體獲得13人份的人的胰臟。
為了急速冷卻胰臟，從供體的腹股溝的血管插入導管，從心臟停止到摘出胰臟為止，從該導管注入冷乳酸林格氏液，進行回流。
接著，摘出胰臟，立即插入1根導管，將M-Kyoto液以每1克胰重量為1ml的量注入到主胰管中之後，迅速將胰臟浸漬在二層法保存容器中的保存液中，將胰臟運送到GMP水平的京都大學人胰島分離設施(Center for Cell and Molecular Therapy)。二層法使用M-Kyoto液和全氟化碳液體(PFC)。
評價方法與上述豬胰島分離中的方法相同。而且統計學的評價也與豬胰島分離相同。
6-2.分離方案在人胰島分離中，在13例的2個例子中使用C2方案，在13例的11個例子中使用Kyoto方案。
6-3.人供體和胰臟的特點供體的平均年齡為44±4歲。ICU滯留期間為11±3天。BMI為21±1kg/m2。胰臟的大小為87±6g。在全部供體中，看到血液生物化學值(average blood chemistry value)異常。
此外，熱缺血時間為7±3分鐘。冷缺血時間為256±18分鐘。通過採用冷乳酸林格氏溶液的即時環流，熱缺血時間在全部胰臟中為最小。而且冷缺血時間在全部胰臟中短6小時。
在2個方案間，供體條件以及熱缺血時間和冷缺血時間沒有有意義的差。
6-4.分離方案的評價2個方案(C2方案、Kyoto方案)中的人胰島分離的評價結果示於表11中。胰島數(IE)表示胰島的總收穫量。
表11

純化前後的胰島收穫量在2個方案間沒有有意義的差異。純度、生存力、形態分在2個方案間也是同樣的結果。
Kyoto方案的純化效率是C2方案的1.6倍高。而且，Kyoto方案的內毒素水平低於C2方案。
對於純化速度來說，在Kyoto方案中，能夠將純化溶液以60ml/min的速度運送到COBE2991 Cell Processor中。另一方面，C2方案中的速度是10～20ml/min。
由該結果可以確認，使用I-Kyoto液作為純化溶液時，即使在人胰島分離中胰島的純化速度也增快3～6倍。
進而，關於純化溶液，進行以下的試驗。
在上述人的胰島分離中，除了將純化溶液設為表12所記載之外，與Kyoto方案相同地操作，對純化效率和胰島的收穫量進行評價。
表12

如表12所示，可知，使用含有蛋白酶抑制劑的溶液作為純化溶液時，即使在人的胰島分離中純化效率也得到提高。還可知，胰島的收穫量也得到提高。
6-5.適於移植的基準適於移植的基準依照Edmonton Protocol，設定如下。
·胰島量≥5000IE/kg(患者體重)·純度≥30％·組織量≤10ml·生存力≥70％·內毒素≤5 IE/kg(患者體重)·革蘭氏染色陰性對於上述基準，除了胰島量之外，13例全部滿足適於移植的基準。
6-6.對於1型糖尿病患者的胰島移植將上述13例中的11例、即通過C2方案分離得到的胰島1例以及用Kyoto方案分離得到的胰島10例移植到6名1型糖尿病患者中。對於剩餘的2例胰島分離部分，冷凍保存。
在6人中，4名患者移植了來自多個供體的胰島。2名患者移植了來自單一供體的胰島。
胰島移植後的評價用以下的方法進行。
在移植前後以天為單位評價血清血糖量、胰島素必需量以及血紅蛋白Alc(HbAlc)。以第1次移植30、60天後，第2次移植30天和60天的間隔進行胰高血糖素刺激試驗。在胰高血糖素刺激試驗中，即將注射1mg胰高血糖素之前和6分鐘後進行C-肽測量用的採血。
6-7.胰島移植後的評價胰島移植後，6名患者全部不發生因低血糖所致的意識消失，能夠改善血中葡萄糖控制。此外，在全部的移植例中，可以確認基於C-肽測量的胰島素分泌開始。
移植時的平均胰島素量雖然為39.2±3.2單位，但減少到11.0±4.4單位(P＜0.0005)。2名患者缺乏胰島素，其他2名患者的胰島素量少於10單位，其他2名患者的胰島素量也減少。
全部6名患者的HbAlc水平緩慢降低，在全部6名患者中，無論是單獨供體或者是多個供體，HbAlc的水平從胰島移植開始在3個月左右都達到正常(圖4A)。
6名患者的平均HbAlc水平得到顯著改善，從移植時的7.5±0.4％改善到5.1±0.2％(P＜0.0003)。
全部患者在移植前都具有不能檢知程度的C-肽值(＜0.1ng/ml)，但移植後C-肽值變得明確。第1次移植後的C-肽值的基礎值為0.29±0.06ng/mg，刺激後的值為0.52±0.11ng/ml(N＝6)(圖4B)。C-肽值在第2次胰島移植後，基礎值和刺激後的值雙方都較第1次得到顯著改善。第2次移植後的C-肽值的基礎值為0.75±0.12ng/ml(P＜0.01)，刺激後的值為1.45±0.26ng/ml(P＜0.005)(N＝3)(圖4B)。
6-8.胰島移植的臨床經過胰島移植的臨床實施依照上述Kyoto方案進行。而且，對於同一患者的第2次移植在約2個月後同樣地進行。
第1次移植的胰島收穫量為354384 IE，第2次為474234 IE。
受體是36歲的女性，為22年的1型糖尿病，具有頻繁的嚴重的低血糖發作情況和糖尿病性視網膜症的病史。
腎功能正常，肌酸酐為0.7ml/dl。除了使用20mg的basiliximab來代替daclizumab之外，依照Edmonton Protocol，在手術後第0天和第4天給予免疫抑制劑。
測定好的約2年前的約2個月間的早餐前和晚餐前的血糖值，以對照移植前的血糖值。
胰島移植前的血糖值非常不穩定，為20mg/dl到400mg/dl的廣度。
然而，第1次移植後，血糖值被維持在狹窄的範圍內，落在50mg/dl到150mg/dl的狹窄範圍(圖5A)。
移植前的胰島素必需量為30到40單位/天，但第1次移植後1個月內，胰島素的服用量可以慢慢減少到10單位/天。進而，第2次移植後第20天可以完全停止，患者從而脫離了胰島素服用(圖5B)。
轉氨酶值在第1次移植後暫時升高，但不會達到100mg/dl以上，在3周內恢復到正常值。肌酸酐值停在1.0mg/dl以下，BUN(blood ureanitrogen)在觀察期間一直維持正常值。
由上述結果可知，根據本發明，可以確認胰島的純化效率得到提高，滿足適於移植基準的胰島的收穫量得到提高。進而，可以確認，純化速度得到提高，在短時間內能夠有效地實施胰島分離。
進而，可以確認，根據本發明能夠得到從心臟停止供體獲得質量都良好的胰島。進而，可以確認，在來自人心臟停止供體的胰島移植中可以得到良好的成績。
權利要求
1.胰島的分離方法，其包括如下工序將含有蛋白酶抑制劑的保護液注入到離體的胰臟的胰管內的工序(1)；將酶溶液注入到該注有保護液的胰臟中，將胰臟分解的工序(3)；以及將該分解得到的胰組織用含有密度梯度劑的純化溶液來純化的工序(4)。
2.如權利要求1所述的分離方法，其中，在工序(1)中，以每1克臟器重量為約0.1～10ml的量將所述保護液注入到胰管內。
3.如權利要求1所述的分離方法，其中，含有蛋白酶抑制劑的保護液的鉀濃度為約4～50mmol/L。
4.如權利要求1所述的分離方法，其中，進一步具有通過二層法保存注有保護液的胰臟的工序(2)。
5.如權利要求4所述的分離方法，其中，工序(2)的二層法使用含有(i)全氟化碳(perfluorocarbon)溶液和(ii)蛋白酶抑制劑的、鉀濃度為約4～50mmol/L的保存液。
6.如權利要求5所述的分離方法，其中，(ii)的保存液進一步含有海藻糖。
7.如權利要求1所述的分離方法，其中，工序(4)中的純化溶液進一步含有海藻糖。
8.如權利要求1所述的分離方法，其中，工序(4)中的密度梯度劑是碘克沙醇。
9.如權利要求1所述的分離方法，其中，工序(4)中的純化溶液進一步含有蛋白酶抑制劑。
10.胰管內注入用保護液，其中，含有蛋白酶抑制劑。
11.如權利要求10所述的保護液，其中，鉀濃度為約4～50mmol/L。
12.二層法用胰臟保存液，其中，含有蛋白酶抑制劑，鉀濃度為約4～50mmol/L。
13.胰島的純化溶液，其中，含有密度梯度劑和海藻糖。
14.如權利要求13所述的純化溶液，其中，密度梯度劑是碘克沙醇。
15.如權利要求13所述的純化溶液，其中，進一步含有蛋白酶抑制劑。
全文摘要
本發明提供胰島的分離方法，其包括如下工序將含有蛋白酶抑制劑的保護液注入到離體的胰臟的胰管內的工序(1)；將注有保護液的胰臟分解的工序(3)；以及將該分解得到的胰組織用含有密度梯度劑的純化溶液來純化的工序(4)。此外，提供胰管內注入用保護液、二層法用胰臟保存液和胰島純化溶液。
文檔編號C12N5/071GK101084305SQ200580043739
公開日2007年12月5日 申請日期2005年12月22日 優先權日2004年12月22日
發明者松本慎一, 和田洋巳, 野口洋文 申請人:國立大學法人京都大學