嗜線蟲真菌培養的一種液體培養基及其厚垣孢子製備方法
2023-12-08 17:44:41 1
專利名稱：嗜線蟲真菌培養的一種液體培養基及其厚垣孢子製備方法
技術領域：
本發明涉及一種動物胃腸道線蟲病生物防治用嗜線蟲真菌菌株----Duddingtoniaflagrans培養的液體培養基和培養技術，屬於家畜胃腸道 寄生蟲病防治技術領域，尤其是嗜線蟲真菌培養的一種液體培養基及其 厚垣孢子製備方法。二、 背景技術目前，對牛羊胃腸道寄生蟲病的防治，主要是用各種化學藥物對動 物進行定期驅蟲。長期反覆用藥， 一方面導致藥物在家畜體內積蓄，使 畜產品質量下降；另一方面致使蟲體抗藥性增強，防制難度進一步加大。 寄生蟲的抗藥性在全球範圍內成為畜牧業最大的威脅之一。因而，家畜 畜產品寄生蟲病的生物防治研究已開始引起重視。用嗜線蟲真菌 Duddingtoniaflagrans進行動物胃腸道線蟲病的防治在已公開的相關生物防治技術中發展較快。嗜線蟲真菌Duddingtonia flagrans在分類上屬於半知菌類杜丁屯屬。 用該菌株培養物生產嗜線蟲真菌厚垣孢子，添加到動物飼料中詞餵動物， 厚垣孢子不僅能通過動物消化道後保持活性，而且可隨動物糞便排入草 場，利用糞便和草場的營養、水份發育成具有捕食感染性幼蟲的菌絲， 捕食和殺滅草場糞便中蟲卵發育出的胃腸道線蟲第三期感染性幼蟲，從
而達到淨化草場防治家畜感染的生物防治效果。在嗜線蟲真菌Duddingtonia flagrans的培養和生物防治製劑的研究開 發中，已公開的技術內容主要包括不同成份的瓊脂平板或以黍粒和小麥 為基本原料，篩選出進行種子培養和厚垣孢子生產的固體培養基，通過 固體培養的方式進行厚垣孢子生產。目前，通過固體培養製備的嗜線蟲 真菌厚垣孢子製劑，用於進行了牛羊胃腸道線蟲病的生物防治應用，並 在一些國家取得生物製劑應用許可證。然而通過試驗研究發現，用固體 培養基進行Duddingtoniaflagmns的培養，對所使用的培養容器的容積有 很大的限制。容器過大影響培養物氣體的交換以及代謝產物的擴散，減 緩菌絲生長速度，降低了厚垣孢子產量；此外，目前國內外仍都是使用 固體培養基進行嗜線蟲真菌Duddingtonia flagrans的培養，其特性也就決 定了在培養方法上只能採用固體培養發酵技術。而固體培養還沒有專門 的規模化生產的設備和裝置。使用培養皿、培養瓶、三角瓶和類似的容 器培養嚴重限制了對該真菌進行批量化生產的規模和水平，增加了生產 的成本和技術難度。固體培養在滅菌、培養過程中佔據大量的空間，培 養周期長，製劑的規模化生產成本高。有關用液體培養基進行該菌株培養的報導很少，僅有的一篇文獻是 利用酵母浸膏-蛋白腖-葡萄糖培養基(MYPG)和含植物腖、酪蛋白、醋 酸鈉、甘油的Vogds培養基進行液體培養的試驗。而這種液體培養基制 備成本高，僅可用於該菌株的實驗室培養。 二、發明內容本發明的目的在於，提出一種製備成本低，保證和促進菌絲生長速度， 提高厚垣孢子產量，適合工業生產的嗜線蟲真菌培養技術，即嗜線蟲真 菌培養的一種液體培養基及其厚垣孢子製備方法。
本發明的技術方案是1、 該液體培養基的主要成份為馬鈴薯汁和微量鹽。馬鈴薯汁含量在0.5—20%;各種無機鹽、微量鹽含量分別為0. 50—2.0g/L; MgS(k 7H20 0. 3—L5g/L ;KCI 0. 3—1. 50g/L ;FeS(k 7H20 0. 005--O. 02g/L ;ZnS(V 7H200. 005--O. 02g/L ;CuSO4. 5H20 0, 003--0. 008g/L。該培養基pH為5. 5—7. 5。2、 用該液體培養基進行嗜線蟲真菌Duddingtonia flagrans的種子 製備技術取保存於瓊脂培養板的嗜線蟲真菌Duddingtonia flagrans培 養物，接種於裝有上述培養基並高壓滅菌的容器中，置恆溫振搖培養箱 中，培養結束時取出，待用。3、 嗜線蟲真菌Duddingtonia flagrans擴大生產技術 採用較大容器，以前述製備的嗜線蟲真菌Duddingtonia flagrans種子接種。置恆溫振搖培養箱中，培養結束時取出，待用。具體培養持續時間，以培養物中厚垣孢子數》1X1 OVml即可。 製備的嗜線蟲真菌Duddingtonia flagrans培養物可通過離心或抽濾，收集沉澱或濾器上的收集物，自然乾燥，碾碎，計數厚垣孢子數，分裝，備用。本發明的有益效果是，該技術以馬鈴薯汁為主要原料製備液體培養 基，並在此基礎上進行該菌厚垣孢子菌絲的液體發酵生產，為嗜線蟲真 菌Duddingtonia flagrans的規模化生產提供了一種新的技術方法，使在該真菌製劑生產中利用大型的液體發酵設備進行培養發酵成為可能，原 料來源充足且成本低，這有助於降低生產成本，減輕勞動強度，提高菌 株製劑的生產效率，提高了該製劑規模化的生產和產業化水平。用該技 術進行嗜線蟲真菌Duddingtonia flagrans的發酵培養，既可以為
Duddingtonia flagrans厚垣孢子批量化生產提供種子，也可以直接用於厚垣孢子的生產。三具體實施方式
實施例l: 1、該液體培養基的主要原料為馬鈴薯和微量鹽，將馬鈴 薯去皮，破碎，加水熟化濾除渣即得，馬鈴薯汁含量在O. 5—20%;各種無機鹽、微量鹽含量分別為KH2P0i 0. 5. 0—2. 0g/L ; MgSOh 7仏0 0. 3—1.5g/L; KCI 0. 3—1.50g/L;FeS04. 7H20 0. 005——0. 02g/L; ZnS04. 7H20 0.005 -_0. 02g/L; CuS(k 5M) 0. 003—0. 008g/L。 i亥培養 基pH為5. 5—7. 5。2、 用該液體培養基進行嗜線蟲真菌Duddingtonia flagrans的種子 製備技術取保存於瓊脂培養板的嗜線蟲真菌Duddingtonia flagrans培 養物，接種於裝有上述培養基並高壓滅菌的100—250ml三角瓶中，置25 'C一3(TC的恆溫振搖培養箱中，前5天每天振搖30~60分鐘，其餘時間靜 置培養，或直接振搖培養10—14天。培養結束時取出，置4"C或室溫待用。3、 嗜線蟲真菌Duddingtonia flagrans擴大生產技術1) 、採用500-—1000ml三角瓶，前述製備的嗜線蟲真菌Duddingtonia flagrans種子，以2—5%的量接種。置25。C--3(TC的恆溫振搖培養箱中， 前5天每天振搖30~60分鐘，其餘時間靜置培養，或直接振搖培養時間持 續3-~4周。培養結束時取出，置4"或室溫待用。具體培養持續時間，以 培養物中厚垣孢子數> 1 X 10'7ml即可。2) 、採用5—15升發酵罐，前述製備的嗜線蟲真菌Duddingtonia flagrans種子，以2—5%的量接種。置25r—30。C的恆溫振搖培養箱中， 前5天每天釆用低速(30—100rpm)攪拌通氣培養30~60分鐘，其餘時間 靜置培養，或直接採用低速(30—100rpm)攪拌通氣培養10—14天。培 養結束時取出，置4X:或室溫待用。具體培養持續時間，以培養物中厚垣 孢子數^lX107ml即可。1)或2)生產的嗜線蟲真菌Duddingtonia flagrans培養物可通過 1000轉/分的離心，或用G5濾器抽濾，收集沉澱或濾器上的收集物，自然 乾燥，碾碎，計數厚垣孢子數，分裝，備用。該技術以馬鈴薯汁為主要原料製備液體培養基，並在此基礎上進行 厚垣孢子的液體生產，為嗜線蟲真菌Duddingtonia flagrans的規模化生 產提供了一種新的技術方法，使在該真菌製劑生產中利用大型的液體發 酵設備進行培養發酵成為可能，原料來源充足且成本低，這有助於降低 生產成本，減輕勞動強度，提高菌株製劑的生產效率，提高了該製劑規 模化的生產和產業化水平。用該技術進行嗜線蟲真菌Duddingtonia flagrans的發酵培養，既可以為Duddingtonia flagrans厚垣孢子批量化生產提供種子，也可以直接用於厚垣孢子的生產。 實施例2:在實施例l中1、 稱取洗淨去皮的新鮮馬鈴薯200g，切成薄片，攪拌成糊狀。加水 適量，微火煮沸30分鐘。雙層紗布過濾。濾液補足水至1000ml，靜置 12小時。2、 配製含KH2PO4l.0g， MgSO4.7H2O0.5g， KCI0.5g， FeS04.7H20 O.Olg， ZnSO4.7H2O0.01g， CuS04.5H20 0.005g的微量鹽溶液lOOOml。3、 取靜置12小時後的馬鈴薯汁上清100ml,上述微量鹽溶液lOOml， 補足水至1000ml,調PH至6.5—7.5。4、 將上述培養基分裝於100—1000ml三角瓶或5—15升發酵罐。裝 量為容器體積的1/3—1/5，優選l/4;三角瓶用透氣矽膠塞塞住瓶口，再 用牛皮紙或絨布包住瓶口，棉線繩綑紮。15磅20分鐘高壓滅菌。5、 取保存於瓊脂培養板的嗜線蟲真菌Duddingtonia flagrans培養物， 接種於裝有上述培養基並高壓滅菌的100~250ml三角瓶中，置26。C恆溫 振搖培養箱中。在培養的前5天，每天以100—110rpm振搖60分鐘，其 餘時間靜置培養，或直接振搖培養10~14天。培養結束時取出，置4'C 或室溫待用。6、 擴大培養可分別用500—1000ml三角瓶或5—15升發酵罐進行。 用上述嗜線蟲真菌Duddingtonia flagrans的液體培養物種子，以2—5%的 量接種。500--1000ml三角瓶培養物的培養同上述種子培養，但培養時間 持續3一周。發酵罐的培養溫度和時間同三角瓶培養物，但採用低速(60—100rpm)攪拌通氣培養。具體培養持續時間根據對培養物的檢査， 厚垣孢子數^lXl5/ml即可。6、將嗜線蟲真菌Duddingtonia flagrans的擴大生產培養物通過1000 轉/分的離心，或用G5濾器抽濾，收集沉澱或濾器上的收集物，自然乾燥，碾碎，計數厚垣孢子數後備用。通過試驗發現，該菌株的生長發育對營養的要求較低，在馬鈴薯汁中添加一定種類和濃度的微量元素即可適應和滿足該真菌不同階段的生長發育。
權利要求
1. 嗜線蟲真菌培養的一種液體培養基及其厚垣孢子製備方法，其特徵在於，液體培養基主要成份為馬鈴薯汁和微量鹽，馬鈴薯汁含量在0.5-20％；各種無機鹽、微量鹽含量分別為KH2PO4 0.50-2.0g/L；MgSO4.7H2O 0.3-1.50g/L；KCI 0.3-1.50g/L；FeSO4.7H2O0.005--0.02g/L；ZnSO4.7H2O 0.005--0.02g/L；CuSO4.5H2O0.003--0.008g/L，該培養基pH為5.5-7.5。
2、 根據權利要求1所述的嗜線蟲真菌培養的一種液體培養基及其厚 垣孢子製備方法，，其特徵在於，液體培養基分裝於100--1000ml三角瓶 或5—15升發酵罐，裝量為容器體積的1/3—1/5;高壓滅菌後可用於真 菌的種子製備和擴大生產發酵。
3、 根據權利要求1所述的嗜線蟲真菌培養的一種液體培養基及其厚 垣孢子製備方法，其特徵在於，取保存於瓊脂培養板的嗜線蟲真菌 Duddingtonia flagrans培養物，接種於裝有上述培養基並高壓滅菌的 100"--250ml三角瓶中，置25t:-3(TC的恆溫振搖培養箱中，前5天每天 振搖30_60分鐘，其餘時間靜置培養，或直接振搖培養10—14天，培 養結束時取出，置4t或室溫待用。
4、 根據權利要求2所述的嗜線蟲真菌培養的一種液體培養基及其厚 垣孢子製備方法，其特徵在於，擴大生產發酵，採用500--lOOOml三角 瓶，製備的嗜線蟲真菌Duddingtonia flagrans種子，以2—5%的量接種， 置25"C—3(TC的恆溫振搖培養箱中，前5天每天振搖30—60分鐘，其餘 時間靜置培養，或直接振搖培養時間持續3—4周，培養結束時取出，置4'C或室溫待用。具體培養持續時間，以培養物中厚垣孢子數^lXlS/ml 即可。培養時間34周，具體培養持續時間根據對培養物的檢査，厚垣孢 子數^lXl5/ml即可。
5、 根據權利要求2所述的嗜線蟲真菌培養的一種液體培養基及其厚 垣孢子製備方法，其特徵在於，擴大生產發酵，採用5—15升發酵罐， 前述製備的嗜線蟲真菌Duddingtonia flagrans種子，以2—5%的量接種。 置25"C—3(TC的恆溫振搖培養箱中，前5天每天採用低速(30—100rpm) 攪拌通氣培養30~60分鐘，其餘時間靜置培養，或直接採用低速(30—100rpm)攪拌通氣培養10—14天，培養結束時取出，置4。C或室溫 待用。具體培養持續時間，以培養物中厚垣孢子數》lXlS/ml即可。
6、 根據權利要求4和5所述的嗜線蟲真菌培養的一種液體培養基及 其厚垣孢子製備方法，其特徵在於，擴大生產發酵生產的嗜線蟲真菌 Duddingtonia flagrans培養物可通過1000轉/分的離心，或用G5濾器抽濾， 收集沉澱或濾器上的收集物，自然乾燥，碾碎，計數厚垣孢子數，分裝，備用o
全文摘要
嗜線蟲真菌(Duddingtonia flagrans)培養的一種液體培養基及其厚垣孢子製備方法，屬於家畜胃腸道寄生蟲病防治技術領域，液體培養基主要成份為馬鈴薯汁和微量鹽。分裝於100-1000ml三角瓶或5-15升發酵罐，裝量為容器體積的1/3-1/5；高壓滅菌後可用於真菌的種子製備和擴大生產發酵。該技術原料來源充足且成本低，這有助於降低生產成本，減輕勞動強度，提高菌株製劑的生產效率，提高了該製劑規模化的生產和產業化水平。用該技術進行嗜線蟲真菌Duddingtonia flagrans的發酵培養，既可以為Duddingtonia flagrans厚垣孢子批量化生產提供種子，也可以直接用於厚垣孢子的生產。
文檔編號C12N1/14GK101210224SQ20061006368
公開日2008年7月2日 申請日期2006年12月28日 優先權日2006年12月28日
發明者琳 王, 王治才 申請人:王治才