Prrs病毒載體重組疫苗的製作方法

2023-12-08 20:00:46 3

Prrs病毒載體重組疫苗的製作方法
【專利摘要】對活性或滅活重組疫苗進行描述，包括病毒載體和藥學上可接受的載體、佐劑和/或賦形劑，其特徵在於，由於α和/或γ幹擾素的增加，病毒載體能夠產生細胞免疫應答，並能夠進行快速複製，已經插入源自PRRS的ORF5和ORF6核苷酸序列。
【專利說明】PRRS病毒載體重組疫苗
發明領域
[0001]本發明涉及到用於預防和控制豬繁殖與呼吸症候群(PRRS)的技術，更具體地說，它與病毒載體重組疫苗有關，該疫苗插入了對PRRS病毒具有抗原活性的蛋白質外源核苷酸序列編碼，並使用藥學上可接受的載體、佐劑和/或賦形劑製成。
[0002]發明背景
[0003]豬繁殖與呼吸症候群病毒(vPRRS)是一種有包膜的病毒，屬於RNA族中動脈炎系列的動脈炎屬。該病毒的大小約為460納米，其病毒基因組由RNA正鏈(包含7個開放閱讀框架(ORF)，分別為ORFla和ORFlb以及0RF2-0RF7，從而形成7種結構性蛋白組合(gp2a、2b - 5、M和N)和至少13種非結構性蛋白(nspla、nsplb_nspl2),每一種蛋白都具有形成vPRRS的特定功能。特別是,這種病毒選擇性地感染負責觸發免疫反應並參與免疫反應調節的單核細胞/巨噬細胞系時，表現出一種免疫調節行為。經證實，該病毒能夠通過減少幹擾素(IFN )的分泌量，延遲中和抗體的分泌並減少免疫誘餌的分泌量，來改變免疫反應(Yoo 等人，2009 年;Sang 等人，2009 年；Patel 等人，2009 年;Chen 等人，2009 年；Lalit, 2009年)。由於vPRRS具有很強的抗原變異性，因此很難使用基於各種疫苗接種策略的傳統方法進行抵抗。因此，全球都在不懈努力開發出一種能有效對抗感染擴散的生物製劑，即能夠實現這一目標的病毒基因操作產品的最佳方案(Lara，2010年)。人們從這一點出發，正在研究可提供任何類型保護的病毒亞單位。0RF5和0RF6的使用已經顯示出了良好的預期效果，因為它們能對病毒毒力的降低起作用，至少起部分作用(Kim等人,2009年；Zuckerman等人，2007年)，但前提條件是利用活細胞(複製)產品實現免疫，因為這些產品是在與病毒對抗過程中唯一能夠提供保護的，而且這種保護程度是通過對抗病毒後病毒血症的緩解程度進行衡量的。2005年，通過修改糖基化研發出0RF5突變體，並將其作為免疫原進行測試，結果表明，GP5低糖基化可提高vPRRS在體內誘導產生中和抗體的能力(Ansari等人，2005年)。
[0004]具體就0RF5而言，美國和歐洲菌株的胺基酸殘基1-25之間具有很高的變異性，但每個大洲將接近胺基酸末端序列的胺基酸殘基26和39之間歸為應變區域的高應變區。
[0005]0RF5序列變更可能導致母豬流產和死亡症候群(SAMS)或「高熱」症候群非典型疫情的爆發，這曾在中國出現過(Ferrari等人，2003年；Martelli，2003年)。
[0006]目前商業化的抗PRRS的疫苗含有一種弱毒，但它的缺點是有可能使豬感染，從而導致病情惡化及免疫系統的損傷，這主要發生在動物幼崽身上(高度易感，預先沒有徵兆);此外，結果表明，這種疫苗病毒會變異，本身可與傳播當中的病毒重新組合，從而形成新的遺傳變種病毒。同樣，研究已顯示，弱毒活疫苗並不能完全有效地預防疾病，並且此前的研究也表明，抗vPRRS抗體參與抗體依賴性增強(ADE)的增強機制和/或vPRRS引發的免疫病理學機制(Thanawongnuwech和Suradhat, 2010年)，從而導致與預期相反，接種疫苗的動物變得更容易受到PRRS疾病的影響。
[0007]上述研究也獲得了一些與對抗此種疾病的重組疫苗相關的專利。
[0008]美國專利號7，722，878中公開了一種抗PRRS的重組疫苗，它由僅包含vPRRS的ORFl或與其他ORF相結合的載體構成。這些疫苗可用於誘導動物體內的免疫反應，防止感染vPRRS，降低病情的嚴重程度或緩解症狀。為確定這些疫苗的效率，對肺部病灶的數目和vPRRS的特徵進行了測定，並得出了相關肺部病灶減少幅度達47%的結果。[0009]在美國專利號5，888，513中，公開了與西班牙分離的vPRRS 0RF2 - 0RF7相對應的重組蛋白，這種蛋白是在杆狀病毒表達系統中製成的，並可用於疫苗配方。
[0010]中國的專利申請號CN1554766A和CN1800375A中描述了將腺病毒用作載體的抗PRRS重組疫苗。同樣，中國專利申請號CN1778926A公開了一種vPRRS的0RF5改性基因，可將其用於製備抵抗這種疾病的疫苗。
[0011 ] 在美國專利號7，041，443中，描述了歐洲型PRRS病毒、多核苷酸和多肽，用於製備包含弱毒或滅活vPRRS的免疫原性組合物，包括一些精選序列的多核苷酸。
[0012]另一方面，美國專利號6，207，165公開了一種對抗豬生殖和/或呼吸病症致病體的多價疫苗配方，其中一種致病體便是PRRS。該配方至少包括三種類型的疫苗，每種疫苗都由質粒和具有豬病原體原子價的基因構成，對於PRRS，便是E、0RF3或M基因。
[0013]最後，美國專利號5，998，601公開了 vPRRS的VR-2332菌株的核苷酸序列，可編碼ORF或其片段以及由此製成的疫苗。
[0014]儘管有上述專利，雖然採用先進技術製成的疫苗能夠減弱疾病的影響，但到目前為止，尚未達到足夠有效預防vPRRS，從而有效控制疾病的水平。
[0015]發明目的
[0016]考慮到現有技術的缺點，本發明的目的在於提供一種能有效對抗豬繁殖與呼吸症候群(PRRS)的病毒載體重組疫苗。
[0017]本發明的另一個目的是，通過提供抗PRRS的病毒載體重組疫苗，使其產生比以整個PRRS病毒為基礎的疫苗更快的免疫反應。
[0018]本發明的目的是提供用於控制PRRS的病毒載體重組疫苗的用法。
[0019]本發明的另一個目的是，提供病毒載體的構建方法，即插入對PRRS病毒具有抗原活性的蛋白質的外源核苷酸序列編碼。
[0020]發明概沭
[0021]為實現這一目的，我們發明了重組疫苗，其病毒載體能夠由於α和/或Υ幹擾素分泌量增加而產生細胞免疫應答，尤其針對新城疫病毒能夠快速複製，從PRRS 0RF5、0RF6及兩者組合中選擇插入了核苷酸序列並使用了藥學上可接受的載體、佐劑和/或賦形劑。
[0022]附圖簡沭
[0023]所附的權利要求書中將特別敘述本發明特徵的新穎方面。然而，有些實施例、特徵、目的及其優點，只有結合附圖才能更好地理解其詳細描述。
[0024]圖1是與商業疫苗相比較，接種了本發明抗PRRS滅活疫苗的豬的體重增長。
[0025]圖2是與商業疫苗相比較，接種了本發明抗PRRS活性疫苗的豬的體重增長。
[0026]發明詳沭
[0027]在研究本發明的過程中，我們發現重組疫苗的病毒載體能夠由於α和/或Y幹擾素分泌量增加而產生細胞免疫應答，能夠快速複製，在PRRS病毒(vPRRS)的抗原位點插入了外源核苷酸序列編碼，並使用了藥學上可接受的載體、佐劑和/或賦形劑，該疫苗能夠對豬繁殖與呼吸症候群提供適當的預防作用，這一成果令人驚訝。[0028]使用的病毒載體可以是活病毒(活的)或滅活病毒(死的)。作為病毒載體並在vPRRS抗原位點插入核苷酸序列編碼的重組病毒一旦滅活後就失去了複製能力，這一點是可以理解的。可通過採用本【技術領域】中眾所周知的物理或化學流程進行滅活，最好用甲醛或β-丙內酯進行化學滅活(國際獸疫局，2008年)。新城疫病。世界動物衛生組織陸生動物診斷試驗和疫苗手冊。國際獸疫局。法國，第576-589頁)。相反，活病毒依舊具有複製能力。
[0029]病毒載體最好是副粘病毒，從任何血清型、基因型或遺傳類型的副粘病毒中進行選擇，包括低毒型、中毒型和強毒病毒。同樣，也可採用能夠利用反向遺傳技術的副粘病毒，以便去除117位的苯基丙氨酸和導致副粘病毒具有致病性的Q114位附近的鹼性胺基酸；或是感染鳥類的病毒屬中的副粘病毒，如新城疫病毒或仙臺病毒。病毒載體最好是新城疫病毒，本發明所述病毒載體最好從低毒、中毒菌株中選擇，例如LaSota、B1、QV4、Ulster、Roakin和Komarov菌株。重組病毒最好是LaSota菌株。
[0030]關於vPRRS抗原位點的核苷酸序列編碼，在現有技術中已經描述了一些ORF序列，如0RF5和0RF6的序列，它們可用於生產抗PRRS的疫苗，如美國專利號5，885，513和7，041，443以及中國專利申請號CN1778926A中公開的疫苗。對於本發明而言，所用的核苷酸序列選自SEQ ID N0:1(0RF5)、SEQ ID N0:2(0RF6)以及兩者的組合。
[0031]通過聚合酶鏈式反應(PCR)擴增感興趣的核苷酸序列，並將該已經擴增的核苷酸序列插入副粘病毒的病毒載體，可製備本發明疫苗的病毒載體。利用分子生物學克隆標準技術進行插入。由此獲得的感染性克隆轉染到細胞培養中，以生成重組病毒。
[0032]病毒在任何適合其不斷增長的培養系統中複製，如SPF雞胚或商業化的細胞系，或明確設計用於繁殖病毒的細胞系，直到達到實現抗原反應所需的病毒濃度，優選濃度介於106_°和10lcl_°DIE P50%/mL之間，最佳濃度在108_°和109 5DIEP50%/mL之間。活疫苗實施例中使用天然低毒力的疫苗活病毒或使用本【技術領域】中熟知的流程將病毒的毒力減弱。另一方面，疫苗滅活時，一旦病毒濃度達到了實現抗原反應所需的濃度，病毒也就失去了活性。最好通過本【技術領域】眾所周知的物理或化學流程進行滅活，優選甲醛、β -丙內酯或二乙烯亞胺(Β.Ε.1.)進行化學滅活。
[0033]適用於本發明疫苗的藥學上可接受載體最好是水溶液或乳液。更具體地說，優選使用的載體是水一油、油一水或水一油一水(WOW)乳液,最好選用水一油一水乳液。關於疫苗接種，以噴淋、噴霧或溶於飲用水的形式，通過肌肉注射、鼻內途徑、皮下注射的方式進行，每種情況根據活疫苗或滅活疫苗的特點，使用適合豬的手段和形式。可以通過肌肉注射或鼻內途徑接種，不過最好選用肌肉注射方式。
[0034]為進一步理解本發明，我們提供了以下實施例。這些實施例僅為說明性的，以便更好地理解本發明的優選實施例，而不意味著可根據以上詳細描述實施其他未舉例的現有實施例。
實施例
[0035]實施例1
[0036]新城疫病毒LaSota載體的製備
[0037]為了克隆新城疫病毒菌株LaSota的基因組，從而生成病毒載體，首先引入稱為「PSL1180NDV/LS」的中間載體。為此，通過三唑方法進行病毒總RNA提取。RNA經過純化，然後將之前純化的總RNA作為模版,進行病毒基因組的cDNA (互補DNA)合成。為了克隆新城疫病毒基因組的所有基因(15，183個鹼基對(bp))，通過PCR方法增強了 7個具有「重疊」末端和粘性酶切位點的基因片段。片段I (Fl)包含核苷酸序列(nt)l-1755，片段2(F2)包含ntl-3321，片段 3(F3)包含 ntl755_6580，片段 4 (F4)包含 nt6, 151-10，210，片段 5 (F5)包含 nt7, 381-11，351，片段 6(F6)包含 ntll, 351-14，995，片段 7(F7)包含 ntl4, 701-15，186。使用連接標準技術在被稱為pGEM-pSL1180的克隆載體中進行7個片段的拼接，以便於新城疫病毒LaSota基因組的重建，該基因組克隆後在P和M基因之間存在單一的酶切位點SacII,並且可用於克隆此病毒載體區域內感興趣的任何基因。
[0038]實施例2
[0039]克隆源自vPRRS的0RF5和0RF6基因 [0040]為克隆vPRRS的0RF5和0RF6基因，使用Triazole法提取病毒總RNA。然後使用經過純化的總RNA合成cDNA(互補DNA)，通過PCR技術，使用特定的寡核苷酸擴增所述PRRS病毒的基因。隨後使用克隆標準技術，將0RF5和0RF6基因插入Fermentas的pJET載體，從而獲得質粒:pJET0RF5/0RF6。
[0041]實施例3
[0042]在pSL1180NDV/LS 載體的 SacII 位點克隆 vPRRS 的 0RF5 和
[0043]0RF6 基因，以形成質粒 pNDV-LS (wt) Orf5/6
[0044]A:吿l|備plntNhe中間載體
[0045]為將新城疫病毒名為GE/GS的轉錄序列引入0RF5和0RF6基因的5』末端，通過將新城疫病毒基因組作為模版，利用PCR方法初次擴增GE/GS序列，然後將這些序列插入PGEM-T的方式，創建新的中間載體。
[0046]B:將0RF5和0RF6某閔亞克降到載體plntNhe
[0047]plntNhe質粒與Spel-Hpal —同消化，然後克隆到plntNhe中，從而獲得pintNhe56質粒。
[0048]C:將 GE/GS-0RF5/6 亞克降到載體 PSL1180NDV/LS
[0049]用Nhel酶消化pINTNhe56質粒，並用SacII消化PSL1180NDV/LS質粒；去除消化產物從而剩下相容性連接位點，GE/GS-0RF5/6區域經過純化後插入pNDV/LS的SacII位點，從而獲得名為pNDV-LS (wt) Orf5/6的感染性克隆。
[0050]實施例4
[0051]在細胞培養中製備重組疫苗rNDV-LS (wt) Orf5/6
[0052]使用感染複數(MOI)為I的MAV-7病毒首次感染ifep-2和A-549細胞。在37°C、5%的CO2環境中孵育I小時後，用I微克(g) pNDV-LS (wt) Orf 5/6的DNA和0.2 g表達質粒pNP、pP和pL的DNA進行轉染，對病毒蛋白P、NP和L進行編碼，從而製備兩種細胞類型的重組疫苗。轉染四十四小時後，獲得兩種細胞類型的重組疫苗，然後接種至10日齡的SPF雞胚，以增強獲得的病毒。在Veix)細胞中使用平板法滴度獲得尿囊液，從而生成用於製備疫苗的最終重組病毒。
[0053]實施例5
[0054]利用插入了 vPRRS 0RF5和0RF6的新城疫LaSota重組病毒生[0055] 產疫苗pNDV-LS (wt) 0rf5/6vac 的方法:
[0056]從產物開始，將先前確定的感染劑量接種至無特定病原體(SPF)的雞胚中。在37°C的條件下孵育雞胚72小時，每日監測其死亡率。之後，將當天的活胚胎冷卻至第二天，最好達到24小時，在無菌條件下獲得氨基尿囊液(西班牙語縮寫FAA)，並用離心法澄清。FAA經過測試，確定其純度、無菌度和DIEP滴定度。
[0057]在水一油一水類型的乳液中製備活疫苗和滅活疫苗。在準備油相時，使用礦物油和Span80和Tween80類型的表面活性劑。在準備水相時，將FAA與防腐劑溶液(硫柳汞)混合。準備水乳液時，將水相緩慢添加至油相中，並不斷攪拌。使用均質器或膠體磨達到規定的粒徑。
[0058]以上疫苗經過配置使其最低濃度達到108_ °DIEP50%/0.5mL，每頭豬的劑量為
2.0mL0
[0059]根據上述流程，利用具有0RF5和0RF6基因的載體(pSL1180NDV/LS)製備重組實驗性疫苗，其名稱為pNDV-LS (wt)/0rf5/6vac，在無佐劑的情況下對活疫苗進行了測試(實施例5A)，使用水一油一水佐劑分別對活疫苗(實施例5B)和滅活疫苗(實施例5C)進行了測試，所有情況下均應用兩個劑量。
[0060]實施例6
[0061]體內評估重組疫苗pNDV-LS (wt)/Orf 5/6vac的效力
[0062]為確定本發明所述疫苗的效力並證明這些疫苗比商業疫苗(應用I劑)更有效，我們對其功效進行了測試。
[0063]以106_°DICC50%mL/45分鐘的劑量使用PRRS病原體活病毒，在不同的實驗中進行測試，以確定疫苗的效力。
[0064]為此，本發明使用3到5周、雙耳分別標記編號的104頭豬，稱其體重並隨機分配為9個治療組,如表1所示。
[0065]表1.治療組
[0066]
【權利要求】
1.病毒載體能夠由於α和/或Y幹擾素的增加而產生細胞免疫應答，並且能夠快速複製，其特徵在於，它已為對PRSS病毒具有抗原活性的蛋白質插入了外源核苷酸序列編碼。
2.根據權利要求1所述的病毒載體，其進一步的特徵在於，它是副粘病毒。
3.根據權利要求2所述的病毒載體，其進一步的特徵在於，副粘病毒選自包括血清型、基因型或遺傳型在內的任何副粘病毒，包括弱毒型、中毒型和強毒病毒；可採用反向遺傳技術去除117位置的苯基丙氨酸和導致副粘病毒具有致病性的Q114位置附近的鹼性胺基酸的副粘病毒；或是感染鳥類的副粘病毒屬中的副粘病毒。
4.根據權利要求3所述的病毒載體，其進一步的特徵在於，副粘病毒源自新城疫病毒和仙臺病毒。
5.根據權利要求4所述的副粘病毒病毒載體，其進一步的特徵在於，副粘病毒屬於新城疫病毒。
6.根據權利要求5所述的病毒載體，其進一步的特徵在於，新城疫病毒選自LaSota、B1、QV4、Ulster、Roakin 和 Komarov 菌株。
7.根據權利要求1所述的病毒載體，其進一步的特徵在於，外源核苷酸序列選自0RF5、0RF6以及它們的組合物。
8.根據權利要求7所述的病毒載體，其進一步的特徵在於，0RF5和0RF6的序列分別是SEQ ID NO:1和 SEQ ID NO:2。
9.重組疫苗的特徵在於，由能夠產生細胞免疫應答的病毒載體(原因在於α和/或Y幹擾素的增加)製成，並能夠快速複製，已經為針對PRRS病毒具有抗原活性的蛋白質插入一個外源核苷酸序列編碼，並使用藥學上可接受的載體、佐劑和/或賦形劑。
10.根據權利要求9所述的重組疫苗，其進一步的特徵在於，病毒屬於副粘病毒。
11.根據權利要求10所述的重組疫苗，其進一步的特徵在於，副粘病毒是活的或經過滅活處理。
12.根據權利要求11所述的重組疫苗，其進一步的特徵在於，副粘病毒源自任何血清型、基因型或遺傳類型，包括低毒、中等毒和強毒性病毒；可採用反向遺傳技術去除117位置的苯基丙氨酸和導致副粘病毒具有致病性的Q114位置附近的鹼性胺基酸的副粘病毒；或是感染鳥類的副粘病毒屬中的副粘病毒。
13.根據權利要求12所述的重組疫苗，其進一步的特徵在於，副粘病毒源自新城疫病毒和仙臺病毒。
14.根據權利要求13所述的重組疫苗，其進一步的特徵在於，副粘病毒屬於新城疫病毒。
15.根據權利要求14所述的重組疫苗，其進一步的特徵在於，新城疫病毒源自LaSota、B1、QV4、Ulster、Roakin 和 Komarov 菌株。
16.根據權利要求9所述的重組疫苗，其進一步的特徵在於，外源核苷酸序列選自0RF5、0RF6以及它們的組合物。
17.根據權利要求16所述的重組疫苗，其進一步的特徵在於，0RF5和0RF6的序列分別是 SEQ ID NO:1和 SEQ ID NO:2。
18.根據權利要求9所述的重組疫苗，其進一步的特徵在於，藥學上可接受的載體最好是水溶液或乳液。
19.根據權利要求18所述的重組疫苗，其進一步的特徵在於，藥學上可接受的載體選自水一油，油一7K或水一油一水乳液。
20.根據權利要求19所述的重組疫苗，其進一步的特徵在於，藥學上可接受的載體最好是水溶液或乳液。
21.根據權利要求9所述的重組疫苗，其進一步的特徵在於，實現抗原反應所需的病毒濃度介於 106_° 和 10lcl_°DIEP50%/mL 之間。
22.根據權利要求21所述的重組疫苗，其進一步的特徵在於，實現抗原反應所需的病毒濃度介於108_°和109 5DIEP50%/mL之間。
23.根據權利要求9所述的重組疫苗，其進一步的特徵在於，它是通過肌肉注射、鼻腔途徑、皮下注射、噴淋、噴霧或溶於飲用水的方式接種。
24.根據權利要求23所述的重組疫苗，其進一步的特徵在於，它是通過肌肉注射的方式接種。
25.根據權利要求9所述，使用重組疫苗的目的是控制PRRS。
26.根據權利要求9所述，使用重組疫苗的目的是控制PRRS，其特點在於，應用兩個劑量的疫苗後，免疫接種動物的肺部病灶低於12%。
【文檔編號】A61K39/12GK103649320SQ201180072146
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2011年5月7日 優先權日:2011年5月7日
【發明者】B.洛扎諾-杜伯納德, E.索託-普裡安特, D.薩法蒂-米茲拉西, J.H.拉拉-普恩特 申請人:阿維-梅克斯實驗室公司