一種檢測細胞損傷修復能力的方法及其專用晶片的製作方法

2023-09-14 03:28:25

專利名稱：：一種檢測細胞損傷修復能力的方法及其專用晶片的製作方法
技術領域：
：本發明涉及細胞損傷修複測定技術，特別提供了一種檢測細胞損傷修復能力的方法及其專用晶片。
背景技術：
：生物體生存的環境是一個不斷變化的、存在細菌、病毒、過敏原等多種致病因素的環境。連續的細胞層在病理因素的持續作用下易於受損，細胞脫落形成缺損，而受損後的組織重建和功能重建過程則依賴於細胞的損傷修復能力。損傷修復的過程首先是傷口周圍細胞向傷口部位發生極化，並伸出突觸，然後細胞開始遷移增殖並逐步癒合傷口。上述過程無論在整個組織還是在單個細胞水平上都是類似的。損傷修復實驗已經被作為研究細胞極化、組織基質重排、預測細胞在不同細胞和不同培養環境下細胞的增殖及遷移能力的重要手段。臨床上，細胞損傷修復能力的下降是胃、十二指腸潰瘍、氣道高反應性、血栓形成等眾多病理過程發生發展的重要因素，而提高細胞損傷修復的能力也是許多細胞因子、神經遞質以及藥物發揮作用的重要途徑。對於細胞損傷修復能力的考察也是細胞學研究常用實驗之一。傳統的損傷修複分析按照造成缺損的方法分為機械損傷和化學損傷兩種，實際應用中以劃痕法為主，即在體外培養的單層細胞上採用機械刮擦的方法形成物理刮痕，然後使用顯微鏡觀察相應時間段內劃痕的癒合情況，具體的癒合時間隨不同的細胞類型、培養條件以及傷口的區域大小而變化。劃痕法依賴於手工操作，其傷口區域的大小及寬度變化較大，初始損傷面積不易控制，拍照時缺損難以準確定位，而且劃痕可能會對周圍的細胞造成損傷從而影響其遷移的效率，因此這種"劃痕"傷口癒合試驗結果由於細胞間相互的多因素作用而不夠理想，往往導致實驗重複性不佳，更為重要的是，在實際應用中，這種定性的觀察(而非定量測量)難以被應用到高通量的研究中。因此，開發操作簡便、缺損一致、拍照方便、通量高的損傷修復定量檢測方法，已成為實驗室技術發展的必然。微流控晶片實驗室又稱晶片實驗室(Lab-on-a-Chip)或微流控晶片(Microfluidic)，指的是把化學和生物等領域中所涉及的樣品製備、反應、分離、檢測、細胞培養、分選、裂解等基本操作單元集成或基本集成到一塊幾平方釐米(甚至更小)的晶片上，由微通道形成網絡，以可控流體貫穿整個系統，用以取代常規化學或生物實驗室的各種功能的一種技術。由於微流控晶片的多維網絡特徵和功能集成特徵，已經有可能使常規的細胞培養、細胞受激、細胞標記和檢測等過程集成在一塊很小的晶片上完成。因此，微流控晶片技術與細胞損傷修復檢測方法發展的需求相吻合，有望成為損傷修復新檢測方法的突破口。
發明內容本發明的目的是提供了一種檢測細胞損傷修復能力的方法及其專用晶片。本發明提供了一種集成化微流控晶片，該晶片由299個相同的細胞培養結構單元構成，這些結構單元之間通過一個公共細胞進樣池相連接；每個結構單元含有299個柱形結構、2~99個擋板結構和一個廢液池。本發明提供的集成化微流控晶片，所述的柱形結構大小和形狀均相同，柱形結構之間間隔相同的距離，沿細胞進樣通路兩側均勻分布；柱形結構的作用是形成相同的細胞缺損區，缺損區大小在顯微鏡拍照視野內。本發明提供的集成化微流控晶片，所述的擋板結構由299個板狀結構組成，主要起分流作用，使細胞在灌注時均勻分布於柱形結構周圍。本發明還提供了一種利用集成化微流控晶片進行檢測細胞損傷修復能力的方法，方法過程為將細胞懸液加入位於晶片中央的公共細胞進樣池中，靜置5-30分鐘，晶片置於顯微鏡下觀察，當晶片中細胞不再流動停駐於細胞培養室中時，加入細胞培養基，使其液面略高於晶片高度；將接種了細胞的微流控晶片放入細胞培養箱中培養，然後將晶片置於顯微鏡下觀察細胞的貼壁及生長情況；待細胞貼壁且細胞密度大於80%後，輕輕將微流控晶片揭去，分別加入含不同藥物的細胞培養基，立即在顯微鏡下尋找損傷區域並拍照；拍照後繼續放置於培養箱中培養，其後每隔412小時對缺損區拍照一次，連續動態觀察24~72小時；收集所有時間點的缺損區域圖像，採用圖像分析軟體勾畫缺損邊緣並測算缺損面積，以Oh缺損面積為百分之百，計算各時間點缺損面積佔Oh缺損面積的百分比，以反映缺損癒合情況；繪製時間與缺損面積的直線回歸圖，作出直線回歸方程，Y=a+bX，損傷修復指數(Woundrepairindex,RI)等於回歸方程中b的絕對值，即RI=|b|，以此反映不同處理組中細胞癒合速度的快慢。本發明具有如下優點1.本發明所述微流控晶片將細胞培養、缺損區域形成、損傷修復過程啟動等功能單元集成於一塊晶片上，待細胞貼壁且密度較高時，只需將晶片揭去既可自動形成缺損區並啟動損傷修復過程。2.本發明只需向細胞進樣池滴加高濃度的細胞懸液，無需額外人為操作，通過柱形結構對細胞的阻擋作用即可形成形狀、大小均相同的細胞缺損區域。與傳統劃痕法相比，可避免由於缺損的大小和形狀不同產生的實驗誤差。3.本發明一次滴加細胞既可形成12個細胞缺損區，通量高且細胞用量少，每三個缺損在一個顯微鏡視野內(x40)，拍照易於定位，使用方便快捷。4.本發明採用的晶片材料底面粘性大，易於與培養皿可逆封接，溶液無滲漏，具有生物相容性，無螢光吸附，且價格低廉，適合大規模生產。圖l集成化微流控晶片示意圖，其中l為細胞進樣池，2為廢液池；圖2集成化微流控晶片示意圖中一個結構單元的放大圖，其中1為細胞進樣通路，2為擋板結構，3為柱形結構，4通往廢液池；圖3集成化微流控晶片細胞灌注過程示意圖，其中A為細胞灌注前，B為灌注細胞，C為細胞貼壁生長至密度大於80%，D為揭去晶片後，形成三個完全相同的細胞缺損；圖4人胃黏膜上皮細胞(GES-1)損傷修復過程圖(X40);圖5人胃黏膜上皮細胞(GES-1)在重組人表皮生長因子(EGF90ng/ml)作用下的損傷修復過程圖(X40);圖6人胃黏膜上皮細胞(GES-1)在重組人表皮生長因子(EGF90ng/ml)作用下的損傷修復能力統計分析圖。具體實施例方式以下實施例將對本發明予以進一步的說明，但並不因此而限制本發明。實施例l將圖1所示的晶片(共有4個結構單元，每個結構單元有3個柱形結構，因此可以同時生成12個大小、形狀均相同的細胞缺損區)接種高濃度(約107/ml)人胃黏膜上皮細胞(GES-1)後置於37。C、5%C02培養箱中過夜，待細胞貼壁且密度大於80%後，輕輕將微流控晶片揭去，對照組加入含12%新生牛血清的高糖DMEM培養基，EGF組加入含90ng/mlEGF及12n/。新生牛血清的高糖DMEM培養基，立即在顯微鏡下尋找損傷區域並拍照。拍照後繼續放置於培養箱中培養，其後每隔8小時拍照一次，連續動態觀察24小時。可見EGF(90ng/ml)可顯著促進GES-1的損傷修復速度(見圖4，圖5)。收集所有時間點的缺損區域圖像，採用圖像分析軟體勾畫缺損邊緣並測算缺損面積，以Oh缺損面積為百分之百，計算各時間點缺損面積佔Oh缺損面積的百分比，以反映缺損癒合情況。繪製時間與缺損面積的直線回歸圖，作出直線回歸方程Y-a+bX(見表l)，損傷修復指數(Woundrepairindex,RI)等於回歸方程中b的絕對值，即RI叫bl，以此反映不同處理組中細胞癒合速度的快慢。可見EGF(90ng/ml)可顯著提高GES-1的損傷修復指數(見圖6，表l)。表l對照組和EGF組的回歸方程tableseeoriginaldocumentpage9實施例2將圖1所示的晶片接種高濃度(約107/ml)體外培養的人晶狀體上皮細胞後置於37。C、5。/。C02培養箱中過夜，待細胞貼壁且密度大於80%後，輕輕將微流控晶片揭去，分別加入含不同濃度鹼性成纖維細胞生長因子(basicfibroblastgrowthfactor,b-FGF)的細胞培養基，立即在顯微鏡下尋找損傷區域並拍照。拍照後繼續放置於培養箱中培養，其後每隔8小時拍照一次，連續動態觀察24小時。可見5^g/L的bFGF可顯著促迸人晶狀體上皮細胞的損傷修復速度，隨著b-FGF濃度的增加，促進作用逐漸增強。權利要求1、一種集成化微流控晶片，其特徵在於該晶片由2～99個相同的細胞培養結構單元構成，這些結構單元之間通過一個公共細胞進樣池相連接；每個結構單元含有2～99個柱形結構、2～99個擋板結構和一個廢液池。2、按照權利要求1所述集成化微流控晶片，其特徵在於所述的柱形結構大小和形狀均相同，柱形結構之間間隔相同的距離，沿細胞進樣通路兩側均勻分布。3、按照權利要求1所述集成化微流控晶片，其特徵在於所述的擋板結構由2~99個板狀結構組成。4、一種利用權利要求1所述晶片進行檢測細胞損傷修復能力的方法，其特徵在於方法過程為將細胞懸液加入位於晶片中央的公共細胞進樣池中，靜置5-30分鐘，晶片置於顯微鏡下觀察，當晶片中細胞不再流動停駐於細胞培養室中時，加入細胞培養基，使其液面略高於晶片高度；將接種了細胞的微流控晶片放入細胞培養箱中培養，然後將晶片置於顯微鏡下觀察細胞的貼壁及生長情況；待細胞貼壁且細胞密度大於80%後，輕輕將微流控晶片揭去，分別加入含不同藥物的細胞培養基，立即在顯微鏡下尋找損傷區域並拍照；拍照後繼續放置於培養箱中培養，其後每隔412小時對缺損區拍照一次，連續動態觀察24~72小時；收集所有時間點的缺損區域圖像，採用圖像分析軟體勾畫缺損邊緣並測算缺損面積，以0h缺損面積為百分之百，計算各時間點缺損面積佔Oh缺損面積的百分比，以反映缺損癒合情況；繪製時間與缺損面積的直線回歸圖，作出直線回歸方程，Y=a+bX，損傷修復指數RI等於回歸方程中b的絕對值，即RI叫b卜以此反映不同處理組中細胞癒合速度的快慢。全文摘要一種檢測細胞損傷修復能力的方法及其專用晶片，該晶片由2～99個相同的細胞培養結構單元構成，這些結構單元之間通過一個公共細胞進樣池相連接；每個結構單元含有柱形結構、擋板結構和廢液池。本發明創造性地將細胞培養、缺損區域形成、損傷修復過程啟動等功能單元集成於一塊晶片上，採用柱形結構對細胞的阻擋作用以形成形狀、大小均相同的細胞缺損區域。與傳統的劃痕法相比，簡化了人為操作，能提供完全相同的初始缺損區域，減少了細胞用量，通量高，且損傷修復過程易於定位拍照。文檔編號C12Q1/02GK101586075SQ20091001240公開日2009年11月25日申請日期2009年7月8日優先權日2009年7月8日發明者敏張,李豔峰,林炳承,秦建華申請人:中國科學院大連化學物理研究所