幹細胞外泌體的分離方法與流程

2023-11-01 13:36:32

本發明涉及細胞生物學
技術領域：
，具體涉及一種幹細胞外泌體的分離方法。
背景技術：
：外泌體(exosome)是由細胞內的多泡體(multivesicularbody,mvb)與細胞膜融合後，釋放到細胞外基質中的一種直徑約30～150nm的膜性囊泡。很多細胞均能分泌外泌體，如t細胞、b細胞、樹突細胞、肥大細胞和腫瘤細胞等。外泌體中包含有多種蛋白質和rna,在細胞之間起到傳通信息和相互調控的作用，而這種傳速信息的方式和相互調控的機制並不完全清楚，尤其是在腫瘤細胞之間：外泌體是否將癌細胞的特徵信息傳速到了癌旁組織，並通過所包含的蛋白促進其癌變；外泌體是否對月中瘤細胞的遷移、增殖以及浸調有影響等。這些急待解決的問題都遇到了一個共同的瓶頸，那就是外泌體的提取與分離。現有技術中的外泌體的分離方法包括：(1)超高速離心或者是密度梯度離心，這種方法有一個限制因素，那就是需要配各超高速高心機，而這種設備的價格是非常昂貴的，因此限制了一些中小型實驗室對外泌體的研究；(2)用超濾的方法，單純的超濾方法收集的外泌體濃度不能達到很高，對於需要較高濃度外泌體的檢測與治療等應用也是一種限制。因此，還需要尋求新型的低成本高效率的分離純化幹細胞外泌體的方法，來克服現有技術中存在的缺陷。技術實現要素：針對現有技術中的缺陷，本發明目的在於提供一種幹細胞外泌體的分離方法，以通過聯合運用大小不同的濃縮管，實現快速、高效、廉價地提取培養基中的外泌體；並且離心時間較短，可有效減少外泌體的機械性損傷，更好地保留外泌體的活性。為實現上述目的，本發明提供了一種幹細胞外泌體的分離方法，包括如下步驟：s1：採用含血清培養基培養幹細胞至細胞密度大於70％，收集幹細胞，然後採用不含血清培養基對幹細胞繼續培養；s2：除去s1得到的培養體系中的幹細胞，然後將剩餘組分過濾，收集濾液；s3：將濾液加入第一濃縮管，離心，得到濃縮液；s4：將濃縮液分裝於第二濃縮管，離心；然後在第二濃縮管中加入緩衝液，再次離心；s5：將再次離心後的第二濃縮管的內管倒置於收集管中，離心，收集管中的液體為含高濃度幹細胞外泌體的溶液。需要說明的是，s4中，緩衝液的體積和第二濃縮管的容積的比值優選為(0.4～0.6):1；本發明採用的幹細胞可以是hascs幹細胞。在本發明的進一步實施方式中，s1中，含血清培養基為含有質量分數為10％的fbs(胎牛血清)的dmem培養基；不含血清培養基為dmem培養基；繼續培養的時間為23～25h。在本發明的進一步實施方式中，s2中，過濾為採用0.22μm過濾膜過濾。在本發明的進一步實施方式中，s3中，第一濃縮管為15ml10kd濃縮管；s4中，第二濃縮管為0.5ml10kd濃縮管。在本發明的進一步實施方式中，s3中，離心條件為：4℃，3500～4500g離心35～45min；s4中，離心和再次離心的條件均為：常溫，15000g離心8～12min；s5中，離心條件為：常溫，900～1100g離心1.5～2.5min。需要說明的是，常溫是指15～30℃。在本發明的進一步實施方式中，s4中，緩衝液包括：0.01mpbs緩衝液；其中，pbs緩衝液的ph值為7.2～7.4。在本發明的進一步實施方式中，s4中，緩衝液還包括：0.05mtris-hcl緩衝液；pbs緩衝液和tris-hcl緩衝液的體積比為(0.4～0.6):1；其中，tris-hcl緩衝液的ph值為7.2～7.4。在本發明的進一步實施方式中，s1中，在繼續培養之前還包括對收集的幹細胞進行多次洗滌的步驟；其中，洗滌液包括：0.01mpbs緩衝液，pbs緩衝液的ph值為7.2～7.4；多次為2～4次。在本發明的進一步實施方式中，s1中，在每升洗滌液中，還包括：5～10gedta-na2、0.5～0.8g聚乙二醇和5～6g乳糖酸。需要說明的是，在實際配製過程中，對於1l洗滌液，可以先加入5～10gedta-na2、0.5～0.8g聚乙二醇和5～6g乳糖酸，然後加入0.01mpbs緩衝液，直至總體積為1l。在本發明的進一步實施方式中，s1中，聚乙二醇的數均分子量為7500～8500。本發明中，採用的hascs幹細胞的分離培養方法包括如下步驟：取年輕健康人體抽脂術後的脂肪組織，pbs液衝洗3遍後剪碎成約1mm3的小塊，加入0.1％膠原酶ⅰ消化30min。配製完全培養基：500ml培養基，10％血清，10ng/mlbfgf，加等體積完全培養基終止消化，1000rpm離心10min。重懸細胞，100μm濾網過濾後按1×106/ml接種於t25細胞培養瓶中，置37℃、5％co2飽和溼度培養箱培養，48小時後換液。觀察細胞至90％融合時，0.25％胰酶消化，按1：3傳代培養。本發明提供的技術方案，具有如下的有益效果：(1)本發明採用大小不同的濃縮管聯合運用，可以實現快速、高效、廉價地提取培養基中的外泌體，且濃度比單純用超濾法收集的外泌體要高；(2)本發明提供的分離方法的離心時間比超速離心時間短，可有效減少外泌體的機械性損傷，更好地保留外泌體的活性；(3)本發明採用的濃縮管可以重複使用，分離方法簡單，綜合起來成本更低。本發明的附加方面和優點將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發明的實踐了解到。附圖說明圖1為本發明實施例一中分離得到的hascs在顯微鏡下觀察到的形態圖；圖2為本發明實施例一中hadscs的表面標記cd90在流式細胞儀檢測下的結果圖；圖3為本發明實施例一中hadscs的表面標記cd44在流式細胞儀檢測下的結果圖；圖4為本發明實施例一中hadscs的表面標記cd105在流式細胞儀檢測下的結果圖；圖5為本發明實施例一中hadscs的表面標記cd73在流式細胞儀檢測下的結果圖；圖6為本發明實施例一中hadscs的表面標記cd73+cd105+在流式細胞儀檢測下的結果圖；圖7為本發明實施例一中hadscs的表面標記cd34-cd45-cd11b-cd19-hla-dr-在流式細胞儀檢測下的結果圖；圖8為本發明實施例五中分離得到含高濃度hascs幹細胞外泌體的溶液中hascs外泌體在掃描電鏡下觀察到的形態圖；圖9為本發明實施例五中分離得到含高濃度hascs幹細胞外泌體的溶液中hascs外泌體的粒徑分布圖。具體實施方式下面將結合本發明實施例中的附圖，對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述。以下實施例僅用於更加清楚地說明本發明的技術方案，因此只是作為示例，而不能以此來限制本發明的保護範圍。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重複實驗，數據為三次重複實驗的平均值或平均值±標準差。實施例一：hascs幹細胞的分離、培養實驗方法：取年輕健康人體抽脂術後的脂肪組織，pbs液衝洗3遍後剪碎成約1mm3的小塊，加入0.1％膠原酶ⅰ消化30min。配製完全培養基：500ml培養基，10％血清，10ng/mlbfgf，加等體積完全培養基終止消化，1000rpm離心10min。重懸細胞，100μm濾網過濾後按1×106/ml接種於t25細胞培養瓶中，置37℃、5％co2飽和溼度培養箱培養，48小時後換液。觀察細胞至90％融合時，0.25％胰酶消化，按1：3傳代培養。流式細胞儀檢測hascs表面分子標記：cd44、cd73、cd90、cd105。實驗結果：將分離得到的hascs在p2代以後細胞維持成纖維樣形態，大小均一且排列緊密，呈漩渦狀或放射狀生長(具體見圖1)。流式細胞儀檢測結果顯示超過95％的細胞表面表達cd73(100％)、cd44(100％)、cd90(99.8％)、cd105(97.6％)呈陽性，而造血細胞系分子標記物cd34、cd45、cd19等呈陰性表達的細胞佔97.8％(具體如圖2-圖7所示)，證實分離得到的hascs為標準的間充質幹細胞。下面將實施例一分離得到的hascs繼續培養，然後提取hascs外泌體，具體如實施例二至實施例七。實施例二本實施例提供一種幹細胞外泌體的分離方法，包括如下步驟：s1：採用含血清培養基培養幹細胞至細胞密度80％，收集幹細胞；採用洗滌液洗滌幹細胞3次，然後採用不含血清培養基繼續培養幹細胞24h；其中，含血清培養基為含有質量分數為10％的fbs的dmem培養基；不含血清培養基為dmem培養基；洗滌液包括：0.01mpbs緩衝液，pbs緩衝液的ph值為7.2；s2：除去s1得到的培養體系中的幹細胞，然後將剩餘組分採用0.22μm過濾膜過濾，收集濾液；s3：將濾液加入15ml10kd濃縮管(第一濃縮管)，4℃、4000g離心40min，得到濃縮液；s4：將濃縮液分裝於0.5ml10kd濃縮管(第二濃縮管)，常溫、15000g離心10min；在第二濃縮管中加入緩衝液，再次常溫、15000g離心10min；其中，緩衝液包括：0.01mpbs緩衝液，pbs緩衝液的ph值為7.2；s5：將s4中再次離心後的0.5ml10kd濃縮管(第二濃縮管)的內管倒置於收集管中，常溫、1000g離心2min，收集管中的液體為含高濃度幹細胞外泌體的溶液。實施例三本實施例提供一種幹細胞外泌體的分離方法，包括如下步驟：s1：採用含血清培養基培養幹細胞至細胞密度為70％，收集幹細胞；採用洗滌液洗滌幹細胞2次，然後採用不含血清培養基繼續培養幹細胞23h；其中，含血清培養基為含有質量分數為10％的fbs的dmem培養基；不含血清培養基為dmem培養基；洗滌液包括：0.01mpbs緩衝液，pbs緩衝液的ph值為7.2；s2：除去s1得到的培養體系中的幹細胞，然後將剩餘組分採用0.22μm過濾膜過濾，收集濾液；s3：將濾液加入15ml10kd濃縮管(第一濃縮管)，4℃、3500g離心35min，得到濃縮液；s4：將濃縮液分裝於0.5ml10kd濃縮管(第二濃縮管)，常溫、15000g離心8min；在第二濃縮管中加入緩衝液，再次常溫、15000g離心8min；其中，緩衝液包括：0.01mpbs緩衝液，pbs緩衝液的ph值為7.2；s5：將s4中再次離心後的0.5ml10kd濃縮管(第二濃縮管)的內管倒置於收集管中，常溫、900g離心1.5min，收集管中的液體為含高濃度幹細胞外泌體的溶液。實施例四本實施例提供一種幹細胞外泌體的分離方法，包括如下步驟：s1：採用含血清培養基培養幹細胞至細胞密度為90％，收集幹細胞；採用洗滌液洗滌幹細胞4次，然後採用不含血清培養基繼續培養幹細胞25h；其中，含血清培養基為含有質量分數為10％的fbs的dmem培養基；不含血清培養基為dmem培養基；洗滌液包括：0.01mpbs緩衝液，pbs緩衝液的ph值為7.4；s2：除去s1得到的培養體系中的幹細胞，然後將剩餘組分採用0.22μm過濾膜過濾，收集濾液；s3：將濾液加入15ml10kd濃縮管(第一濃縮管)，4℃、4500g離心45min，得到濃縮液；s4：將濃縮液分裝於0.5ml10kd濃縮管(第二濃縮管)，常溫、15000g離心12min；在第二濃縮管中加入緩衝液，再次常溫、15000g離心12min；其中，緩衝液包括：0.01mpbs緩衝液，pbs緩衝液的ph值為7.4；s5：將s4中再次離心後的0.5ml10kd濃縮管(第二濃縮管)的內管倒置於收集管中，常溫、1100g離心2.5min，收集管中的液體為含高濃度幹細胞外泌體的溶液。實施例五本實施例提供一種幹細胞外泌體的分離方法，包括如下步驟：s1：採用含血清培養基培養幹細胞至細胞密度80％，收集幹細胞；採用洗滌液洗滌幹細胞3次，然後採用不含血清培養基繼續培養幹細胞24h；其中，含血清培養基為含有質量分數為10％的fbs的dmem培養基；不含血清培養基為dmem培養基；每升洗滌液包括：8gedta-na2、0.65g數均分子量為8000的聚乙二醇、5.5g乳糖酸，餘量為0.01mpbs緩衝液，pbs緩衝液的ph值為7.2；s2：除去s1得到的培養體系中的幹細胞，然後將剩餘組分採用0.22μm過濾膜過濾，收集濾液；s3：將濾液加入15ml10kd濃縮管(第一濃縮管)，4℃、4000g離心40min，得到濃縮液；s4：將濃縮液分裝於0.5ml10kd濃縮管(第二濃縮管)，常溫、15000g離心10min；在第二濃縮管中加入緩衝液，再次常溫、15000g離心10min；其中，緩衝液包括：0.01mpbs緩衝液和0.05mtris-hcl緩衝液；pbs緩衝液和tris-hcl緩衝液的體積比為0.5:1，pbs緩衝液的ph值為7.2，tris-hcl緩衝液的ph值為7.2；s5：將s4中再次離心後的0.5ml10kd濃縮管(第二濃縮管)的內管倒置於收集管中，常溫、1000g離心2min，收集管中的液體為含高濃度幹細胞外泌體的溶液。實施例六本實施例提供一種幹細胞外泌體的分離方法，包括如下步驟：s1：採用含血清培養基培養幹細胞至細胞密度為70％，收集幹細胞；採用洗滌液洗滌幹細胞2次，然後採用不含血清培養基繼續培養幹細胞23h；其中，含血清培養基為含有質量分數為10％的fbs的dmem培養基；不含血清培養基為dmem培養基；每升洗滌液包括：5gedta-na2、0.5g數均分子量為7500的聚乙二醇、5g乳糖酸，餘量為0.01mpbs緩衝液，pbs緩衝液的ph值為7.2；s2：除去s1得到的培養體系中的幹細胞，然後將剩餘組分採用0.22μm過濾膜過濾，收集濾液；s3：將濾液加入15ml10kd濃縮管(第一濃縮管)，4℃、3500g離心35min，得到濃縮液；s4：將濃縮液分裝於0.5ml10kd濃縮管(第二濃縮管)，常溫、15000g離心8min；在第二濃縮管中加入緩衝液，再次常溫、15000g離心8min；其中，on17-p11856緩衝液包括：0.01mpbs緩衝液和0.05mtris-hcl緩衝液；pbs緩衝液和tris-hcl緩衝液的體積比為0.4:1，pbs緩衝液的ph值為7.2，tris-hcl緩衝液的ph值為7.2；s5：將s4中再次離心後的0.5ml10kd濃縮管(第二濃縮管)的內管倒置於收集管中，常溫、900g離心1.5min，收集管中的液體為含高濃度幹細胞外泌體的溶液。實施例七本實施例提供一種幹細胞外泌體的分離方法，包括如下步驟：s1：採用含血清培養基培養幹細胞至細胞密度為90％，收集幹細胞；採用洗滌液洗滌幹細胞4次，然後採用不含血清培養基繼續培養幹細胞25h；其中，含血清培養基為含有質量分數為10％的fbs的dmem培養基；不含血清培養基為dmem培養基；每升洗滌液包括：10gedta-na2、0.8g數均分子量為8500的聚乙二醇、6g乳糖酸，餘量為0.01mpbs緩衝液，pbs緩衝液的ph值為7.4；s2：除去s1得到的培養體系中的幹細胞，然後將剩餘組分採用0.22μm過濾膜過濾，收集濾液；s3：將濾液加入15ml10kd濃縮管(第一濃縮管)，4℃、4500g離心45min，得到濃縮液；s4：將濃縮液分裝於0.5ml10kd濃縮管(第二濃縮管)，常溫、15000g離心12min；在第二濃縮管中加入緩衝液，再次常溫、15000g離心12min；其中，緩衝液包括：0.01mpbs緩衝液和0.05mtris-hcl緩衝液；pbs緩衝液和tris-hcl緩衝液的體積比為0.6:1，pbs緩衝液的ph值為7.4，tris-hcl緩衝液的ph值為7.4；s5：將s4中再次離心後的0.5ml10kd濃縮管(第二濃縮管)的內管倒置於收集管中，常溫、1100g離心2.5min，收集管中的液體為含高濃度幹細胞外泌體的溶液。將本發明實施例二至實施例七分離得到的含高濃度幹細胞外泌體的溶液進行測定。1、bca蛋白濃度測定：根據bca蛋白濃度測定試劑盒，將實施例二至實施例七分離得到的含高濃度幹細胞外泌體的溶液進行蛋白測定：首先，配置工作液：bca：cu＝50:1，然後，稀釋標準品，按多濃度梯度接種於96孔(製備標準曲線)，然後將樣品多梯度稀釋，接種於96孔板，每孔另加200微升bca工作液，於37℃放置15-30mins，最後酶標儀測定a562nm。根據標準曲線和樣品數據算出蛋白濃度。以實施例二測定得到的蛋白濃度為100％，表徵其他組別的相對蛋白濃度。表1不同組別的樣品的相對蛋白濃度2、治療急性肝衰竭大鼠模型的情況實驗方法：(1)造模取雄性sd大鼠100隻，耳釘標記並稱量每隻實驗大鼠體重，以0.8g/kg體重計算d-gal用量。電子天平稱量d-gal粉末l0g，加入90ml生理鹽水中充分溶解，以lmol/l的naoh溶液調節其ph值至7.0。100ml容量瓶定容後轉入試管備用，d-gal終濃度為0.1g/μl。用一次性5ml注射器，以0.8g/kg體重給藥劑量向大鼠腹腔內注射d-gal。注射點取兩側腹股溝區以上1cm範圍，局部酒精棉球消毒，注射器針頭與皮膚呈45度方向刺入，穿過腹肌刺入腹腔，有落空感即進入腹膜腔，回抽無血液、腸液、尿液後緩慢注入藥物。記錄每隻大鼠的耳釘編號、體重、給藥劑量及給藥時間，間隔12h後再次注射一次。給藥後自由進食和飲水。經腹腔注射d-gal造模後大鼠出現精神萎靡、嗜睡、反應遲鈍、行為異常、尿黃等症狀。(2)經股靜脈分別注射本發明實施例二至實施例七分離得到的含高濃度幹細胞外泌體的溶液1)大鼠的固定與手術區域消毒在急性肝衰竭動物模型建造後第2天，將sd大鼠隨機分為8組，即低濃度實施例一組、實施例二組、實施例三組，實施例四組、實施例五組、實施例六組、hascs組以及pbs對照組，每組10隻。術前使用大鼠固定器將大鼠固定在超淨操作臺上，取仰臥位，標記手術部位，以手術部位為中心周圍5cm區域用碘伏消毒。2)手術過程手術操作過程嚴格遵守無菌操作原則，於超淨臺上取左側髂窩皮膚作一斜行切口，暴露出股靜脈，使用一次性1ml注射器，接30g1/2針頭，實施例一組、實施例二組、實施例三組，實施例四組、實施例五組、實施例六組分別經股靜脈注射相應組分離得到的含高濃度幹細胞外泌體的溶液100μg/只，hascs組注射細胞數為2×106個，pbs對照組注射pbs100μg/只。注射後以75％酒精棉球壓迫止血，待出血停止後縫合傷口。3)術後預防感染術後在大鼠傷口處塗抹雙抗防止感染，並分成5隻一籠飼養，避免大鼠相互撕咬增加手術部位感染機會。4)術後觀察項目觀察統計每組大鼠的生存率及生活狀態，每天觀察記錄實驗大鼠體重、活動、進食、尿液、毛色、肌力、對刺激的反應等一般情況，有無脫毛、皮疹、厭食、腹瀉、嗜睡、昏迷等症狀。實驗結果：pbs對照組當日即出現大鼠死亡，該組大鼠精神異常萎靡，嗜睡、拒絕進食、毛蓬鬆雜亂，連續3天不斷出現死亡，該組大鼠總體生存率僅為20％；實施例二組、實施例三組，實施例四組從第3日開始出現死亡，120h後未再出現死亡情況，具體每組的存活率情況如下表2所示。表2各組大鼠的生存率統計表組別實施例二實施例三實施例四實施例五存活率70％70％70％100％組別實施例六實施例七hascs組pbs對照組存活率100％100％40％20％3、掃描電鏡觀察：實驗方法：滴1滴約10μg外泌體液(實施例五製備得到的含高濃度幹細胞外泌體的溶液)滴於封口膜上，用鑷子取1個碳支持膜銅網蓋在液滴上5min，然後滴1滴2％磷鎢酸染液與封口膜上，然後用鑷子將銅網從外泌體液滴移到磷鎢酸液滴上，染色3min，用濾紙吸乾液體，至於白熾燈下烤乾，用透射電鏡觀察並拍照。實驗結果：本發明實施例五製備得到的含高濃度幹細胞外泌體的溶液中，hascs外泌體呈均一大小的圓杯形態，大小約在30～200nm之間，具體如圖8所示。4、nanosight粒度儀檢測：實驗方法：打開ns300軟體，將1ml實施例五製備得到的含高濃度幹細胞外泌體的溶液樣品注射入樣品槽，注滿為止，調整軟體參數使視頻清晰，點開軟體中的run鍵，收集數據。實驗結果：利用nanosight粒度儀檢測收集的hascs外泌體，可以看到hascs外泌體的尺寸、濃度以及對應的強度等，粒徑大小如圖9所示，大多數外泌體均處於30～200nm間；此外，利用粒度儀還可以捕捉到hascs外泌體在液體中的布朗運動，如圖9所示。本發明提供的技術方案，具有如下的有益效果：(1)本發明採用大小不同的濃縮管聯合運用，可以實現快速、高效、廉價地提取培養基中的外泌體，且濃度比單純用超濾法收集的外泌體要高；(2)本發明提供的分離方法的離心時間比超速離心時間短，可有效減少外泌體的機械性損傷，更好地保留外泌體的活性；(3)本發明採用的濃縮管可以重複使用，分離方法簡單，綜合起來成本更低。需要注意的是，除非另有說明，本申請使用的技術術語或者科學術語應當為本發明所屬領域技術人員所理解的通常意義。除非另外具體說明，否則在這些實施例中闡述的部件和步驟的相對步驟、數字表達式和數值並不限制本發明的範圍。在這裡示出和描述的所有示例中，除非另有規定，任何具體值應被解釋為僅僅是示例性的，而不是作為限制，因此，示例性實施例的其他示例可以具有不同的值。在本發明的描述中，需要理解的是，術語「第一」、「第二」僅用於描述目的，而不能理解為指示或暗示相對重要性或者隱含指明所指示的技術特徵的數量。由此，限定有「第一」、「第二」的特徵可以明示或者隱含地包括一個或者更多個該特徵。在本發明的描述中，「多個」的含義是兩個以上，除非另有明確具體的限定。最後應說明的是：以上各實施例僅用以說明本發明的技術方案，而非對其限制；儘管參照前述各實施例對本發明進行了詳細的說明，本領域的普通技術人員應當理解：其依然可以對前述各實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分或者全部技術特徵進行等同替換；而這些修改或者替換，並不使相應技術方案的本質脫離本發明各實施例技術方案的範圍，其均應涵蓋在本發明的保護範圍當中。當前第1頁12