利用產生3-hpa的乳酸桿菌與中鏈三酸甘油酯油結合改進哺乳動物免疫功能的方法

2023-12-02 01:47:11 2

專利名稱：：利用產生3-hpa的乳酸桿菌與中鏈三酸甘油酯油結合改進哺乳動物免疫功能的方法利用產生3-HPA的乳酸桿菌與中鏈三酸甘油酯油結合改進哺乳動物免疫功能的方法
背景技術：
：發明領域本發明涉及在用於哺乳動物的產品中採用MCT(中鏈三酸甘油酯)油與乳酸桿菌的特定菌株相結合以實現提高免疫的效果。相關技術的描述在營養學中，通常被稱為脂肪或油脂的物質是被化學家和營養學家們分類為脂質的幾種物質中的一種。脂肪的特徵是不溶於水並且只溶於特定的溶劑例如乙醇中。脂肪與糖類的組成相類似但是每克脂肪提供了更高的能量。它們包含比糖類多2至2.5倍的能量。不幸的是，脂肪在新陳代謝中利用氧氣很不經濟並且結果是很難燃燒。身體需要脂肪用於各種過程，例如它們被用於構建細胞壁和它們為脂溶性維生素(維生素A、D、E和K)提供傳輸機制。有三種類型的脂肪三酸甘油酯、膽固醇和磷脂。在食物中發現的脂肪和油脂主要是三酸甘油酯。三酸甘油酯由甘油和三個脂肪酸鏈組成，甘油是一種醇類三酸甘油酯構成了我們消耗和儲存在身體中脂肪的大部分。它們被分成三個不同的組飽和的、單不飽和的、和多不飽和的。脂肪的分類與它們的化學組成相聯繫。飽和的脂肪酸具有接近的化學結構，它們的碳原子被氫原子"飽和"，使得其它化合物不可能與它們結合。單不飽和脂肪酸具有一個單一的雙鍵和兩個自由碳原子，氫原子的其它化學鍵可以與其發生反應。最後，多不飽和脂肪酸具有兩個或更多雙鍵並且具有多個可以進行結合的自由碳原子。這些雙鍵使得不飽和脂肪酸比幾乎惰性的飽和脂肪酸更具生物活性。作為三酸甘油酯成分的脂肪酸是由不同長度的碳、氧和氫原子鏈組成的。碳鏈的長度導致這些鏈被分成短鏈、中鏈和長鏈三酸甘油酯。中鏈三酸甘油酯(MCT)具有獨特的性質，其能使它們比其它形式的脂肪酸更加具有生物學上可利用性(OsbomH.T.etal,ComprehensiveReviewsinFoodScienceandFoodSafety,Vol1,2002,page93-103)。MCTs繞過了脂肪獲取的常用路線，該路線被身體用來獲取可用的能量。不像其它脂肪，要求身體在使用之前先儲存它們，MCTs需要有限的加工並且在身體的能源系統中能快速獲得而使用。中鏈三酸甘油酯的另一個明顯特徵是不管消耗了多少身體脂肪也不能將它們儲存為身體脂肪。MCT油是天然發生的，並且最豐富的來源是椰子油。絕大多數MCT油是從椰子油中精煉的。MCT油是一種清亮的、無味的、低黏度的液體。MCT油引起了人們的興趣是因為當它在體內新陳代謝時，它的表現更像一種糖類而不是脂肪。身體的優先燃料是糖類，身體在使用其它燃料之前會先用完它的糖類儲存。糖類很快起作用，運動員服用葡萄糖片以提供能量，當我們飲酒時身體很快發熱，通常糖類在吃下去後幾個小時之內就被利用，這就是為什麼我們這樣頻繁的食用它。相反，脂肪的基本角色是儲存能量，動物堆積脂肪已準備過冬。長鏈脂肪(即，常見的種類)通過消化系統轉變成被稱為乳糜微粒的化學品，而他們隨後在進入循環系統之前通過淋巴系統被運輸到身體各處。這是一個相對慢的過程，因此脂肪的代謝要比糖類慢得多。不像其它脂肪，MCT油不進入淋巴系統；相反，它被直接運送到肝臟並在那裡被代謝，因此很快釋放能量，就像一種糖類，並且在此過程中產生很多酮類。MCT常用於各種營養品中，包括醫用營養品，例如非腸道或腸道營養品。已經報導MCTs具有更多的直接健康效果。例如TufanoM.A.等人在"Survivaltolipopolysaccharide,cytokinereleaseandphagocytefunctionsinmicetreatedwithdifferenttotalparenteralnutritionregimens".(ImmunopharmacolImmunotoxicol.1995Aug;17(3》493-509)中報導了帶有長-(LCT)和中鏈三酸甘油酯(MCT)的全胃腸道外營養(TPN)對宿主抵抗力的效果。在經受了脂多糖(LPS)刺激，大腸桿菌co//)的血液清除之後，研究了腫瘤壞死因子a(TNF-a)和白細胞介素-6(IL-6)在體內和體外的產量。在BALB/c小鼠中，與對照相比LCTs降低了25X的死亡率。帶有LCT和MCT混合物的TPN實現降低死亡率50%。臨床仔細控制三酸甘油酯注射的濃度，特別是MCT的濃度，有可能提供抗腫瘤的效果並且維持正常的免疫系統(KimotoY.etal.;Antitumoreffectofmedium-chaintriglycerideanditsinfluenceontheself-defensesystemofthebody;CancerDetectPrev.1998;22(3》219-24)。MCT油本身也作為營養配方中的一部分而被介紹，例如在歐洲專利EP0756827和美國專利US6589576中，但是沒有與任何乳酸桿菌結合。而且，歐洲專利EP1344458A1公開了一種保護益生菌有機體例如乳酸桿菌的方法，將它們製成小球，優選地最小體積為0.02cm3並且隨後可以用各種載體包被，包括MCT油。該工作與本發明的核心不相同，即本發明涉及在一種液體產品中將產生所選擇的3-HPA(卩-羥基-丙醛)的乳酸桿菌菌株與MCT油相結合以提高免疫能力。根據普遍接受的定義，益生菌是一種活的微生物飼料補充劑，其通過改善宿主動物腸內的微生物平衡而給宿主動物帶來有益效果。雖然最初指的是農場動物的動物飼料補充劑，該定義也很容易接受為適用於人類的情況。人類消耗的主要益生菌是包含腸道乳酸桿菌和雙歧桿菌菌種的乳製品形式的食品。在定義中暗示益生菌的消耗影響腸內的微生物菌落的組成。有人提出益生菌對腸內生態系統的這種影響，有益於攝取者。通過益生菌的作用而改變腸內微生物菌群所帶來的多種益處已有文獻指出的包括提高對傳感性疾病的抵抗力，尤其是腸的，減少腹瀉的持續時間，降低血壓，減少血液中膽固醇的濃度，減少過敏，刺激外周血白細胞的吞噬作用，調節細胞因子基因表達，輔助作用，消退腫瘤，以及減少致癌物或輔致癌物的產生。很多種類的乳酸桿菌菌株，包括路氏乳酸桿菌已經被用於配製益生菌製劑。路氏乳酸桿菌是一種在動物胃腸道中天然產生的居住者，並且通常發現於健康動物，包括人的腸內。已知它具有抗微生物活性。參見美國專利US5,439,678、5,458,875、5,534,253、5,837,238、和5,849,289。當路氏乳酸桿菌細胞在存在甘油厭氧條件下生長時，它們產生被稱為P-羥基-丙醛(3-HPA)的抗微生物物質。3-HPA是一種代謝中間產物，通過幾種乳酸桿菌從細胞分泌。那些已知輸出3-HPA的細菌種類包括路氏乳酸桿菌、棒狀乳桿菌、丘狀乳桿菌、希氏乳桿菌等(ClaisseO等人JFoodProt.2001Jun;64(6):833-7)(SauvageotN等人IntJFoodMicrobiol.2000Apr10;55(l-3):167-70)。長久以來人們就知道3-HPA具有抗微生物特性，這部分解釋了生產菌株殺死病原菌的能力。乳酸桿菌包括路氏乳酸桿菌和棒狀乳桿菌，也已經顯示出會對它們的宿主有機體的免疫系統產生影響。參見，例如WagnerRD等人的"Biotherapeuticeffectsofprobioticbacteriaoncandidiasisinimmunodeficientmice"(InfectImmune1997Oct65:4165-72);然而，在菌株之間存在效果的差異並且需要提高效果的方法，例如在WO2004/034808中提供的選擇募集CD4+細胞並且結合毒素的菌株的方法。乳酸桿菌刺激或修飾宿主免疫細胞活性的確切機制仍然不太清楚。許多研究顯示釋放到生長基質中的來自所選擇的乳酸桿菌中的特異性物質負責調節宿主細胞的免疫應答。這些物質一般被認為是蛋白質，多肽和核酸。例如，參見Pena等人的CellMicrobiol.2003Apr;5(4):277-85。本發明在此提供了一種用於提高特定乳酸桿菌在一些動物包括人類中的免疫調節作用的新方法，即通過將產生所選擇的3-HPA的乳酸桿菌與MCT油相結合。這種組合的效果除了包括以前已知的那些乳酸桿菌的免疫調節以外還包括那些乳酸桿菌的抗微生物作用。它帶來的效果是產生3-HPA並且通過這種物質而直接作用於淋巴細胞的增殖。3-HPA或者其前體甘油、或者其代謝產物、1,3-丙二醇和3-羥基-丙酸，此前並沒有被作為哺乳動物免疫系統的潛在調節劑而公開。雖然幾種乳酸桿菌可能抗微生物活性的作用是已知的，並且其特定的免疫調節作用也是已知的，但是以前並不知道通過將產生3-HPA的菌株與MCT油相結合能明顯提高免疫調節作用。因此本發明的一個目的是提供在適當條件下已知產生3-HPA的乳酸桿菌的菌株並且將它們與MCT油結合從而提高免疫調節。本發明的另一個目的是提供包含所述菌株和MCT油的產品給動物，包括人類施用。其它的目的和優點將通過以下的說明和權利要求而更加清楚。發明概述本發明這裡是一種利用產生所選擇的3-HPA的乳酸桿菌與MCT油結合而提高哺乳動物免疫功能的方法。這種組合的效果不僅僅是以前已知的那些乳酸桿菌的免疫調節和抗微生物作用。它帶來的效果是3-HPA的產生並且通過這種物質而直接作用於淋巴細胞的增殖。其它的目的和優點將通過以下的說明和權利要求而更加清楚。圖1顯示了吞噬細胞檢測結果A，細胞對照；Bl，路氏乳酸桿菌溶菌產物(800|ig/ml);B2，路氏乳酸桿菌溶菌產物(40(^g/ml);B3，路氏乳酸桿菌溶菌產物(200pg/ml);B4，路氏乳酸桿菌溶菌產物(100pg/ml);B5,路氏乳酸桿菌溶菌產物(50^ig/ml);Cl，單核細胞增生李斯特菌溶菌產物(800嗎/ml);C2，單核細胞增生李斯特菌溶菌產物(400pg/ml);C3,單核細胞增生李斯特菌溶菌產物(200^ig/ml);C4，單核細胞增生李斯特菌溶菌產物(100(ag/ml);D，路氏乳酸桿菌上清液(MRS);E,路氏乳酸桿菌上清液(甘油溶液)；F，路氏乳酸桿菌+單核細胞增生李斯特菌溶菌產物。圖2顯示了淋巴細胞增殖檢測結果B，ConA(6.25pg/ml);C，PWM(5^g/ml);D，PHA(6.25pg/ml);E5，LPS(2.5ng/ml);Fl，路氏乳酸桿菌溶菌產物(40(^g/ml);F2，路氏乳酸桿菌溶菌產物(200|ig/ml);F3，路氏乳酸桿菌溶菌產物(100ng/ml);F4，路氏乳酸桿菌(50嗎/ml);Gl，路氏乳酸桿菌上清液(MRS100W);G2，路氏乳酸桿菌上清液(MRS50|il);Hl，路氏乳酸桿菌上清液(甘油溶液lOOpl);H2，路氏乳酸桿菌上清液(甘油溶液50W)。圖3顯示了在RL(路氏乳酸桿菌)和PC(陽性對照)治療中施用單核細胞增生李斯特菌(6d)3天後的細菌數。圖4a-4g顯示的是接種單核細胞增生李斯特菌之後3天(6d)和2個星期(17d)主要免疫細胞的分析結果。具體地，圖4a顯示(beta)TCR+CD3-T細胞，圖4b顯示CD4+CD25+T細胞，圖4c顯示CD8+T細胞，圖4d顯示CD4/CD8比率，圖4e顯示(gamma,delta)TCR+CD25+T細胞，圖4f顯示NK+CD28+細胞，以及圖4g顯示NK+細胞。圖5是本發明產品製備工藝一個實施例的流程圖。發明詳述和優選實施例令人^C奇地發現，乳酸桿菌在甘油條件下培育所產生和輸出的物質或代謝物能夠刺激免疫系統的重要細胞成分以及全面提高宿主免疫系統並且能夠抗感染。飼餵物質(例如油、脂肪和脂質)並且期望通過在胃腸道代謝產生甘油的條件與從甘油中產生3-HPA的乳酸桿菌相結合，剌激宿主的免疫系統。MCT油是本發明這裡最佳的添加劑，如下所述。因此，以這樣的方式將乳酸桿菌輸送給宿主是有優勢的。本發明的一個優選實施例是一種產品，包含MCT油和產生3-HPA的乳酸桿菌，其被製備和用於患有脂肪代謝發育不良的人口服或者插管詞餵到胃腸道中，例如大多數正常的嬰兒和幼兒，但是也包括患有脂肪代謝障礙的成人。原因是本發明的MCT-油的脂肪代謝，例如，通常胃腸道中不產生甘油而是產生單醯基甘油(仍然帶有一個脂肪酸的甘油)。這些單醯基甘油通過消化道的壁被吸收並且在肝和循環系統中被加工成新的脂質；然而，例如，人乳中分泌的膽汁鹽刺激的脂酶被發現缺乏位置特異性，即，它水解乳化的三醯基甘油成甘油和脂肪酸。它還水解微粒化的sn-2單醯基甘油("sn"指的是脂肪酸在醯基甘油的甘油骨架上的位置，例如，sn-2位置是脂肪酸在甘油骨架的中間位置)。這與胰脂酶相反，該酶顯著優先水解sn-l和sn-3酯鍵。當兩種酶一起作用時，比如在母乳餵養的嬰兒腸胃中，通過胰脂酶所形成的sn-2單醯基甘油成為了膽汁鹽剌激脂酶的極好的底物。(PediatricResearch,Vol16,882-885,Digestionofhumanmilklipids:physiologicsignificanceofsn-2monoacylglycerolhydrolysisbybilesalt-stimulatedlipase,O.HernellandL.Blackberg)。這樣，三醯基甘油水解的終產物就成為甘油和脂肪酸而不是sn-2單醯基甘油和脂肪酸。膽汁鹽刺激的脂酶還催化脂肪酸摻入到醯基甘油中，但其程度遠遠小於胰脂酶。膽汁鹽刺激的脂酶的這兩種作用一起促進了管腔內的脂解作用整個過程。在新生嬰兒中，十二指腸內的膽汁鹽濃度很低，甘油和脂肪酸也應該比單醯基甘油和脂肪酸更加容易吸收。因此，作為胰脂酶的補充，膽汁鹽剌激脂酶可以確保嬰兒和其它脂肪消化和吸收機制不成熟的人充分利用例如牛奶脂質。結果，例如，嬰兒具有的從他們母乳(或者配方奶)中獲取脂質的不同系統，因為他們的脂肪代謝不成熟，因此，作為哺乳嬰兒補充劑的產生3-HPA的乳酸桿菌在這樣的情況下具有相當豐富的甘油來源共同作用，但是為了確保獲得可以代謝為產生3-HPA的分泌物的脂肪並且提高本發明的免疫功能，本發明的計劃是一種脂肪來源，例如MCT油應該和產生3-HPA的乳酸桿菌一起被分送。這有助於提高例如嬰兒的免疫系統的作用。在以上優選的實施例中，本發明的產品被分送到胃腸道中以提高接受者體內整個或局部的免疫系統。在胃腸道中產生的3-HPA可以影響整個免疫系統的原因是胃腸道中豐富的免疫功能。這是通過，例如，細胞例如生長在黏膜和腸壁上的巨噬細胞和淋巴細胞。很多本領域的專家認為胃腸道是人身體中最大的免疫器官("Overviewofgutfloraandprobiotics"，Holzapfel,W.H.et.al"InternationalJournalofFoodMicrobiology,May1998)。在本發明的另一個優選實施例中可以採用一種相似的產品，例如包含MCT-油和產生3-HPA的乳酸桿菌，但是局部施用用於增強免疫系統和抵抗皮膚疾病。通過皮膚上皮的分散和與皮下免疫細胞的相互作用能夠提高對抗病原菌的免疫作用同時減少炎症反應和治療，例如溼疹、痤瘡和傷口。MCT油是不常見的脂質，它們迅速裂解並且能快速發生甘油，這就是MCT被用於本發明中以提高的免疫效果的原因。根據本發明的益生菌、預防劑和藥物製劑產品可以包含營養或藥物使用可接受的任何添加劑和賦形劑。中鏈三酸甘油酯油是一種含油的中鏈三酸甘油酯，即甘油的中鏈脂肪酯。中鏈脂肪酸是本領域公知的並且包含6至12個碳原子，優選8至10個碳原子例如辛酸和癸酸。來自卡爾斯港的AkomedR是根據本發明可用的MCT油的實施例。它包含辛/癸三酸甘油酯。從以下例子可以看到，用於本發明的MCT油在市場上可容易獲得。可以採用不同的方法分離產生3-HPA的乳酸桿菌，例如RodriguesE,等人所描述(LettersinAppliedMicrobiologyVolume37Issue3Page259-September2003)。優選的種類之一是路氏乳酸桿菌並且一個優選菌株是路氏乳酸桿菌ATCC55730。本發明的特徵通過參考以下例子將被更加清楚的理解，其不應該被解釋成本發明的限制。實施例1:巨噬細胞中提高的吞噬活性概述路氏乳酸桿菌上清液取自存在和不存在甘油(50mM)條件下生長的路氏乳酸桿菌ATCC55730中。這些上清液被用於預處理腹巨噬細胞(取自6周齡的SPFBALB/c小鼠)過夜孵育。巨噬細胞隨後採用單核細胞增生李斯特菌接種以確定它們的吞噬細胞能力。孵育2小時後，確定在巨噬細胞中存活的單核細胞增生李斯特菌的數量。對照在不存在路氏乳酸桿菌上清液的條件下孵育，顯示出在這些條件下巨噬細胞中明顯的單核細胞增生李斯特菌存活率。利用生長在不存在甘油條件下的路氏乳酸桿菌細胞的上清液預處理巨噬細胞，與對照孵育相比，不影響吞噬細胞吞噬作用(圖1)。然而，令人驚奇的是，利用來自生長在存在甘油條件下的路氏乳酸桿菌細胞的上清液預處理巨噬細胞導致巨噬細胞有效殺死所有的單核細胞增生李斯特菌。因此，在存在甘油情況下生長的路氏乳酸桿菌能夠刺激細胞的吞噬活性。單獨存在甘油的培養基(對照)不具有這樣的效果(對照"H"與其它對照相同)。利用路氏乳酸桿菌或單核細胞增生李斯特菌的酶解物預處理巨噬細胞，可以以一種劑量依賴的方式誘導相似但是不太顯著的巨噬細胞吞噬作用活性的刺激。在路氏乳酸桿菌中甘油-誘導的代謝導致更有效地刺激吞噬細胞活性，優於抗原暴露的誘導。實驗詳述研究方法l.吞噬細胞檢測和淋巴細胞增殖檢測。淋巴細胞和腹巨噬細胞分離自特異的無病原菌BALB/c小鼠(6周齡)並且被用於檢測宿主中的任何免疫再增強效果。吞噬作用利用腹巨噬細胞。-腹巨噬細胞的分離。BALB/c小鼠拉頸處死，隨後採用5ml的IMDM培養基(Iscove'smodifiedDulbecco'smedium)浸漬並且按擦。回收浸漬的IMDM，並且採用酞酚藍顯示技術計數活的細胞並且以調節的終濃度lxlO"ml用於實驗中。-細菌溶菌產物的製備。路氏乳酸桿菌SD2112和單核細胞增生李斯特菌HPB3血清型4b分別在MRS+0.02M葡萄糖培養基和胰酶大豆培養基(TSB)中孵育24小時，並且在8,000rpm離心20分鐘以收集細胞碎片。細胞碎片利用0.9%NaCl溶液清洗兩次。隨後在60'C加熱3小時滅活，並且蛋白質的濃度通過雙辛可寧酸(BSA)蛋白檢測方法計算並且調節到5mg/ml。-路氏乳酸桿菌上清液的製備。路氏乳酸桿菌在MRS+0.02M葡萄糖培養基中孵育24小時並且離心以獲得MRS培養基上清液。上清液懸浮在0.05M甘油溶液中並且孵育6小時，隨後回收甘油溶液上清液。回收的細胞碎片數量高達2g/30ml(溼重)。在調節pH至7.3之後所有回收的上清液被採用。-吞噬作用檢測。腹巨噬細胞被懸浮在IMDM+10。/。馬血清中，4xl05個細胞每孔，並且利用各種濃度的路氏乳酸桿菌、單核細胞增生李斯(待菌細胞溶菌產物和路氏乳酸桿菌上清液過夜孵育處理，濃度和條件如下表l、吞噬作用檢測的處理條件tableseeoriginaldocumentpage13MRS對照和甘油溶液對照通過在培養基中調節PH而被採用，其沒有用路氏乳酸桿菌孵育。用上述條件處理的腹巨噬細胞被孵育在TBS中並且用敘104單核細胞增生李斯特菌(HPB3血清型4b,慶大黴素敏感)接種並用0.9%NaCl溶液清洗。在37。C孵育2小時之後，清洗巨噬細胞並隨後釆用200ng/ml慶大黴素處理以殺死細胞外的細菌。細胞採用磷酸鹽緩衝液(PBS)清洗三次並採用0.5ml/孔的PBS+0.5%TritonX-100溶解以暴露細胞內的微生物。然後，細菌的數量通過連續稀釋利用Palcani瓊月旨(Oxoidme,Ogdensburg，N.Y"USA)和胰酶大豆瓊脂(OxoidInc,Ogdensburg,N.Y.，USA)採用薄層方法進行計數。實施例2:提高的淋巴細胞增殖概述從BALB/c小鼠脾和胸腺製備淋巴細胞，並孵育在存在和不存在甘油(50mM)情況下生長的路氏乳酸桿菌ATCC55730的上清液中。選擇路氏乳酸桿菌ATCC55730是由於它是已知的3-HPA的良好生產者並因此符合本發明的選擇要素。對照孵育採用單獨的甘油，單獨的培養基和已知的淋巴細胞增殖刺激劑。已知的剌激劑(ConA,PWM，PHAabdLPS)引發顯著的淋巴細胞增殖刺激。來自路氏乳酸桿菌的溶菌產物導致一個小的，劑量依賴的淋巴細胞增殖刺激，並且與來自生長在不存在甘油情況下的路氏乳酸桿菌上清液孵育沒有導致淋巴細胞增殖的明顯提高。令人驚奇的是，生長在存在甘油情況下的路氏乳酸桿菌的上清液導致淋巴細胞的增殖水平提高至明顯高於所見到的已知刺激劑達到的水平(見圖2)。實驗詳述淋巴細胞增殖檢測-分離脾和胸腺淋巴細胞。BALB/c小鼠拉頸處死，分離它們的胸腺，浸漬在Hanks'平衡鹽溶液(HBSS)中並且逐步粉碎以獲得單個細胞。單個細胞通過Histopaque-1083(Sigma)中的雙層離心以獲得淋巴細胞。這些細胞用IMDM清洗兩次，並且活著的細胞通過苔酚藍顯示技術計數並且以調節的最終濃度1x10々mL用於實驗中。-細菌溶菌產物的製備。如在吞噬作用檢測中所述，製備路氏乳酸桿菌和單核細胞增生李斯特菌溶菌產物。-路氏乳酸桿菌上清液的製備。如在吞噬作用檢測中所述，製備路氏乳酸桿菌上清液。-淋巴細胞增殖檢測。採用將淋巴細胞懸浮在IMDM+10。/。馬血清中4"06個細胞每孔進行淋巴細胞增殖檢測。利用不同濃度的路氏乳酸桿菌，單核細胞增生李斯特菌細胞溶菌產物和路氏乳酸桿菌上清液和參照刺激劑處理淋巴細胞，濃度和條件如下表2.淋巴細胞增殖檢測的處理條件tableseeoriginaldocumentpage15在表2所報導的結果中，MRS對照和甘油溶液對照通過在沒有與路氏乳酸桿菌孵育的培養基中調節pH而被採用，並採用如下符號:ConA:伴刀豆球蛋白A，PWM:美洲商陸有絲分裂原，PHA:植物血球凝集素，LPS:來自鼠傷寒沙門氏菌的脂多糖。根據每個條件，向包含淋巴細胞的孔中加入包括ConA的刺激劑，在阿爾瑪藍以10%濃度被加入前的3小時。加入每種刺激劑72小時之後，採用OD570nm-OD600nm的值確定淋巴細胞增殖水平。淋巴細胞增殖結果描繪為刺激指數(SI)，它是(OD處理液-OD培養基對照)/OD細胞對照的比值，然而，在路氏乳酸桿菌上清液處理小組的情況中，是J和K處理液小組的值，而不是IMDM+10。/。馬血清，被用作OD培養基對照值。小鼠體內剌激和免疫細胞分布率的改變特定的無菌BALB/c小鼠(6周齡)被分成4個小組。路氏乳酸桿菌和單核細胞增生李斯特菌被製備成5xl0V小鼠並且口腔施用。在施用單核細胞增生李斯特菌之前30分鐘，施用0.25M的10%碳酸氫鈉以提高單核細胞增生李斯特菌的存活率。表3、鼠處理小組tableseeoriginaldocumentpage16為了研究路氏乳酸桿菌抵抗單核細胞增生李斯特菌的保護作用，每組中分別有8隻小鼠在施加單核細胞增生李斯特菌之後的3天(6d)和14天(17d)被處死，並取出血液，肝臟和脾。此外，為了研究路氏乳酸桿菌本身在免疫機制中的作用，NC小組和R小組中都分別有8隻小鼠在31d被進一步檢測。1)計算在肝臟和脾中的單核細胞增生李斯特菌稱量來自每個小鼠組中的肝臟和脾並且用10ml的PBS(pH7.0)在攪拌器中均質化。活著的細菌連續稀釋採用Palcam瓊脂計數。2)採用流式細胞計檢測免疫細胞-從血液中分離白細胞。從2-3隻動物抽血並且在Histopaque-1083中以1,500rpm雙層離心30分鐘，之後從淋巴細胞層中收集淋巴細胞。它們被磷酸鹽緩衝液(PBS)清洗三次並用RPMI-1640培養基懸浮，隨後活著的細胞採用苔酚藍顯示技術計數並調節最終濃度為lxl0々ml而用於實驗中。-流式細胞檢測採用白細胞表面單克隆抗體。分離的白細胞懸浮在含有20%山羊血清的第一清洗緩衝液中(PBS450ml,ACD50ml，20%NaN35ml，無y球蛋白(gammaglobulin)的馬血清10ml，250mMEDTA20ml，0.5%酚紅1ml)，並且在4。C致敏10分鐘。離心之後，每個V-型底96孔微板的孔中被加入100pl白細胞一表面抗原特異性單克隆抗體和lxl07/ml的5(^1從血液分離的，提前在4°C超敏化30分鐘的白細胞。進行二元染色，所用試劑與表4中的相同。採用第一清洗緩衝液清洗三次之後，剩餘的白細胞用4。C的第二緩衝液清洗三次，該緩衝液與第一緩衝液基本相同除了馬血清被去除，並混合了2%福馬林溶液。多於2,000的染色細胞通過流式細胞術檢查，數據分析通過CellQuestprogram(BectonDickinson)的方式進行。表4、用於免疫細胞檢測中的單克隆吸附tableseeoriginaldocumentpage18結果和討論1)採用腹巨噬細胞檢測吞噬作用採用腹巨噬細胞檢測吞噬作用的結果見圖1。如圖所示，腹巨噬細胞吞噬作用檢測的結果被證實在採用路氏乳酸桿菌甘油溶液上清液和路氏乳酸桿菌+單核細胞增生李斯特菌溶菌產物(PO.05)處理的情況中最高。換句話說，路氏乳酸桿菌甘油溶液上清液無論是lOO)il或50)^1處理具有相同的效果，並且幾乎完全殺死被巨噬細胞所吞噬的單核細胞增生李斯特菌。每個400、200禾卩100pl/ml的路氏乳酸桿菌+單核細胞增生李斯特菌溶菌產物的混合處理液部分殺死被巨噬細胞所吞噬的單核細胞增生李斯特菌。單獨用路氏乳酸桿菌溶菌產物處理的小組比以上兩個處理小組的吞噬活性要低並且單核細胞增生李斯特菌即使在被吞噬後仍然存活，雖然路氏乳酸桿菌溶菌產物處理小組(B)的吞噬細胞活性被看見高於單核細胞增生李斯特菌溶菌產物處理小組(C)(P0.05)。在這些結果的啟發下，認識到路氏乳酸桿菌溶菌產物本身和它的代謝物能增強腹巨噬細胞的吞噬活性，特別是在病原菌溶菌產物存在的情況下，例如單核細胞增生李斯特菌。考慮到採用MRS培養基上清液處理的小組被發現不能增強腹巨噬細胞的吞噬活性；而採用甘油溶液上清液處理的小組顯示高的吞噬活性，增強吞噬細胞活性的物質被假定為甘油代謝物同時也不能假定排除是具有高抗生素活性的無蛋白菌素的可能性。這件事被認為需要通過隨後的試驗進一步研究。採用單核細胞增生李斯特菌溶菌產物處理的小組液被發現具有某種程度增強的吞噬活性，雖然它的活性低於路氏乳酸桿菌溶菌產物處理的小組。應該考慮到這個結果不是採用活著的單核細胞增生李斯特菌處理獲得的結果，令人注意的特殊性在於吞噬活性被確認在採用高濃度單核細胞增生李斯特菌溶菌產物處理的小組中降低。這似乎表明巨噬細胞的活性被存在於高濃度的單核細胞增生李斯特菌溶菌產物中的幾種毒性因子抑制。2)淋巴細胞增殖檢測圖2中所示的結果是採用從脾和胸腺分離的淋巴細胞進行的淋巴細胞增殖檢測。從脾和胸腺分離的淋巴細胞的增殖在路氏乳酸桿菌上清液(甘油溶液)處理小組中被證實最高(P<0.05)。在實驗中所採用的一種檢測增殖的方法是阿爾瑪藍檢測，其原理是由於細胞增殖而還原的試劑的程度。不能排除它的值可能由於醛氧化作用而高於試劑還原程度因為路氏乳酸桿菌上清液(甘油溶液)包含3HPA，一種醛。然而，茵為路氏乳酸桿菌上清液(甘油溶液)處理小組的細胞增殖在顯微觀察下也被認定是最高的，路氏乳酸桿菌上清液(甘油溶液)的淋巴細胞增殖能力可以被證實。僅僅採用路氏乳酸桿菌溶菌產物處理的小組也被確認具有某種程度的淋巴細胞增殖活性，雖然這種活性低於參照的刺激劑。實施例3:給人類幼兒施用MCT油中的路氏乳酸桿菌以研究溼疹的減少實施本研究以確定單純的飲食補充路氏乳酸桿菌和MCT油是否可以影響目前進行標準治療的幼兒特應性溼疹的治療。倫德的兒童醫院中研究的病例顯示至少一個患有持續性溼疹，標準治療不起作用的JL童通過30天的飲食補充路氏乳酸桿菌和MCT油而使溼疹題得以解決。本研究明確了採用路氏乳酸桿菌的標準治療補充被證實在受控制的研究條件下具有這樣的效果。這項研究的主要終點是在12個月的治療期間對於施用路氏乳酸桿菌和MCT油根據有效的評分系統(SCORAD)認定的溼疹程度和嚴重性的減少。治療開始時對評分進行標準化。在治療的3、6、9和/或12個月路氏乳酸桿菌-MCT小組的評分降低比安慰劑小組顯著被認為是主要終點。這是一項連續進行的雙盲隨機研究。診斷有中度特應性皮炎的並得到父母知情同意的年齡介於3個月至3歲之間(即快到但不包括4周歲生日的)的患者被包括在本研究中。診斷不需要是新的，例如已經在標準治療下的兒童也可以被包括在內。招募的患者來自看過敏病的患者人群。研究者向可能的參與者的父母提供有關研究的信息，如果滿足納入的標準，則獲得書面同意，患者被包括進來。患者被隨機分成兩個組，每個組包含20名患者。一個小組接受在MCT油中的路氏乳酸桿菌補充品而另一組接受僅僅包含MCT油的安慰劑配方。研究的產品被服用12個月。研究者基於患者的檢査填寫溼疹評分並且將溼疹拍照。根據調查表記錄家庭環境以確定在家庭環境中的危險因素。研究產品被交給父母並開始日常的服用。兩組繼續進行他們的溼疹常規藥物治療的處方。為了檢測類固醇的使用，患者的父母被要求將所有他們的類固醇處方攜帶到醫院並且藥品被稱重和記錄。患者的父母在接受研究產品後一個月接受電話訪問以監控進程並且患者返回醫院進行全面檢查，溼疹的照片文件和更新的溼疹評分在3、6、9和12個月後完成。12個月完成治療。在研究開始取得血液樣本以確定患者的總IgE水平和gm異型，並且在研究完成時再次確定總IgE水平。在兩個時間點進行針對雞蛋，牛奶，魚，貓和花生的皮膚穿刺檢測。研究產品的容器被收回，稱重並且記錄以確保達到要求。劑量在整個研究中，在MCT油中的路氏乳酸桿菌以1x1(fCFU/天的劑量被施用，其相當於10滴路氏乳酸桿菌-MCT油。在安慰劑組中相等劑量的MCT油被施用。藥劑/幹涉/飲食所有形式的類固醇是允許的並且如果需要可進行特殊的飲食。患者在研究期間應該完全避免所有其它種類的添加了乳酸桿菌和益生菌的食物。定義溼疹嚴重性和程度的界定根據SCORAD指數(KunzB，OranjeAP，LabrezeL，StalderJF,RingJ，TaiebA.Dermatology.1997;195(1):10-9.ClinicalvalidationandguidelinesfortheSCORADindex:consensusreportoftheEuropeanTaskForceonAtopicDermatitis)。每次就診的程序研究要求父母帶著患者進行共計5次的臨床檢査和一次與一名父母的電話交流。第一次就診(O天)書面同意之後，患者被包括在研究中。根據調査表記錄患者的家庭環境以確定家庭環境中皮炎危險因素。研究者根據患者的檢查結果填寫溼疹評分，並且溼疹被拍照。對血液取樣以分析總的IgE以及gm異型(變態反應的遺傳決定簇)。進行皮膚穿刺試驗以確定對雞蛋、牛奶、魚、花生和貓的過敏反應。每名患者接受隨機的數字並將相應的研究產品(兩瓶)交給其父母開始日常的服用。所有的患者繼續他們常規溼疹藥物治療的處方。為了檢測類固醇的使用，患者的父母被要求攜帶他們所有的處方類固醇到醫院並且藥品被稱重和記錄。電話訪問(l個月)第一次就診後的1個月後與患者的父母進行電話聯繫以監控進展，確保研究產品被服用並鑑別父母/患者在遵從研究協議中遇到的任何問題。第二次就診(3個月)患者返回醫院進行全面檢査，對溼疹進行拍照記錄並完成對溼疹評分表的更新。患者的父母被要求攜帶所有的處方類固醇到醫院並且藥品被稱重和記錄。首批的兩瓶研究產品被稱重並記錄。一瓶應該是空的並且被研究者保留。另一瓶應該空了一部分並被保留在研究中繼續使用。另外兩瓶研究產品在本次就診中被交給父母。第三次就診(6個月)患者返回醫院進行全面檢查，對溼疹進行拍照記錄並完成對溼疹評分表的更新。患者的父母被要求攜帶所有的處方類固醇到醫院並且藥品被稱重和記錄。研究產品的瓶子被稱重並記錄。兩個瓶子現在應該空了並被研究者保留。第三瓶差不多是滿的並被保留繼續在研究中使用。在本次觀察中另外兩瓶研究產品被交給父母。第四次就診(9個月)患者返回醫院進行全面檢查，對溼疹進行拍照記錄並完成對溼疹評分表的更新。患者的父母被要求攜帶所有的處方類固醇到醫院並且藥品被稱重和記錄。研究產品的瓶子被稱重和記錄。一瓶應該是空的並被研究者保留。第二瓶應該空了一半而第三瓶是滿的。這兩瓶被保留繼續用於研究中。第五和最後一次就診(U個月)患者返回醫院進行全面檢查，對溼疹進行拍照記錄並完成對溼疹評分表的更新。取出血液樣本分析總IgE的量。進行皮膚穿刺試驗以確定對雞蛋，牛奶，魚，花生和貓的過敏反應。患者的父母應該攜帶所有的處方類固醇到醫院並且藥品被稱重和記錄。研究產品的瓶子被稱重和記錄。保留下來的兩瓶現在應該是空的並被研究者保留。統計方法和樣本大小的確定患者隨機分成兩組，每組包括25人。一般對於每個研究，基於前面的結果，確定治療50%有效(如在較早的研究中)和80%有作用，估計每組有20就足以表現出效果。每組包括的另外5個孩子預備有中途退出的情況。結果概述和討論表5、在0，3，6，9和12個月的溼疹評分tableseeoriginaldocumentpage24tableseeoriginaldocumentpage25平均值37.6526.5025.7024.4527.30路氏乳酸桿菌菌株ATCC55730作為一種良好的3-HPA的產生菌與MCT油相結合對溼疹有很重要的改善。實施例4:包含所選擇菌株的產品的製備製備工藝的描述在圖5中顯示了優選製備工藝的流程圖。一個可用於在本發明中這樣的可行工藝如下。1、成分的混合將中鏈三酸甘油酯例如AkomedR(KarlshamnsAB5Karshamn，Sweden)與二氧化矽，Cab-o-silM5P,(M5P,Cabot)在一臺Bolz混合器(ManufacturerAlfredBOLZApparatebauGmbH,WangenimAllgau,Germany)中混合。2、均質化一臺正弦泵和dispax粉碎機(SinePump,Arvada,Colorado,UnitedStates)被連接到Bolz混合器上並且混合物被均質化。3、真空乾燥混合物在Bolz缸中在10mBar真空中被乾燥12小時以去除油中的水分從而延長產品的保質期。4、加入路氏乳酸桿菌大約20kg乾燥的油化合物被移到50升不鏽鋼容器中。路氏乳酸桿菌粉末，例如，凍幹的細胞，以想要的數量被懸浮於油中。例如，加入0.2&§活性為10"CFU/g的培養物。它被緩慢混合直至均質化。5、混合與路氏乳酸桿菌的預混合物放回到BoIz混合器中。6、出料懸浮液被倒進一個200升玻璃容器中，並用氮氣覆蓋。懸浮液保存在容器中直至被裝入產品瓶子中。這裡所配製的產品可用於口服。可替代的，配製用於管飼的產品可以添加本領域已知的腸營養品，或者用於皮膚局部應用的採用本領域公知的標準成分而使其適合於外用。雖然這裡已經介紹了特定的實施例，本領域技術人員很清楚可以作出各種修飾，這些均沒有背離本發明的精神和範圍。權利要求1、一種用於提高哺乳動物包括人類免疫功能的產品，包括與中鏈三酸甘油酯油相結合的、產生3-HPA的乳酸桿菌。2、如權利要求l所述的產品，其中，乳酸桿菌選自由路氏乳酸桿菌菌株所組成的組。3、如權利要求2所述的產品，其中，路氏乳酸桿菌是菌株ATCC55730。4、如權利要求1所述的產品，其中，中鏈三酸甘油酯油是AkomedR。5、如權利要求l所述的產品，其中，所述產品被配製用於口服。6、如權利要求l所述的產品，其中，所述產品被配製用於導管飼養，以作為腸營養品的添加劑。7、如權利要求l所述的產品，其中，所述產品被配製用於局部皮膚應用。8、一種用於提高哺乳動物包括人類免疫功能的方法，包括向哺乳動物施用與中鏈三酸甘油酯油相結合的、產生3-HPA的乳酸桿菌。9、如權利要求6所述的方法，其中，產品通過口服施用。10、如權利要求6所述的方法，其中，產品應用於皮膚。全文摘要本發明涉及一種利用能夠產生所選擇的3-HPA的乳酸桿菌與中鏈三酸甘油酯(MCT)油相結合來改進哺乳動物免疫功能的方法。文檔編號A61K35/74GK101184497SQ200680014891公開日2008年5月21日申請日期2006年5月2日優先權日2005年5月6日發明者埃蒙·康諾利,霍金·康申請人:生命大地女神有限公司