一種耐鹽紫花苜蓿的構建與培育方法
2023-12-08 19:49:41 2
專利名稱：一種耐鹽紫花苜蓿的構建與培育方法
技術領域：
本發明涉及生物工程技術領域，屬於生物轉基因技術，特別是一種耐鹽紫花苜蓿的構建與培育方法。
背景技術：
隨著世界人口的增加和人民生活水平的提高，人們對農業生產有著日益增長的需求。人類已經將森林和草原改造為農田，將處於生態邊緣的乾旱和半乾旱土地用人工灌溉生產糧食。這些活動的間接後果就是地表鹽分的升高，在全世界大約有25%的農田已經淪為鹽鹼地，僅發明者所處的寧夏地區就有80多萬畝的鹽鹼荒地和150多萬畝的鹽鹼低產地，而且它們的面積還在逐年擴大。現有改善鹽鹼地的主要方法是用工程方法構建排水網絡，使地表鹽分隨灌溉水或天然降雨流入低處。最近亦有人嘗試將燃燒過的含硫煤渣摻入鹽鹼土，改善的土壤環境，促·進植物生長。但所有這些工程法都需要大量的先期投入。在農業生產相對附加值減少，經濟市場化的趨勢下，這些方法很難普遍實行。紫花苜蓿具有非常高的經濟價值，被稱為「畜草之王」。它是多年生豆科植物，它有較深的根系並可以固氮，是改良土壤的常用作物。但是，一般紫花苜蓿雖然具備了改良鹽鹼地的基本條件，但是抗鹽的能力非常有限。轉基因工程利用農桿菌質粒將特定基因轉移至植物內部的技術已經成熟。
發明內容
本發明的目的是克服現有技術缺陷，提供一種構建和培育耐鹽紫花苜蓿的方法。本發明的目的按照下述方案實現一種構建和培育耐鹽紫花苜蓿的方法，包括以下步驟(1)選擇易於產生離體葉胚性愈傷組織的紫花苜蓿品種；(2)選擇適於紫花苜蓿葉離體培養並產生愈傷組織的培養基；(3)選擇適於轉化紫花苜蓿的農桿菌品種；(4)選擇農桿菌二元質粒，使重組基因處於高效啟動子的控制下；(5)將大麥鈉氫離子對流泵完整的表達基因克隆，並將其植入農桿菌二元質粒；(6)將重組二元質粒導入農桿菌，並用其感染紫花苜蓿離體葉組織；(7)選擇並培養轉基因紫花苜蓿整體植株；
上述農桿菌二元質粒的構建步驟是首先，用PCR將大麥鈉氫離子對流泵基因的完整編碼序列從它的cDNA克隆中擴增，HvNHXl PCR引子為5』- CGTCTAGAATGGCGTTCGAAGTGGTGGC-3』 和 5』- ACGCGAGCTCAGCTGTAATGGCTTTTCTCT -3』 ；其次，選擇農桿菌 pBI121 作為重組二元質粒的基本架構JfpBI121質粒中的GUS基因用限制性內切酶去除，然後用連接酶植A PCR擴增的大麥鈉氫離子對流泵基因HvNHXl ；
上述適於紫花苜蓿葉離體培養並產生愈傷組織的培養基包括紫花苜蓿的葉片組織轉化為愈傷組織的培養基B5hKTc，該培養基含有以下成分3. I g/L Gamborg's B5 salts,I. 0 ml/L IOOOx Gamborg's B5 vitamins,0. 5 g/L KN03,0. 25 g/L MgS04(7H20)，0. 5g/L proline, 30 g/L sucrose, pH to 5. 7 with KOH, 8 g/L Phytagar,植物 hormones
Img/L 2, 4-D,0. I mg/L kinetin,胺基酸母液 30ml/L (胺基酸母液含有26.6 g/LL-glutamine,3. 32 g/L serine, 0. 016 g/L adenine, 0. 332 g/L L-glutathione),25 mg/Lkanamycin and 500 mg/L ticarcillin ；
上述適於紫花苜蓿葉離體培養並產生愈傷組織的培養基包括用紫花苜蓿愈傷組織產生胚胎的B5hOKTc培養基，該培養基含有以下成分3. I g/L Gamborg's B5 salts, 1.0ml/L IOOOx Gamborg's B5 vitamins,0. 5 g/L KN03,0. 25 g/L MgS04(7H20)，0. 5 g/Lproline, 30 g/L sucrose, pH to 5. 7 with KOH, 8 g/L Phytagar,胺基酸母液 30ml/L (胺基酸母液含有26. 6 g/L L-glutamine, 3. 32 g/L serine, 0. 016 g/L adenine, 0. 332 g/LL-glutathione ),25 mg/L kanamycin and 500 mg/L ticarcillin ；
上述適於紫花苜蓿葉離體培養並產生愈傷組織的培養基包括用紫花苜蓿的胚胎產生幼莖的MMSKTc培養基,該培養基含有以下成分4. 3 g/L Murashige and Skoog salts, I ml/L IOOOx Nitsch and Nitsch vitamin stock,0. I g/L myo-inositol,30 g/L sucrose,pH to 5. 7 with KOH,7. 0 g/L phytagar,500 mg/L ticarcillin, 25 mg/L kanamycin ；上述適於紫花苜蓿葉離體培養並產生愈傷組織的培養基包括用紫花苜蓿的幼莖產生根的MMSTc培養基,該培養基含有以下成分4. 3 g/L Murashige and Skoog salts, I ml/L IOOOx Nitsch and Nitsch vitamin stock,0.I g/L myo-inositol,30 g/L sucrose,pHto 5.7 with KOH,7. 0 g/L phytagar,500 mg/L ticarcillin。本發明轉基因耐鹽紫花苜蓿的構建和培育為改良鹽鹼地提供了一個新途徑，它把鹽鹼地改良從浩大規模的土方工程變為了高新科技的基因工程。這種新方法的初始投入量很少，但生物無限繁殖的特性卻使它有不可估量的長遠效益。轉基因耐鹽紫花苜蓿具有下述潛質1)能在鹽鹼地中生長，這是生物改善鹽鹼地的先決條件；2)它具有較深的根系，這些深根系降低了鹽鹼地的地下水位，起到排水網絡的效果；3)具有相當的經濟價值，使鹽鹼地的改良可持續進行。
圖I.本發明方法圖示；
圖2. 二元重組質粒的結構示意 圖3.用PCR檢測轉基因紫花苜蓿基因組中大麥鈉氫離子對流泵基因的存在的圖片；圖4.用RT-qPCR比較大麥鈉氫離子對流泵在轉基因紫花苜蓿以及對照紫花苜蓿中的表達的圖片；
圖5.轉基因紫花苜蓿(SY27+TranSgene HvNHXl) 土壤抗鹽試驗圖片；從右列至左列，每種鹽處理濃度分別為0%，0. 6%，I. 0%和I. 2%，持續時間為3個月。圖6.非轉基因紫花苜蓿(SY27) 土壤抗鹽試驗的圖片；從右列至左列，每種鹽處理濃度分別為0%，0. 6%，I. 0%和I. 2%，持續時間為3個月。
具體實施例方式構建轉基因紫花苜蓿的總體方案如圖I所示。它分為三個大步驟1)構建農桿菌重組二元質粒；2)轉化農桿菌和紫花苜蓿；3)選擇和培育轉基因紫花苜蓿。
用PCR將大麥鈉氫離子對流泵基因(HvNHXl)的完整編碼序列從它的cDNA克隆中擴增。HvNHXl PCR 引子為 5，- CGTCTAGAATGGCGTTCGAAGTGGTGGC -3， 和 5，-ACGCGAGCTCAGCTGTAATGGCTTTTCTCT -3，
選擇PBI121作為重組二元質粒的基本架構。將農桿菌pBI 121質粒中的⑶S基因用限制性內切酶去除，然後用連接酶植入PCR擴增的大麥鈉氫離子對流泵基因HvNHXl。重組二元質粒的結構如圖2所示。含有大麥鈉氫離子對流泵基因的重組二元質粒先被用來轉化農桿菌；重組農桿菌再被用來轉化紫花苜蓿離體葉片組織。用含有卡那黴素的培養基選擇轉基因紫花苜蓿胚性愈傷組織。該胚性愈傷組織在含有植物激素的培養基中長成整株轉基因紫花苜蓿。用PCR和RT-qPCR證實轉基因紫花苜蓿基因組中含有大麥鈉氫離子對流泵基因，且其高效表達，如圖3和4。 RT-qPCR的引子和探針序列分別為HvNHXl PCR引子:·5』 -TGGATGCACTGGATATCGAGAA-3』 和 5』 - AAAATTGAGCTTATTCCGATGGAT-3』 ；探針為 5』FAM-TGGAAAITTGCTAGTGACAGCCCTGGC-3』 Iowa Black，FAM 和 Iowa Black 分別為螢光染料和猝光劑。用不同濃度的鹽溶液長期澆灌生長在花土中的紫花苜蓿，比較轉基因紫花苜蓿和對照非轉基因紫花苜蓿，我們得到結果如圖5和圖6.
具體實驗如下
(I)PCR反應條件如下
在200 u I的PCR反應管中，加入下述反應試劑I X PCR緩衝液II (ABI，無Mg2+)，3mM MgCl2 ,300 mM dNTP，200 nM PCR 正向引物，200 nM 反向引物，I U GoldTaq DNA 聚合酶(ABI)，DNA樣品，總反應體積為12. 5微升。PCR反應溫度控制如下95 C 11分鐘，40個循環(94 C 30秒，55 C 30秒，72 C30 秒)。( 2 ) qPCR反應條件如下
在伯樂公司的96孔板上，加入下述反應試劑1 X PCR緩衝液II (ABI，無Mg2+)，3mMMgCl2 ,300 mM dNTP，200 nM PCR 正向引物，200 nM 反向引物，300 nM TaqMan IOffA BLACK探針，I U GoldTaq DNA聚合酶(ABI)，DNA樣品，總反應體積為12.5微升。TaqMan PCR反應溫度控制如下95 C 11分鐘，40個循環(94 C 30秒，65 C 30秒)。(3)紫花苜蓿的葉片組織適於在B5hKTc培養基中轉化為愈傷組織。B5hKTc培養基含有以下成分3. I g/L Gamborg's B5 salts, I. 0 ml/L IOOOx Gamborg's B5vitamins,0. 5 g/L KN03,0. 25 g/L MgS04(7H20),0. 5 g/L proline,30 g/L sucrose, pHto 5. 7 with KOH, 8 g/L Phytagar,植物hormones I mg/L 2, 4-D, 0. I mg/L kinetin,胺基酸母液 30ml/L (氛基酸母液含有26. 6 g/L L-glutamine, 3. 32 g/L serine, 0. 016 g/Ladenine,0. 332 g/L L-glutathione),25 mg/L kanamycin and 500 mg/L ticarcillin。
(4)紫花苜蓿愈傷組織在B5h0KTc培養基中產生胚胎。B5h0KTc培養基含有以下成分3. I g/L Gamborg's B5 salts, I. 0 ml/L IOOOx Gamborg's B5 vitamins, 0. 5 g/LKN03,0. 25 g/L MgS04 (7H20)，0. 5 g/L proline, 30 g/L sucrose, pH to 5.7 with KOH,8 g/L Phytagar，胺基酸母液 30ml/L (胺基酸母液含有:26.6 g/L L-glutamine, 3. 32 g/L serine,0. 016 g/L adenine,0. 332 g/L L-glutathione ),25 mg/L kanamycin and 500mg/L ticarcillin。(5)紫花苜蓿的胚胎在麗SKTc培養基中產生幼莖。麗SKTc培養基含有以下成分4. 3 g/L Murashige and Skoog salts，I ml/L IOOOx Nitsch and Nitsch vitamin stock，0. I g/L myo-inositol,30 g/L sucrose,pH to 5. 7 with KOH,7. 0 g/L phytagar,500 mg/L ticarcillin, 25 mg/L kanamycin。(6)紫花苜蓿的幼莖適於在麗STc培養基中產生根。麗STc培養基含有以下成分4. 3 g/L Murashige and Skoog salts，I ml/L IOOOx Nitsch and Nitsch vitamin stock，0. I g/L myo-inositol,30 g/L sucrose,pH to 5. 7 with KOH,7. 0 g/L phytagar,500 mg/L ticarcillin。·
權利要求
1.一種構建和培育耐鹽紫花苜蓿的方法，包括以下步驟(1)選擇易於產生離體葉胚性愈傷組織的紫花苜蓿品種；(2)選擇適於紫花苜蓿葉離體培養並產生愈傷組織的培養基；(3)選擇適於轉化紫花苜蓿的農桿菌品種；(4)選擇農桿菌二元質粒，使重組基因處於高效啟動子的控制下；(5)將大麥鈉氫離子對流泵完整的表達基因克隆，並將其植入農桿菌二元質粒；(6)將重組二元質粒導入農桿菌，並用其感染紫花苜蓿離體葉組織；(7)選擇並培養轉基因紫花苜蓿整體植株。
2.如權利要求I所述的構建和培育耐鹽紫花苜蓿的方法，其特徵在於上述農桿菌二元質粒的構建步驟是首先，用PCR將大麥鈉氫離子對流泵基因的完整編碼序列從它的cDNA 克隆中擴增，HvNHXl PCR 引子為 5』 - CGTCTAGAATGGCGTTCGAAGTGGTGGC -3』 和 5』 -ACGCGAGCTCAGCTGTAATGGCTTTTCTCT -3』 ；其次，選擇農桿菌pBI121作為重組二元質粒的基本架構JfpBI121質粒中的GUS基因用限制性內切酶去除，然後用連接酶植入PCR擴增的大麥鈉氫離子對流泵基因HvNHXl。
3.如權利要求I所述的構建和培育耐鹽紫花苜蓿的方法，其特徵在於上述適於紫花 苜蓿葉離體培養並產生愈傷組織的培養基包括紫花苜蓿的葉片組織轉化為愈傷組織的培養基 B5hKTc，該培養基含有以下成分3. I g/L Gamborg's B5 salts, I. O ml/L IOOOxGamborg's B5 vitamins,0. 5 g/L KN03,0. 25 g/L MgS04(7H20),0. 5 g/L proline, 30 g/L sucrose, pH to 5. 7 with Κ0Η, 8 g/L Phytagarjl^lJhormones I mg/L 2, 4-D, 0. I mg/L kinetin,胺基酸母液 30ml/L (胺基酸母液含有26. 6 g/L L-glutamine, 3. 32 g/Lserine,0. 016 g/L adenine,0. 332 g/L L-glutathione),25 mg/L kanamycin and 500 mg/L ticarcillin。
4.如權利要求I所述的構建和培育耐鹽紫花苜蓿的方法，其特徵在於上述適於紫花苜蓿葉離體培養並產生愈傷組織的培養基包括用紫花苜蓿愈傷組織產生胚胎的B5h0KTc培養基，該培養基含有以下成分3. I g/L Gamborg's B5 salts, I. O ml/L IOOOx Gamborg'sB5 vitamins,0. 5 g/L KN03,0. 25 g/L MgS04(7H20),0. 5 g/L proline,30 g/L sucrose,pH to 5. 7 with Κ0Η, 8 g/L Phytagar,胺基酸母液 30ml/L (胺基酸母液含有26.6 g/LL-glutamine,3. 32 g/L serine,0. 016 g/L adenine,0. 332 g/L L-glutathione ),25 mg/L kanamycin and 500 mg/L ticarcillin。
5.如權利要求I所述的構建和培育耐鹽紫花苜蓿的方法，其特徵在於上述適於紫花苜蓿葉離體培養並產生愈傷組織的培養基包括用紫花苜蓿的胚胎產生幼莖的MMSKTc培養基，該培養基含有以下成分4. 3 g/L Murashige and Skoog salts, I ml/L IOOOx Nitschand Nitsch vitamin stock,0.I g/L myo-inositol,30 g/L sucrose, pH to 5. 7 withΚ0Η,7. 0 g/L phytagar,500 mg/L ticarcillin, 25 mg/L kanamycin。
6.如權利要求I所述的構建和培育耐鹽紫花苜蓿的方法，其特徵在於上述適於紫花苜蓿葉離體培養並產生愈傷組織的培養基包括用紫花苜蓿的幼莖產生根的MMSTc培養基，該培養基含有以下成分4. 3 g/L Murashige and Skoog salts, I ml/L IOOOx Nitsch andNitsch vitamin stock, 0. I g/L myo-inositol, 30 g/L sucrose, pH to 5. 7 with KOH,7.0 g/L phytagar,500 mg/L ticarcillin。
全文摘要
本發明涉及一種構建和培育耐鹽紫花苜蓿的方法，包括以下步驟(1)選擇易於產生離體葉胚性愈傷組織的紫花苜蓿品種；(2)選擇適於紫花苜蓿葉離體培養並產生愈傷組織的培養基；(3)選擇適於轉化紫花苜蓿的農桿菌品種；(4)選擇農桿菌二元質粒，使重組基因處於高效啟動子的控制下；(5)將大麥鈉氫離子對流泵完整的表達基因克隆，並將其植入農桿菌二元質粒；(6)將重組二元質粒導入農桿菌，並用其感染紫花苜蓿離體葉組織；(7)選擇並培養轉基因紫花苜蓿整體植株。本發明轉基因耐鹽紫花苜蓿的構建和培育為改良鹽鹼地提供了一個新途徑，它把鹽鹼地改良從浩大規模的土方工程變為了高新科技的基因工程。這種新方法的初始投入量很少，但生物無限繁殖的特性卻使它有不可估量的長遠效益。
文檔編號C12N15/82GK102787136SQ201210115969
公開日2012年11月21日 申請日期2012年4月19日 優先權日2012年4月19日
發明者李健, 柳金鳳, 計皖 申請人:寧夏森淼種業生物工程有限公司