一種產乙醯膽鹼酯酶抑制劑的真菌及其用途的製作方法
2023-12-02 11:35:51 1
專利名稱:一種產乙醯膽鹼酯酶抑制劑的真菌及其用途的製作方法
技術領域:
本發明涉及微生物技術領域,具體地說,涉及一種產乙醯膽鹼酯酶抑制劑的真菌及其應用。
背景技術:
阿爾茨海默病是一種常見的老年性腦神經退行性病變,發病率較高,已成為現代社會嚴重威脅老年人生命的疾病之底前腦膽鹼能功能障礙和皮層、海馬廣泛的神經元丟失和突觸形態的改變。該疾病典型的病理變化包括β澱粉樣蛋白沉積形成老年斑,神經纖維纏結基底前腦膽鹼能功能障礙和皮層、海馬廣泛的神經元丟失和突觸形態的改變。研究發現阿爾茨海默病患者腦內皮層及海馬區的病變比較明顯,以前腦基底核膽鹼能神經元破壞最多。因此,通過增加乙醯膽鹼的含量,或作用於膽鹼受體,可增強和改善中樞膽鹼能系統的功能,從而達到促智治病的目的)。乙醯膽鹼酯酶抑制劑就建立是建立在這種理論基礎上開發出來的臨床上用於阿爾茨海默病治療最早最成熟的一類藥物,該類藥物對輕、中度阿爾茨海默病患者療效確切,可使其認知功能及其它症狀得到部分改善。目前多種乙醯膽鹼酯酶抑制劑已經用於阿爾茨海默病的治療。但此類藥物的療效依賴於膽鹼能神經元的完整程度,不適於重度病人。同時,該類藥物只能提高乙醯膽鹼的含量,不能阻止中樞膽鹼能神經元的進行性退化死亡,隨著病情的發展,中樞膽鹼能神經元進行性退化死亡,乙醯膽鹼酯酶抑制劑的藥效也會逐漸降低。因此,尋找既能抑制乙醯膽鹼酯酶活性又能阻止中樞膽鹼能神經元退化死亡的新型乙醯膽鹼酯酶抑制劑成為尋找阿爾茨海默病治療藥物的關鍵。在海洋中,由於環境條件極為複雜與獨特,如壓力、溫度、含氧量、光線、鹽度、營養狀況等與陸地相異,在那裡存在著許多新的微生物,其代謝產物的化學結構豐富多樣,新穎獨特,是陸地生物所不具備的。另外,海洋微生物生長周期短,容易培養可以用發酵罐進行工業化生產,實現高新技術產業化。因此,海洋微生物作為巨大的潛在藥物和化學的資源, 具有廣闊的研究和開發前景,成為近年來尋找新藥的研究熱點。從海洋中分離海洋微生物並從其發酵產物中分離純化結構新穎的乙醯膽鹼酯酶抑制劑,對抗阿爾茨海默病藥物的研發和海洋生物資源的開發利用具有重要的意義。
發明內容
為了尋找新型的乙醯膽鹼酯酶抑制劑,本申請的發明人從江蘇連雲港海域分離海洋微生物並製取其發酵產物,然後對獲得的發酵產物的乙醯膽鹼酯酶抑制活性進行了研究,結果找到了一株海洋真菌SH0701。該海洋真菌菌株SH0701是發明人從中國江蘇連雲港海域的海底沉積物中分離到的一株真菌,發酵產物具有較強的乙醯膽鹼酯酶抑制活性,經鑑定表明它屬於赭麴黴AspergiIIus ochraceus。本發明所述的的海洋赭麴黴AspergiIIus ochraceus SH0701已於2012年I月10日保藏在中國典型培養物保藏中心(其簡稱CCTCC), 保藏編號為CCTCC M 2012003。
上述的海洋赭麴黴Aspergillus ochraceus SH0701的生物學形態描述為在海水 PDA培養基上,菌落圓形呈放射狀,菌絲白色透明、稀疏,孢子細密、淺黃色,如圖I所示;顯微觀察顯示,菌絲透明,有分枝和分隔,有假根,有分生孢子梗,分生孢子梗無橫隔,光滑,頂囊半球形或球形,小梗呈放射狀,產生分生孢子、細小圓形,如圖2、圖3、圖4所示。上述的海洋麴黴Aspergillus ochraceus SH0701的遺傳學特徵,該海洋真菌的 ITS序列為GGCTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTACTGAGTGAGGGTCCCTCGGGGCCCAACCTCCCACC CGTGTATACCGTACCTTGTTGCTTCGGCGAGCCCGCCCCCTTTTTCTTTTAGGGGGCACAGCGCTCGCCGGAGACAC CAACGTGAACACTGTCTGAAGTTTTGTCGTCTGAGTCGATTGTATCGCAATCAGTTAAAACTTTCAACAATGGATCT CTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAATTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAG TCTTTGAACGCACATTGCACCCCCTGGTATTCCGGGGGGTATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCTGCCCTCAAGCACGG CTTGTGTGTTGGGTCGTCGTCCCCCCCCAGGGGGACGGGCCCGAAAGGCAGCGGCGGCACCGCGTCCGGTCCTCGAG CGTATGGGGCTTTGTCACCCGCTCTTGTAGGCCCGGCCGGCTGCTGGCCGACGCTGAAAAGCAACCAACTATTTTTC CAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGA該序列與NCBI 核酸資料庫(Genbank http://www. ncbi. nlm. nih. gov/)BLAST 比對結果顯不,該真菌的ITS序列與麴黴Aspergillus sepultus、Aspergillus ostianus及 Aspergillus ochraceus 同源性最高,達到 100% 微管蛋白(β-tubulin)基因序列為5 』 -GCTATCCAGGATCATCTTCGATACCTTAGGACTTATGACTCTCAATCCTTGATACTTGTTTACTGA TAGGTGAATAGGCAAAACATCTCTGGCGAGCACGGCCTTGACGGCGCCGGTGTGTAAGTACATCCCGCGTTTACACC CATCGAAATCAGAGTCGAAAATAGAGGAAAAGAAAGAAACGACCATGGTGGGATTGATTGTCTGATGGGATGAACAG TTACAATGGCTCCTCCGACCTTCAGCTGGAGCGCATGAACGTCTACTTCAACGAGGTTCGTTGCCCGAAAATTTTCT ATCTCCTTTCGCCTATTCGAAACGCCCCGTACAAAGCTCTAACCCACGCTTTTTTCTTCATCTTCTAGGCTTCCGGT GGCAAGTATGTTCCCCGTGCCGTTCTGGTCGATCTTGAGCCCGGTACCATGGACGCTGTCCGTGCCGGTCCCTTCGG TCAGCTTTTCCGCCCCGACAACTTCGTCTTCGGCCAGTCTGGTGCCGGTAACAACTGGGCCAAGGGTCACA-3,該序列與NCBI 核酸資料庫(Genbank http://www. ncbi. nlm. nih. gov/)BLAST 比對結果顯示,該真菌的微管蛋白序列與Aspergillus ochraceus相似度最高,達到99%。前述海洋赭麴黴Aspergillus ochraceus SH0701菌株的發酵產物、發酵產物的提取物經檢測發現均具有乙醯膽鹼酯酶抑制活性的特性。發酵產物的提取物包括發酵液提取物、極性段提取物、菌體提取物。經檢測發現這三種提取物均具有乙醯膽鹼酯酶抑制活性的特性。發酵液提取物發酵產物經管式離心機離心固液分離,得到發酵液和菌體;將發酵液減壓蒸餾濃縮至原體積的三分之一後用等體積的乙酸乙酯萃取3次,再將乙酸乙酯層減壓乾燥後得到發酵液提取物。極性段提取物將前述的發酵液提取物以I : 5(W/V)懸浮在水中,再採用液-液分配萃取法用石油醚或氯仿或乙酸乙酯或正丁醇按照I:I比例萃取得到極性段提取物, 極性段提取物為石油醚提取物、氯仿提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物或水提取物。菌體提取物發酵產物經管式離心機離心固液分離,得到發酵液和菌體;菌體在烘箱中50°C乾燥得乾燥的菌體;乾燥的菌體按I : 20(W/V)加入甲醇萃取3次,合併甲醇提取液,減壓蒸餾乾燥得到菌體提取物。前述獲得海洋赭麴黴Aspergillus ochraceus SH0701菌株的發酵產物的發酵方法包括菌種活化過程、種子液製備過程和發酵培養過程。菌種活化過程取所述保藏菌種,採用劃線法接種於海洋PDA斜面培養基上,培養得到產生孢子的斜面培養物,培養溫度為28°C,培養時間5天。種子液製備過程將上述的斜面培養物加無菌陳海水後,在無菌條件下刮取孢子, 製備孢子懸液;再將孢子懸液接種於海洋PDA培養基中,震蕩培養獲得種子液。其中,前述孢子懸液的接種按5%接種量接種於海洋PDA培養基;震蕩培養環境參數為溫度28°C、每分鐘150-180轉;培養時間為3-4天。發酵培養過程在通氣攪拌式發酵罐內加入海洋PDA發酵培養基,滅菌後接入種子液攪拌發酵,獲得發酵產物。其中,滅菌的方法為在121°C下放置30min ;種子液的接入按接種量5%接入;攪拌發酵環境參數為通氣量I : O. 5,溫度為28°C,攪拌速度為每分鐘 250轉;發酵時間為7天。前述發酵方法中的海洋PDA斜面培養基的配置方法為將馬鈴薯去皮切成小塊, 於海水中煮沸後過濾;然後在濾液中加入庶糖和瓊脂粉,加熱溶解後,加海水定各,再經滅菌後獲得海洋PDA斜面培養基。其中,馬鈴薯小塊煮沸時間為30min ;滅菌方法為121°C下放置25min ;馬鈴薯和海水的比例為200g馬鈴薯對應IOOOmL海水;蔗糖和馬鈴薯的比例為20g蔗糖對應200g馬鈴薯;瓊脂粉和馬鈴薯的比例為15-20g瓊脂粉對應200g馬鈴薯; 加海水定容後培養基體積和馬鈴薯的比例為1000mL對應200g馬鈴薯。前述發酵方法中的海洋PDA發酵培養基的配置方法為將馬鈴薯去皮切成小塊, 於海水中煮沸後過濾;然後在濾液中加入蔗糖,加熱溶解後,加海水定容,再經滅菌後獲得海洋PDA發酵培養基。其中,馬鈴薯小塊煮沸時間為30min ;滅菌方法為121°C下放置 25min ;馬鈴薯和海水的比例為200g馬鈴薯對應IOOOmL海水;蔗糖和馬鈴薯的比例為 20g蔗糖對應200g馬鈴薯;加海水定容後培養基體積和馬鈴薯的比例為1000mL對應200g 馬鈴薯。如上所述,本發明的海洋赭麴黴Aspergillus ochraceus SH0701菌株發酵產物、 發酵產物的提取物具有乙醯膽鹼酯酶抑制活性的特點。因此,發酵產物、發酵產物的提取物用於治療阿爾茨海默病或治療阿爾茨海默病的藥物,或者可用於提取分離具有乙醯膽鹼酯酶抑制活性的化合物用於治療阿爾茨海默病或治療阿爾茨海默病的藥物。該治療阿爾茨海默病的藥物包含上述發酵產物,或發酵產物的提取物,或由發酵產物的提取物提煉的提煉物。
圖I為海洋赭麴黴Aspergillus 圖2為海洋赭麴黴Aspergillus 圖3為海洋赭麴黴Aspergillus 圖4為海洋赭麴黴Aspergillus 圖5為海洋赭麴黴Aspergillus
ochraceus SH0701菌株的菌落形態。 ochraceus SH0701菌株的菌絲體。 ochraceus SH0701菌株的產抱結構。 ochraceus SH0701菌株的分生抱子。 ochraceus SH0701菌株發酵液提取物對乙醯膽
鹼酯酶的抑制活性。
具體實施例方式以下通過實施例和附圖對本發明作進一步詳細的說明。實施例I 海洋赭麴黴Aspergillus ochraceus SH0701 (CCTCC M 2012003)的分離
培養方法選擇性海洋PDA培養基200g馬鈴薯去皮切成2cm3左右小塊,於IOOOmL陳海水中煮沸30min,過濾,在濾液中加入20g蔗糖和15_20g瓊脂粉,用陳海水定容至1000mL,pH自然。分裝於250mL三角瓶中,於121°C滅菌25min。滅菌後,待冷至約45°C時,加入氨苄青黴素、硫酸鏈黴素的無菌水稀釋液(終濃度為100yg/mL)混合均勻後分別倒平板,冷卻後備用。海洋PDA斜面培養基200g馬鈴薯去皮切成2cm3左右小塊,於IOOOmL陳海水中煮沸30min,過濾,在濾液中加入20g蔗糖和15_20g瓊脂粉,加熱溶解後,用陳海水定容至 IOOOmL, pH自然。分裝於試管中,於121°C滅菌25min後,擺斜面,備用。從連雲港燕尾港港口採集海底淤泥,取Ig海底淤泥懸浮在5mL無菌海水中。取上清液ImL加入盛有9mL無菌海水的大試管中充分混勻,然後從此試管中吸取ImL加入另一盛有9mL無菌水的試管中,混合均勻,以此類推製成10' 10_2、10' 10_4、10_5、10_6不同稀釋度的溶液。從不同稀釋度的試管中吸取100 μ L溶液,小心地滴在選擇性海洋PDA培養基平板表面中央位置。用無菌玻璃塗布棒塗開,將菌懸液先沿同心圓方向輕輕地向外擴展,使之分布均勻。室溫下靜置5 10分鐘,使菌液浸入培養基。每個梯度塗4至5皿,作為重複;該平板置於25_28°C培養4 7天;挑取單菌落接種於海洋PDA斜面培養基上即獲得純培養物。純培養物在28 V培養箱中培養4天後,放在4 V冰箱中保存。實施例2海洋赭麴黴Aspergillus ochraceus SH0701 (CCTCC M 2012003)的發酵方法I、海洋PDA發酵培養基200g馬鈴薯去皮切成2cm3左右小塊,於IOOOml陳海水中煮沸30min,過濾,在濾液中加入20g鹿糖,用陳海水定容至1000ml,pH自然。分裝,於121 °C 滅菌25min,備用。2、海洋PDA斜面培養基200g馬鈴薯去皮切成2cm3左右小塊,於IOOOml陳海水中煮沸30min,過濾,在濾液中加入20g蔗糖和15_20g瓊脂粉,加熱溶解後,用陳海水定容至 1000ml, pH自然。分裝於試管中,於121°C滅菌25min後,擺斜面,備用。3、菌種活化取海洋赭麴黴(Aspergillus ochraceus SH0701)斜面保藏菌種,採用劃線法接種於海洋PDA斜面培養基上,在28°C條件下培養5天得到產生孢子的斜面培養物。利用此法將菌種連續活化三次以上備用。4、種子液製備移取5mL無菌陳海水到培養好的海洋赭麴黴斜面培養物上,在無菌條件下再用接種針刮取海洋赭麴黴孢子,製備海洋赭麴黴孢子懸液(IO7個/ml)。按5% 接種量,取海洋赭麴黴孢子懸液IOml,接種到已滅菌含有200mL海洋PDA培養基的500mL三角瓶中,於溫度為28°C、轉速150 180轉/分鐘的電熱全溫震蕩培養箱中,震蕩培養3天, 獲得種子液。5、發酵培養於50L通氣攪拌式發酵罐內加入30L海洋PDA發酵培養基,在121°C下滅菌30min後冷卻至28°C,按接種量5%接入種子液。在通氣量I : O. 5,溫度為28°C, 攪拌速度為250轉/分鐘條件,發酵7天,獲得發酵產物。實施例3海洋赭麴黴Aspergillus ochraceus SH0701 (CCTCC M 2012003)在實施例2的基礎上,從發酵產物提取具有乙醯膽鹼酯酶抑制活性的提取物的方法發酵液提取物的提取方法I.發酵產物經過管式離心機離心固液分離,得到發酵液和菌體。2.發酵液減壓蒸餾濃縮至原體積的三分之一後用等體積的乙酸乙酯萃取3次。3.乙酸乙酯層減壓乾燥得到發酵液提取物。極性段提取物提取方法將上述得到的發酵液提取物以I : 5 (W/V)懸浮在水中,再採用液-液分配萃取法依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇按照I : I比例萃取,把發酵液提取物分成石油醚、 氯仿、乙酸乙酯、正丁醇和水5個極性段。極性段提取物分別為石油醚提取物、氯仿提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物和水提取物。菌體提取物提取方法a.將發酵液提取物提取方法中步驟I得到的.菌體在烘箱中50°C乾燥得乾燥的菌體。b.乾燥的菌體按I : 20 (W/V)加入甲醇萃取3次,合併甲醇提取液。c.減壓蒸餾乾燥得到菌體提取物。實施例4乙醯膽鹼酯酶的抑制活性檢測本實施例測試實施例2中海洋赭麴黴Aspergillus ochraceus SH0701發酵產物和實施例3中發酵液提取物、發酵液提取物的極性提取物及菌體提取物的乙醯膽鹼酯酶抑制活性。發酵產物直接取發酵產物10 μ L進行測試,發酵液提取物及乾燥菌體提取物溶解在甲醇中配置成不同濃度的溶液,取樣品10 μ L進行測試。I、活兔處死後迅速取出大腦,用冷生理鹽水將腦組織表面漂洗乾淨,輕輕用濾紙吸乾表面水份,稱重後按W/V為I : 4的比例與含有O. lmol/L磷酸緩衝液(PH值7. 4)混合,在冰浴條件下,用玻璃勻漿器充分勻漿後,裝入離心管中置於高速冷凍離心機在4°C條件下IOOOOr ·η η-1離心30min,取上清液,即得酶液,記錄體積並在4°C的冰箱中保存備用。2、在96孔板中加入140 μ L的磷酸鹽緩衝溶液,10 μ L酶液,20 μ L顯色劑(DTNB), 20 μ L底物(ATCI)和10 μ L待測物溶液。96孔板置於酶標儀,在波長412nm的可見光下, 每隔I. 5min記錄反應液的A412nm值,持續9min。所有樣品都重複三次。以未加樣品孔(加入相應體積的用培養基或甲醇)的光密度值作為100%,樣品測定孔的光密度與之比較,降低的百分率即為酶抑制率。在IC5tl測試中,每個樣品測5個濃度梯度對乙醯膽鹼酯酶的抑制活性,通過化合物濃度對數對抑制率作圖求IC5tl值(抑制50%酶活性時化合物的濃度)。如圖5所示,發酵液提取物對乙醯膽鹼酯酶的抑制活性呈現劑量依賴關係,不同濃度下發酵液提取物對乙醯膽鹼酯酶的抑制率見表I。其抑制乙醯膽鹼酯酶的IC5tl值為 7. 8±2· 8 μ g/mL。表I不同濃度的發酵液提取對乙醯膽鹼酯酶的抑制作用濃度(μ g/mL)抑制率(%)100096. 34±2. 1010085. 98±4. 271066. 97±0. 82I19. 96±7. 48O. I3. 17±3. 26O. 01I. 48±4. 75發酵培養過程中每隔12小時取樣監測一次,如表2所示,在發酵過程中,發酵開始時, 隨著發酵時間的進行發酵液的乙醯膽鹼酯酶抑制活性迅速升高,發酵到2天時發酵液的乙醯膽鹼酯酶抑制活性達到最高值。其後,發酵液的乙醯膽鹼酯酶活性略有下降,但變化不大。表2不同發酵時間段發酵液對乙醯膽鹼酯酶的抑制活性
發酵時間(h)抑制率(% )0. 50. 58 ±0. 78I24. 60±7. 45I. 563. 94±4. 80281.62±1. 702. 576. 82±6. 51376. 626±5. 103. 571.88±2. 78471. 55±5. 894. 567. 51±4. 31583. 23±3. 975. 566. 10±5. 99667. 18±5. 616. 567. 53±2. 53
發酵液提取物用不同極性的溶劑分段後,各極性段的乙醯膽鹼酯酶抑制活性不同 (見表3),在5 μ g/mL濃度下,乙酸乙酯極性段具有最高的乙醯膽鹼酯酶抑制活性,氯仿相次之。因此,海洋赭麴黴 Aspergillus ochraceus SH0701 (CCTCC M 2012003)發酵產物中的乙醯膽鹼酯酶抑制劑主要分布在中等極性大小的極性段。乾燥菌體提取物在100 μ g/mL 時對乙醯膽鹼酯酶的抑制率65. 2%。表3發酵液提取物的不同極性段對乙醯膽鹼酯酶的抑制活性
抑制率(%)石油醚極性段51. 84±9· 07氯仿極性段65. 06±2· 46乙酸乙酯極性段71. 55±6· 27正丁醇極性段19. 02± I. 82水極性段5. 43±4· 46
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權利要求
1.一種產乙醯膽鹼酯酶抑制劑的真菌,分類命名為海洋赭麴黴Aspergillus ochraceus SH0701,保藏於中國典型培養物保藏中心,保藏日期為2012年I月10日,保藏編號為 CCTCC M 2012003。
2.一種具有乙醯膽鹼酯酶抑制活性的發酵產物,其特徵在於,所述的發酵產物由權利要求I所述的真菌發酵獲得。
3.一種具有乙醯膽鹼酯酶抑制活性的提取物,其特徵在於,所述的提取物由權利要求 2所述的發酵產物提煉獲得。
4.根據權利要求3所述的提取物,其特徵在於,所述的提取物是由權利要求2所述的發酵產物提煉獲得的發酵液提取物。
5.根據權利要求3所述的提取物,其特徵在於,所述的提取物是由權利要求2所述的發酵產物提煉獲得的極性段提取物。
6.根據權利要求3所述的提取物,其特徵在於,所述的提取物是由權利要求2所述的發酵產物提煉獲得的菌體提取物。
7.一種治療阿爾茨海默病的藥物,其特徵在於,包含權利要求2所述的發酵產物或其提煉物,或包含權利要求3所述的提取物或其提煉物,或包含權利要求4所述的提取物或其提煉物,或包含權利要求5所述的提取物或其提煉物,或包含權利要求6所述的提取物或其提煉物。
8.根據權利要求2所述的發酵產物的發酵方法,其特徵在於,包括菌種活化過程、種子液製備過程和發酵培養過程;所述菌種活化過程為取所述保藏菌種,採用劃線法接種於海洋PDA斜面培養基上,培養得到產生孢子的斜面培養物;所述種子液製備過程為將上述的斜面培養物加無菌陳海水後,在無菌條件下刮取孢子,製備孢子懸液;再將孢子懸液接種於海洋PDA培養基中,震蕩培養獲得種子液;所述發酵培養過程為在通氣攪拌式發酵罐內加入海洋PDA發酵培養基,滅菌後,接入種子液攪拌發酵,獲得發酵產物。
9.根據權利要求8所述的發酵方法,其特徵在於,所述的海洋PDA斜面培養基的配置方法為將馬鈴薯去皮切成小塊,於海水中煮沸後過濾;然後在濾液中加入蔗糖和瓊脂粉,加熱溶解後,加海水定容,再經滅菌後獲得海洋PDA斜面培養基。
10.根據權利要求8所述的發酵方法,其特徵在於,所述的海洋PDA發酵培養基的配置方法為將馬鈴薯去皮切成小塊,於海水中煮沸後過濾;然後在濾液中加入蔗糖,加熱溶解後,加海水定容,再經滅菌後獲得海洋PDA發酵培養基。
全文摘要
本發明公開了一種產乙醯膽鹼酯酶抑制劑的真菌及其用途,分類命名為海洋赭麴黴Aspergillusochraceus SH0701,保藏於中國典型培養物保藏中心,保藏日期為2012年1月10日,保藏編號為CCTCCM2012003。該真菌發酵後得到的發酵產物、以及發酵液提取物和菌體提取物均有具有顯著的乙醯膽鹼酯酶抑制活性。乙醯膽鹼酯酶抑制活性的特性使得該真菌發酵產物和發酵產物的提取物可以用於製備治療阿爾茨海默病的藥物。
文檔編號C12N1/14GK102586121SQ20121003998
公開日2012年7月18日 申請日期2012年2月21日 優先權日2012年2月21日
發明者劉煒瑋, 劉玉委, 史大華, 吳小兵, 張鑫鑫, 徐加濤, 朱強 申請人:淮海工學院