甘藍型油菜細胞分裂原激活的蛋白激酶的激酶1蛋白編碼序列的製作方法

2023-12-08 19:53:36 3

專利名稱：甘藍型油菜細胞分裂原激活的蛋白激酶的激酶1蛋白編碼序列的製作方法
技術領域：
本發明涉及的是一種用於基因工程技術領域的蛋白編碼序列，特別是一種甘藍型甘藍型油菜細胞分裂原激活的蛋白激酶的激酶1(BnMKK1)蛋白編碼序列。
背景技術：
農作物在生長過程中會遇到各種各樣的自然災害而造成減產，如乾旱、滯澇和病蟲害等。當前一個重要的育種手段是將各種抗逆基因對農作物進行基因工程改造，以獲得抗逆農作物新品種。植物為抵抗不良的外界環境的脅迫，在長期的自然進化中發展起複雜的信號傳遞系統幫助自己度過當前的困境，其中MAP激酶(Mitogen-actived protein kinase)信號傳遞系統在抗逆過程中扮演了極其重要的作用。MAPKs是由MAP激酶(MAPK)與MAP激酶的激酶(mitogen-activatedprotein kinase kinase，MAPKK)和MAP激酶的激酶的激酶(mitogen-activatedprotein kinase kinase kinase，MAPKKK)3種類型組成。植物細胞感受環境脅迫(如損傷、乾旱、低溫等)和生長發育信號(生長素、乙烯、脫落酸等)後，可以通過受體蛋白激酶等上遊激活子順次激活MAPKKK、MAPKK、MAPK。其中，MAPKK是該傳遞鏈中中間的一個激酶，直接作用於MAPK調控下遊的基因表達，使植物表現出各種抗逆性能，是植物信號傳遞過程中重要的一環。
在對現有技術文獻的分析中，雖然雜誌《the Plant Journal植物雜誌》在2002，29637-647發表了文「Activation of AtMEK1，an Arabidopsis mitogen-activatedprotein kinase kinase，in vitro and in vivoanalysis of active mutantsexpressed in E.coli and generation of the active form in stress responsein seedlings(體內和體外的擬南芥細胞分裂原激活的蛋白激酶的激酶AtMEK1的激活大腸桿菌活性的突變表達分析和幼苗壓力反應中的活性形式)」，對基因MKK1在不同的非生物脅迫處理下的表達已經做了充分描述，但尚不清楚該基因的耐鹽、抗旱和抗蟲等其它環境因素的效果。

發明內容
本發明的目的在於克服現有技術中的不足，提供一種甘藍型油菜細胞分裂原激活的蛋白激酶的激酶1蛋白編碼序列。本發明公開了與甘藍型油菜BnMKK1密切相關的蛋白基因和甘藍型油菜BnMKK1蛋白序列及其核酸序列，應用轉基因技術改良植物抗生物和非生物脅迫的能力，使其在抗各種環境脅迫中具有明顯的作用，即能夠明顯降低在乾旱、水淹和病蟲害土地上種植的各種農作物在生物產量上的損失。
本發明是通過以下技術方案實現的本發明所分離出的DNA分子，該分子包括編碼具有甘藍型油菜BnMKK1蛋白質活性的多肽的核苷酸序列，而且該核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸第39-1007位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者該核苷酸序列能與SEQ ID NO.3中從核苷酸第39-1007位的核苷酸序列雜交。該編碼序列具有SEQ ID NO.3所示的胺基酸序列的多肽，或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。該編碼序列具有SEQ ID NO.3中從核苷酸第39-1007位的核苷酸序列。
所述的甘藍型油菜BnMKK1蛋白質活性的多肽，是本發明分離出的包含細胞分裂原激活的蛋白激酶甘藍型油菜MAPK類相關蛋白質多肽BnMKK1，它包括具有SEQID NO.3胺基酸序列的多肽，該多肽是具有SEQ ID NO.3序列的多肽，該多肽能夠在鹽、旱、冷、活性氧以及水楊酸處理下均能發揮作用，提供植物的抵抗各種不良環境的能力。
所述的DNA分子，它包含在本發明所提供的一種載體，該載體是一種核酸分子，它包含所述的DNA分子中8-100個連續核苷酸。
本發明用所述的DNA分子轉化的宿主細胞，它是真核細胞。
在本發明中，「分離的」、「純化的」DNA是指，該DNA或片段已從天然狀態下位於其兩側的序列中分離出來，還指該DNA或片段已經與天然狀態下伴隨核酸的組分分開，而且已經與在細胞中伴隨其蛋白質分開。
在本發明中，術語「甘藍型油菜抗逆信號傳遞激酶的激酶」指編碼具有甘藍型油菜BnMKK1蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.3中第39-1007位核苷酸序列及其簡併序列。該簡併序列是指，位於SEQ ID NO.3序列的編碼框第39-1007位核苷酸中，有一個或多個密碼子被編碼相同胺基酸的簡併密碼子所取代後而產生的序列。由於密碼子的簡併性，所以與SEQ ID NO.3中第39-1007位核苷酸序列同源性低至約70％的簡併序列也能編碼出SEQ ID NO.3所述的序列。該術語還包括能在中度嚴緊條件(70-85％一致性)下，更佳的在高度嚴緊條件(85％以上一致性)下與SEQ ID NO.3中從核苷酸第39-1007位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。該術語還包括與SEQ ID NO.3中從核苷酸第39-1007位的核苷酸序列的同源性至少70％，較佳地至少80％，更佳地至少90％，最佳地至少95％的核苷酸序列。
該術語還包括能編碼具有與天然的甘藍型油菜BnMKK1相同功能的蛋白的SEQID NO.3中開放閱讀框序列的變異形式。這些變異形式包括(但並不限於)若干個(通常為1-90個，較佳地1-60個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5』和/或3』端添加數個(通常為60個以內，較佳地為30個以內，更佳地為10個以內，最佳地為5個以內)核苷酸。
在本發明中，術語「甘藍型油菜抗逆信號傳遞的蛋白激酶的激酶編碼序列」指具有甘藍型油菜BnMKK1蛋白活性的SEQ ID NO.3序列的多肽。該術語還包括具有與天然甘藍型油菜BnMKK1相關相同功能的、SEQ ID NO.4序列的變異形式。這些變異形式包括(但並不限於)若干個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)胺基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數個(通常為20個以內，較佳地為10個以內，更佳地為5個以內)胺基酸。例如，在本領域中，用性能相近或相似的胺基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數個胺基酸通常也不會改變蛋白質的功能。該術語還包括甘藍型油菜BnMKK1蛋白的活性片段和活性衍生物。
本發明的甘藍型油菜BnMKK1多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導突變體、在高或低的嚴謹條件下能與甘藍型油菜BnMKK1相關DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用甘藍型油菜BnMKK1多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。
在本發明中，「甘藍型油菜BnMKK1保守性變異多肽」指與SEQ ID NO.3的胺基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個胺基酸被性質相似或相近的胺基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據表1進行替換而產生。
表1

表286％ identity in 1091nt overlapQuery39 atgaagaagggtggattcagcaataatctcaagttctcaatccctcctgctggcgagcaa 98|||||||| |||||||||||||||||||||||| || |||| ||| |||||||||||||Sbjct25 atgaagaaaggtggattcagcaataatctcaagctcgcaattcctgttgctggcgagcaa 84
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Sbjct1102 acgttctccgt 1112Query甘藍型油菜BnMKK1的核酸序列Sbjct擬南芥AtMKK1的核酸序列(AF067792)表2為本發明的甘藍型油菜BnMKK1蛋白與擬南芥AtMKK1蛋白的核苷酸序列的同源比較(GAP)表。
表390％ identity in 313aa overlapQuery1 MKKGGFSNNLKFSIPPAGEQSITKFLTQSGTFKDGDLRVNKDGVRIVSQSEPEALSPIKP 60MKKGGFSNNLK +IP AGEQSITKFLTQSGTFKDGDLRVNKDGVRI+SQ EPE LSPIKPSbjct1 MKKGGFSNNLKLAIPVAGEQSITKFLTQSGTFKDGDLRVNKDGVRIISQLEPEVLSPIKP 60Query61 ADDKLGLSDLDMVKFVGKGSSGVVQLVQHKWTGQFFALKVIQLNVDEAIRKSIAQELKIN 120ADD+L LSDLDMVK +GKGSSGVVQLVQHKWTGQFFALKVIQLN+DEAIRK+IAQELKINSbjct61 ADDQLSLSDLDMVKVIGKGSSGVVQLVQHKWTGQFFALKVIQLNIDEAIRKAIAQELKIN 120Query121 QSSQCPYLVTSYQSFYDNGAISLILEYMDGGSLEDFLKSVKTIPESYLSTIFKQVLQGLI 180QSSQCP LVTSYQSFYDNGAISLILEYMDGGSL DFLKSVK IP+SYLS IF+QVLQGLISbjct121 QSSQCPNLVTSYQSFYDNGAISLILEYMDGGSLADFLKSVKAIPDSYLSAIFRQVLQGLI 180Query181 YLHHDKHIIHRDLKPSNLLVNHRGEVKITDFGVSTVMTNTAGLANTFVGTYNYMSPERIV 240YLHHD+HIIHRDLKPSNLL+NHRGEVKITDFGVSTVMTNTAGLANTFVGTYNYMSPERIVSbjct181 YLHHDRHIIHRDLKPSNLLINHRGEVKITDFGVSTVMTNTAGLANTFVGTYNYMSPERIV 240Query241 GNKYGNKSDIWSLGLVVLECATGKFPYLPPDEEETWSSAFELMEAIVDQPPPTLPSESFS 300GNKYGNKSDIWSLGLVVLECATGKFPY PP++EETW+S FELMEAIVDQPPP LPS +FSSbjct241 GNKYGNKSDIWSLGLVVLECATGKFPYAPPNQEETWTSVFELMEAIVDQPPPALPSGNFS 300Query301 PELSSFISTCLQR 313PELSSFISTCLQ+Sbjct301 PELSSFISTCLQK 313Query甘藍型油菜BnMKK1的胺基酸序列
Sbjct擬南芥AtMKK1的胺基酸序列(ACC72754)表3為本發明的甘藍型油菜BnMKK1蛋白與擬南芥AtMKK1的胺基酸序列的同源比較(FASTA)表。其中，相同的胺基酸在兩個序列之間用胺基酸單字符標出。
發明還包括甘藍型油菜BnMKK1蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然甘藍型油菜BnMKK1相關多肽的差別可以是胺基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導的遺傳變異體。誘導變異體可以通過各種技術得到，如通過輻射或暴露於誘變劑而產生隨機誘變，還可通過定點誘變法或其他已知分子生物學的技術。類似物還包括具有不同於天然L-胺基酸的殘基(如D-胺基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的胺基酸(如β、γ-胺基酸)的類似物。應理解，本發明的多肽並不限於上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級結構)形式包括體內或體外的多肽的化學衍生形式如乙醯化或羧基化。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進一步加工步驟中進行糖基化修飾而產生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露於進行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化胺基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優化了溶解性能的多肽。
在本發明中，可選用本領域已知的各種載體，如市售的載體，包括質粒，粘粒等。在生產本發明的甘藍型油菜BnMKK1多肽時，可以將甘藍型油菜BnMKK1編碼序列可操作地連於表達調控序列，從而形成甘藍型油菜BnMKK1蛋白表達載體。
如本發明所用，「可操作地連於」指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號肽DNA作為前體表達並參與多肽的分泌，那麼信號肽(分泌前導序列)DNA就是可操作地連於多肽DNA；如果啟動子控制序列的轉錄，那麼它是可操作地連於編碼序列；如果核糖體結合位點被置於能使其翻譯的位置時，那麼它是可操作地連於編碼序列。一般，「可操作地連於」意味著相鄰，而對於分泌前導序列則意味著在閱讀框中相鄰。
在本發明中，術語「宿主細胞」為真核細胞。常用的真核宿主細胞包括酵母細胞、菸草細胞和其它植物細胞。
還可用Northern印跡法和一步法RT-PCR法技術分析甘藍型油菜BnMKK1基因產物的表達，即分析甘藍型油菜BnMKK1的RNA轉錄物在細胞中的存在與否和數量。
此外，本發明還提供了一種可用作探針的核酸分子，該分子通常具有甘藍型油菜BnMKK1核苷酸編碼序列的8-100個連續核苷酸，較佳地具有15-50個連續核苷酸。該探針可用於檢測樣品中是否存在編碼甘藍型油菜BnMKK1相關的核酸分子。
本發明還提供了檢測樣品中是否存在甘藍型油菜BnMKK1相關核苷酸序列的方法，它包括用上述的探針與樣品進行雜交，然後檢測探針是否發生了結合。較佳地，該樣品是PCR擴增後的產物，其中PCR擴增引物對應於甘藍型油菜BnMKK1相關核苷酸編碼序列，並可位於該編碼序列的兩側或中間。引物長度一般為15-50個核苷酸。
此外，根據本發明的甘藍型油菜BnMKK1核苷酸序列和胺基酸序列，可以在核酸同源性或表達蛋白質的同源性基礎上，篩選甘藍型油菜BnMKK1相關同源基因或同源蛋白。
為了得到與甘藍型油菜BnMKK1相關基因相關的甘藍型油菜cDNAs的點陣，可以用DNA探針篩選甘藍型油菜cDNA文庫，這些探針是在低嚴謹條件下，用32P對甘藍型油菜BnMKK1相關的全部或部分做放射活性標記而得的。最適合於篩選的cDNA文庫是來自甘藍型油菜的文庫。構建來自感興趣的細胞或者組織的cDNA文庫的方法是分子生物學領域眾所周知的。另外，許多這樣的cDNA文庫也可以購買到，例如購自Clontech，Stratagene，Palo Alto，Cal.。這種篩選方法可以識別與甘藍型油菜BnMKK1相關相關的基因家族的核苷酸序列。
本發明的甘藍型油菜BnMKK1相關核苷酸全長序列或其片段通常可以用PCR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對於PCR擴增法，可根據本發明所公開的有關核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設計引物，並用市售的cDNA庫或按本領域技術人員已知的常規方法所製備的cDNA庫作為模板，擴增而得有關序列。當序列較長時，常常需要進行兩次或多次PCR擴增，然後再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。這通常是將其克隆入載體，再轉入細胞，然後通過常規方法從增殖後的宿主細胞中分離得到有關序列。
此外，還可通過化學合成將突變引入本發明蛋白序列中。
除了用重組法產生之外，本發明蛋白的片段還可用固相技術，通過直接合成肽而加以生產(Stewart等人，(1969)Solid-Phase Peptide Synthesis，WHFreeman Co.，San Francisco；Merrifield J.(1963)J.Am Chem.Soc 852149-2154)。在體外合成蛋白質可以用手工或自動進行。例如，可以用AppliedBiosystems的431A型肽合成儀(Foster City，CA)來自動合成肽。可以分別化學合成本發明蛋白的各片段，然後用化學方法加以連接以產生全長的分子。
利用本發明的甘藍型油菜BnMKK1蛋白，通過各種常規篩選方法，可篩選出與甘藍型油菜BnMKK1相關發生相互作用的物質，或者受體、抑制劑或拮抗劑等。
本發明具有在抗各種環境脅迫具有明顯的作用，能夠明顯降低在乾旱、水淹和病蟲害土地上種植的各種農作物在生物產量上的損失。乾旱、水淹和病蟲害能夠造成大部分農作物如水稻、棉花、甘藍型油菜和小麥等生長緩慢甚至死亡，從而使其明顯減產甚至顆粒無收。我國存在大面積的乾旱半乾旱、鹽鹼半鹽鹼地區，及世界範圍內也存在乾旱半乾旱、鹽鹼半鹽鹼地區，此外大面積的應用各種農藥也嚴重汙染環境，因此，本發明具有很大的應用價值。
具體實施例方式
下面結合實驗室試驗數據，以具體實施例來進一步闡述本發明說明下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等分子克隆實驗室手冊(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。
實施例1甘藍型油菜BnMKK1基因的克隆1.組織分離(isolation)甘藍型油菜(品種為「滬油15」)從市場上購得，將甘藍型油菜置於28℃發芽24小時，然後播種於溫室中，待甘藍型油菜葉片為3-5片時，準備抽取DNA或RNA。
2.RNA的分離(RNA isolation)
取部分組織，用研缽研碎，加入盛有裂解液的1.5mL EP管，充分振蕩後，再移入玻璃勻漿器內。勻漿後移至1.5mL EP管中，抽提總RNA(TRIzol Reagents，GIBCO BRL，USA)。用甲醛變性膠電泳鑑定總RNA質量，然後在分光光度計上測定RNA含量。
3.基因的全長克隆(Cloning of Full-length cDNA)根據擬南芥AtMKK1基因的胺基酸保守序列，利用同源性基因克隆原理，採用RACE方法(GibcoBRL試劑盒)進行cDNA全長克隆，分三個階段進行(1)RT-PCRPCR[BP001(SEQ ID NO.1)+BP002(SEQ ID NO.2)]得到PCR產物(405bp)進行回收，連接到pGEMT-Easy載體上，用SP6或T7作為通用引物，採用終止物螢光標記(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI 377測序儀(Perkin-Elmer，USA)上進行測序。測序結果用GCG軟體包(Wisconsin group，USA)中的BLAST和FASTA軟體搜索已有的資料庫(Genebank+EMBL)，知其核酸序列及編碼蛋白與已知十字花科植物如擬南芥(Arabidopsis thaliana)AtMKK1基因的同源性很高，故初步認為它是一個細胞分裂原激活的蛋白激酶基因。
(2)3』-RACEPCR[AP+M301(5』-TCTCCAGAGAG(G/A)ATCGTTGG-3』)]得到M3』(694bp)，回收，連接到T-Easy載體上，用SP6或T7作為通用引物，採用終止物螢光標記(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI 377測序儀(Perkin-Elmer，USA)上進行測序。測序結果用GCG軟體包(Wisconsin group，USA)中的BLAST和FASTA軟體搜索已有的資料庫(Genebank+EMBL)，知其核酸序列及編碼蛋白與已知十字花科植物如擬南芥(Arabidopsis thaliana)AtMKK1基因的同源性很高，故初步認為它是一個與MAPK相關基因。
(3).5』-RACE第一輪PCR[AAP+M501(5』-ATT(C/G)GATGGTTTCAAGTCAC-3』)]第二輪PCR[(AUAP+M502(5』-TCAGGGATGG(T/C)TTT(G/A)ACTGA-3』)]得到M5』(約741bp)(過程同(1))將測序結果的重疊區拼接，發現得到的片段既是該基因的完整編碼區。
BLAST的結果證明從甘藍型油菜中新得到的基因確為一個與擬南芥AtMKK1相關的基因。
通過組合使用上述3種方法，獲得了候選的甘藍型油菜BnMKK1蛋白的全長編碼序列(SEQ ID NO.3)。
實施例2甘藍型油菜BnMKK1基因的序列信息與同源性分析本發明新的甘藍型油菜BnMKK11全長cDNA的長度為1464bp，詳細序列見SEQID NO.3，其中開放讀框位於39-1007位核苷酸(1114個核苷酸)。根據全長cDNA推導出甘藍型油菜BnMKK1的胺基酸序列，共370個胺基酸殘基，分子量為35708.39道爾頓，等電點(pI)為5.59。詳細序列見SEQ ID NO.3。
將甘藍型油菜BnMKK1的全長cDNA序列及其編碼蛋白質用BLAST程序在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GenBank CDStranslations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR資料庫中進行核苷酸和蛋白質同源性檢索，結果發現它與擬南芥基因AtMKK1在核苷酸水平上具有90％的相同性，(附表2)；在胺基酸水平上，它與擬南芥基因AtMKK1(CAB75493)也有94％的相同性(附表3)。由此可見，甘藍型油菜基因BnMKK1與擬南芥基因AtMKK1無論從核酸還是蛋白水平上都存在較高的同源性。擬南芥基因AtMKK1(ACC72754)已經被證明在多個非生物脅迫條件下明顯增強表達，並發揮著重要的作用，可以認為甘藍型油菜基因BnMKK1在抗逆方面也具有相似的作用。
實施例3甘藍型油菜基因BnMKK1蛋白或多肽在擬南芥中進行真核細胞表達及轉基因植株的抗逆性鑑定含目的基因(甘藍型油菜基因BnMKK1)的表達載體的構建根據甘藍型油菜基因BnMKK1的全長序列(SEQ ID NO.3)，設計擴增出完整編碼閱讀框的引物，並在上遊和下遊引物上分別引入限制性內切酶位點(這可視選用的載體而定)，以便構建表達載體。以實施例1中獲得的擴增產物為模板，經PCR擴增後，將甘藍型油菜基因BnMKK1基因cDNA克隆至中間載體(如pBluescript)，進一步克隆到雙元表達載體(如pBI121和改進的pCAMBIA2300)，在保證閱讀框架正確的前提下鑑定好的表達載體，再將其轉入農桿菌中，利用葉盤法技術轉化模式植物擬南芥。
1.發苗種子用無菌水漂洗15-20分鐘，再用70％的乙醇消毒1分鐘，然後用0.1％升汞消毒10-12分鐘。最後再用無菌水衝洗5遍。將洗好的種子用吸水紙吸乾，放入MS培養基。光照培養5天，待苗長到4-5釐米便可以剪苗。
2.剪苗剪取0.5-1釐米的下胚軸小片段放入預培養基，培養2天。
預培養基MS+6BA(0.2mg/l)+2.4D(1.2mg/l)3.轉化共培養將預培養2天的下胚軸放入事先培養好的菌液中(OD值0.4-0.6)侵染3-5分鐘。接著取出放入預培養基暗培養2天。
4.篩選培養共培養結束後，將外植體放入篩選培養基。2周繼代一次。2-4周有愈傷組織形成和芽的分化。待綠芽長到2釐米後，切下生根。
篩選培養基MS+6BA(4.5mg/l)+NAA(0.1mg/l)+AgNO3(6mg/l)+cb(250mg/l)+Kan(20mg/l)生根培養基MS+NAA(0.5mg/l)+cb(250mg/l)+Kan(5mg/l)5.轉化植株培養；待根系發達後，將植株取出，用無菌水洗淨附著的固體培養基，移入土壤中，剛開始用玻璃罩罩幾天，待植株健壯後再取下玻璃罩，溫室中培養。
含甘藍型油菜基因BnMKK1的轉基因擬南芥植株的抗逆性鑑定鑑於編碼BnMKK1，如擬南芥的AtMKK1基因已被證明在抗逆條件下發揮作用，而甘藍型油菜基因BnMKK1轉錄水平與擬南芥的AtMKK1具有較高的同源性，可進一步對含甘藍型油菜基因BnMKK1的轉基因擬南芥植株進行抗逆性鑑定。用300mM氯化鈉和300mM甘露醇處理處理轉基因植株和轉基因植株的種子(2天、7天、14天、21天、28天)後研究BnMKK1基因在轉基因植株中的表達情況以及各種處理對植株的生長情況。Northern blot分析結果證明，轉基因植株BnMKK1轉錄水平在鹽和甘露醇處理後其表達量顯著增強，而對照非轉基因植株雖表達量提高，但明顯低於轉基因植株。此外非轉基因植株生長緩慢，最後在鹽和甘露醇處理下枯萎而死，轉基因植物依然能正常生長，只是比未經處理的植株生長稍慢。在抗厭氧、抗氧化和抗病試驗中，轉基因植株也明顯表現出比對照(未轉基因植株)生長正常。這證明甘藍型油菜基因BnMKK1基因比擬南芥基因AtMKK1具有更有效的和更廣泛的抗逆境的功能，將可用於利用轉基因技術改良植物抗旱耐鹽的研究和產業化生產中。
部分已檢測出是陽性的轉基因植株，在生長後期，產生了類似於植株受細菌、真菌、病毒和類病毒等病原物侵染後所形成的病斑，即所謂的植物過敏性死亡。從這一現象來看，可以推測MKK基因在植物體中的表達引起了MAPK級聯中的一些下遊蛋白激酶或者轉錄子等的激活，啟動了植物過敏性反應，類似的結果也在菸草NtMEK2的超表達研究中出現。初步推測MKK基因在MAPK級聯中可能參與了病原信號的傳遞，但還需進一步的研究結果進行證實。
實施例4甘藍型油菜基因BnMKK1在甘藍型油菜中的拷貝數分析採用常規方法從甘藍型油菜葉片中提取DNA(參考《分子克隆》，Sambrook等，1989)，分別用HindIII Xba I BamH和EcoR I酶切DNA[13μg(微克)/樣品]後，將DNA轉至雜交膜(尼龍膜)上後。使用Amersham Pharmacia公司GeneImagesTMContents CDP-StarTMlabelling module(PRN3540)，我們將BnMKK1基因編碼區標記為探針，然後進行雜交(於60℃雜交16小時)。取出膜，置於洗膜液I(1*SSC，1％SDS)中，於60℃漂洗3次，每次15分鐘。轉入洗膜液II(0.1*SSC，1％SDS)中於60℃漂洗3次，每次同樣15分鐘。用X光片壓片60-90分鐘，然後顯影、定影(方法參照Roche DIG labeled試劑盒說明書)。結果(Southern blot)發現在雜交膜上出現少量的雜交條帶，說明甘藍型油菜基因BnMKK1在甘藍型油菜中是低拷貝。
實施例5甘藍型油菜BnMKK1基因在NaCl、甘露醇、H2O2的不同時間處理的表達譜分析1.RNA的提取將生長了3-5片葉的甘藍型油菜幼苗經200mM甘露醇、200mM NaCl和200μM H2O2處理0分鐘、2分鐘、5分鐘、20分鐘、1小時、2小時、6小時、12小時和24小時，然後按照華舜公司提供的RNA抽提試劑盒抽提RNA，並進行定量。
2.採用一步反應法定量進行表達分析，利用One Step RNA PCR Kit(TaKaRaBiotechnology Co.，Ltd)，具體操作按照試劑盒說明書進行。每個反應包括2.5μl10×One Step RNA PCR buffer，5μl 25mM MgCl2，5μl dNTP混合液，20U RNase抑制劑，0.5U AMV Rtase XL，0.5U AMV-Optimized Taq，特異引物1(5』-ATGAACAACGCCGGCGGCCA-3』)和特異引物2(5 』-CTAAGCATATGTTGGATTGAGTGC-3』)各10μMol，各種時間處理的RNA 2μl，然後補充無RNase水到25μl。PCR反應條件如下50℃ 30分鐘，94℃ 2分鐘，然後進行94℃ 30秒，60℃ 30秒和72℃ 1分鐘共30循環，最後72℃延伸5分鐘。
3.反應結束後，取15μl PCR反應液在1％瓊脂糖凝膠中進行電泳，5V/cm電壓電泳1小時左右，在凝膠成像系統上觀察DNA量。
定量RT-PCR結果顯示，甘藍型油菜BnMKK1在4℃、甘露醇和脫落酸ABA處理1小時後達到最高峰，隨後表達降低；但H2O2處理中2小時後就達到最高峰隨後降低。這些表達特點說明甘藍型油菜BnMKK1是典型的信號傳遞蛋白，屬於各種逆境處理早期表達基因，並啟動各種與抗逆有關的基因的表達，提高植株的抗逆能力。
本發明涉及的序列及記號分列如下(1)SEQ ID NO.1的信息(i)序列特徵(A)長度23bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii).分子類型寡核苷酸(iii).序列描述SEQ ID NO.1GG(A/T/C/G)A(A/G)(A/T/C/G)GGA(A/G)(A/T/C/G)(C/T)GG(A/C/T)GG(A/G/T)(A/G)(C/T)(A/T/C/G)GT(2)SEQ ID NO.2的信息(i)序列特徵(A)長度20bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii).分子類型寡核苷酸(iii).序列描述SEQ ID NO.2
CTC(A/T/C/G)GG(A/T/C/G)S(A/C/T)CAT(A/G)TA(A/T/C/G)(G/T)(C/T)(A/G)(A/C/T)A(A/T/C/G)GT(A/T/C/G)CC(2)SEQ ID NO.3的信息110上海交通大學120甘藍型油菜細胞分裂原激活的蛋白激酶的激酶1蛋白編碼序列1602170PatentIn version 3.221012111435212DNA213Brassica napus220
221CDS222(39)..(1007)
4001gggaaagcga cgagaagaag aaggaagaag aagacgaa atg aag aag ggt gga ttc 56Met Lys Lys Gly Gly Phe1 5agc aat aat ctc aag ttc tca atc cct cct gct ggc gag caa tcc atc 104Ser Asn Asn Leu Lys Phe Ser Ile Pro Pro Ala Gly Glu Gln Ser Ile10 15 20acc aaa ttc ttg acg cag agc ggt acg ttc aag gat gga gat ctg cga 152Thr Lys Phe Leu Thr Gln Ser Gly Thr Phe Lys Asp Gly Asp Leu Arg25 30 35gta aac aag gat gga gtt cgc atc gtc tct caa tct gag cct gaa gct 200Val Asn Lys Asp Gly Val Arg Ile Val Ser Gln Ser Glu Pro Glu Ala40 45 50cta tct ccg att aag cca gcg gat gat aag ttg ggc tta tcc gat tta 248Leu Ser Pro Ile Lys Pro Ala Asp Asp Lys Leu Gly Leu Ser Asp Leu55 60 65 70gac atg gtt aaa ttc gtt ggt aaa gga agc agt ggt gtt gtg cag ctt 296Asp Met Val Lys Phe Val Gly Lys Gly Ser Ser Gly Val Val Gln Leu75 80 85gtt caa cac aaa tgg act ggt caa ttc ttc gcc tta aag gtc att caa 344Val Gln His Lys Trp Thr Gly Gln Phe Phe Ala Leu Lys Val Ile Gln90 95 100cta aac gtc gat gaa gct att cgc aag tca att gca caa gag ctt aaa 392Leu Asn Val Asp Glu Ala Ile Arg Lys Ser Ile Ala Gln Glu Leu Lys105 110115
ata aac cag tcc tca caa tgt ccg tac ctt gtt acc tcc tac caa tcg 440Ile Asn Gln Ser Ser Gln Cys Pro Tyr Leu Val Thr Ser Tyr Gln Ser120 125130ttt tac gat aac ggc gca atc tcg ctg ata ttg gag tac atg gac ggt 488Phe Tyr Asp Asn Gly Ala Ile Ser Leu Ile Leu Glu Tyr Met Asp Gly135 140145 150gga tct cta gaa gac ttt ctc aaa tca gtc aaa acc atc cct gag tcc 536Gly Ser Leu Glu Asp Phe Leu Lys Ser Val Lys Thr Ile Pro Glu Ser155160 165tat ctt tct acc atc ttt aag caa gtg ctt cag gga ctg atc tat ctt 584Tyr Leu Ser Thr Ile Phe Lys Gln Val Leu Gln Gly Leu Ile Tyr Leu170175 180cat cat gac aag cac atc atc cac cgt gac ttg aaa cca tcg aat ctg 632His His Asp Lys His Ile Ile His Arg Asp Leu Lys Pro Ser Asn Leu185 190195ttg gtc aac cac aga gga gag gtc aag atc act gac ttc ggt gtg agt 680Leu Val Asn His Arg Gly Glu Val Lys Ile Thr Asp Phe Gly Val Ser200 205210acc gtt atg act aac acc gcg ggt tta gca aac acc ttt gtc ggg act 728Thr Val Met Thr Asn Thr Ala Gly Leu Ala Asn Thr Phe Val Gly Thr215 220225 230tac aac tat atg tct cca gag agg atc gtt ggg aac aag tac ggt aac 776Tyr Asn Tyr Met Ser Pro Glu Arg Ile Val Gly Asn Lys Tyr Gly Asn235240 245aaa agc gat ata tgg agc ttg gga tta gta gtg ctt gaa tgt gca aca 824
Lys Ser Asp Ile Trp Ser Leu Gly Leu Val Val Leu Glu Cys Ala Thr250255 260ggg aag ttc cca tat ttg cca cca gat gaa gag gaa aca tgg agc agt 872Gly Lys Phe Pro Tyr Leu Pro Pro Asp Glu Glu Glu Thr Trp Ser Ser265270 275gct ttc gag ttg atg gaa gca atc gtg gac caa cca cca cca act ctt 920Ala Phe Glu Leu Met Glu Ala Ile Val Asp Gln Pro Pro Pro Thr Leu280 285290cct tca gaa agc ttc tcc cct gag tta tct tca ttc atc tcc act tgt 968Pro Ser Glu Ser Phe Ser Pro Glu Leu Ser Ser Phe Ile Ser Thr Cys295 300305 310ttg caa agg acc caa aca gtc gaa gct ctg cta ggg aac taatggaaca 1017Leu Gln Arg Thr Gln Thr Val Glu Ala Leu Leu Gly Asn315320tcctttcgtg aagaaatacg acaacaactc ggagatcaac ctcgcgtcac actttacaaa 1077tgcagggtct ccgcttgcaa cgcttaagaa tctgtctggt acattctccg tttaagctct 1137ccagggagac aaatagtatc ttcatcatct ggtggttact gttatcttct gaggtttctt 1197tgtctttaac ttccagttaa ataaatgatc ttaatcatct actatatata tatatatata 1257tatttgtatt gttgctgtat tttgataata tgagctacat gagagtcctt attcagtttt 1317atttttttat tttccactcg gagctctcat aagtgagata ctttggattg gaatgttatg 1377ttgaaaaaga agattcatta ttttattagt gtttttttct tcaaaaaaaa aaaaaaaa 1435
2102211323212PRT213Brassica napus4002Met Lys Lys Gly Gly Phe Ser Asn Asn Leu Lys Phe Ser Ile Pro Pro1 5 10 15Ala Gly Glu Gln Ser Ile Thr Lys Phe Leu Thr Gln Ser Gly Thr Phe20 25 30Lys Asp Gly Asp Leu Arg Val Asn Lys Asp Gly Val Arg Ile Val Ser35 40 45Gln Ser Glu Pro Glu Ala Leu Ser Pro Ile Lys Pro Ala Asp Asp Lys50 55 60Leu Gly Leu Ser Asp Leu Asp Met Val Lys Phe Val Gly Lys Gly Ser65 70 75 80Ser Gly Val Val Gln Leu Val Gln His Lys Trp Thr Gly Gln Phe Phe85 90 95Ala Leu Lys Val Ile Gln Leu Asn Val Asp Glu Ala Ile Arg Lys Ser100 105110Ile Ala Gln Glu Leu Lys Ile Asn Gln Ser Ser Gln Cys Pro Tyr Leu115 120 125Val Thr Ser Tyr Gln Ser Phe Tyr Asp Asn Gly Ala Ile Ser Leu Ile
130 135 140Leu Glu Tyr Met Asp Gly Gly Ser Leu Glu Asp Phe Leu Lys Ser Val145 150 155 160Lys Thr Ile Pro Glu Ser Tyr Leu Ser Thr Ile Phe Lys Gln Val Leu165 170 175Gln Gly Leu Ile Tyr Leu His His Asp Lys His Ile Ile His Arg Asp180 185 190Leu Lys Pro Ser Asn Leu Leu Val Asn His Arg Gly Glu Val Lys Ile195 200 205Thr Asp Phe Gly Val Ser Thr Val Met Thr Asn Thr Ala Gly Leu Ala210 215 220Asn Thr Phe Val Gly Thr Tyr Asn Tyr Met Ser Pro Glu Arg Ile Val225 230 235 240Gly Asn Lys Tyr Gly Asn Lys Ser Asp Ile Trp Ser Leu Gly Leu Val245 250 255Val Leu Glu Cys Ala Thr Gly Lys Phe Pro Tyr Leu Pro Pro Asp Glu260 265 270Glu Glu Thr Trp Ser Ser Ala Phe Glu Leu Met Glu Ala Ile Val Asp275 280 285Gln Pro Pro Pro Thr Leu Pro Ser Glu Ser Phe Ser Pro Glu Leu Ser290 295 300Ser Phe Ile Ser Thr Cys Leu Gln Arg Thr Gln Thr Val Glu Ala Leu
305 310 315 320Leu Gly Asn
權利要求
1.一種甘藍型油菜細胞分裂原激活的蛋白激酶的激酶1蛋白編碼序列，其特徵在於，所分離出的DNA分子，該分子包括編碼具有甘藍型油菜BnMKK1蛋白質活性的多肽的核苷酸序列，而且該核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸第39-1007位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者該核苷酸序列能與SEQ ID NO.3中從核苷酸第39-1007位的核苷酸序列雜交。
2.根據權利要求1所述的甘藍型油菜細胞分裂原激活的蛋白激酶的激酶1蛋白編碼序列，其特徵是，所述的編碼序列具有SEQ ID NO.3所示的胺基酸序列的多肽，或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
3.根據權利要求1或2所述的甘藍型油菜細胞分裂原激活的蛋白激酶的激酶1蛋白編碼序列，其特徵是，所述的編碼序列具有SEQ ID NO.3中從核苷酸第39-1007位的核苷酸序列。
4.根據權利要求1所述的甘藍型油菜細胞分裂原激活的蛋白激酶的激酶1蛋白編碼序列，其特徵是，所述的甘藍型油菜BnMKK1蛋白質活性的多肽，是分離出的包含細胞分裂原激活的蛋白激酶甘藍型油菜MAPK類相關蛋白質多肽BnMKK1，它包括具有SEQ ID NO.3胺基酸序列的多肽，該多肽是具有SEQ ID NO.3序列的多肽。
5.根據權利要求1所述的甘藍型油菜細胞分裂原激活的蛋白激酶的激酶1蛋白編碼序列，其特徵是，所述的DNA分子，它包含在所提供的一種載體，該載體是一種核酸分子，它包含所述的DNA分子中8-100個連續核苷酸。
6.根據權利要求1或5所述的甘藍型油菜細胞分裂原激活的蛋白激酶的激酶1蛋白編碼序列，其特徵是，用所述的DNA分子轉化的宿主細胞，它是真核細胞。
全文摘要
一種用於基因工程技術領域甘藍型油菜細胞分裂原激活的蛋白激酶的激酶1蛋白編碼序列。所分離出的DNA分子，該分子包括編碼具有甘藍型油菜BnMKK1蛋白質活性的多肽的核苷酸序列，而且該核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸第39－1007位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者該核苷酸序列能與SEQ ID NO.3中從核苷酸第39－1007位的核苷酸序列雜交。本發明在植物抗旱病蟲害等不良環境脅迫具有明顯的作用，能夠明顯減少農作物在乾旱、病蟲害等不良環境條件下生物產量的損失。
文檔編號C12N15/29GK1594570SQ200410025688
公開日2005年3月16日 申請日期2004年7月1日 優先權日2004年7月1日
發明者餘舜武, 張利達, 唐東芹, 左開井, 唐克軒 申請人:上海交通大學