使用抗人il-22抗體的方法

2023-12-08 21:50:41 4

專利名稱：使用抗人il-22抗體的方法
技術領域：
本發明涉及結合白介素-22(IL-22)，特別是結合人IL-22的抗體(例如人抗體)及其抗原結合片段，還涉及所述抗體及其抗原結合片段在調節與IL-22相關的活性中的用途。文中所公開的抗體用於診斷、預防和/或治療與IL-22相關的病症，例如包括關節炎的自身免疫病。

背景技術：
抗原引發免疫應答並激活兩類最大的淋巴細胞群體T細胞及B細胞。接觸抗原後，T細胞增生並分化成效應細胞，而B細胞增生且分化成分泌抗體的漿細胞。這些效應細胞分泌細胞因子和/或對細胞因子應答，該細胞因子是由淋巴細胞及其它細胞類型分泌的小蛋白質(<約30kDa)。
白介素-22(IL-22)為顯示出與IL-10序列同源的II類細胞因子。其在T細胞內的表達通過IL-9或ConA而上調(Dumoutier L.等人，(2000)Proc NatlAcad Sci USA 97(18)10144-9)。進一步研究已證明響應於LPS投藥，IL-22mRNA的表達在體內被誘導，且已證明IL-22調節預示急性期反應的參數(Dumoutier L.等人，(2000)；Pittman D.等人，(2001)Genes and Immunity 2172)。此外，IL-22增強與宿主防禦有關的抗微生物肽(其包括β-防衛素、S100A7、S100A8及S100A)的表達。Wolk等人，Immunity，21241-54(2004)；Boniface等人，J.Immunol.1743695-3702(2005)；Liang等人，J.Exp.Med.，203(10)2271-79(2006)。總之，這些觀察資料顯示IL-22在炎症中發揮作用(Kotenko S.V.(2002)Cytokine & Growth Factor Reviews13(3)223-40)。
據信IL-22結合至由IL-22R及IL-10R2(II型細胞因子受體家族(CRF2)的兩成員)組成的受體複合物(Xie M.H.等人(2000)J Biol Chem 275(40)31335-9；Kotenko S.V.等人(2001)JBiol Chem 276(4)2725-32)。該IL-22受體的這兩條鏈在許多器官中組成型表達。衍生自這些器官的上皮細胞系體外響應IL-22(Kotenko S.V.(2002)Cytokine & Growth Factor Reviews 13(3)223-40)。IL-22誘導JAK/STAT3及ERK途徑的激活，以及誘導其它MAPK途徑的中間物的激活(Dumoutier L.等人(2000)，同上；Xie M.H.等人(2000)，同上；Dumoutier L.等人(2000)J Immunol 164(4)1814-9；Kotenko S.V.等人(2001)J Biol Chem 276(4)2725-32；Lejeune，D.等人(2002)J Biol Chem277(37)33676-82)。
CRF2成員為以下因子的受體INFα/β、IFNγ、凝血因子(coagulationfactor)VIIa、IL-10及該IL-10相關蛋白質IL-19、IL-20、IL-22、IL-24、IL-26，以及最近鑑定的IFN樣細胞因子IL-28及IL-29(Kotenko S.V.(2002)Cytokine& Growth Factor Reviews 13(3)223-40；Kotenko，S.V.等人(2000)Oncogene19(21)2557-65；Sheppard，P.等人(2003)Nature Immunology 4(1)63-8；Kotenko，S.V.等人(2003)Nature Immunology 4(1)69-77)。除這些膜受體外，CRF2家族也包括對IL-22具有特異性且可阻斷IL-22活性的可溶性蛋白質，IL-22結合蛋白(IL-22BP)(Dumoutier，L.等人(2001)J Immunol 166(12)7090-5；Kotenko，S.V.等人(2001)JImmunol 166(12)7096-103；Xu，W.等人(2001)Proc Natl Acad Sci USA 98(17)9511-6；Gruenberg，B.H.等人(2001)Genes & Immunity 2(6)329-34；Wei C-C等人(2003)Gene & Immunity4204-211)。雖然IL-22受體複合物對IL-22是唯一的，但是各條鏈(亦即IL-22R及IL-10R2)與其它CRF2成員參與定義其它細胞因子(包括IL-20、IL-24(IL-22R/IL-20R2)、IL-28、IL-29(IFN-λR1/IL-10R2)及IL-10(IL-10R1/IL-10R2))的功能性受體(Dumoutier，L.等人(2001)J.Immunol.167(7)3545-9；Wang，M.等人(2002)J Biol Chem 277(9)7341-7；Parrish-Novak，J.等人(2002)J Biol Chem 277(49)47517-23；Kotenko，S.V.等人(1997)EMBO J.16(19)5894-903；Spencer，S.D.等人(1998)J Exp Med187(4)571-8)。
由CRF2組成的受體的兩條鏈均為信號轉導所必需。組成的受體的其中一條鏈根據其對該細胞因子的高親和性，傳統上已被定義為配體結合鏈(例如IFNγR1)。另一鏈(例如IFNγR2)已描述為輔助鏈或副鏈，且其單獨對細胞因子僅具有極微親和性(Kotenko，S.V.等人(2000)Oncogene19(21)2557-65)。就IL-22而言，IL-22R為高親和性受體亞基，且隨後IL-10R2結合至IL-22/IL-22R複合物(Li，J.等人(2004)Int.Immunopharmacol.4(5)673-708；Logsdon，N.J.等人(2002)J.Interferon Cytokine Res 22(11)1099-1112)。


發明內容
本申請至少部分地提供了結合至白介素-22(「IL-22」)，特別是結合至人IL-22的具有高親和性及特異性的IL-22結合劑，諸如抗體及其抗原結合片段。本發明抗體及其抗原結合片段在文中也分別稱為「抗IL-22抗體」及「其片段」。在一個實施方案中，抗體或其片段減少、抑制或拮抗IL-22活性。此類抗體可通過拮抗IL-22活性而用以調節免疫應答或與IL-22相關的病症。在其它實施方案中，可診斷性地使用抗IL-22抗體或該抗IL-22抗體可作為靶標抗體以將治療或細胞毒劑遞送至表達IL-22的細胞。因此，本發明抗IL-22抗體適用於診斷、治療和/或預防與IL-22相關的病症，例如自身免疫病症，例如關節炎(其包括類風溼性關節炎、幼年類風溼性關節炎、骨關節炎、銀屑病關節炎，與狼瘡有關的關節炎或強直性脊椎炎)、硬皮病、系統性紅斑狼瘡、HIV、舍格倫症候群、血管炎、多發性硬化、自身免疫性甲狀腺炎、皮炎(其包括特應性皮炎及溼疹性皮炎)、重症肌無力、炎症性腸病(IBD)、節段性迴腸炎、結腸炎、糖尿病(I型)；炎症例如皮膚的炎症(例如牛皮癬)、心血管系統的炎症(例如動脈粥樣硬化)、神經系統的炎症(例如阿爾茨海默病)、肝的炎症(例如肝炎)、腎的炎症(例如腎炎)及胰臟的炎症(例如胰腺炎)；心血管疾病，例如膽固醇代謝病、氧自由基損傷、局部缺血；與創傷癒合相關的病症；呼吸系統病症，例如哮喘及COPD(例如囊性纖維化)；急性炎症(例如內毒素血症、膿毒症及敗血症、中毒性休克症候群及感染性疾病)；移植排斥及過敏。在一個實施方案中，與IL-22相關的病症為關節炎的病症，例如選自以下一種或多種的病症類風溼性關節炎、幼年型類風溼性關節炎、骨關節炎、銀屑病關節炎或強直性脊椎炎；呼吸系統病症(例如哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD))；或例如皮膚的炎症(例如牛皮癬)、心血管系統的炎症(例如動脈粥樣硬化)、神經系統的炎症(例如阿爾茨海默病)、肝的炎症(例如肝炎)、腎的炎症(例如腎炎)、胰臟的炎症(例如胰腺炎)，及胃腸器官的炎症，例如結腸炎、節段性迴腸炎及IBD。
因此，一方面，本發明的特徵是結合至IL-22，特別是結合至人IL-22的分離的抗體。在特定實施方案中，抗IL-22抗體可具有至少一種以下特徵(1)其是單克隆或單特異性抗體；(2)其是人抗體；(3)其是體外產生的抗體；(4)其是體內產生的抗體(例如轉基因系統)；(5)其以至少1012M-1的結合常數與IL-22結合；(6)其以至少1011M-1的結合常數結合至IL-22；(7)其以至少1010M-1的結合常數結合至IL-22；(8)其以至少109M-1的結合常數結合至IL-22；(9)其以至少106M-1的結合常數結合至IL-22；(10)其以500nM或較低的解離常數結合至IL-22；(11)其以10nM或較低的解離常數結合至IL-22；(12)其以150pM或較低的解離常數結合至IL-22；(13)其以60pM或較低的解離常數結合至IL-22；(14)其以10nM或較低的IC50抑制IL-22結合至IL-22R或IL-22R及IL-10R2的受體複合物；(15)在一個實施方案中，其以1nM或較低的IC50，在另一個實施方案中，其以150pM或較低的IC50，在另一個實施方案中，其以100pM或較低的IC50，且在另一個實施方案中，其以10pM或較低的IC50阻斷IL-22受體改造的BaF3細胞經IL-22調節的增生；及(16)在一個實施方案中，其以1nM或較低的IC50，在另一個實施方案中，其以150pM或較低的IC50，且在另一個實施方案中，其以10pM或較低的IC50阻斷IL-22調節的自HT29細胞分泌GROa。可以如以下實施例中所述測定IL-22調節的BaF3細胞增生及IL-22調節的自HT29細胞分泌的GROa。
本發明抗體非限制性的說明性實施例在文中稱為「GIL01」、「GIL16」、「GIL45」、「GIL60」、「GIL68」、「GIL92」、「097D09」、「062A09」、「062G05」、「087B03」、「367D04」、「368D04」、「166B06」、「166G05」、「375G06」、「376B10」、「354A08」、「355B06」、「355E04」及「356A11」。這些抗體可以被種系化(germlined)或非種系化。在另一個實施方案中，該抗體選自356A11、354A08、087B03及368D04。本發明抗體可特異性結合至GIL01、GIL16、GIL45、GIL60、GIL68、GIL92、097D09、062A09、062G05、087B03、367D04、368D04、166B06、166G05、375G06、376B10、354A08、355B06、355E04或356A11所結合的相同IL-22表位或類似表位(例如重疊表位)。在其它實施方案中，抗體特異性結合至IL-22的片段，例如SEQ ID NO1所示胺基酸序列的具有至少10、20、50、75、100、150或200個胺基酸的連續片段或與其具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的序列。在另一個實施方案中，該抗體競爭性地抑制GIL01、GIL16、GIL45、GIL60、GIL68、GIL92、097D09、062A09、062G05、087B03、367D04、368D04、166B06、166G05、375G06、376B10、354A08、355B06、355E04或356A11中的至少一種結合至其靶表位。
在一個實施方案中，本發明抗體包括GIL01、GIL16、GIL45、GIL60、GIL68、GIL92、097D09、062A09、062G05、087B03、367D04、368D04、166B06、166G05、375G06、376B10、354A08、355B06、355E04或356A11的FV片段的VH結構域、VL結構域或其組合。例如抗體包括的VH和/或VL結構域，該的VH和/或VL結構域具有如表1及7(就VH而言，SEQ ID NO5、23、41、59、77、95、113、131、149、167、185、203、221、239、257、275、293、311、329、347、365、383、401、419、437、455、473、491、509、527、545、563、581、599或617；及就VL而言，SEQ ID NO6、24、42、60、78、96、114、132、150、168、186、204、222、240、258、276、294、312、330、348、366、384、402、420、438、456、474、492、510、528、546、564、582、600或618)中所示的胺基酸序列或實質上與其相同的序列(例如至少與其具有約85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的序列或與SEQ ID NO5、6、23、24、41、42、59、60、77、78、95、96、113、114、131、132、149、150、167、168、185、186、203、204、221、222、239、240、257、258、275、276、293、294、311、312、329、330、347、348、365、366、383、384、401、402、419、420、437、438、455、456、473、474、491、492、509、510、527、528、545、546、563、564、581、582、599、600、617或618的差異不超過1、2、5、10或15個胺基酸殘基的序列)。
在另一個實施方案中，本發明抗體包括選自356A11、354A08、087B03及368D04的抗體的FV片段的VH結構域、VL結構域或其組合。在本實施方案中，該抗體或其抗原結合片段包括 含SEQ ID NO167或491中所示胺基酸序列的VH結構域和/或含SEQ IDNO168及492中所示胺基酸序列的VL結構域(087B03)； 含SEQ ID NO293或545中所示胺基酸序列的VH結構域和/或含SEQ IDNO294或546所示胺基酸序列的VL結構域(354A08)； 含SEQ ID NO203或617中所示胺基酸序列的VH結構域和/或含SEQ IDNO204或618中所示胺基酸序列的VL結構域(368D04)；或 含SEQ ID NO347或599中所示胺基酸序列的VH結構域和/或含SEQ IDNO348或600中所示胺基酸序列的VL結構域(356A11)。
在另一個實施方案中，抗體包括由下述核酸編碼的VH和/或VL結構域，該核酸具有如表1及7(就VH而言，SEQ ID NO14、32、50、68、86、104、122、140、158、176、194、212、230、248、266、284、302、320、338、356、374、392、410、428、446、464、482、500、518、536、554、572、590、608或626，且就VL而言，SEQ ID NO15、33、51、69、87、105、123、141、159、177、195、213、231、249、267、285、303、321、339、357、375、393、411、429、447、465、483、501、519、537、555、573、591、609或627)中所示核苷酸序列或實質上與其相同的核苷酸序列(例如與其具有至少約85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的序列或與SEQ ID NO14、15、32、33、50、51、68、69、86、87、104、105、122、123、140、141、158、159、176、177、194、195、212、213、230、231、248、249、266、267、284、285、302、303、320、321、338、339、356、357、374、375、392、393、410、411、428、429、446、447、464、465、482、483、500、501、518、519、536、537、554、555、572、573、590、591、608、609、626或627的差異不超過1、2、3、6、15、30或45個核苷酸的核苷酸序列)。
在其它實施方案中，抗體包括FV結構域，其具有如表1及7(SEQ IDNO7、25、43、61、79、97、115、133、151、169、187、205、223、241、259、277、295、313、331、349、367、385、403、421、439、457、475、493、511、529、547、565、583、601或619)中所示胺基酸序列或實質上與其相同的胺基酸序列(例如與其具有至少約85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的序列或與SEQ ID NO7、25、43、61、79、97、115、133、151、169、187、205、223、241、259、277、295、313、331、349、367、385、403、421、439、457、475、493、511、529、547、565、583、601或619的差異不超過1、2、5、10、15、20、30或35個胺基酸殘基的序列)。在另一個實施方案中，本發明抗體包括選自356A11(SEQ IDNO349或601)、354A08(SEQ ID NO295或547)、087B03(SEQ ID NO169或493)及368D04(SEQ ID NO205或619)的抗體的FV結構域。在另一個實施方案中，抗體包括由下述核酸編碼的FV結構域，即該核酸具有如表1及7(SEQ ID NO16、34、52、70、88、106、124、142、160、178、196、214、232、250、268、286、304、322、340、358、376、394、412、430、448、466、484、502、520、538、556、574、592、610或628)中所示核苷酸序列或實質上與其相同的核苷酸序列(例如與其具有至少約85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的序列或與SEQ ID NO16、34、52、70、88、106、124、142、160、178、196、214、232、250、268、286、304、322、340、358、376、394、412、430、448、466、484、502、520、538、556、574、592、610或628的差異不超過1、2、3、6、15、30、45、60、90或105個核苷酸的序列)。在又一個實施方案中，該抗體包含這些VH及VL結構域中的至少一個互補決定區(CDR)。例如抗體可包括VH結構域的1、2或3個CDR，該VH結構域具有如表1及7(SEQ ID NO5、7、8、9、10、23、25、26、27、28、41、43、44、45、46、59、61、62、63、64、77、79、80、81、82、95、97、98、99、100、113、115、116、117、118、131、133、134、135、136、149、151、152、153、154、167、169、170、171、172、185、187、188、189、190、203、205、206、207、208、221、223、224、225、226、239、241、242、243、244、257、259、260、261、262、275、277、278、279、280、293、295、296、297、298、311、313、314、315、316、329、331、332、333、334、347、349、350、351、352、365、367、368、369、370、383、385、386、387、388、401、403、404、405、406、419、421、422、423、424、437、439、440、441、442、455、457、458、459、460、473、475、476、477、478、491、493、494、495、496、509、511、512、513、514、527、529、530、531、532、545、547、548、549、550、563、565、566、567、568、581、583、584、585、586、599、601、602、603、604、617、619、620、621或622)中所公開或表1及7中這些序列所包含的胺基酸序列或實質上與其同源的胺基酸序列(例如與其具有至少約85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的序列)。在另一個實施方案中，本發明抗體包括選自356A11、354A08、087B03及368D04的抗體的VH結構域的1、2或3個CDR。在本實施方案中，抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區，其包含 a)SEQ ID NO170或494；b)SEQ ID NO171或495；和/或c)SEQ IDNO172或496(087B03)； a)SEQ ID NO296或548；b)SEQ ID NO297或549；和/或c)SEQ IDNO298或550(354A08)； a)SEQ ID NO206或620；b)SEQ ID NO207或621；和/或c)SEQ IDNO208或622(368D04)；或 a)SEQ ID NO350或602；b)SEQ ID NO351或603；和/或c)SEQ IDNO352或604(356A11)。
在另一個實施方案中，該抗體可包括VL結構域的1、2或3個CDR，該VL結構域具有如表1及7(SEQ ID NO6、7、11、12、13、24、25、29、30、31、42、43、47、48、49、60、61、65、66、67、78、79、83、84、85、96、97、101、102、103、114、115、119、120、121、132、133、137、138、139、150、151、155、156、157、168、169、173、174、175、186、187、191、192、193、204、205、209、210、211、222、223、227、228、229、240、241、245、246、247、258、259、263、264、265、276、277、281、282、283、294、295、299、300、301、312、313、317、318、319、330、331、335、336、337、348、349、353、354、355、366、367、371、372、373、384、385、389、390、391、402、403、407、408、409、420、421、425、426、427、438、439、443、444、445、456、457、461、462、463、474、475、479、480、481、492、493、497、498、499、510、511、515、516、517、528、529、533、534、535、546、547、551、552、553、564、565、569、570、571、582、583、587、588、589、600、601、605、606、607、618、619、623、624或625)中所公開或表1及7中的這些序列所包含的胺基酸序列或實質上與其相同的胺基酸序列(例如與其具有至少約85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的序列)。在另一個實施方案中，本發明抗體包括一種選自356A11、354A08、087B03及368D04的抗體的VL結構域的1、2或3個CDR。在本實施方案中，抗體或其抗原結合片段包含輕鏈可變區，其包含 a)SEQ ID NO173或497；b)SEQ ID NO174或498；和/或c)SEQ IDNO175或499(087B03)； a)SEQ ID NO299或551；b)SEQ ID NO300或552；和/或c)SEQ IDNO301或553(354A08)； a)SEQ ID NO209或623；b)SEQ ID NO210或624；和/或c)SEQ IDNO211或625(368D04)；或 a)SEQ ID NO353或605；b)SEQ ID NO354或606；和/或c)SEQ ID NO355或607(356A11)。
在另外的實施方案中，抗體包含GIL01、GIL16、GIL45、GIL60、GIL68、GIL92、097D09、062A09、062G05、087B03、367D04、368D04、166B06、166G05、375G06、376B10、354A08、355B06、355E04或356A11的VH結構域的H3片段，例如具有如表1及7(SEQ ID NO10、28、46、64、82、100、118、136、154、172、190、208、226、244、262、280、298、316、334、352、370、388、406、424、442、460、478、496、514、532、550、568、586、604或622)中所示胺基酸序列或實質上與其相同的胺基酸序列(例如與其具有至少約85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的序列)的H3片段。
本發明抗體可以是全長(例如包括至少一個完全的重鏈及至少一個完全的輕鏈)或可僅包括抗原結合片段(例如Fab、F(ab′)2、FV、單鏈FV片段、Fd片段或dAb片段)。該抗體可包括選自以下任一種的恆定區或其部分κ、λ、α、γ、δ、ε及μ恆定區基因。例如可使用包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD及IgE的各種同種型的重鏈恆定區。輕鏈恆定區可選自κ或λ。抗體可以是IgG或其也可以是IgG1κ或IgG1λ。
文中所述抗IL-22抗體可被衍生或與另一種功能性分子(諸如另一個肽或蛋白質(例如Fab片段))連接。例如本發明的抗體可以與至少一種其它分子實體功能性連接(例如通過化學偶聯、基因融合、非共價聯合或其它方法)，該其它分子實體諸如另一種抗體(例如雙特異性或多重特異性抗體)、毒素、放射性同位素、細胞毒劑或細胞生長抑制劑等等。
本發明的另一方面提供含至少一種抗IL-22抗體及可藥用載體的藥物組合物。該藥物組合物還可包括至少一種抗IL-22抗體及至少一種治療劑(例如，如文中詳述的細胞因子及生長因子抑制劑、免疫抑制劑、消炎劑、代謝抑制劑、酶抑制劑、細胞素劑、細胞生長抑制劑或其組合)的組合。抗IL-22抗體及治療劑的組合也屬於本發明的範圍。本發明組合物及組合可用以調節與IL-22有關的炎症，例如通過位於除潛在活化及組織局限性免疫細胞之外的各種組織的上皮細胞(包括但不限於胰臟、皮膚、肺、腸、肝、腎、唾液腺及血管內皮的上皮細胞)上的其受體而調節IL-22的信號傳送。
本發明的另一方面提供治療罹患與IL-22相關的病症的受試者的方法。該方法包括向病患施用抗IL-22抗體，其施用量足以抑制免疫細胞的至少一種IL-22活性，從而治療與IL-22相關的病症。
該抗IL-22抗體可單獨或與如文中所述的其它治療劑一起向受試者施用。該受試者可以是哺乳動物，例如人類。例如可使用該方法以治療罹患與IL-22相關的病症的受試者，該與IL-22相關的病症諸如自身免疫病症，例如關節炎(包括類風溼性關節炎、幼年型類風溼性關節炎、骨關節炎、銀屑病關節炎，與狼瘡有關的關節炎或強直性脊椎炎)、硬皮病、系統性紅斑狼瘡、HIV、舍格倫症候群、血管炎、多發性硬化、自身免疫性甲狀腺炎、皮炎(其包括特應性皮炎及溼疹性皮炎)、重症肌無力、炎症性腸病(IBD)、節段性迴腸炎、結腸炎、糖尿病(I型)；炎症例如皮膚的炎症(例如牛皮癬)、心血管系統的炎症(例如動脈粥樣硬化)、神經系統的炎症(例如阿爾茨海默病)、肝的炎症(例如肝炎)、腎的炎症(例如腎炎)及胰臟的炎症(例如胰腺炎)；心血管疾病，例如膽固醇代謝病、氧自由基損傷、局部缺血；與創傷癒合相關的病症；呼吸系統病症，例如哮喘及COPD(例如囊性纖維化)；急性炎症(例如內毒素血症、膿毒症及敗血症、中毒性休克症候群及感染性疾病)；移植排斥及過敏。在一個實施方案中，與IL-22相關的病症為關節炎，例如選自以下一種或多種的關節炎病症類風溼性關節炎、幼年型類風溼性關節炎、骨關節炎、銀屑病關節炎或強直性脊椎炎；呼吸系統病症(例如哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD))；或炎症，例如皮膚的炎症(例如牛皮癬)、心血管系統的炎症(例如動脈粥樣硬化)、神經系統的炎症(例如阿爾茨海默病)、肝的炎症(例如肝炎)、腎的炎症(例如腎炎)、胰臟的炎症(例如胰腺炎)，及胃腸器官的炎症，例如結腸炎、節段性迴腸炎及IBD。
本發明的另一方面提供降低、抑制或減少受試者體內的急性期反應的方法。該方法包括向受試者施用IL-22結合劑，例如IL-22拮抗劑(例如，如文中所述的抗IL-22抗體或其片段)，其施用量足以降低、抑制或減少受試者體內的急性期反應。在一個實施方案中，該受試者為哺乳動物，例如罹患與IL-22相關的病症(包括例如呼吸系統病症、炎症及自身免疫病症)的人類。在一個實施方案中，該IL-22結合劑是局部施用，例如局部，皮下或非用在全身循環中的其它投藥法。
在另一方面中，可使用IL-22結合劑以改變免疫應答的類型和/或增加用於免疫受試者的疫苗製劑的效力。例如本發明抗IL-22抗體可以在免疫前、期間和/或其後施用以增加疫苗效力。在一個實施方案中，該疫苗製劑含有一或多種IL-22拮抗劑及抗原，也即免疫原，其包括例如病毒、細菌或腫瘤抗原。在另一個實施方案中，該IL-22拮抗劑及免疫原分別施用，例如相隔不到一小時、三小時、一天或兩天。
本發明另一方面提供一種體外檢測樣品中存在IL-22的方法。樣品可包括生物樣品，諸如血清、血漿、組織及活組織檢查物。該主題方法可用以診斷病症，諸如如文中所述的與IL-22相關的病症。該方法包括(1)將抗IL-22抗體接觸該樣品或對照物樣品，及(2)檢測該抗IL-22抗體與樣品或對照物樣品間的複合物形成，其中相對於對照物樣品，樣品內形成的複合物在統計學上的顯著變化表示IL-22存在於該樣品中。
本發明另一方面提供一種體內檢測IL-22存在的方法(例如在受試者體內成像)。該方法可用以診斷病症，例如如文中所述的與IL-22相關的病症。該方法包括(1)於可以使抗體與IL-22結合的條件下，向受試者或對照受試者施用抗IL-22抗體，及(2)檢測抗體及IL-22間的複合物形成，其中相對於對照(例如對照受試者)，複合物在受試者體內形成的統計學上的顯著變化表示存在IL-22。
抗體可直接或間接經可檢測物質標記以有利於結合或未結合抗體的檢測。合適的可檢測物質包括各種酶、輔基、螢光材料、發光材料及放射性材料。
本發明另一方面提供一種體內將藥劑，例如治療劑或細胞毒劑遞送或靶向至表達IL-22的細胞的方法。該方法包括於可以使該抗體與IL-22結合的條件下向受試者施用抗IL-22抗體。該抗體可以與諸如毒素的第二治療部分偶聯。
本公開內容提供得自GIL01、GIL16、GIL45、GIL60、GIL68、GIL92、097D09、062A09、062G05、087B03、367D04、368D04、166B06、166G05、375G06、376B10、354A08、355B06、355E04及356A11的VH及VL結構域的核酸序列。也提供含來自GIL01、GIL16、GIL45、GIL60、GIL68、GIL92、097D09、062A09、062G05、087B03、367D04、368D04、166B06、166G05、375G06、376B10、354A08、355B06、355E04及356A11的至少一個CDR的核酸序列。本公開內容也提供含此類核酸的載體及宿主細胞。
本公開內容進一步提供製備新VH及VL結構域及含衍生自GIL01、GIL16、GIL45、GIL60、GIL68、GIL92、097D09、062A09、062G05、087B03、367D04、368D04、166B06、166G05、375G06、376B10、354A08、355B06、355E04或356A11的VH或VL結構域的此類結構域的所有及部分的功能性抗體的方法。
本發明的另外方面部分地公開於本說明書中，且部分地可根據本說明書而明了，或可通過實踐本發明而了解。在權利要求中公開並特別指明本發明，且本公開內容不應被視為對權利要求的限制。以下詳細說明包括本發明各實施方案的例證代表，如所申請，其並未非對本發明進行限制。以下附圖構成本申請的一部分，且與本說明書一起僅用以闡明實施方案而非限制本發明。



圖1.親本抗IL-22scFv克隆在IL-22受體複合物試驗(生物IL-22結合IL-22受體複合物DELFIA競爭性試驗)中的效價。
圖2A-G.在IL-22受體複合物試驗(生物IL-22結合IL-22受體複合物DELFIA競爭性試驗)中先導(lead)scFv克隆的分析圖。(A)GIL1所衍生的。(B)GIL16所衍生的。(C)GIL16、GIL60及GIL68所衍生的。(D)GIL60所衍生的。(E)GIL68所衍生的。(F)GIL68所衍生的。(G)GIL92所衍生的。
圖3.在基於GROa細胞的分析中IgG的效價。在hulL-22GROa分析中最優化的GIL-IgG。(A)種系化的IgG。(B)非種系化的IgG。
圖4.通過ELISA分析的IL-22抗體的物種間反應性。最優化GIL-IgG特異性地與IL-22結合。(A)種系化的IgG。(B)非種系化的IgG。
圖5.人IL-22的胺基酸及核苷酸序列。人IL-22的核苷酸序列為SEQ IDNO2且包括聚(A)尾。所公開核苷酸序列包括開放閱讀框，且相應於前述核苷酸序列的全長IL-22蛋白質的胺基酸序列記錄在SEQ ID NO1中。成熟IL-22的胺基酸序列相應於SEQ ID NO1的大約34-179位胺基酸。
圖6.小鼠IL-22的胺基酸及核苷酸序列。
圖7.非種系化的GIL01、GIL16、GIL45、GIL60、GIL68、GIL92、097D09、062A09、062G05、087B03、367D04、368D04、166B06、166G05、375G06、376B10、354A08、355B06、355E04及356A11的胺基酸及核苷酸序列，其包括VH與VL結構域，以及CDR(H1、H2、H3、L1、L2及L3)。
圖8.種系化的GIL01、GIL16、GIL45、GIL60、GIL68、GIL92、062A09、087B03、166B06、166G05、354A08、355B06、355E04、356A11及368D04的胺基酸及核苷酸序列，其包括VH與VL結構域，以及CDR(H1、H2、H3、L1、L2及L3)。
圖9.CDR(H1、H2、H3、L1、L2及L3)用下劃線標出的非種系化的GIL01、GIL16、GIL45、GIL60、GIL68、GIL92、097D09、062A09、062G05、087B03、367D04、368D04、166B06、166G05、375G06、376B10、354A08、355B06、355E04及356A11的scFv’s的胺基酸及核苷酸序列。
圖10.具有CDR(H1、H2、H3、L1、L2及L3)用下劃線標出的種系化的GIL01、GIL16、GIL45、GIL60、GIL68、GIL92、062A09、087B03、166B06、166G05、354A08、355B06、355E04、356A11及368D04的scFv’s的胺基酸及核苷酸序列。
圖11A-B.(A)356A11及(B)368D04的體內半衰期。
圖12A-B.在鼠CIA模型中，每隔一天施用各種劑量的356A11的平均疾病嚴重性得分(A)或疾病嚴重性得分(B)。
圖13A-D.在多次研究的鼠CIA模型中，每隔一天施用8mg/kg的356A11的平均疾病嚴重性得分。
圖14A-B.在鼠CIA模型中，每周一次或兩次施用8mg/kg的356A11的平均疾病嚴重性得分。
圖15A-B.得自在鼠CIA模型中，每隔一天、每周兩次或每周一次施用8mg/kg的356A11的兩個分別研究的疾病嚴重性得分。
圖16A-F.在鼠CIA模型中，使用(A)每隔一天施用8mg/kg的356A11或(B)每隔一天施用16mg/kg的356A11，(C)每隔一天、每周一次或每周兩次施用8mg/kg的356A11，(D)每周一次施用8mg/kg的356A11，(E)每周兩次施用8mg/kg的356A11或(F)每隔一天施用8mg/kg的356A11，治療的小鼠在多次研究中進行疾病演變的組織學評估(腳爪)。
圖17.在經356A11治療的關節炎小鼠中進行體內IL-22(ng/mL)的檢測及穩定性。
圖18.在施用同種型對照抗體的關節炎小鼠中進行體內IL-22(ng/mL)的檢測。
圖19.IL-22及IL-22R蛋白質在人類牛皮癬性損害中的上調。
圖20.在牛皮癬的鼠模型中，對經16mg/kg的356A11、368D04或對照抗體治療的小鼠進行疾病評估。(A)進行10周的臨床疾病演變。(B)10周的臨床得分。
圖21.在經16mg/kg的356A11、368D04或對照抗體治療的牛皮癬小鼠中進行體內IL-22血清含量(pg/mL)的檢測。
圖22.在經16mg/kg的356A11、368D04或對照抗體治療的牛皮癬小鼠中進行體內(A)IL-17A、(B)IL-17F、(C)IL-17A/F及(D)IL-6血清含量的檢測。
圖23.分離自經16mg/kg的356A11、368D04或對照抗體治療的牛皮癬小鼠，經PMA及離子黴素處理並對IL-22及IL-17A；IL-22及IL-17F；IL-17A及IL-17F；IL-22及TNFα；IL-22及INFγ或TNFα及IFNγ進行染色後的所匯集CD4+淋巴結細胞的流式細胞術分析。
圖24.在16mg/kg的356A11、368D04或對照抗體治療的牛皮癬小鼠耳的細胞因子的基因表達。(A)IL-22。(B)IL-17。(C)IFNγ。(D)IL-17F。(E)IL-16。
圖25.在從16mg/kg的356A11、368D04或對照抗體治療的牛皮癬小鼠分離的並採用或未採用平皿結合性(platebound)，抗CD3抗體離體刺激的所匯集淋巴結細胞的上清液中進行細胞因子檢測。(A)IL-22。(B)IL-16。(C)IFNγ。(D)IL-17F。(E)IL-17A/F。(F)IL-17A。
圖26.在從16mg/kg的356A11、368D04或對照抗體治療的牛皮癬小鼠分離，並經平皿結合性抗CD3抗體離體刺激所匯集淋巴結細胞中的細胞因子的基因表達。(A)IL-22。(B)IL-6。(C)IFNγ。(D)IL-17F。(E)IL-17A。
圖27.在牛皮癬的鼠模型中，對16mg/kg的356A11或對照抗體治療的小鼠進行疾病評估。於T細胞過繼轉移後第一天以IL-12及LPS處理小鼠。(A)以10周評估臨床疾病演變。(B)10周的臨床得分。
圖28.在16mg/kg的356A11或對照抗體治療的牛皮癬小鼠中進行體內IL-22血清含量(ng/mL)的檢測。於T細胞過繼轉移後第一天，以IL-12及LPS處理小鼠。
圖29.在16mg/kg的356A11或對照抗體治療的牛皮癬小鼠中進行體內(A)IL-17A、(B)IL-17F、(C)IL-17A/F及(D)IL-6血清含量的檢測。於T細胞過繼轉移後第一天以IL-12及LPS處理小鼠。
圖30.在16mg/kg的356A11或對照抗體治療的牛皮癬小鼠耳的細胞因子的基因表達。(A)IL-17。(B)IL-22。(C)IL-17F。(D)IFNγ。(E)IL-6。於T細胞過繼轉移後第一天以IL-12及LPS處理小鼠。
圖31.自16mg/kg的356A11或對照抗體治療的牛皮癬小鼠分離後，經PMA及離子黴素處理，並對IL-22及IL-17A；IL-22及IL-17F；IL-17A及IL-17F；IL-22及TNFα；IL-22及IFNγ或TNFα及IFNγ進行染色後的所匯集CD4+淋巴結細胞的流式細胞術分析。於T細胞過繼轉移後第一天以IL-12及LPS處理小鼠。
圖32.在從16mg/kg的356A11或對照抗體治療的牛皮癬小鼠分離，並採用或未採用平皿結合性抗CD3抗體離體刺激所匯集淋巴結細胞上清液中進行細胞因子檢測。(A)IL-22。(B)IL-6。(C)IFNγ。(D)IL-17A。(E)IL-17F。於T細胞過繼轉移後第一天以IL-12及LPS處理小鼠。
圖33.在從16mg/kg的356A11或對照抗體治療的牛皮癬小鼠分離，並經平皿結合性抗CD3抗體離體刺激的所匯集淋巴結細胞內細胞因子的基因表達。(A)IL-22。(B)IL-6。(C)IFNγ。(D)IL-17A。(E)IL-17F。於T細胞過繼轉移後第一天以IL-12及LPS處理小鼠。
圖34.在牛皮癬的鼠模型中，對16mg/kg的356A11或對照抗體治療的小鼠進行疾病評估。(A)以10周評估臨床疾病演變。(B)10周的臨床得分。
圖35.對16mg/kg的356A11或對照抗體治療的牛皮癬小鼠進行體內IL-22血清含量(ng/mL)的檢測。
圖36.在16mg/kg的356A11或對照抗體治療的牛皮癬小鼠耳的細胞因子基因表達。(A)IL-22、(B)IL-17、(C)IL-17F、(D)IL-1F6(IL-1家族成員6)、(E)IL-6、(F)IFNγ、(G)IL-22BP(IL-22結合蛋白質)或(H)IL-22R1(IL-22受體亞基)。
圖37.在牛皮癬的鼠模型中，對16mg/kg的356A11或對照抗體治療的小鼠進行疾病評估。(A)以10周評估疾病演變。(B)10周的臨床得分。於T細胞過繼轉移後第一天以IL-12及LPS處理小鼠。
圖38.對16mg/kg的356A11或對照抗體治療的牛皮癬小鼠進行體內IL-22血清含量(ng/mL)檢測。於T細胞過繼轉移後第一天以IL-12及LPS處理小鼠。
圖39.對16mg/kg的356A11或對照抗體(未共施用IL-12及LPS)治療的牛皮癬小鼠進行體內(A)IL-17A及(B)IL-6血清含量的檢測及對經16mg/kg的356A11或對照抗體(於T細胞過繼轉移後第一天共施用IL-12及LPS)治療的牛皮癬小鼠進行體內(C)IL-17A及(D)IL-6血清含量的檢測。
圖40.在鼠CIA模式中，每隔一天施用16mg/kg的356A11，第30天時的(A)平均疾病嚴重性得分或(B)疾病嚴重性得分。
圖41.在鼠CIA模式中，每隔一天、每周一次或每周兩次施用8mg/kg的356A11的平均疾病嚴重性得分。
圖42.對經(A)每周一次施用8mg/kg的356A11，(B)每周兩次施用8mg/kg的356A11或(C)每隔一天施用8mg/kg的356A11治療的小鼠進行疾病演變的組織學評估(腳爪)。
圖43.對經每周一次、每周兩次或每隔一天施用8mg/kg的356A11治療的小鼠進行疾病演變的組織學評估(平均腳爪嚴重性得分)。
圖44A-B.在鼠CIA模式中，得自每周一次施用8mg/kg的356A11的兩個分別研究的平均疾病嚴重性得分。
圖45A-B.在鼠CIA模式中，得自每周一次施用8mg/kg356A11治療的小鼠的兩個分別研究的疾病演變的組織學評估(腳爪)。
圖46A-C.在鼠CIA模式中，得自每周一次施用8mg/kg的368D04的3個分別研究的平均疾病嚴重性得分。
圖47A-C.在鼠CIA模式中，得自每周一次施用8mg/kg 368D04治療的小鼠的3個分別研究的疾病演變的組織學評估(腳爪)。
圖48.在鼠CIA模式中，得自經356A11(每周8mpk)治療的小鼠的(A)IL-6(pg/ml)及(B)CXCL1(ng/ml)的血清含量。

具體實施例方式 I.定義 為了使本發明更容易被理解，首先定義某些術語。其它定義在整個詳細說明書中公開。
術語「抗體」是指免疫球蛋白或其片段，且包括含抗原結合片段或抗原結合結構域的任何多肽。該術語包括但不限於多克隆抗體、單克隆抗體、單特異性抗體、多特異性抗體、非特異性抗體、人源化抗體、人抗體、單鏈抗體、嵌合抗體、合成抗體、重組抗體、雜合抗體、突變抗體、移植抗體及體外產生的抗體。除非詞組「完整的」位於前面修飾，否則術語「抗體」包括抗體片段，諸如Fab、F(ab′)2、FV、scFV、Fd、dAb及仍保持抗原結合作用的其它抗體片段。通常此類片段包含抗原結合結構域。
術語「抗原結合結構域」及「抗原結合片段」是指含對抗體與抗原間特異性結合起作用的胺基酸的抗體分子的一部分。特異性地由抗體識別並結合的抗原部分稱為「表位」。抗原結合結構域可包含抗體輕鏈可變區(VL)及抗體重鏈可變區(VH)；然而其不必要兩種都包含。例如Fd片段具有兩個VH區域且通常仍保留完整抗原結合結構域的部分抗原結合功能。抗體的抗原結合片段的實例包括(1)Fab片段，其是具有VL、VH、CL及CH1結構域的單價片段；(2)F(ab′)2片段，其是具有由鉸鏈區內二硫鍵連接的兩個Fab片段的雙價片段；(3)具有兩個VH及CH1結構域的Fd片段；(4)具有抗體單臂的VL及VH結構域的FV片段；(5)具有VH結構域的dAb片段(Ward等人，(1989)Nature 341544-546)；(6)分離的互補決定區(CDR)，及及(7)單鏈FV(scFV)。雖然FV片段的兩個結構域，VL及VH，是由分別的基因編碼，但是使用重組方法，其可通過能夠使其以單一蛋白質鏈而製備的合成接頭將其連接(其中VL及VH區域配對以形成單價分子，亦即單鏈FV(scFV)；參見例如Bird等人(1988)Science 242423-426；及Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA855879-5883)。這些抗體片段是使用本領域技術人員已知的技術而獲得，且以如同完整抗體的方式評估這些片段的功能。
術語「有效量」是指足以調節IL-22活性以減輕臨床症狀或獲得所期望生物結果(例如降低的T細胞和/或B細胞活性、自體免疫抑制、移植排斥抑制等)的劑量或含量。
術語「人抗體」包括具有實質上相當於本領域已知的人類種系免疫球蛋白序列的可變及恆定區域，其包括例如由Kabat等人所述的序列(見Kabat等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，U.S.Department of Health and Human Services，NIH Publication No.91-3242)。本發明的人抗體可包括未由例如CDR(且尤其CDR3)中的人類種系免疫球蛋白序列編碼的胺基酸殘基(例如通過體外的隨機或位點特異性突變或通過體內體細胞突變而引入的突變)。該人抗體可具有至少1、2、3、4、5或更多個由非人類種系免疫球蛋白序列編碼的胺基酸殘基取代的位置。
用語「抑制」或「拮抗」IL-22活性及其同源詞是指由於結合抗IL-22抗體而減少、抑制或降低IL-22的至少一種活性，其中該減少是相對於在無相同抗體存在下的IL-22活性而言。可使用本領域中已知的任何技術(包括例如實施例7及9中所述的技術)測定該活性。抑制或拮抗作用未必顯示IL-22多肽生物活性的全部消除。活性的減少量可以是約10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更高。
術語「白介素-22」或「IL-22」指可結合至IL-22R和/或IL-22R與IL-10R2的受體複合物且具有至少一種以下特徵的第II類細胞因子(其可以是哺乳動物的細胞因子)(1)天然發生的哺乳動物IL-22多肽(全長或成熟形式)或其片段的胺基酸序列，例如以SEQ ID NO1(人類)或SEQ ID NO3(鼠)表示的胺基酸序列或其片段；(2)實質上與如SEQ ID NO1或其胺基酸34-179(人類)或SEQ ID NO3(鼠)或其片段所示的胺基酸序列相同，例如具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的胺基酸序列；(3)由天然發生的哺乳動物IL-22核苷酸序列或片段(例如SEQ ID NO2或核苷酸71至610(人類)或SEQ ID NO4(鼠)或其片段)編碼的胺基酸序列；(4)由實質上與如SEQ ID NO2或其核苷酸71至610(人類)或SEQ ID NO4(鼠)或其片段所示的核苷酸序列相同(例如具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性)的核苷酸序列編碼的胺基酸序列；(5)由天然發生的IL-22核苷酸序列或其片段(例如SEQ ID NO2(人類)或SEQ ID NO4(鼠)或其片段)的簡併核苷酸序列編碼的胺基酸序列；或(6)於嚴謹條件(例如高度嚴謹條件)下，與前述核苷酸序列中的一種雜交的核苷酸序列。該IL-22可以與哺乳動物來源(例如人類或小鼠)的IL-22R和/或IL-22R與IL-10R2的受體複合物結合。
人IL-22的核苷酸序列及預測胺基酸序列分別在SEQ ID NO2及SEQID NO1中表示。人成熟的IL-22的胺基酸序列相當於SEQ ID NO1的胺基酸34-179。重組人IL-22的分析顯示許多結構域(Nagem等人(2002)Structure，101051-62；美國專利申請US 2002/0187512A1)。
術語「IL-22活性」是指由於IL-22結合至由細胞上的IL-22R及IL-10R2所組成的受體複合物，而引發或阻斷至少一種細胞過程。IL-22活性包括以下的至少一種，但不限於此(1)結合IL-22R或IL-22R及IL-10R2的受體複合物(例如具有或不具有人IL-10R2的人IL-22R)；(2)與信號轉導分子(例如JAK-1)聯繫；(3)激發STAT蛋白(例如STAT5、STAT3或其組合)的磷酸化作用；(4)活化STAT蛋白；及(5)調節(例如增加或降低)上皮細胞、成纖維細胞或免疫細胞的增殖、分化、效應細胞功能、細胞溶解活性、細胞因子分泌、存活或其組合。上皮細胞包括，但不限於皮膚細胞、腸細胞、肝細胞、腎細胞以及內皮細胞。成纖維細胞包括但不限於滑膜成纖維細胞。免疫細胞可包括CD8+及CD4+T細胞、NK細胞、B細胞、巨噬細胞及巨核細胞。IL-22活性可在體外測定，例如使用如實施例2及6所述的IL-22受體抑制試驗、實施例9所述的GROa分泌試驗或實施例7所述的BAF3增生試驗。IL-22活性也可在體內測定，例如如實施例13所述通過對免疫應答或病症的演變過程進行打分而測定。
如文中使用，「體外產生的抗體」是指其中所有或部分該可變區(例如至少一個CDR)是在非免疫細胞選擇(例如體外噬菌體展示、蛋白質晶片或可測試候選序列與抗原結合的能力的任何其它方法)中產生的抗體。該術語不包括免疫細胞內的基因組重排而產生的序列。
術語「分離的」是指實質上無天然環境的分子。例如分離蛋白質為實質上無細胞物質或無來自其所衍生的細胞或組織源的其它蛋白質。該術語也指就藥物組合物而言，該分離蛋白質具充分純度或至少70-80％(w/w)純度；或至少80-90％(w/w)純度；或至少90-95％純度或至少95％、96％、97％、98％、99％，或100％(w/w)純度的製劑。
用語「相同％」或「同一性％」是指至少兩種不同序列間的相似度。該同一性％可通過以下標準比對算法而測定例如由Altshul等人所述的theBasic Local Alignment Tool(BLAST)((1990)J.Mol.Biol.，215403-410)；Needleman等人的算法((1970)J.Mol.Biol.，48444-453)；或Meyers等人的算法((1988)Comput.Appl.Biosci.，411-17)。一組參數可以是具有缺口罰分為12、缺口擴大罰分為4，及移碼缺口罰分為5的Blosum 62計分矩陣。也可使用已併入ALIGN程序(第2.0版)內的E.Meyers及W.Miller的算法((1989)CABIOS，411-17)，利用PAM120加權殘基表、缺口長度罰分為12及缺口罰分為4以測定兩種胺基酸或核苷酸序列間的同一性％。同一性％通常是通過比較具類似長度的序列而計算。
該術語「譜(repertoire)」是指全部或部分衍生自至少一種編碼至少一種免疫球蛋白的序列的至少一種核苷酸序列。可通過重鏈的V、D、J片段，及輕鏈的V與J片段的體內重排而產生該序列(群)。或者，可自對重排的發生(例如體外刺激)應答的細胞產生該序列(群)。或者，部分或所有該序列(群)可通過DNA拼接、核苷酸合成、誘變及其它方法(參見例如美國專利5,565,332)而獲得。譜可僅包括一種序列或可包括數個序列，其包括在遺傳上多樣標本收藏中的一類。
術語「特異性結合」是指形成在生理條件下相對穩定的複合物的兩個分子。特異性結合與非特異性結合(其通常具有低親和性及中至高能量(capacity))不同之處在於具有高親和性及低至中能量的特徵。通常，當結合常數KA高於106M-1時，結合被視為具特異性。如果必要，在不會實質上影響特異性結合的情況下，通過改變結合條件，可減少非特異性結合。熟練的技術人員可通過使用常規技術而最優化合適的結合條件，諸如抗體濃度、溶液的離子強度、進行結合的溫度及時間、阻斷劑(例如血清白蛋白、牛奶酪蛋白)的濃度等。說明性條件公開在實施例3中，但是本領域普通技術人員已知的其它條件皆屬於本發明範圍。
如文中使用，該術語「嚴謹的」用於描述雜交及洗滌條件。嚴謹條件為本領域技術人員所知且可在以下資料中找到Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley & Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6。水性及非水性方法描述於該參考資料中且任一種皆可使用。嚴謹雜交條件的一個實例為於約45℃下在6×氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中進行雜交，繼而於50℃下在0.2×SSC、0.1％ SDS中進行至少一次洗滌。嚴謹雜交條件的第二個實例為於約45℃下在6×SSC中進行雜交，繼而於55℃下在0.2×SSC、0.1％ SDS中進行至少一次洗滌。嚴謹雜交條件的另一個實例為於約45℃下在6×SSC中進行雜交，繼而於60℃下在0.2×SSC、0.1％ SDS中進行至少一次洗滌。嚴謹雜交條件的另一個實例為於約45℃下在6×SSC中進行雜交，繼而於65℃下在0.2×SSC、0.1％ SDS中進行至少一次洗滌。高度嚴謹條件包括於65℃下在0.5M碳酸鈉、7％SDS中進行雜交，繼而於65℃下，在0.2×SSC、1％ SDS中進行至少一次洗滌。
用語「實質上如所陳述的」、「實質上相同」或「實質上同源」意指相關胺基酸或核苷酸序列(例如CDR、VH或VL結構域)與所陳述的序列相同或無實質差異(通過保守性胺基酸取代)。無實質差異包括較少的胺基酸變化，諸如在特定區域的5個胺基酸序列中1個或2個個取代。就抗體而言，第二種抗體具有相同特異性且其親和性為第一種抗體親和性的至少50％。
實質上與文中所公開的序列相同或同源的序列(例如至少約85％序列同一性)也為本申請的一部分。在某些實施方案中，序列的同一性可以是約85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高。或者，當於選擇的雜交條件(例如高度嚴謹雜交條件)下，核酸片段雜交至互補鏈時，存在實質同一性或同源性。核酸可存在於全細胞內、細胞溶解產物內或以部分純化或實質上純的形式存在。
該術語「治療劑」為治療或協助治療病症的物質。治療劑可包括，但不限於以補充抗IL-22抗體的IL-22活性的方式調節免疫細胞或免疫應答的物質。治療劑的非限制性實施方案及用途描述於文中。
如文中使用，抗IL-22抗體的「治療有效量」是指通過對受試者(諸如人類病患)進行單一或多重劑量施用，而有效處理、預防、治療、延緩、減少病症或復發病症的嚴重性，和/或改善病症或復發病症的至少一種症狀或延長病患的存活時間，使受試者的生命超越無此治療時所預期的存活時間的有效抗體量。
術語「治療」是指治療或預防措施。對罹患病症的受試者或最終會罹患該病症的受試者施用該治療以預防、治療、延緩、減少病症或復發病症的嚴重性，和/或改善病症或復發病症的一種或多種症狀或延長受試者的存活時間，使病患的生命超過無此治療時所預期的存活時間。
II.抗IL-22抗體 本公開內容提供包含新的抗原結合片段的新的抗IL-22抗體。
本領域技術人員已知許多方法皆適用於獲得抗體或其抗原結合片段。例如可使用重組DNA方法以製備抗體(美國專利4,816,567)。也可根據已知方法通過產生雜交瘤而製備單克隆抗體(參見例如Kohler和Milstein(1975)Nature，256495-499)。然後使用標準方法，諸如酶聯免疫吸附分析(ELISA)及表面等離振子共振(BIACORETM)分析，篩選該方法所形成的雜交瘤，以鑑定產生與特定抗原特異性結合的抗體的一或多種雜交瘤。任何形式的特定抗原皆可作為免疫原，例如重組抗原、天然形式、其任何變體或片段，以及其抗原性肽。
製備抗體的一個代表性方法包括篩選蛋白質表達文庫，例如噬菌體或核糖體展示文庫。噬菌體展示技術描述在例如以下資料中Ladner等人，美國專利5,223,409；Smith(1985)Science 2281315-1317；Clackson等人(1991)Nature，352624-628；Marks等人(1991)J.Mol.Biol.，222581-597；WO 92/18619；WO 91/17271；WO 92/20791；WO 92/15679；WO 93/01288；WO 92/01047；WO 92/09690及WO 90/02809。
除展示文庫的使用外，可使用特定抗原免疫非人類動物(例如齧齒目動物，諸如小鼠、倉鼠或大鼠)。在一個實施方案中，非人類動物包括人類免疫球蛋白基因的至少一部分。例如可使用人類免疫球蛋白基因座的大片段改造而產生小鼠抗體生成缺陷的小鼠品系。使用雜交瘤技術，可製備並選擇衍生自具有所期望特異性的基因的抗原特異性單克隆抗體。參見例如XENOMOUSETM，Gree等人(1994)Nature Genetics 713-21、美國專利2003-0070185、1996年10月31日公開的WO 96/34096及1996年4月29日申請的PCT申請PCT/US 96/05928。
在另一個實施方案中，單克隆抗體得自非人類動物，然後可使用本領域中已知的重組DNA技術對其產生修飾，例如人源化、去免疫化、嵌合化。製備嵌合抗體的多種方法已經公開。參見例如Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.816851，1985；Takeda等人，Nature 314452，1985；Cabilly等人，美國專利4,816,567；Boss等人，美國專利4,816,397；Traaguchi等人，歐洲專利公開EP 171496；歐洲專利公開0173494；英國專利GB 2177096B。也可使用，例如表達人類重鏈及輕鏈基因但是不能表達內源性小鼠免疫球蛋白重鏈及輕鏈基因的轉基因小鼠以產生人源化抗體。Winter描述可用以製備文中所述人源化抗體的代表性CDR移植方法(美國專利5,225,539)。特定人抗體的所有CDR可被非人CDR的至少一部分取代，或僅部分CDR可被非人類CDR取代。僅必需取代使人源化抗體與預定抗原結合所需的CDR數。
可通過得自人類FV可變結構域的同等序列取代未直接涉及抗原結合的FV可變結構域的序列而產生人源化抗體或其片段。產生人源化抗體或其片段的代表性方法通過以下而提供Morrison(1985)Science 2291202-1207；Oi等人(1986)Bio Techniques 4214；及美國專利5,585,089；美國專利5,693,761；美國專利5,693,762；美國專利5,859,205；美國專利6,407,213。這些方法包括分離、操作及表達編碼得自重鏈或輕鏈中的至少一種的所有或部分免疫球蛋白FV可變結構域的核酸序列。如上述，此類核酸得自能產生抗預定目標抗體的雜交瘤，以及其它來源。然後可將編碼人源化抗體分子的重組DNA克隆入合適的表達載體內。
在特定實施方案中，通過保守取代、共有序列取代、種系取代和/或回復突變的導入而使人源化抗體最優化。通過本領域已知的幾種技術中的任一種而製成此類改變的免疫球蛋白分子(參見例如Teng等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，807308-7312，1983；Kozbor等人，Immunology Today，47279，1983；Olsson等人，Meth.Enzymol.，923-16，1982)，且可根據PCT公開WO 92/06193或EP 0239400的教導而製成。
也可通過WO 98/52976及WO 00/34317中所公開的人類T細胞表位的特定刪除或「去免疫化」方法而修飾抗體或其片段。簡言之，可分析抗體重鏈及輕鏈可變結構域的結合II類MHC的肽；這些肽代表潛在的T細胞表位(如WO 98/52976及WO 00/34317中所定義)。就潛在的T細胞表位的檢測而言，可應用稱為「肽結構預測線索法(peptide threading)」的電腦模擬方法，此外如WO 95/52976及WO 00/34317所述，可檢索人類II類MHC結合肽資料庫而尋求存在於VH及VL序列中的模序。這些模序結合至18種主要II類MHC的DR同種異型中的任一種，因此構成潛在的T細胞表位。可通過取代可變結構域中的少數胺基酸殘基或優選通過單一胺基酸取代而去除所檢測到的潛在T細胞表位。通常進行保守取代。通常，但並非絕對，可使用與人類種系抗體序列中的位置常見的胺基酸。人類種系序列公開在以下資料中例如Tomlinson等人(1992)J.Mol.Biol.，227776-798；Cook，G.P.等人(1995)Immunol.Today Vol.16(5)237-242；Chothia，D.等人(1992)J.Mol.Biol.227799-817；及Tomlinson等人(1995)EMBO J.144628-4638。該V BASE目錄提供人類免疫球蛋白可變區序列的綜合目錄(由Tomlinson，I.A.等人彙編，MRC Centre for Protein Engeneering，Cambridge，UK)。這些序列可作為人類序列(例如架構區及CDR)的來源。也可使用共有人類架構區，例如美國專利6,300,064中所述的。
在特定實施方案中，抗體可含有改變的免疫球蛋白恆定或FC區。例如根據文中教導所製備的抗體可以更強或更具特異性地結合至效應分子(諸如補體和/或FC受體)，該效應分子可控制抗體的幾種免疫功能，諸如效應細胞活性、細胞裂解、補體介導的活性、抗體清除率及抗體半衰期。結合至抗體(例如IgG抗體)FC區的典型FC受體包括，但不限於以下的受體FCγR I、FCγR II及RCγR III與FCRn亞類的受體，其包括這些受體的等位基因變體或可變剪接形式。FC受體在Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol 9457-92，1991；Capel等人，Immunomethods 425-34，1994；及de Haas等人，J.Lab.Clin.Med.126330-41，1995中評論。
就另外的抗體製備技術而言，見AntibodiesA Laboratory Manual，Harlow等人編著，Cold Spring Harbor Laboratory，1988。本發明不受限於抗體的任何特定來源、製法或其它特別特徵。
抗體，也稱為免疫球蛋白，通常為由各約25kDa的兩條輕(L)鏈及各約50kDa的兩條重(H)鏈所組成的四聚合糖基化蛋白質。在抗體內可找到兩種類型的輕鏈，即λ及κ。根據重鏈恆定結構域的胺基酸序列，可將免疫球蛋白分成5種主要的種類A、D、E、G及M，且其中一些可進一步分成亞類(同種型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。各輕鏈包括一個N-末端可變(V)結構域(VL)及一個恆定(C)結構域(CL)。各重鏈包括一個N-末端V結構域(VH)、3或4個C結構域(CH)及一個鉸鏈區。最接近VH的CH結構域稱為CH1。VH及VL結構域由4個相對保守的序列區域(稱為構架區，即FR1、FR2、FR3及FR4)所組成，該構架區可形成3個高變序列區域(互補決定區，CDR)所需的構架。該CDR含有大部分進行抗體與抗原間特異性相互作用的殘基。CDR稱為CDR1、CDR2及CDR3。因此，在重鏈上的CDR組分稱為H1、H2及H3，而在輕鏈上的CDR組分稱為L1、L2及L3。
CDR3通常為抗體結合部分內的最大分子多樣性的來源。例如H3可以短至兩個胺基酸殘基或大於26個胺基酸。不同免疫球蛋白種類的亞基結構及立體構型為本領域所熟知。就抗體結構的綜述而言，見AntibodiesALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Harlow等人編著，1988。本領域技術人員了解各亞基結構(例如CH、VH、CL、VL、CDR、FR結構)包含與抗原結合的活性片段，例如與抗原結合的VH、VL或CDR亞基的部分，亦即抗原結合片段，或例如結合至例如FC受體和/或補體和/或將其活化的CH亞基的部分。如Kabat等人在Sequences of Proteins ofImmunological Interest，US Department of Health and Human Services(1991)編著中所述，CDR通常是指Kabat CDR。描述抗原結合部分特徵的另一標準是指如通過Chothia所述的高變環。參見例如Chothia，D.等人(1992)J.Mol.Biol.227799-817；及Tomlinson等人(1995)EMBO J.144628-4638。另外又一個標準為由Oxford Molecular’s AbM抗體模型軟體所使用的AbM定義。一般而言，參見例如Antibody Engineering Lab Manual中的Protein Sequenceand Structure Analysis of Antibody Variable Domains.(Duebel，S.和Kontermann，R.，編著Springer-Verlag，Heidelberg)。或者可使用有關Chothia高變環或AbM所定義環的類似描述關係實施有關Kabat CDR的描述的具體實施例。
Fab片段(抗原結合片段Fragment antigen-binding)由VH-CH1及VL-CL結構域組成，所述結構域通過恆定區間的二硫鍵而共價連接。FV片段較小且由非共價連接的VH及VL結構域組成。為了克服非共價連接結構域解離的趨勢，可構建單鏈FV片段(scFV)。scFV含有使(1)VH的C-末端與VL的N-末端連接或使(2)VL的C-末端與VH的N-末端連接的柔性多肽。15-mer(Gly4Ser)3肽可作為接頭，但是其它接頭在本領域中已知。
組裝及體細胞突變後的抗體基因的序列具高變化性，且這些變化的基因估計可編碼1010個不同抗體分子(Immunoglobulin Genes，第2版，Jonio等人編著，Academic Press，San Diego，CA，1995)。
「雙特異性」或「雙功能性抗體」為具有兩種不同重/輕鏈對及兩種不同結合部分的人造雜種抗體。雙特異性抗體可通過各種方法製備，其包括雜交瘤的融合或Fab』片段的連接。參見例如Songsivilai & Lachmann，Clin.Exp.Immunol.79315-321(1990)；Kostelny等人，J.Immunol.148，1547-1553(1992)。在一個實施方案中，雙特異性抗體包含通過免疫球蛋白恆定區而與第二結合結構域多肽連接的第一結合結構域多肽，諸如Fab』片段。
小模塊免疫藥物(Small Modular ImmunoPharmaceuticals，即SMIPTM)提供含結合結構域多肽的變體分子的實例。SMIP及其用途與應用公開在以下專利申請中例如美國公開專利申請2003/0118592、2003/0133939、2004/0058445、2005/0136049、2005/0175614、2005/0180970、2005/0186216、2005/0202012、2005/0202023、2005/0202028、2005/0202534、2005/0238646及其相關的專利族，這些專利申請的全文在此皆併入本申請以作為參考資料。
SMIPTM通常指結合性結構域-免疫球蛋白融合蛋白質，其包括融合至或連接至免疫球蛋白鉸鏈或鉸鏈作用區多肽的結合性結構域多肽，其接著融合至或連接至含一或多種來自免疫球蛋白重鏈的非CH1的天然或改造的恆定區的區域(例如IgG及IgA的CH2及CH3區或IgE的CH3及CH4區)(參見例如頒予Ledbetter，J.等人的美國專利2005/0136049，為更完全地說明，其在此併入本申請以作為參考資料)。結合性結構域免疫球蛋白融合蛋白質可進一步包括這樣的區域，其包含融合至或連接至鉸鏈區多肽的天然或改造的免疫球蛋白重鏈CH2恆定區多肽(或就全部或局部衍生自IgE的結構而言是CH3)，以及融合至或連接至該CH2恆定區多肽(或就全部或局部衍生自IgE的結構而言是CH3)的天然或改造的免疫球蛋白重鏈CH3恆定區多肽(或就全部或局部衍生自IgE的結構而言是CH4)。通常，此類結合性結構域免疫球蛋白融合蛋白質可具有至少一種選自以下的免疫活性依賴抗體的細胞毒性、補體結合，和/或結合至靶標，例如靶標抗原(諸如人IL-22)。
治療型蛋白質，即對其起作用的身體區域或對其通過中間物而遠距離地起作用的身體區域有生物學效應的蛋白質或肽，也可用於實踐本發明。治療型蛋白質可包括肽模擬物。模擬物為模擬蛋白質二級結構元件的含肽分子。參見例如Johnson等人，BIOTECHNOLOGY AND PHARMACY中的「Peptide Turn Mimetics」，Pezzuto等人編著，Chapman and Hall，New York(1993)，其在此併入本申請以作為參考資料。該肽模擬物使用背後的基本原因為蛋白質的肽骨架存在的主要功能為將胺基酸側鏈以促進分子相互作用的方式定向，諸如抗體與抗原的分子相互作用。已預期肽模擬物可以進行與天然分子類似的分子相互作用。可使用這些原理以改造不僅具有文中所公開靶肽的許多天然性質且具有改變的且潛在性被改良特徵的二代分子。
治療型蛋白質的其它實施方案包括融合蛋白質。這些分子通常具有在其N-或C-末端與所有或一部分第二多肽或蛋白質連接的所有或大部分靶標肽，例如IL-22或抗IL-22抗體。例如融合作用可使用得自其它物種的前導序列以使蛋白質在異源宿主內重組表達。另一有用的融合作用包括添加免疫活性結構域，諸如抗體表位，以促進融合蛋白質的純化。包含於或接近該融合接合處的剪切位點可促進純化後該外來多肽的移除。其它有用的融合包括連接功能性結構域，諸如酶的活性位點、糖基化結構域、細胞靶標信號或跨膜區。可併入融合蛋白內的蛋白質或肽實例包括細胞生長抑制性蛋白質、殺細胞性蛋白質、促細胞凋亡劑、抗血管生成劑、激素、細胞因子、生長因子、肽藥物、抗體、抗體的Fab片段、抗原、受體蛋白質、酶、凝集素、MHC蛋白質、細胞黏連蛋白質及結合性蛋白質。產生融合蛋白的方法為本領域技術人員所熟知。例如可通過使用雙功能交聯劑的化學附著法，通過完整融合蛋白的從新合成法或通過將編碼靶標肽的DNA序列與編碼第二肽或蛋白質的DNA序列連接，繼而表達完整的融合蛋白而製備此類蛋白質。
在一個實施方案中，該靶標肽(例如IL-22或抗IL-22抗體)與含兩個恆定區結構域及鉸鏈區，但無可變區的免疫球蛋白重鏈恆定區(諸如FC片段)融合(參見例如美國專利6,018,026及5,750,375，其皆在此併入本申請以作為參考資料)。該FC區可以是天然發生的FC區或可以經改造以改良特定性質，諸如治療特性、循環時間、減少的凝集性等的FC區。與FC區融合的肽及蛋白質的體內半衰期大於未經融合的對應物。而且與FC區融合的作用可以使該融合多肽進行二聚化作用/多聚化作用。
如為技術人員所知的VHH分子(或納米抗體(nanobodies))是衍生自天然缺乏輕鏈的免疫球蛋白的重鏈可變結構域，諸如衍生自如WO 9404678(其在此併入本申請以作為參考資料)中所述駱駝科動物的重鏈可變結構域。此種VHH分子可衍生自在駱駝科物種(例如駱駝、美洲駝、單峰駝、羊駝及南美野生羊駝)中所取得的抗體且有時稱為駱駝科動物或駱駝科動物化可變結構域。參見例如Muyldermans.，J.Biotechnology(2001)74(4)277-302。其在此併入本申請以作為參考資料。除駱駝科動物外，其它物種可產生天然無輕鏈的重鏈抗體。VHH分子比IgG分子大約小10倍。其是單一多肽且很穩定，可以抗極端pH及溫度條件。而且，其可抗蛋白酶的作用，已知抗體並無此作用。而且，VHH的體外表達可產生高產率、正確摺疊的功能VHH。此外，駱駝科動物中產生的抗體識別不同於通過體外使用抗體文庫或通過免疫非駱駝科動物的哺乳動物而產生抗體所識別的表位(見WO9749805，其在此併入本申請以作為參考資料)。
本發明一方面包括結合IL-22的抗體及抗原結合片段。本公開內容提供衍生自人類免疫球蛋白文庫的新的CDR。用於攜帶CDR的結構通常為抗體重鏈或輕鏈或其一部分，其中該CDR是位於天然發生的CDR區內。可以如Kabat等人在Sequences of Proteins of Immunological Interest，No.91-3242，National Institutes of Health Publications，Bethesda，MD(1991)中所述的方法測定可變結構域的結構及位置。
本發明抗IL-22抗體的說明性實施方案的DNA及胺基酸(AA)序列，包括其scFV片段、VH及VL結構域及CDR，公開在圖7至10中且在表1及7中列舉。非種系化抗體的20種具體實例稱為GIL01、GIL16、GIL45、GIL60、GIL68、GIL92、097D09、062A09、062G05、087B03、367D04、368D04、166B06、166G05、375G06、376B10、354A08、355B06、355E04及356A11。在非種系化抗體的VH及VL結構域中CDR位置示於表2中。種系化抗體的15種具體實例稱為GIL01、GIL16、GIL45、GIL60、GIL68、GIL92、062A09、087B03、166B06、166G05、354A08、355B06、355E04、356A11及368D04。


表2CDR在VH及VL結構域的非種系化抗體的胺基酸序列內的位置 本發明抗IL-22抗體可任選地包含抗體恆定區或其部分。例如VL結構域可以以其C-末端與輕鏈恆定結構域(如Cκ或Cλ)連接。類似地，VH結構域或其部分可以與所有或部分重鏈(例如IgA、IgD、IgE、IgG及IgM)，及任何同種型亞類連接。恆定區在本領域中是已知(參見例如Kabat等人，Sequences ofProteins of Immunological Interest，No.91-3242，National Institutes of HealthPublications，Bethesda，MD(1991))。因此，屬於本發明範圍的抗體包括與本領域已知的恆定區聯合的VH及VL結構域或其部分。
特定實施方案包括得自GIL01、GIL16、GIL45、GIL60、GIL68、GIL92、097D09、062A09、062G05、087B03、367D04、368D04、166B06、166G05、375G06、376B10、354A08、355B06、355E04或356A11的FV片段的VH結構域、VL結構域或其組合。另一個實施方案包括選自356A11、354A08、087B03及368D04的抗體的FV片段的VH結構域、VL結構域或其組合。其它實施方案包含1、2、3、4、5或6個得自VH及VL結構域的互補決定區(CDR)。其CDR序列包括在SEQ ID NO5-13、23-31、41-49、59-67、77-85、95-103、113-121、131-139、149-157、167-175、185-193、203-211、221-229、239-247、257-265、275-283、293-301、311-319、329-337、347-355、365-373、383-391、401-409、419-427、437-445、455-463、473-481、491-499、509-517、527-535、545-553、563-571、581-589、599-607或617-625內的抗體屬於本發明範圍。例如在一個實施方案中，抗體包含種系化或非種系化GIL01、GIL16、GIL45、GIL60、GIL68、GIL92、097D09、062A09、062G05、087B03、367D04、368D04、166B06、166G05、375G06、376B10、354A08、355B06、355E04或356A11或選自356A11、354A08、087B03及368D04抗體的VH結構域的H3片段。
在特定實施方案中，VH和/或VL結構域可被種系化，亦即使用已知分子生物學技術使這些結構域的構架區(FR)突變以匹配通過種系細胞所產生的那些構架區。在其它實施方案中，FR序列保持偏離共有種系序列。在本發明一個實施方案中，種系化的抗體示於表7中。
在一個實施方案中，本發明提供種系化的GIL01、GIL16、GIL45、GIL60、GIL68、GIL92、097D09、062A09、062G05、087B03、367D04、368D04、166B06、166G05、375G06、376B10、354A08、355B06、355E04或356A11的胺基酸及核酸序列。種系化的GIL01、GIL16、GIL45、GIL60、GIL68、GIL92、062A09、087B03、166B06、166G05、354A08、355B06、355E04、356A11及368D04的VH結構域的胺基酸及核苷酸系列公開在表7及圖8中。種系化的GIL01、GIL16、GIL45、GIL60、GIL68、GIL92、062A09、087B03、166B06、166G05、354A08、355B06、355E04、356A11及368D04的VL結構域的胺基酸及核苷酸系列公開在表7及圖8中。
在一個實施方案中，使用誘變以製備更類似一或多種種系序列的抗體。優選通過體細胞誘變或通過易錯PCR將突變導入抗體的架構區內。可通過對VBASE資料庫(MRC Center for Protein Engineering，UK)進行胺基酸及核酸序列比對而確認VH及VL結構域的種系序列。VBASE為彙編自超過一千種已公開序列(其包括Genbank和EMBL資料庫最近發布的序列)的所有人類種系可變區序列的綜合目錄。在某些實施方案中，以與VBASE資料庫中最接近的匹配物一致的形式突變scFV的FR區域，且保持CDR部分完整。
在特定實施方案中，本發明抗體特異性地與GIL01、GIL16、GIL45、GIL60、GIL68、GIL92、097D09、062A09、062G05、087B03、367D04、368D04、166B06、166G05、375G06、376B10、354A08、355B06、355E04或356A11所識別的相同表位進行反應，通過此其可競爭性地抑制GIL01、GIL16、GIL45、GIL60、GIL68、GIL92、097D09、062A09、062G05、087B03、367D04、368D04、166B06、166G05、375G06、376B10、354A08、355B06、355E04或356A11結合至人IL-22。可以在競爭性結合試驗中測定此類抗體。在一個實施方案中，抗體或其抗原結合片段結合至368D04所識別的IL-22表位，以此抗體競爭性地抑制368D04結合至人IL-22。在另一個實施方案中，抗體或其抗原結合片段可結合至356A11所識別的IL-22表位，以此抗體競爭性地抑制356A11結合至人IL-22。在另一個實施方案中，抗體或其抗原結合片段結合至354A08所識別的IL-22表位，以此抗體競爭性地抑制354A08結合至人IL-22。在另一個實施方案中，抗體或其抗原結合片段結合至087B03所識別的IL-22表位，以此抗體競爭性地抑制087B03結合至人IL-22。在一個實施方案中，這些抗體對人IL-22的結合常數(KA)為至少106M-1。在另一個實施方案中，這些抗體對人IL-22的結合常數為至少109M-1。在其它實施方案中，這些抗體對人IL-22的結合常數為至少1010M-1、至少1011M-1或至少1012M-1。可使用本領域中已知的技術測定結合親和性，諸如ELISA、生物傳感器技術(諸如生物特異性相互作用分析)或其它技術(包括本申請中所述技術)。
已預期本發明抗體可結合其它蛋白質，諸如含所有或部分IL-22的重組蛋白。
本領域普通技術人員了解可使用所公開抗體以檢測、測定和/或抑制稍不同於IL-22的蛋白質。例如這些蛋白質可以是IL-22的同源物。已預期抗IL-22抗體可結合的蛋白質所包含的序列與SEQ ID NO1中所示序列內的至少100、80、60、40或20個連續胺基酸的任何序列具至少約60％、70％、80％、90％、95％或更高同一性。
除了序列同源性分析，可進行表位作圖(參見例如Epitope MappingProtocols，Morris編著，Humana Press，1996)，及二級與三級結構分析以鑑定目前公開的抗體及其與抗原的複合物所假設的特定3D結構。此類方法包括但不限於X射線結晶學(Engstem(1974)Biochem.Exp.Biol.，117-13)及現有抗體實際表徵的電腦模擬(Fletterick等人(1986)Computer Graphics andMolecular Modeling，in Current Communications in Molecular Biology，ColdSpring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY)。
本公開內容提供一種獲得抗IL-抗體的方法，其包括產生具有表1VH和/或VL序列改變的抗體。熟練的技術人員使用本領域已知技術可衍生出此類抗體。例如可將胺基酸取代、缺失或添加導入FR和/或CDR區中。設計FR改變通常用以改良抗體的穩定性及免疫原性，而設計CDR改變通常用以增加抗體對其抗原的親和性。可通過改變CDR序列並測定抗體對其靶標的親和性而測試增加親和性的變化(見Antibody Engineering，第2版，OxfordUniversity Press，Borrebaeck編著，1995)。
其CDR序列實質上與SEQ ID NO5-13、23-31、41-49、59-67、77-85、95-103、113-121、131-139、149-157、167-175、185-193、203-211、221-229、239-247、257-265、275-283、293-301、311-319、329-337、347-355、365-373、383-391、401-409、419-427、437-445、455-463、473-481、491-499、509-517、527-535、545-553、563-571、581-589、599-607或617-625的序列所包含的CDR序列相同的抗體屬於本發明範圍。通常包括以具有類似電荷、疏水或立體化學特性的胺基酸進行胺基酸取代。與CDR區域不同，也可進行FR區內的更大程度的取代，其限制條件為該取代不對抗體的結合性質產生不利影響(例如與未取代的抗體比較，降低了超過50％的親和性)。可進行取代以將該抗體種系化或將抗原結合位點穩定化。
保守修飾可製備具有類似於得到此類修飾的分子的功能及化學特徵的分子。反之，可通過選擇胺基酸序列中的取代而實質修飾分子的功能和/或化學特徵，該取代在對於維持以下內容的功能上存在顯著差異的胺基酸序列中進行(1)取代區域中分子骨架的結構，例如摺疊或螺旋構型，(2)於靶標部位的分子的電荷或疏水性或(3)該分子的大小。
例如「保守胺基酸取代」可包括以非天然殘基取代天然胺基酸殘基，以此對於該位置的胺基酸殘基的極性或電荷幾乎沒有或沒有影響(參見例如MacLennan等人，1998，Acta Physiol.Scand.Suppl.64355-67；Sasaki等人，1998，Adv.Biophys.351-24)。
在取代為所期望的情況下，可通過本領域技術人員決定所期望胺基酸取代基(不論保守或非保守)。例如可使用胺基酸取代以鑑定分子序列的重要殘基或增加或降低文中所述分子的親和性。代表性胺基酸取代包括，但不限於表3中所示取代。
表3胺基酸取代 在特定實施方案中，保守胺基酸取代基也包括通常通過化學肽合成(而非在生物系統中進行的合成)而加入的非天然發生的胺基酸殘基。
在一個實施方案中，製備變體VH結構域的方法包括添加、缺失或取代所公開VH結構域中的至少一個胺基酸或組合所公開VH結構域與至少一個VL結構域，並測試變體VH結構域的IL-22結合性或IL-22活性的調節作用。
一種製備變體VL結構域的類似方法包括添加、缺失或取代所公開VL結構域中至少一個胺基酸或使所公開的VL結構域與至少一個VH結構域組合，並測試變體VL結構域的IL-22結合性或IL-22活性的調節作用。
本公開內容的另一方面提供一種製備特異性結合至IL-22的抗體或抗原結合片段的方法。該方法包括 (a)提供編碼缺少至少一個CDR或含有至少一個待取代CDR的VH結構域的核酸的起始譜； (b)以至少一個編碼實質上如同文中公開的VH CDR的胺基酸序列的供體核酸插入或取代起始譜的CDR區域以得到產物譜； (c)表達產物譜的核酸； (d)選擇結合至IL-22的特異性抗原結合片段；及 (e)回收特異性抗原結合片段或編碼其的核酸。
在一個類似方法中，本發明至少一個VL CDR與編碼缺少至少一種CDR或含有至少一種待取代CDR的VL結構域的核酸譜組合。至少一種VH或VLCDR可以是CDR1、CDR2、CDR3或其組合，其包括VH CDR與VL CDR的組合，諸如表1或7中所示那些，其包括以下SEQ ID NO所示那些SEQ IDNO8、9、11、12、13、26、27、28、29、30、31、44、45、46、47、48、49、62、63、64、65、66、67、80、81、82、83、84、85、98、99、100、101、102、103、116、117、118、119、120、121、134、135、136、137、138、139、152、153、154、155、156、157、170、171、172、173、174、175、188、189、190、191、192、193、206、207、208、209、210、211、224、225、226、227、228、229、242、243、244、245、246、247、260、261、262、263、264、265、278、279、280、281、282、283、296、297、298、299、300、301、314、315、316、317、318、319、332、333、334、335、336、337、350、351、352、353、354、355、368、369、370、371、372、373、386、387、388、389、390、391、404、405、406、407、408、409、422、423、424、425、426、427、440、441、442、443、444、445、458、459、460、461、462、463、476、477、478、479、480、481、494、495、496、497、498、499、512、513、514、515、516、517、530、531、532、533、534、535、548、549、550、551、552、553、566、567、568、569、570、571、584、585、586、587、588、589、602、603、604、605、606、607、620、621、622、623、624或625。
在一個實施方案中，該可變結構域包括待取代的CDR3或無CDR3編碼區，且至少一種供體核酸編碼實質上如以下SEQ ID NO所示胺基酸SEQ IDNO10、13、28、31、46、49、64、67、82、85、100、103、118、121、136、139、154、157、172、175、190、193、208、211、226、229、244、247、262、265、280、283、298、301、316、319、334、337、352、355、370、373、388、391、406、409、424、427、442、445、460、463、478、481、496、499、514、517、532、535、550、553、568、571、586、589、604、607、622或625。
在另一個實施方案中，可變結構域包括待取代的CDR1或無CDR1編碼區，且至少一種供體核酸編碼實質上如以下SEQ ID NO所示胺基酸序列SEQ ID NO8、11、26、29、44、47、62、65、80、83、98、101、116、119、134、137、152、155、170、173、188、191、206、209、224、227、242、245、260、263、278、281、296、299、314、317、332、335、350、353、368、371、386、389、404、407、422、425、440、443、458、461、476、479、494、497、512、515、530、533、548、551、566、569、584、587、602、605、620或623。
在另一個實施方案中，可變結構域包括待取代的CDR2或無CDR2編碼區，且至少一種供體核酸編碼實質上如以下SEQ ID NO所示胺基酸序列SEQ ID NO9、12、27、30、45、48、63、66、81、84、99、102、117、120、135、138、153、156、171、174、189、192、207、210、225、228、243、246、261、264、279、282、297、300、315、318、333、336、351、354、369、372、387、390、405、408、423、426、441、444、459、462、477、480、495、498、513、516、531、534、549、552、567、570、585、588、603、606、621或624。
在另一個實施方案中，可變結構域包括待取代的CDR3或無CDR3編碼區，且進一步包含待取代的CDR1或無CDR1編碼區，其中至少一種供體核酸編碼實質上如表1或7所示胺基酸序列。
在另一個實施方案中，可變結構域包括待取代的CDR3或無CDR3編碼區，且進一步包含待取代的CDR2或無CDR2編碼區，其中至少一種供體核酸編碼實質上如表1或7中所示胺基酸序列。
在另一個實施方案中，可變結構域包括待取代的CDR3或無CDR3編碼區，且進一步包含待取代的CDR1與CDR2或無CDR1及CDR2編碼區，其中至少一種供體核酸編碼實質上如表1或7中所示胺基酸序列。
使用重組DNA方法，可將所公開CDR序列導入缺少各自CDR的VH或VL結構域譜內(Marks等人，Bio Technology(1992)10779-783)。例如使用鄰接可變結構域的5′末端的引物及鄰接第三FR的引物以產生無CDR3的可變結構域序列的譜。該譜可以與所公開抗體的CDR3組合。使用類似技術，部分所公開的CDR序列可經得自其它抗體的CDR序列的一部分改組以得到結合IL-22的抗原結合片段的譜。任一種譜可在宿主系統，諸如噬菌體展示技術(描述在WO 92/01047及其對應美國專利5,969,108中)中表達，因此可選擇能結合IL-22的合適抗原結合片段。
另一種使用所公開VH或VL序列的隨機誘變以產生仍可結合IL-22的變體VH或VL結構域。使用易錯PCR的技術由Gram等人描述在Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.(1992)893576-3580中。
另一種方法使用所公開VH或VL序列的定點誘變。此類技術由Barbas等人(Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.(1994)913809-3813中)及Schier等人(J.Mol.Biol.(1996)263551-567)公開。
可變結構域的一部分包含至少一種實質上如文中公開的CDR區及視需要選用的得自如文中所公開VH或VL結構域的間插構架區。該部分可包括FRI的C末端半部和/或FR4的N末端半部。該可變結構域N末端或C末端的其它殘基可以不同於在天然發生抗體中所發現的殘基。例如通過重組DNA技術而構建的抗體通常自使用的接頭導入N-或C-末端殘基。可使用某些接頭以使可變結構域與其它可變結構域(例如雙抗體)、恆定結構域或蛋白質標記連接。
雖然在下文實施例中所闡明的實施方案包含VH及VL結構域的「配」對，熟練的技術人員知道另外實施方案可包括僅含得自VL或VH結構域的單一CDR的抗原結合片段。可使用單鏈特異性抗原結合結構域中的任一種以篩選可形成能結合例如IL-22的雙結構域特異性抗原結合片段的互補結構域。可通過噬菌體展示篩選方法，使用WO 92/01047中所公開的所謂階層雙組合方式以進行篩選。在該方法中，使用含H或L鏈克隆的個別菌落以感染編碼另一鏈(L或H)的克隆的完整文庫，且根據如所述噬菌體展示技術選擇形成的雙鏈特異性抗原結合結構域。
在某些另外實施方案中，可通過化學交聯法或重組法而使抗IL-22抗體與蛋白質(例如白蛋白)連接。也可以使用美國專利4,640,835、4,496,689、4,301,144、4,670,417、4,791,192或4,179,337中所公開的方式使所公開的抗體與各種非蛋白質聚合物(例如聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧化烯烴)連接。抗體可通過與聚合物共價綴合而被化學修飾，例如以增加其在血液循環中的半衰期。代表性聚合物及連接方法示於美國專利4,766,106、4,179,337、4,495,285；及4,609,546中。
所公開抗體可經修飾以改變其糖基化作用；亦即至少一種碳水化合物部分可被缺失或添加至抗體內。可通過改變胺基酸序列以缺失或產生本領域中已熟知的糖基化作用共有位點而進行糖基化作用位點的缺失或添加。添加碳水化合物部分的另一種方法為糖苷與抗體胺基酸殘基的化學或酶促耦合(見WO 87/05330及Aplin等人(1981)CRC Crit.Rev.Biochem.，22259-306)。也可使用化學或酶促方法進行碳水化合物部分的移除(見Hakimuddin等人(1987)Arch.Biochem.Biophys.，25952；Edge等人(1981)Anal.Biochem.，118131；Thotakura等人(1987)Meth.Enzymol.，138350)。
改變抗體恆定區的方法在本領域中已知。可通過以不同殘基取代抗體恆定區內的至少一種胺基酸殘基而製成具有不同功能(例如對於效應配體，諸如細胞上的FCR或補體的C1組分的不同親和性)的抗體(參見例如EP388,151A1、US 5,624,821及US 5,648,260)。可描述類似的改變類型，若其應用鼠或其它物種抗體將減少或去除類似功能。
例如可改變抗體(例如IgG，諸如人IgG)的FC區對FCR(例如FCγR1)或Clq的親和性。可通過以至少一種其側鏈具有合適功能的殘基取代至少一種特定殘基或通過導入帶電荷功能基團，諸如穀氨酸根或天冬氨酸根，或也許是芳香族非極性殘基，諸如苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸或丙氨酸而改變該親和性(參見例如US 5,624,821)。
例如在該IgG恆定區內以丙氨酸取代殘基297(天冬醯氨)可顯著抑制效應細胞的募集，且僅稍微減少(約弱3倍)對Clq的親和性(參見例如US5,624,821)。這類殘基在重鏈中的編號為EU索引的編號(見上文，Kabat等人，1991)。此改變破壞糖基化位點且據信碳水化合物的存在為FC受體結合作用所需。據信於該位點的破壞糖基化作用的任何其它取代會導致溶解活性的類似降低。也已知，例如殘基318(Glu)、320(Lys)及322(Lys)的任一種改變為Ala的其它胺基酸取代可破壞Clq與IgG抗體的FC區的結合(參見例如US5,624,821)。
可製備與FC受體的相互作用較低的修飾的抗體。例如已經證明結合至人類FCγR1受體的人類IgG3中的Leu 235改變為Glu將破壞其與受體的相互作用。抗體鉸鏈連接區的鄰接或接近位點上的突變可用於影響抗體對FCγR1受體的親和性。該殘基在重鏈內的編號是根據EU索引(見上述Kabat等人，1991)。
改變抗體溶解活性的另外方法，例如改變CH2結構域的N末端區域內的至少一種胺基酸的方法描述在WO 94/29351(頒予Morgan等人)及US5,624,821。
本發明抗體可用可檢測或功能性標籤標記。這些標籤包括放射性標記(例如131I或99Tc)、酶促的標記(例如辣根過氧化物酶或鹼性磷酸酶)，及其它化學部分(例如生物素)。
本發明的特徵也為結合至IL-22，特別是結合至人IL-22的分離抗體。在特定實施方案中，抗IL-22抗體可具有至少一種以下特徵(1)其是單克隆或單一特異性抗體；(2)其是人抗體；(3)其是體外產生的抗體；(4)其是體內產生的抗體(例如轉基因小鼠系統)；(5)其結合至IL-22，且結合常數為至少1012M-1；(6)其結合至IL-22，且結合常數為至少1011M-1；(7)其結合至IL-22，且結合常數為至少1010M-1；(8)其結合至IL-22，且結合常數為至少109M-1；(9)其結合至IL-22，且結合常數為至少106M-1；(10)其結合至IL-22，且解離常數為500nM或較少；(11)其結合至IL-22，且解離常數為10nM或較少；(12)其結合至IL-22，且解離常數為150pM或較少；(13)其結合至IL-22，且解離常數為60pM或較少；(14)以IC50為10nM或較少下，其抑制IL-22結合至IL-22R或IL-22R及IL-10R2的受體複合物；(15)在一個實施方案中，在IC50為1nM或較少下；在另一個實施方案中，在IC50為150pM或較少下；在另一個實施方案中，在IC50為100pM或較少下；在另一個實施方案中，在IC50為10pM或較少下，其阻斷IL-22受體改造的BaF3細胞的經IL-22調節的增殖；及(16)在一個實施方案中，在IC50為1nM或較少下；在另一個實施方案中，在IC50為150pM或較少下；且在另一個實施方案中，在IC50為10pM或較少下，其阻斷IL-22調節的自HT29分泌GROa。
本領域技術人員可知上述修飾並非窮舉的，且根據本公開內容的教導，許多其它修飾為熟練的技術人員所知。
III.核酸、克隆及表達系統 本公開內容提供編碼所公開抗體的分離核酸。核酸可包含DNA或RNA，且其可以是合成(完全或局部)或重組(完全或局部)的。如文中公開的核苷酸序列包括具有特定序列的DNA分子，且包括具有其中以U取代T的特定序列的RNA分子。
也提供的核酸包含編碼如文中公開的1、2或3個CDR、VH結構域、VL結構域或其組合的序列或實質上與其相同的序列(例如與其具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的序列或於嚴謹條件下可與所公開序列雜交的序列)。
在一個實施方案中，分離核酸具有編碼具有至少一個選自下述胺基酸序列的CDR的抗IL-22抗體的重鏈及輕鏈可變區的核苷酸序列SEQ IDNO8-13、26-31、44-49、62-67、80-85、98-103、116-121、134-139、152-157、170-175、188-193、206-211、224-229、242-247、260-265、278-283、296-301、314-319、332-337、350-355、368-373、386-391、404-409、422-427、440-445、458-463、476-481、494-499、512-517、530-535、548-553、566-571、584-589、602-607或620-625的胺基酸序列；或具有編碼與文中所述的序列相差1或2個胺基酸的CDR的序列。
核酸可僅編碼輕鏈或重鏈可變區或也編碼有效地與對應可變區連接的抗體輕或重鏈恆定區。在一個實施方案中，輕鏈可變區與選自κ或λ恆定區的恆定區連接。該輕鏈恆定區也可以是人類κ或λ類型。在另一個實施方案中，重鏈可變區與選自IgG(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、IgM、IgA1、IgA2、IgD，及IgE的抗體同種型的重鏈恆定區連接。
本發明核酸組合物(雖然除了經修飾的限制位點及諸如此類外，其通常為cDNA或基因組DNA或其混合物的天然序列)可根據標準技術而經突變以得到基因序列。就編碼序列而言，如所期望的這些突變作用可影響胺基酸序列。更詳細地涵蓋實質上與天然V、D、J、恆定的、轉換的、及文中所述的其它此類序列相同或自其衍生的核苷酸序列，其中「衍生」表示與另一序列相同或自其修飾的序列。
在一個實施方案中，核酸與所提供的序列的核酸不同，例如由於取代、插入或缺失不同而產生差異，例如相差至少一個但小於10、20、30或40個核苷酸；至少一個但小於該實驗對象核酸中核苷酸的1％、5％、10％或20％。就分析而言，若必要，應對序列進行比對以獲得最大同源性。自缺失或插入或錯配而「圈出(loop out)」的序列被認為有差異。該差異可以是編碼非必需殘基的核苷酸或該差異可以是保守取代。
該公開內容也提供質粒、載體、轉錄或表達盒形式的核酸構建體，其包含至少一種如文中所述的核酸。
該公開內容進一步提供一種宿主細胞，其包含至少一種文中所述的核酸構建體。
也提供自含文中所述序列的核酸製備所編碼的蛋白質的方法。該方法包括於合適條件下培養宿主細胞以使其自核酸表達蛋白質。在表達及製備後，可使用任何合適技術分離和/或純化VH或VL結構域或特定結合部分，然後使用。方法也可包括以下步驟融合編碼scFv的核酸與編碼抗體Fc部分的核酸，並在細胞內表達該融合核酸。該方法也可包括進行種系化的步驟。
抗原結合片段、VH和/或VL結構域，及編碼核酸分子與載體可自其天然環境以實質上純或均質形式(或就核酸而言，無或實質上無不同於編碼所期望功能的多肽的序列來源的核酸或基因)而分離和/或純化。
用於在各種宿主細胞內克隆或表達多肽的系統在本領域中是已知。適於產生抗體的細胞描述在例如Fernandez等人(1999)Gene ExpressionSystems，Academic Press編著中。簡言之，合適的宿主細胞包括哺乳動物細胞、昆蟲細胞、植物細胞、酵母細胞或原核性細胞，例如大腸桿菌(E.coli)。適用於本領域進行異源多肽表達的哺乳動物細胞包括淋巴細胞系(例如NSO)、HEK 293細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、COS細胞、HeLa細胞、幼倉鼠腎細胞、卵母細胞，及得自轉基因動物的細胞，例如乳腺上皮細胞。在一個實施方案中，GIL01、GIL16、GIL45、GIL60、GIL68、GIL92、097D09、062A09、062G05、087B03、367D04、368D04、166B06、166G05、375G06、376B10、354A08、355B06、355E04及356A11抗體在HEK293或CHO細胞內表達。在另一個實施方案中，選自365A11、354A08、087B03及368D04的抗體在HEK293或CHO細胞內表達。在其它實施方案中，編碼本發明抗體的核酸受組織特異性啟動子(例如乳腺特異性啟動子)的調控，且抗體在轉基因動物體內產生。例如抗體是分泌入該轉基因動物(諸如轉基因牛、豬、馬、綿羊、山羊或齧齒目動物)的奶內。
可選用或構成以含有合適調控序列的合適載體，調控序列包括啟動子序列、終止子序列、聚腺苷酸化序列、增強子序列、標記序列及其它序列。載體亦可含有質粒或病毒骨架。就細節而言，見Sambrook等人，MolecularCloningA Laboratory Manual，第2版，Gold Spring Harbor Laboratory Press(1989)。使用載體的許多已確認技術(包括DNA操作、製備、誘變、測序及轉染)描述在Current Protocols in Molecular Biology，第2版，Ausubel等人編著，John Wiley & Sons(1992)中。
本公開內容的另一方面是提供一種將核酸導入宿主細胞內的方法。就真核細胞而言，合適的轉染技術可包括磷酸鈣、DEAD-葡聚糖、電穿孔、脂質體介導的轉染，及使用反轉錄病毒或其它病毒(例如牛痘或杆狀病毒)的轉導。就細菌細胞而言，合適的技術可包括氯化鈣轉化、電穿孔及使用噬菌體的轉染。DNA導入後可進行選擇方法(例如抗藥性)以選擇含有該核酸的細胞。
IV.抗IL-22抗體的用途 可使用作為IL-22拮抗劑的抗IL-22抗體以調節至少一種IL-22介導的免疫應答，諸如在實體組織內的上皮細胞上作用，且間接地調節下遊免疫應答，諸如阻斷T細胞亞群(包括例如TH17T細胞)的擴張。在一個實施方案中，本發明抗體用於調節免疫應答的方法中，該方法包括使IL-22接觸本發明抗體，由此調節免疫應答。在一個實施方案中，免疫應答包括細胞增殖、細胞溶解活性、細胞因子分泌或趨化因子分泌。
因此，本發明抗體可用以直接或間接抑制免疫或造血細胞(例如脊髓、淋巴或紅細胞譜系的細胞或其前體細胞)的活性(例如增生、分化和/或存活)，且因此可用以治療各種免疫病症及過度增生性病症。可治療的免疫病症的非限制性實例包括但不限於自身免疫病症，例如關節炎(其包括類風溼性關節炎、幼年型類風溼性關節炎、骨關節炎、銀屑病關節炎，與狼瘡有關的關節炎或強直性脊椎炎)、硬皮病、系統性紅斑狼瘡、HIV、舍格倫症候群、血管炎、多發性硬化、自身免疫性甲狀腺炎、皮炎(其包括特應性皮炎及溼疹性皮炎)、重症肌無力、炎症性腸病(IBD)、節段性迴腸炎、結腸炎、糖尿病(I型)；炎症例如皮膚的炎症(例如牛皮癬)、心血管系統的炎症(例如動脈粥樣硬化)、神經系統的炎症(例如阿爾茨海默病)、肝的炎症(例如肝炎)、腎的炎症(例如腎炎)及胰臟的炎症(例如胰腺炎)；心血管疾病，例如膽固醇代謝病、氧自由基損傷、局部缺血；與創傷癒合相關的病症；呼吸系統病症，例如哮喘及COPD(例如囊性纖維化)；急性炎症(例如內毒素血症、膿毒症及敗血症、中毒性休克症候群及感染性疾病)；移植排斥及過敏。在一個實施方案中，與IL-22相關的病症為關節炎的病症，例如選自以下的一或多種的關節炎類風溼性關節炎、幼年型類風溼性關節炎、骨關節炎、銀屑病關節炎或強直性脊椎炎；呼吸系統病症(例如哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD))；或例如以下的炎症皮膚的炎症(例如牛皮癬)、心血管系統的炎症(例如動脈粥樣硬化)、神經系統(例如阿爾茨海默病)、肝的炎症(例如肝炎)、腎的炎症(例如腎炎)、胰臟的炎症(例如胰腺炎)，及胃腸器官的炎症(例如結腸炎)、節段性迴腸炎及IBD；急性炎症，例如內毒素血症、膿毒症及敗血症、中毒型休克症候群及感染疾病；多器官衰竭；呼吸性疾病(ARD)；澱粉樣變性病；腎病，諸如腎小球硬化、膜狀神經病變、腎動脈硬化、腎小球腎炎、腎的纖維增生疾病，以及其它腎機能異常及腎腫瘤。由於IL-22對上皮細胞有影響，所以可使用抗IL-22抗體以治療上皮癌，例如癌、黑素瘤及其它。就在這些及其它病症中IL-22抑制作用的理論說明而言，見WO 03/083062(第58至75頁)。
多發性硬化為中樞神經系疾病，其特徵為髓鞘(其是保護神經且為合適神經機能所需的脂肪物質)的發炎及損失。起因於依賴IL-22的免疫應答的發炎可用本發明抗體及組合物治療。在適於多發性硬化的實驗性自身免疫性腦炎(EAE)的小鼠模型(Tuohy等人(J.Immunol.(1988)1411126-1130)、Sobel等人(J.Immunol.(1984)1322393-2401)，及Traugott(Cell Immunol.(1989)119114-129))中，在EAE誘導前注射GIL01、GIL16、GIL45、GIL60、GIL68、GIL92、097D09、062A09、062G05、087B03、367D04、368D04、166B06、166G05、375G06、376B10、354A08、355B06、355E04或356A11以治療小鼠可顯著地延緩疾病的發作。其可作為確認本發明抗體用途的模型。同樣可使用本發明抗體以治療人類的多發性硬化。
關節炎的特徵為關節的炎症。類風溼性關節炎(RA)為關節炎的最常發形式，其包括結締組織及滑膜(其是沿關節排列的膜)的發炎。發炎的滑膜通常可浸潤關節並損害關節軟骨及骨組織。IL-22及IL-22蛋白和/或轉錄物與這兩種人類的疾病有關聯。在RA滑液活檢物中，IL-22蛋白在波形蛋白+(vimentin+)滑液成纖維細胞及一些CD68+巨噬細胞內檢測到，而IL-22R是在滑液成纖維細胞內檢測到。以IL-22治療滑液成纖維細胞誘發單核細胞化學誘質蛋白質-1(MCP-1)的產生，以及一般的代謝活性(Ikeuchi，H.，等人(2005)Arthritis Rheum.521037-46)。IL-22的抑制劑改善類風溼性關節炎的症狀(WO 2005/000897 A2；美國專利6,939,545)。可以使用本發明抗體治療炎性細胞因子及趨化因子分泌的增加，且更重要的是，可治療增加的起因於依賴IL-22的免疫應答疾病。類似地，本發明抗體及組合物可用以治療人類RA及其它關節炎疾病。
移植非斥為其中得自供體的組織受宿主免疫細胞特異性地「攻擊」的免疫學現象。主要「攻擊」細胞為T細胞，其T細胞受體把供體的MHC分子認為是「外來者」。此識別作用活化T細胞，使其增殖並分泌最後破壞移植物的各種細胞因子及細胞溶解的蛋白質。MLR及移植模型已經在以下參考文獻說明Current Protocols in Immunology，第2版，Coligan等人編著，JohnWiley & Sons，1994；Kasaian等人(Immunity(2002)16559-569)；Fulmer等人(Am.J.Anat.(1963)113273-285)，及Lenschow等人(Science(1992)257789-792)。本發明抗體及組合物可用以減少MLR並治療依賴IL-22的人類的移植排斥及相關疾病(例如移植物抗宿主病)。
本發明抗體也可用以治療與IL-22-反應性細胞及IL-22R/IL-10R2-反應性細胞的異常活性有關的過度增生性病症，其是通過施用足量的抗體以抑制或減少受試者體內IL-22和/或IL-22R和/或IL-10R2-反應性細胞的過度增生，因而使得抗體治療或預防病症。IL-22及IL-22R在許多組織(包括胰臟、肺、皮膚、腸、肝臟、腎)的上皮細胞中組成型表達(Kotenko，S.V.等人(2001)J.Biol.Chem.2762725-32；Xie，M.H.等人(2000)J.Biol.Chem.27531335-9；Wolk，K.等人(2004)Immunity 21241-54)。此外，IL-22受體複合物也在得自已生病關節及正常腸的成纖維細胞的表面上表達(Ikeuchi，H.等人(2005)Arthritis Rheum.521037-46；Andoh，A.等人(2005)Gastroenterology 129969-84)。這些細胞類型的瘤性衍生物可以對IL-22具高反應性，因此可調節這些細胞在生物內的存活能力。所以可使用IL-22的抗體以抑制此類贅生物，例如鱗狀細胞癌、基底細胞癌、移行細胞乳頭狀瘤及癌、腺瘤、腺癌、皮革狀胃、胰島腺瘤、胰升糖素瘤、胃泌素瘤、血管活性腸多肽瘤、膽管癌、肝細胞癌、囊腺癌、闌尾類癌瘤、催乳素瘤、嗜酸粒細胞瘤、胡爾特爾細胞腺瘤、腎細胞癌、格拉韋茨瘤、多發性內分泌腺瘤、子宮內膜樣腺瘤(endometroid adenoma)、子宮附件及皮膚附件瘤、黏液上皮瘤、囊狀的，黏液蛋白狀的及漿液狀瘤、囊腺瘤、腹膜假黏液瘤、導管狀，小葉狀及髓狀瘤、腺泡細胞瘤、複合上皮瘤、沃辛瘤、胸腺瘤、特殊的性腺瘤、生殖索基質瘤、泡膜細胞瘤、粒層細胞瘤、男性細胞瘤、塞-萊細胞瘤、嗜鉻細胞瘤、嗜鉻細胞瘤、血管球腫瘤、黑素細胞痣、惡性黑素瘤、黑素瘤、結節型黑素瘤、發育不良的痣、惡性雀斑樣痣、表淺蔓延型黑素瘤或肢端色斑樣黑素瘤。雖然在離體天然或活化免疫細胞上並末檢測出IL-22受體，但是受體的失調可能使此類衍生性瘤性細胞對IL-22有反應且因此通過IL-22的抗體而抑制。
本發明另一方面的特徵為降低、抑制或減少受試者的急性期反應的方法。該方法包括向受試者施用如文中所述的抗IL-22抗體或其片段，其施用量足以降低、抑制或減少該受試者的急性期反應。在一個實施方案中，該受試者為哺乳動物，例如罹患如文中所述與IL-22相關的病症(包括例如呼吸系統病症、炎症及自體免疫病)的人類。在一個實施方案中，以口服例如局部、皮下或非用在全身循環中的其它投藥方法施用IL-22結合劑。
據信IL-22可局部性地發揮其發炎作用，例如與直接全身性作用不同，其通過以組織炎症的調節劑或調整劑的形式作用(例如直接作用)。因此使用，例如本發明抗IL-22抗體以抑制IL-22活性可得到比全身性消炎用藥方式更有效(例如低毒性)的組織特異性消炎劑。而且，使用例如文中所述的抗IL-22抗體或其片段以抑制局部IL-22可得到適於與全身性消炎用藥方式聯合使用的有用候選物。
V.聯合治療 在一個實施方案中，在聯合治療中施用包含至少一種抗IL-22抗體及至少一種治療劑的藥物組合物。該治療用於治療病理症狀或病症，諸如免疫及炎症。本文的術語「聯合使用」意指實質上同時期(同時或連續)施用抗體組合物及治療劑。在一個實施方案中，若連續施用，則於第二種化合物開始施用時，於治療的位點仍可檢測到有效濃度的這兩種化合物中的第一種化合物。在另一個實施方案中，若連續施用，則於第二種化合物開始施用時，於治療的位點並未檢測到有效濃度的這兩種化合物中的第一種化合物。
例如聯合治療可包括與至少一種其他其它治療劑共配製，和/或共施用的至少一種抗IL-22抗體。其它藥劑可包括如下文更詳述的至少一種細胞因子抑制劑、生長因子抑制劑、免疫抑制劑、消炎劑、代謝抑制劑、酶抑制劑、細胞毒劑及細胞生長抑制劑。在一個實施方案中，該其它藥劑為用於治療關節炎的標準藥劑，其包括但不限於非類固醇類消炎劑(NSAID)；皮質類甾醇，其包括潑尼松龍、潑尼松、可的松及去炎松；及疾病改進的抗風溼病藥劑(DMARD)，諸如氨甲蝶呤、羥氯喹(硫酸羥氯喹)及柳氮磺吡啶、來氟米特(來氟米特(Arava))；腫瘤壞死因子抑制劑，其包括伊那西普(etanercept)(Enbrel)、英夫單抗(Remicade)(具或未具有氨甲蝶呤)，及阿達木單抗(adalimumab)(Humira)抗Cd20抗體(例如靈吐忍(Rituxan))；可溶性白介素-1受體，諸如阿那白滯素(anakinra)(Kineret)、金、二甲胺四環素(鹽酸二甲胺四環素)、青黴胺，及細胞毒劑，包括硫唑嘌呤、環磷醯胺及環孢黴素。此類聯合治療可有利地使用較低劑量的所施用治療劑，因此可避免與各種單一療法有關的毒性或併發症。而且，文中所公開的其它治療劑可在IL-22/IL-22R/IL-10R2途徑之外或與其不同的途徑上作用，因此已預期增強抗IL-22抗體的作用和/或與其產生協同作用。
與抗IL-22抗體一起使用的治療劑可以是於自體免疫的不同階段及後續發炎反應中進行幹涉的藥劑。在一個實施方案中，至少一種文中所述的抗IL-22抗體可以與至少一種細胞因子和/或生長因子拮抗劑共配製，和/或共施用。拮抗劑可包括可溶性受體、肽抑制劑、小分子、配體融合物、抗體及其結合片段(其結合細胞因子或生長因子或其受體或其它細胞表面分子)，及「消炎細胞因子」及其激動劑。
可與文中所述的抗IL-22抗體聯合使用的藥劑的非限制性實例包括，但不限於以下至少一種的拮抗劑白介素(例如IL-1、IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-12(或其亞基p35或p40之一)、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17A-F(包括其異源二聚體，例如IL-17A/IL-17F異源二聚體)、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21及IL-23(或其亞基p19或p40之一))；細胞因子(例如TNFα、LT、EMAP-II及GM-CSF)；及生長因子(例如FGF及PDGF)。藥劑也可包括，但不限於白介素、細胞因子及生長因子的至少一種受體的拮抗劑。抗IL-22抗體也可與以下細胞表面分子的抑制劑(例如抗體或其結合片段)諸如CD2、CD3、CD4、CD8、CD20(例如靈吐忍)、CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、CD80(B7.1)、CD86(B7.2)、CD90或其配體(例如CD154(gp39、CD40L))，或LFA-1/ICAM-1及VLA-4/VCAM-1聯合使用(Yusuf-Makagiansar等人(2002)Med Res Rev22(2)146-67)。在特定實施方案中，可以與文中所述的抗IL-22抗體聯合使用的拮抗劑可包括以下的拮抗劑IL-1、IL-12(或其亞基p35或p40之一)、TNFα、IL-15、IL-17A-F(包括其異源二聚體，例如IL-17A/IL-17F異源二聚體)、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21及IL-23(或其亞基p19或p40之一)及其受體。
此類藥劑的實例包括IL-22拮抗劑(諸如結合IL-22的抗體(參見例如WO00/56772)或其亞基p35或p40之一)；IL-12受體抑制劑(諸如IL-12受體的抗體)；及可溶性IL-12受體及其片段。IL-15拮抗劑的實例包括抗IL-15或其受體的抗體、IL-15受體的可溶性片段及IL-15結合蛋白質。IL-18拮抗劑的實例包括IL-18的抗體、IL-18受體的可溶性片段，及IL-18結合蛋白質(IL-18BP，Mallet等人(2001)Ci rc.Res.28)。IL-1拮抗劑的實例包括白介素-1-轉化酶(ICE)抑制劑(諸如Vx740)、IL-1拮抗劑(例如IL-1RA(ANIKINRA(或Kineret)、AMGEN))、sIL-1R II(Immunex)及抗IL-1受體抗體。
在一個實施方案中，聯合治療包括至少一種與抗IL-22抗體共配製，和/或共施用的拮抗劑，諸如IL-17A、IL-17F、IL-17A/IL-17F異源二聚體或IL-23(或其亞基p19或p40之一)的至少一種的抗體或其抗原結合片段或可溶性受體。
TNF拮抗劑的實例包括TNF(例如人TNFα)的抗體，諸如D2E7(人類抗TNFα抗體，美國專利6,258,562，HumiraTM，BASF)；CDP-571/CDP-870/BAY-10-3356(人源化抗TNFα抗體，Celltech/Pharmacia)；cA2(嵌合型抗TNF抗體，RemicadeTM，Centocor)；及抗TNF抗體片段(例如CPD870)。其它實例包括可溶性TNF受體(例如人類p55或p75)片段及衍生物，諸如p55kd TNFR-IgG(55kD TNF受體-IgG融合蛋白，LenerceptTM)及75kd TNFR-IgG(75kD TNF受體-IgG融合蛋白，EnbrelTM，Immunex，參見例如Arthritis & Rheumatism(1994)第37卷，S295；J.Invest.Med.(1996)第44卷，235A)。其它實例包括酶拮抗劑(例如TNFα轉化酶抑制劑(TACE)，諸如α-磺醯基氧肟酸衍生物(WO 01/55112)或N-羥基甲醯胺抑制劑(GW3333、-005或-022))及TNF-bp/s-TNFR(可溶性TNF結合蛋白質，參見例如Arthritis & Rheumatism(1996)第39卷，第9期(增補)，S284；及Am.J.Physiol.Heart Circ.Physiol.(1995)第268卷，pp37-42)。TNF拮抗劑可以是可溶性TNF受體(例如人類p55或p75)片段及衍生物，諸如75kd TNFR-IgG；及TNFα轉化酶(TACE)抑制劑。
在其它實施方案中，文中所述的抗IL-22抗體可以與下述的至少一種一起施用IL-13拮抗劑，諸如可溶性IL-13受體和/或抗IL-13抗體；及IL-2拮抗劑，諸如IL-2融合蛋白(例如DAB 486-IL-2和/或DAB 389-IL-2，Seragen，參見例如Arthritis & Rheumatism(1993)第36卷，1223)及抗IL-2R抗體(例如抗Tac(人源化抗體，Protein Design Labs，見Cancer Res.1990 Mar 1；50(5)1495-502))。另一種聯合包括抗IL-22抗體與非耗盡性抗CD4抗體，諸如IDEC-CE 9.1/SB 210396(抗CD4抗體，IDEC/Smithkline)的組合。又一個其它組合包括抗IL-22抗體與共刺激性分子(諸如CD80(B7.1)及CD86(B7.2))的拮抗劑(諸如抗體、可溶性受體或拮抗性配體)；ICOSL、ICOS、CD28及CTLA4(例如CTLA4-Ig(atabacept))；P-選擇蛋白糖蛋白配體(PSGL)；及消炎性細胞因子及其激動劑(例如抗體)的組合。消炎性細胞因子可包括IL-4(DNAX/Schering)；IL-10(SCH52000、重組IL-10、DNAX/Schering)；IL-13；及TGF。
在其它實施方案中，至少一種抗IL-22抗體可以與至少一種消炎藥、免疫抑制劑、代謝抑制劑及酶抑制劑共配製，和/或共施用。可與文中所述的IL-22拮抗劑聯合使用的藥物或抑制劑的非限制性實例包括，但不限於以下的至少一種非類固醇類消炎藥(NSAID)(諸如異丁苯丙酸(ibuprofen)、替尼達普(參見例如Arthritis & Rheumatism(1996)第39卷，第9期(增補)，S280))、萘普森(參見例如Neuro Report(1996)第7卷，pp.1209-1213)、美洛昔康、吡羅昔康、雙氯酚酸鈉，及吲哚美辛；柳氮磺吡啶(參見例如Arthritis& Rheumatism(1996)第39卷，第9期(增補)，S281)；皮質類甾醇(諸如潑尼松龍)；細胞因子抑制性消炎藥(CSAID)；及核苷酸生物合成的抑制劑(諸如嘌呤生物合成的抑制劑(例如葉酸鹽拮抗劑，諸如氨甲蝶呤)及嘧啶生物合成的抑制劑(例如二氫乳清酸脫氫酶(DHODH)抑制劑，諸如來氟米特(參見例如Arthritis & Rheumatism(1996)第39卷，第9期(增補)，S131；InflammationResearch(1996)第45卷，pp.103-107))。適用於與IL-22/IL-22R或IL-22/IL-10R2拮抗劑聯合使用的治療劑可包括NSAID、CSAID、DHODH抑制劑(諸如來氟米特)，及葉酸鹽拮抗劑(諸如氨甲蝶呤)。
其它抑制劑的實例包括以下的至少一種皮質類甾醇(口服、吸入及局部注射)；免疫抑制劑(諸如環孢黴素)及他克莫司(tacrolimus)(FK-506))；mTOR抑制劑(諸如西羅莫司(瑞帕黴素)或瑞帕黴素衍生物(例如酯類瑞帕黴素衍生物，諸如CCI-779(Elit.L.(2002)Current Opinion Investig.Drugs 3(8)1249-53；Huang，S.等人(2002)Current Opinion Investig.Drugs 3(2)295-304)))；可幹擾促炎細胞因子信號傳送(諸如TNFα及IL-1)的藥劑(例如IRAK、NIK、IKK、p38或MAP激酶抑制劑)；COX2抑制劑(例如塞來昔布(celecoxib)及其變體(MK-966)，參見例如Arthritis & Rheumatism(1996)第39卷，第9期(增補)，S81)；磷酸二酯酶抑制劑(例如R973401，參見例如Arthritis & Rheumatism(1996)第39卷，第9期(增補)，S282)；磷脂酶抑制劑(例如胞質磷脂酶2(cPLA2)，諸如三氟甲基酮類似物(U.S.6,350,892))；血管內皮細胞生長因子(VEGF)的抑制劑；VEGF受體的抑制劑；及血管發生的抑制劑。適於與抗IL-22抗體聯合使用的治療劑可包括免疫抑制劑(諸如環孢黴素及他克莫司(FK-506))；及mTOR抑制劑(諸如西羅莫司(瑞帕黴素)或瑞帕黴素衍生物(例如酯瑞帕黴素衍生物，諸如CCI-779))；COX2抑制劑(諸如塞來昔布及其變體)；及磷脂酶抑制劑(諸如胞質磷脂酶2(cPLA2)的抑制劑(例如三氟甲基酮類似物))。
可以與至少一種抗IL-22抗體共施用和/或共配製的治療劑實例包括，但不限於以下的至少一種TNF拮抗劑(諸如抗TNF抗體)；TNF受體(例如人類p55及p75)的可溶性片段及其衍生物(諸如p55kd TNFR-IgG(55kD TNF受體-IgG融合蛋白，LenerceptTM)及75kd TNFR-IgG(75kD TNF受體-IgG融合蛋白，EnbrelTM))；TNF酶拮抗劑(諸如TACE抑制劑)；IL-12(或其亞基p35或p40之一)、IL-15、IL-17A-F(包括其異源二聚體，例如IL-17A/IL-17F異源二聚體)、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22及IL-23(或其亞基p19或p40之一)的拮抗劑；T細胞及B細胞清除劑(depleting angent)(諸如抗CD4或抗CD22抗體)；小分子抑制劑(諸如氨甲蝶呤及來氟米特)；西羅莫司(瑞帕黴素)及其類似物(諸如CCI-779)Cox-2及cPLA2抑制劑；p38、TPL-2、Mk-2及MFκB抑制劑；RAGE及可溶性RAGE；P-選擇蛋白及PSGL-1抑制劑(諸如其抗體及小分子抑制劑)；及雌激素受體β(ERB)激動劑及ERB-NFkb拮抗劑。可以與至少一種抗IL-22抗體共施用和/或共配製的治療劑可包括以下的至少一種TNF受體(例如人類p55或p75)的可溶性片段，諸如75kdTNFR-IgG(75kD TNF受體-IgG融合蛋白，EnbrelTM)；氨甲蝶呤；來氟米特；及西羅莫司(瑞帕黴素)及其類似物(諸如CCI-779)。
文中公開的IL-22抗體可以與其它治療劑聯合使用以治療如下文更詳細討論的特異性免疫病症。
可與抗IL-22抗體聯合使用以治療關節炎病症(例如類風溼性關節炎、發炎性關節炎、幼年型類風溼性關節炎、骨關節炎及銀屑病關節炎)的藥劑的非限制性實例包括以下的至少一種TNF拮抗劑(諸如抗TNF抗體)；TNF受體(例如人類p55及p75)的可溶性片段及其衍生物(諸如p55kd TNFR-IgG(55kD TNF受體-IgG融合蛋白，LenerceptTM)及75kd TNFR-IgG(75kD TNF受體-IgG融合蛋白，EnbrelTM))；TNF酶拮抗劑(諸如TACE抑制劑)；以下的拮抗劑IL-12(或其亞基p35或p40之一)、IL-15、IL-17A-F(包括其異源二聚體，例如IL-17A/IL-17F異源二聚體)、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23(或其亞基p19或p40之一)及IL-24；T細胞及B細胞清除劑(諸如抗CD4、抗CD20或抗CD22抗體)；小分子抑制劑(諸如氨甲蝶呤及來氟米特)；西羅莫司(瑞帕黴素)及其類似物(例如CCI-779)；Cox-2及cPLA2抑制劑；NSAID；p38、TPL-2、Mk-2及NFκB抑制劑；RAGE或可溶性RAGE；P-選擇蛋白或PSGL-1抑制劑(諸如小分子抑制劑及其抗體)；雌激素受體β(ERB)激動劑及ERB-NFκB拮抗劑。可以與至少一種IL-22/IL-22R/IL-10R2拮抗劑共施用和/或共配製的治療劑可包括以下的至少一種TNF受體(例如人類p55或p75)的可溶性片段，諸如75kd TNFR-IgG(75kD TNF受體-IgG融合蛋白，EnbrelTM)；氨甲蝶呤；來氟米特；及西羅莫司(瑞帕黴素)或其類似物(例如CCI-779)。
可與抗IL-22抗體聯合使用以治療多發性硬化的藥劑的非限制性實例包括幹擾素-β(例如IFN β-1a及IFN β-1b)、格拉太咪爾(copaxone)、皮質類甾醇、IL-1抑制劑、TNF抑制劑、CD40配體的抗體、CD80的抗體及IL-12拮抗劑，其包括結合IL-12(或其亞基p35或p40之一)的抗體。
可與抗IL-22抗體聯合使用以治療炎症性腸病或節段性迴腸炎的藥劑的非限制性實例包括布地萘德(budenoside)；上皮細胞生長因子；皮質類甾醇；環孢黴素；柳氮磺吡啶；對氨水楊酸煙肼；6-巰基嘌呤；硫唑嘌呤；甲硝唑；脂肪加氧酶抑制劑；美沙拉秦；奧沙拉嗪；巴柳氮(balsalazide)；抗氧化劑；凝血(thromboxane)抑制劑；IL-1受體拮抗劑；抗IL-1單克隆抗體；抗IL-6單克隆抗體；生長因子；彈性蛋白酶抑制劑；吡啶基咪唑化合物；如文中所述的TNF拮抗劑；IL-4、IL-10、IL-13，和/或TGFβ或其激動劑(例如激動劑抗體)；IL-11；潑尼松龍、地塞米松或布地萘德的葡糖苷酸-或聚葡萄糖-綴合前藥；ICAM-1反義硫代磷酸寡脫氧核苷酸(ISIS 2302；IsisPharmaceuticals，Inc.)；可溶性補體受體1(TP10；T Cell Sciences，Inc.)；慢釋放的美沙拉秦(mesalazine)；氨甲蝶呤；血小板活化因子(PAF)的拮抗劑；環丙沙星；及利多卡因。
在其它實施例中，抗IL-22抗體可與至少一種針對涉及調節免疫應答(例如移植排斥或移植物抗宿主病)的其它靶標抗體聯用。可與本發明IL-22/IL-22R/IL-10R2拮抗劑聯合使用以治療免疫應答的藥劑的非限制性實例包括以下抗細胞表面分子的抗體，其包括但不限於CD25(IL-2受體α)、CD11a(LFA-1)、CD54(ICAM-1)、CD4、CD45、CD28/CTLA4、CD80(B7-1)、CD86(B7-2)或其組合。在另一個實施方案中，抗IL-22抗體與至少一種常用免疫抑制劑(諸如環孢黴素A或FK506)一起使用。
因此，本發明另一方面涉及實現抗IL-22抗體與其它治療劑聯合給藥的藥盒。在一個實施方案中，該藥盒包含至少一種配製於藥學載體中的抗IL-22抗體，及至少一種適當地配製於一或多種不同藥學製劑中的治療劑。
VI.診斷用途 抗體也可用以檢測IL-22在生物樣品中的存在。通過使這些蛋白質的含量與病況的相互關聯，本領域技術人員可診斷有關的病症。例如IL-22誘發與通過發炎性細胞因子(諸如IL-1及TNFα)而導致的病症有關的變化，且IL-22的抑制劑可改善類風溼性關節炎的症狀(WO 2005/000897A2)。可通過本發明抗體而診斷的代表性病症包括多發性硬化、類風溼性關節炎、牛皮癬、炎症性腸病、胰腺炎及移植排斥。
在本領域中已熟知基於抗體的檢測方法，且包括ELISA、放射免疫分析、免疫印跡法、西方印跡法(Western blot)、流式細胞術法、免疫螢光、免疫沉澱及其它相關技術。可在包含至少一種這些方法的診斷試劑盒中提供抗體以檢測IL-22。該試劑盒可含有其它組分、包裝材料、說明書或有助於檢測該蛋白質及試劑盒使用的其它材料。
抗體可被可檢測標記(包括配體基團(例如生物素)、螢光團及發色團、放射性同位素、電子稠密劑(electron-dense reagents)或酶修飾。酶是通過其活性而檢測。例如辣根過氧化物酶是通過其將四甲基聯苯胺(TMB)轉化成藍色顏料的能力而檢測，使用分光光度計定量。其它合適的結合配偶體包括生物素及抗生物素蛋白、IgG及蛋白質A，及本領域中已知的其它受體-配體對。
抗體也可以與至少一種其它分子實體(包括諸如另一種抗體(例如雙特異性或多特異性抗體)、毒素、放射性同位素、細胞毒劑或細胞生長抑制劑)功能性連接(例如通過化學偶聯、基因融合、非共價結合或其它方法)。其它置換法及可能使用的方法為一般技術人員所知，且這些方法被視為屬於本發明範圍的同等物。
VII.藥物組合物及給藥方法 本發明特定實施方案包括含所公開抗體的組合物。組合物可適於藥學用途及向病患施用。組合物包含本發明的抗體及藥學輔藥。如文中使用，「藥學輔藥」包括溶劑、分散介質、塗料、抗細菌劑、抗真菌劑、等滲壓劑及吸收延緩劑等，這些輔藥皆可以與藥學給藥相容。本領域技術人員已熟知這些適用於藥學活性物質的試劑。組合物也可含有提供補充性、其它的或增強治療功能的其它活性化合物。藥物組合物也可包含具有給藥說明的容器、小包或配藥器中。
本發明藥物組合物是經配製而適合其計劃的給藥方式。進行給藥的方法為本領域普通技術人員所知。可局部或以口服方式或能夠通過黏膜輸送的方式而施用藥物組合物。藥物組合物的給藥實例包括口服或吸入。也可進行靜脈、腹膜內、肌內、腔內、皮下、皮膚或經皮給藥。
用於皮內或皮下給藥的溶液或懸浮液通常包括以下組分的至少一種無菌稀釋劑，諸如水、鹽水溶液、不揮髮油類、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶劑；抗細菌劑，諸如苯甲醇或對羥基苯甲酸甲酯；抗氧化劑，諸如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑，諸如乙二胺四乙酸(EDTA)；緩衝劑，諸如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽；及滲性劑(tonicity agents)，諸如氯化鈉或右旋糖。該pH可經酸或鹼調整。此類製劑可包封在小玻璃管、一次性注射器或多劑量小玻瓶 用於靜脈給藥的溶液或懸浮液包括載體，諸如生理鹽水、制菌劑、Cremophor ELTM(BASF，Parsippany，NJ)、乙醇或多元醇。就一切情況而言，該組合物必需無菌且為容易注射的流體。通常可使用卵磷脂或表面活化劑以獲得合適流動性。在製備及貯存的條件下，組合物也必需具穩定性。可使用抗細菌劑及抗真菌劑(例如對羥基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、酚、抗壞血酸、硫柳汞(thimerosal)等)以防止微生物。在許多情況下，組合物可包含等滲劑(糖)、多元醇(甘露糖醇及山梨糖醇)或氯化鈉。可通過添加能延緩吸收的藥劑(例如單硬脂酸鋁及明膠)而延長組合物的吸收。
口服組合物包括惰性稀釋劑及食用載體。可將組合物包封在明膠內或壓制在片劑內。就口服而言，抗體可與輔藥合併，然後放入片劑、含片或膠囊內。組合物可包含藥學上相容的結合劑或佐劑物質。片劑、含片及膠囊可含有(1)結合劑，諸如微晶纖維素、西黃蓍膠或明膠；(2)輔藥，諸如澱粉或乳糖；(3)崩解劑，諸如褐藻酸、Primogel或玉米澱粉；(4)潤滑劑，諸如硬脂酸鎂；(5)助流劑，諸如膠態二氧化矽；或(6)甜味劑或調味劑。
也可通過經黏膜或經皮方式而施用組合物。例如含Fc部分的抗體可穿越腸、口或肺(通過Fc受體)內的黏膜。可通過使用錠劑、鼻腔噴霧劑、吸入器或栓劑而進行經黏膜給藥。也可通過使用含本領域已知的油膏、軟膏、凝膠或乳膏的組合物而進行經皮給藥。就經黏膜或經皮給藥而言，使用適於待滲透屏障的滲透劑。就吸入給藥而言，自含有推進劑(例如液體或氣體)或霧化器的加壓容器或分配器以噴霧劑形式遞送抗體。
在特定實施方案中，使用保護抗體免於自身體快速消除的載體製備本發明抗體。通常使用生物可分解的聚合物(例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯(polyorthoesters)、聚乳酸)。此類配方的製法為本領域技術人員所知。脂質體懸浮液也可作為可藥用載體。可根據本領域中已確定的方法製備脂質體(美國專利4,522,811)。
本發明抗體或抗體組合物以如所述的治療有效量施用。治療有效量可根據病患年齡、病況、性別，及病情的嚴重性而不同。醫生根據臨床指徵而決定合適劑量。可以以團注劑量提供抗體或組合物而使最長時間下的抗體的循環量最大化。該團注劑量後，也可使用連續輸注。
如文中使用，該術語「病患」是有意包括人類及非人類動物。病患可包括罹患以表達IL-22的細胞(例如癌細胞或免疫細胞)為特徵的病症的人類病患。本發明術語「非人類動物」包括所有脊椎動物，諸如非人類的靈長類、棉羊、狗、牛、雞、兩棲動物、爬行動物等。
可向病患施用的劑量範圍的實例可選自1μg/kg至20mg/kg、1μg/kg至10mg/kg、1μg/kg至1mg/kg、10μg/kg至1mg/kg、10μg/kg至100μg/kg、100μg/kg至1mg/kg、250μg/kg至2mg/kg、250μg/kg至1mg/kg、500μg/kg至2mg/kg、500μg/kg至1mg/kg、1mg/kg至2mg/kg、1mg/kg至5mg/kg、5mg/kg至10mg/kg、10mg/kg至20mg/kg、15mg/kg至20mg/kg、10mg/kg至25mg/kg、15mg/kg至25mg/kg、20mg/kg至25mg/kg及20mg/kg至30mg/kg(或更高)。根據劑量、給藥方法、欲治療的病症或症狀及個別病患的特徵，這些劑量可每日、每周、雙周、每月或較低頻率，例如一年兩次施用。也可通過連續輸注(諸如通過泵)而施用劑量。所施用劑量也可取決於給藥途徑。例如皮下給藥所需的劑量高於靜脈給藥。
在特定情況下，最好可以以劑量單位形式配製組合物以容易給藥及獲得該劑量的均勻性。如文中使用的劑量單立形式是指適於病患的實際上各別的單位。各劑量單位含有經計算可產生治療作用的預定量抗體與載體。該劑量單位取決於抗體的特徵及欲獲得的特定治療作用。
可在細胞培養物或實驗動物中通過標準藥學方法而測定組合物的毒性及治療效力，例如測定LD50(50％群體致死的劑量)及ED50(50％群體有治療效果的劑量)。毒性作用與治療作用間的劑量比為治療指數且其可以以LD50/ED50的比率表示。具有大治療指數的抗體可以具低毒性和/或更具治療上有效性。
可使用得自細胞培養物分析及動物研究的資料以配製適用於人類的劑量範圍。這些化合物的劑量在於血液內循環抗體濃度的範圍內，其包括幾乎沒有或無毒性的ED50。根據所使用劑量組合物形式及給藥途徑，劑量在該範圍內可不同。就用於本發明的任何抗體而言，可首先使用細胞培養物分析法以估計治療有效劑量。可以在動物模型中調配劑量以獲得包括IC50(即獲得症狀的最大抑制作用半數的抗體濃度)的循環血漿濃度。通過合適生物分析法而監測任何特定劑量的效用。合適的生物分析法的實例包括DNA複製分析、基於轉錄的分析、IL-22/IL-22R結合分析、IL-22/IL-10R2結合分析、IL-22/IL-22R/IL-10R2及其它免疫學分析法。
實施例 實施例1抗IL-22scFv’s的選擇 親本GIL01及GIL68的選擇 通過在IL-22上進行可溶性選擇而自scFv文庫分離GIL01及GIL68。使用生物素醯化的IL-22及N-末端His/FLAG標記的蛋白質(bio.IL-22H/F)進行可溶性選擇。首先使用100nM濃度的Bio.IL-22H/F。使用scFv噬菌粒文庫，其是所述該1.38×1010文庫(Vaughan等人，1996)的擴增版，以選擇對IL-22具特異性的抗體。在100μl 3％ MPBS(3％奶粉的PBS溶液)內封閉純化scFv噬菌體(1012轉導單位(tu))30分鐘，然後添加bio.IL-22H/F並於室溫下培育1小時。添加噬菌體/抗原至50μl Dynal M280鏈黴抗生物素(Streptavidin)磁珠(其已經於37℃下在1ml 3％ MPBS中封閉一小時)，然後於室溫下再培育15分鐘。使用磁性裝置架捕獲磁珠並在1ml 3％ MPBS/0.1％(v/v)Tween 20內洗滌4次，繼而在PBS中洗滌3次。最後一次洗滌後，使磁珠再懸浮於100μl PBS內，並用以感染5ml指數生長期的大腸桿菌TG-1細胞。於37℃下培育磁珠上的細胞及噬菌體一小時(30分鐘靜止，於250轉/分鐘下搖動30分鐘)，然後塗布在2TYAG平皿上。於30℃下過夜培育平皿，並於隔天可視菌落。並將平板上菌落刮落移入10ml 2TY肉湯內並添加15％甘油以方便於-70℃下貯存。
使得自第一輪淘選的甘油儲備培養物經輔助噬菌體超感染並復甦以得到適用於第二輪選擇的scFv抗體表達噬菌體顆粒。如上述進行第2及第3輪可溶性選擇，使bio.IL-22H/F的濃度降至50nM。
親本GIL16、GIL45、GIL60及GIL92的分離 通過在IL-22融合蛋白進行淘選及在bio.IL-22H/F上進行可溶性選擇的組合而自scFv文庫分離GIL16、GIL45、GIL60及GIL92。以10μg/ml(Dulbecco氏PBS，pH 7.4)人IL-22融合蛋白包被微量滴定板的各孔並於4℃下培育過夜。在PBS內洗滌各孔並於37℃下在3％ MPBS中封閉2小時。添加純化噬菌體(1012tu)的100μl 3％MPBS溶液至封閉的各孔並於室溫下培育一小時。以PBST(含0.1％v/v Tween 20的PBS)洗滌各孔共10次，然後以PBS洗滌10次。於37℃下以100μl胰蛋白酶溶液(在50mM Tris pH8、1mM CaCl2內的0.5μg/ml胰蛋白酶)洗脫結合的噬菌體顆粒30分鐘。使用該洗脫的噬菌體感染10ml指數期生長的大腸桿菌TG1。如上述，於37℃下使感染的細胞在2TY肉湯內生長一小時，然後在2TYAG平皿上劃線接種並於30℃下培育一夜。自平皿刮落長出菌落並如上述復甦噬菌體。使用100nM bio.IL-22H/F，如上述進行第二輪可溶性選擇。
實施例2ScFv阻斷IL-22與IL-22R的結合 在親本抗體GIL01、GIL16、GIL45、GIL60、GIL68及GIL92上進行抑制試驗以鑑定阻斷或改變IL-22結合至IL-22R和/或IL-22受體複合物的抗體。篩選含scFv的胞質粗提物的抑制bio.IL-22H/F結合至人IL-22受體蛋白質(hIL-22R)的能力。將自選擇法長出的菌落挑取入含100μl 2TYAG的96孔平皿內。通過添加1mM IPTG至指數生長期的培養物內並於30℃下培育一夜而誘發ScFv的產生。在50mM MOPS(pH 7.4)/0.5mM EDTA/0.5M山梨糖醇內製備胞質提取物(Griffiths等人，1993)。
於室溫下以1.25μg/ml的IL-22受體蛋白質抗體(在PBS中)包被微量滴定板1.5小時。然後在PBS中洗滌板共3次，並於室溫下用含2％奶粉的PBS(2％MPBS)封閉一小時。再洗滌3次後，添加含IL-22受體蛋白質的50μl25％細胞條件培養基至各孔，並於4℃下培養一夜。隔天，添加25μl樣品及25μl bio.IL-22H/F(在PBS/0.05％ BSA/0.05％ Tween中54ng/ml)至該洗滌的板內，並於室溫下培養1.5小時。在PBST中洗滌3次後，以銪-鏈黴抗生物素檢測bio.IL-22H/F的結合作用，並以

試劑試劑盒及Victor 2TMPlate Reader(Perkin Elmer)檢測TRF。
如純化的scFv，再測試顯示抑制IL-22結合的克隆。使用該IL-22/IL-22R結合分析(如上述)及IL-22/IL-22受體複合物分析(如下述)。用滴定法測定ScFv濃度以確認如通過分析IC50值所測定的克隆效價。使用GraphPad Prism軟體及四參數邏輯方程曲線擬合法以測定這些效價。得自IL-22受體複合物分析的試樣結果示於圖1中。
實施例3通過噬菌體ELISA而證實IL-22的結合作用 為確定scFv’s對IL-22的特異性，使用IL-22融合蛋白、IL-22H/F及非相關蛋白質進行噬菌體ELISA。在每孔含100μl 2TYAG培養基的96孔板內接種含噬菌粒的單個大腸桿菌菌落。添加M13K07輔助噬菌體至指數生長期的培養物內，使感染複數(moi)達到10，並於37℃下再培育板一小時。在臺式離心機內以2000轉/分鐘離心處理板10分鐘。移除上清液並使細胞沉澱再懸浮於100μl 2TYAK中，然後在搖動下，於30℃培育一夜。隔天，以2000轉/分鐘離心處理板10分鐘，並將得自各孔的100μl含噬菌體的上清液移至新的96孔板內。於室溫下在最終濃度為3％MPBS內封閉噬菌體樣品一小時。
以1μg/ml IL-22融合蛋白、IL-22H/F或不相關蛋白質包被微量滴定板並於40℃下培養一夜。包被後，自各孔移除溶液，並於室溫下在3％ MPBS中封閉板一小時。以PBS衝洗板，然後添加50μl預封閉的噬菌體至各孔內。於室溫下培育板一小時，然後先後經3種改變的PBST及3種改變的PBS洗滌。添加50μl抗M13-HRP綴合物(Pharmacia)的1:5000稀釋液至各孔內，並於室溫下培育該板一小時。將板用PBST洗滌3次，然後用PBS洗滌3次。添加50μlTMB底物至各孔內並進行培育，直到顯色為止。通過添加25μl的0.5M H2SO4而中止該反應，且測定於450nm下的吸光度。這些實驗確認scFv克隆對IL-22的特異性結合作用。
實施例4scFv轉化成IgG 以克隆特異性引物擴增得自scFv克隆的重及輕鏈V區。以合適限制酶消化PCR產物並亞克隆入含有人類IgG4重鏈恆定結構域(就VH結構域而言)的載體內或若合適，克隆入含有人類λ或κ輕鏈恆定結構域(就VL結構域而言)的載體內。測定VH及VL片段最接近的人類種系化物並使用該數據以表明是使用κ還是λ輕鏈恆定結構域(表4)。通過將得自個別大腸桿菌菌落的質粒DNA測序而證實V區域結構域正確地插入質粒內。通過標準技術從大腸桿菌培養物製備質粒，並使用標準技術將重及輕鏈構建體共轉染入HEK 293EBNA細胞內。使用蛋白質A瓊脂糖(Pharmacia)並將緩衝劑換成PBS而純化分泌的IgG。
表4IL-22中和克隆的VH及VL種系化物 在如下述的生物化學IL-22受體複合物抑制試驗中證實純化IgG的效價。以滴定法測定IgG濃度以獲得效價值。樣品效價數據示於表5內。
表5IL-22scFv及IgG在IL-22受體複合物抑制作用試驗中的效價 實施例5最優化IL-22抗體 基本上如Hanes等人(2000)所述，產生並篩選大核糖體展示文庫的特異性識別重組人IL-22的scFv’s。首先使5種親本克隆(GIL01、GIL16、GIL60、GIL68及GIL92)轉化成核糖體展示格式，接著使用該模板產生文庫。在DNA水平，添加T7啟動子於5′-端以有效轉錄為mRNA。在mRNA水平，為了獲得mRNA穩定性構建體而包含原核性核糖體結合位點(Shine-Dalgarno序列)及5′&3′莖環。在單鏈的3′末端處，移除終止密碼子並添加一部分gIII以作為間隔物以允許離開核糖體管道的scFv摺疊(Hanes等人，2000)。
衍生自前導克隆的核糖體展示文庫通過使用具有非校正讀碼Taq DNA聚合酶的PCR進行該單鏈互補決定區的誘變而產生。進行基於親和性的選擇法，其中文庫是先後與bio.IL-22H/F及鏈黴抗生物素包被的順磁性小珠(Dynal M280)培育。通過磁性分離法而回收三聚複合物(mRNA-核糖體-scFv)，並洗掉未結合複合物。然後通過如所述的RT-PCR而救回編碼結合scFvs的mRNA(Hanes等人，2000)，並在減少bio.IL-22H/F的濃度(在5輪操作內自100nM減至10pM)下，重複選擇方法。
引入易錯PCR以進一步增加文庫大小。根據Cadwell及Joyce的方法(1992)，所使用的錯誤率在標準PCR反應後產生每1,000bp平均7.2次突變。在第一及第二輪選擇間進行初次易錯PCR反應。
在進行第二或第四輪選擇後，自VH及VL CDR核糖體展示技術產物製備各親本克隆的VH/VL重組文庫。使用克隆特異性引物使特定譜系的VH CDR選擇產物的VH部分經PCR特異性擴增。分別擴增相同譜系的VL CDR選擇產物的VL部分。通過重疊PCR反應而重組這兩種PCR產物。其可產生含所有再進行核糖體展示技術選擇所需組分的scFv產物的完整文庫。
就某些克隆而言，也使用噬菌體展示文庫。使用具合適引物的PCR反應通過單鏈CDR的誘變而產生噬菌體文庫，並如上述進行選擇。這些產物也與核糖體展示技術選擇產物組合以產生VH/VL重組文庫。得自第四輪核糖體展示技術的VH選擇產物及得自第三輪噬菌體展示技術的產物與得自相同譜系的VL產物重組。使用克隆特異性引物及重疊PCR以產生VH/VL重組文庫。如上所述，在核糖體展示格式中持續進行使用可溶性bio.IL-22H/F的選擇。將選擇產物的scFv區定向插入pCANTAB6中以產生適於生物化學高通量篩選的scFv產物。
實施例6最優化克隆的鑑定 使用兩種分析法以進行選擇產物的高通量篩選。在均相性時間分辨螢光分析法(homogeneous time resolved fluorescence assay)

CisBiointernational)中篩選衍生自GIL01、GIL16及GIL68的產物，而在

(Perkin Elmer)分析法中篩選GIL60及GIL92產物。
HTRF

表位競爭分析法 如上述製備含得自GIL01、GIL16及GIL68產物克隆的粗scFv培養物上清液，並在HTRF分析中篩選bio.IL-22H/F結合GIL68的抑制作用。
在分析緩衝劑(PBS/0.4M KF/0.05％ BSA/0.05％ Tween)中將Cryptate標記的GIL68 IgG(得自Cis Biointernational的標記試劑盒)稀釋400倍，繼而添加7.5nM鏈黴抗生物素XL665(Xlent，Cis Biointernational)。使溶液在Packardblack 384 well Optiplate(Perkin Elmer)中與粗scFv樣品(稀釋125倍)，及bio.IL-22H/F混合。於室溫下培育板一小時，然後使用Victor 2TM板測讀機(PerkinElmer)讀取。使用665nM/620nM發射光比以計算各孔中特異性結合的百分比。


時間分辨的螢光分析法 篩選GIL60及GIL92產物克隆對bio.IL-22H/F與IL-22受體複合物結合的抑制。
以IL-22受體複合物抗體(在PBS中1μg/ml)包被微量滴定板，並於室溫下培養1.5小時。在PBST中洗滌板共3次，並於室溫下用2％ MPBS封閉一小時。再進行3次洗滌後，添加含IL-22受體複合物的稀釋的細胞條件培養基並於4℃下培育一夜。如上述製備粗ScFv上清液。隔天，添加25μl稀釋的scFv樣品及25μl bio.IL-22H/F(6ng/ml)至洗滌的板內，並於室溫下培育1.5小時。在PBST中洗滌板共3次，然後使用銪-鏈黴抗生物素及

試劑試劑盒(Perkin Elmer)以檢測bio.IL-22H/F與IL-22受體複合物的結合作用。使用Victor 2TM板式測讀機(Perkin Elmer)測定時間分辨的螢光。
在如上述的

IL-22受體複合物競爭試驗中測試得自經篩選所確認的陽性克隆的純化scFv。使用scFv濃度的滴定測量法以確認如通過試驗中的IC50值而測定的克隆效價。樣品結果示於圖2中。14種最優化克隆被稱為097D09、062A09、062G05、087B03、367D04、368D04、166B06、166G05、375G06、376B10、354A08、355B06、355E04及356A11。
實施例7最優化克隆在BAF3-IL-22增殖試驗中的分級 進行增殖試驗以評估抗體阻斷IL-22介導的BaF3細胞增殖的能力。通過用hIL-22R-GFP及hIL10R2-YFR共轉染BaF3細胞而產生表達hIL22R/hIL10R2的BaF3細胞。通過FACS分選並收集表達hIL22R及hIL10R2(BaF3-IL-22受體細胞)的BaF3細胞。
在具有10％FBS及1ng/ml鼠IL-3的RPMI1640內常規維持BaF3-IL-22受體細胞。試驗開始前不久，在試驗培養基(具有10％ FBS、100U/ml青黴素及100μg/ml鏈黴素的RPMI 1640)中洗滌細胞共4次，懸浮在試驗培養基內並於37℃、5％CO2下培育6至8小時。為了製備試驗板，添加100μl細胞(在試驗培養基中1×105個/ml)至96孔平底組織培養板(Costar)的中央60孔內。通過在試驗培養基內稀釋儲備樣品，繼而通過0.22μM濾器過濾而製備測試scFv或IgG樣品。在分別的稀釋板中製備連續5倍的樣品稀釋液。先後以50μl樣品及50μl人IL-22(在試驗培養基內40ng/ml)處理含細胞的各孔，然後於37℃在5％CO2下培育40小時。對照孔僅包含培養基及僅包含細胞或在10ng/ml人IL-22的存在下包含細胞。
添加20μlAlamar藍(Serotec)至各孔中，繼而於37℃在5％CO2下培育5小時±30分鐘而檢測細胞增殖。在進行螢光測定(激發光＝560nm，發射光＝590nm)前，溫和輕拍而混合板以確保信號均勻地遍及各孔。使用4參數邏輯曲線擬合法(Graphpad Prism 2軟體)以估計EC50及IC50值，並使用該值對抗體評定分級。最優化的scFv及IgG的樣品效價數據示於表6中。
表6.在BaF3-IL-22增殖試驗中的scFv及IgG克隆的IC50值 ★GIL92衍生的克隆如種系化IgG而檢測。
實施例8種系化 使用6種親本克隆的序列數據以確認各克隆重鏈及輕鏈的最接近種系序列。使用標準定點誘變以合適誘變引物進行合適的突變。通過測序而確認序列的突變。種系化克隆及其scFV與VH及VL結構域的序列示於表7中。在如先前所述的生物素醯化的IL-22結合IL-22受體複合物競爭試驗中測試得自種系化親本克隆的純化scFv，以確立如通過在試驗中的IC50值而測定的克隆效價。結果總結在表8內。
表7A種系化抗體(GIL01、GIL16、GIL45、GIL60、GIL68、GIL92、062A09及087B03)的VH及VL結構域、Fv及CDR的胺基酸及核苷酸序列 表7B種系化抗體(166B06、166G05、354A08、355B06、355E04、356A11及368D04)的VH及VL結構域、Fv及CDR的胺基酸與核苷酸序列 表8在IL-22受體競爭試驗中非種系化及種系化親本克隆的ScFv效價
如上述將9種最優化抗體種系化。在如上述的BaF3-IL-22增殖試驗中測試8種種系化IgG。得自代表性實驗的抗體IC50值示於表9中。
然後將抗體序列送至GENEART North America(28 Kirk Bradden Rd.East，Toronto，ON，Canada M8Y2E6)，在那裡使用GENEART的專利最優化算法合成用於在CHO細胞中最優化表達的抗體。
表9在BaF3-IL-22R增殖試驗中，種系化的最優化克隆的IgG效價 ★樣品含有沉澱物 ND＝未測定 實施例9抗體抑制IL-22誘導的HT29細胞分泌GROa 進行GRO試驗以評估抗體阻斷IL-22誘導的HT29細胞分泌GRO的能力。將HT29細胞接種在含DMEM培養基(DMEM+10％ FBS+100U/ml青黴素及鏈黴素+2mM穀氨醯胺)的96孔平底組織培養板(Corning Inc.Cat.#3595)內(5×104個/孔)。在DMEM培養基內使10ng/ml IL-22與經系列稀釋的抗體混合併於37℃下培育30分鐘。接種後24小時，自HT29細胞移除培養基，並添加預混的IL-22及抗體到96孔板的細胞內。
於37℃在5％ CO2下培育48小時後，收集培養基並使用人GROa免疫分析試劑盒(R&D Systems，Cat.DGR 00)，根據廠商的指示以測試分泌的GROa。結果示於圖3中。
實施例10抗體結合併抑制不同物種的IL-22 測定種系化及非種系化的最優化抗體的跨物種反應性的方法如下以1μg/ml大鼠、小鼠或人IL-22或人IL-26在PBS緩衝劑中的溶液包被ELISA板(Costar，Cat.#3590)一夜。將板用PBST緩衝劑(PBS中含0.05％ Tween 20)洗滌3次，然後於室溫下用1％ BSA(Sigma A8918)/PBST封閉一小時。以1μg/ml的濃度添加抗體，於25℃下培育一小時。洗滌板，然後添加HRP綴合的山羊抗人IgG抗體(Southern Biotech Association，Cat.#2040-05)。於25℃下培育板一小時，然後用PBST洗滌，並用TMB(KPL，Cat.#50-76-04)顯色。以0.18M H2SO4中止反應。於OD 450nm下讀取板。結果示於圖4中。
也在GROa細胞試驗及BaF3-22增殖試驗中評估這些抗體。如表10(a)及10(b)中所示，抗體阻斷人類、猴子、大鼠及小鼠IL-22通過人IL-22受體的信號傳送活性。如實施例11中進一步所討論，使用實時生物特異性相互作用試驗(BIA)，也證明356A11及368D04對鼠、大鼠及猴子IL-22具跨物種反應性。
表10(a).如在基於GROa細胞的分析系統中所示，IL-22抗體能強有力地阻斷其它物種的IL-22。所示數值代表以pM表示的IC50值。
表10(b).如在基於BaF3細胞的分析系統中所示，IL-22抗體能強有力地阻斷其它物種的IL-22。所示數值代表以pM表示的IC50值。
實施例11比較大鼠抗IL-22單克隆抗體與人抗IL-22單克隆抗體的結合動力學 通過實時生物特異性相互作用試驗(BIA)，使用表面等離振子共振技術以評估人類單克隆抗IL-22抗體(356A11及368D04)及大鼠單克隆抗IL-22抗體(得自WO 2005/000897及WO 02/068476的P3/3(Ab-02)與P3/2(Ab-04))對人IL-22的結合動力學。
為了製備適於大鼠單克隆抗體的生物傳感器表面，使用胺偶合法將蛋白質A/G(Pierce #21186，Rockford，IL)固定在研究級羧甲基葡聚糖晶片(CM5)上。以EDC/NHS活化該表面。以50μg/ml的濃度注入蛋白質A/G乙酸鈉緩衝劑(pH 4.0)。以蛋白質A/G的3000(RUs)為目的，使用精靈工具(wizardtools)進行固定化作用。以1.0M乙醇胺(pH 8.0)封閉剩下的活化基團。使用第一個流動細胞作為參考表面以校正整體折射率、基質效應及非特異性結合。以捕獲分子包被第2、第3及第4個流動細胞。通過注入30μl的1μg/ml溶液而在蛋白質A/G表面上捕獲結合蛋白質A/G的大鼠單克隆抗體Ab-02及Ab-04。完成Ab-02或Ab-04注入後，基線與約90秒的時間點間的淨差異代表配體結合的量。
為了製備適於人類單克隆抗體的生物傳感器表面，使用標準胺偶合法將人單克隆抗體(356A11或368D04)或對照抗體固定在研究級羧甲基葡聚糖晶片(CM5)上。以EDC/NHS活化該表面。以1μg/ml的濃度將捕獲抗體乙酸鈉緩衝劑(pH 5.5)注入。以1.0M乙醇胺(pH 8.0)封閉剩下的活化基團。使用第一個流動細胞作為參考表面以校正整體折射率、基質效應，及非特異性結合。以捕獲分子包被第2、第3及第4個流動細胞。
就Ab-02及Ab-4而言，於每分鐘30μl的流速一份三次，注入300、100、50、25、12.5、6.4、3.2、1.6及0nM濃度的人IL-22溶液，費時3分鐘，且記錄作為時間函數的結合物質的量以作為感應圖。於相同的流速下在HBS/EP緩衝劑中監測解離相10分鐘，繼而注射5μl的0.1％ TFA及5μl的甘氨酸(pH 1.5)以再生完全活性的捕獲表面。
就356A11及368D04而言，於每分鐘100μl的流速(高流量可避免非特異性結合)下以一份三次，注入400、200、100、50、25、12.5、6.25及0nM濃度的人IL-22溶液，費時3分鐘，並記錄以時間為函數的結合物質的量以作為感應圖。於相同的流速下在HBS/EP緩衝劑中監測解離相60分鐘，繼而注射5μl甘氨酸(pH 1.5)共兩次以再生完全性的捕獲表面。
於22.5℃下在HBS/EP緩衝劑內進行所有動力學實驗。使用雙參考分析，自各感應圖減掉空白及緩衝劑效應。在對照實驗中，第一次注射包含緩衝劑。
使用適用1:1模型的BIA評估軟體3.0.2分析動力學數據。使用整體分析，自感應圖的合適區域計算出表觀解離(Kd)及結合(Ka)率常數。通過以下公式而自動力速率常數計算出抗體與分析物相互作用的親和性常數KD＝Kd/Ka，其中KD為解離常數，且KA＝Ka/Kd，其中KA為結合常數，Ab-02及Ab-04的結合數據總結在表11A及11B中。356A11及368D04的結合數據總結在表12中。
表11A.人IL-22與抗IL-22抗體Ab-02及Ab-4的相互作用的動力學參數 表11B.用於人IL-22的大鼠單克隆抗體的動力學數據 表12.用於人IL-22的人類單克隆抗體的動力學數據 這些結果顯示本發明人單克隆抗IL-22抗體對人IL-22的親和性顯著高於如WO 2005/000897及WO 02/068476中所述可中和人IL-22的大鼠單克隆抗IL-22抗體，Ab-02及Ab-04。更明確地，356A11對人IL-22的解離常數(KD＝5.40×10-11M或0.054nM)分別比Ab-02(KD＝5.22×10-8M或52nM)及Ab-04(KD＝2.38×10-9M或2.38nM)大約1000倍或超過40倍。類似地，368D04(KD＝1.32×10-10M或0.132nM)對人IL-22的親和性分別比Ab-02及Ab-04強約400倍及18倍。356A11及368D04對猴子、鼠及大鼠IL-22的結合特性與其對人IL-22的結合特性類似(未顯示數據)。
也使用BIA評估356A11及368D04的結合特異性。任一種抗體皆無顯示與人類IL-10、人類IL-19、人類IL-20、人類IL-24、人類IL-28A、人類IL-29、人類IFN-α2c或人類IFN-ω的交叉反應(未顯示數據)。
實施例12抗人IL-22抗體的體內半衰期 本發明抗人IL-22抗體具有長的體內半衰期。例如356A11及368D04在DBA/1小鼠中的體內半衰期為8天。更明確地，對DBA/1小鼠以腹膜內注射的方式施用356A11或368D04的單一劑量(16mg/kg)。使用人類IgG1 ELISA，自小鼠的血清檢測出356A11及368D04抗體。356A11及368D04血清濃度的時間過程示於圖11A及11B中。356A11及368D04的PK參數總結在下表13中。
表13.356A11及368D04的PK參數 實施例13關節炎的治療 關節炎的特徵為關節發炎。類風溼性關節炎(RA)為最常見的關節炎形式，其包括結締組織及滑膜(其是沿關節排列的膜)的炎症。已發炎的滑膜通常浸潤關節並損害關節軟骨及骨組織。IL-22及IL-22R蛋白質和/或轉錄物皆與人類疾病有關。在RA滑液活體組織檢查中，在波形蛋白+滑液成纖維細胞及一些CD68+巨噬細胞中檢測出IL-22蛋白，而在滑液成纖維細胞中檢測出IL-22R。以IL-22治療滑液成纖維細胞誘導了單核細胞化學誘質蛋白質-1(MCP-1)，以及一般的代謝活性產生(Ikeuchi，H等人(2005)Arthritis Rheum.521037-46)。
使用IL-22以研究其對得自滑膜(沿關節排列的膜)的細胞的影響。自進行關節手術的類風溼性關節炎病患的滑液組織分離人類成纖維細胞樣的滑膜細胞(HFLS)(Cell Applications(San Diego，CA))。使HFLS與人IL-22培養48小時，移除上清液並通過ELISA而測試趨化因子及細胞因子。IL-22可增加HFLS分泌趨化因子(MCP-1、嗜酸細胞活化趨化因子(Eotaxin)及IP-10)，及細胞因子(TNFα、IL-6及IL-8)。在本領域中已知這些趨化因子及細胞因子可通過許多活性而引起發炎，且由IL-22導致的關節內其濃度的增加將使炎症及RA惡化。
使用356A11及368D04抗體以檢查人類抗IL-22抗體改善膠原誘導的關節炎(CIA)的症狀的能力。CIA為用於研究類風溼性關節炎的標準小鼠及大鼠模型，參見例如Holmdahl等人，(2002)Ageing Res.Rev.，1135。第0天時，以皮下注射方式對雄性DBA/1(Jackson Laboratory，Bar Harbor，Maine)小鼠尾的基部注射100μg在完全弗氏佐劑中的牛II型膠原(Chondrex，Redmond，WA)，並在第21天時，再對小鼠注射100μg在不完全弗氏佐劑中的牛II型膠原以用以加強。
至少每周兩次監測小鼠的疾病演變過程。使用總爪評估將該疾病嚴重性評分如下0＝無腫脹，1＝1至2已腫脹趾或已腫脹踝，2＝超過2個已腫脹趾或輕度的爪腫脹，3＝嚴重(extensive)的爪腫脹，4＝爪關節強直。膠原注射後，注射同種型對照抗體的小鼠漸進性地發展出疾病。使用356A11或368D04進行治療可顯著減少疾病演變。以上為盲試驗，因此研究者並不清楚哪組動物接受哪種抗體，直到研究結束為止。
評估不同劑量356A11及368D04。當治療組中10％小鼠的疾病嚴重性評估為至少1時，開始進行356A11或368D04(或人類IgG1λ同種型對照抗體)的治療。以各種頻率施用抗體每隔一天，每周一次或每周兩次，且監測小鼠的疾病演變。如在圖12A-B、13及40-41中所示，在多項研究中，每隔一天施用8或16mg/kg的356A11可顯著阻斷CIA的演變。4個分別的CIA研究(圖13A-D)，每隔一天以8mg/kg的356A11進行測試顯示在鼠CIA模型中，356A11抗體可一致性地阻斷疾病演變。令人驚訝的是，如圖14-15、41及44A-B中所示，在多項研究中，每周兩次且甚至每周一次施用8mg/kg的356A11也足以顯著地阻斷疾病演變。
在使用368D04(每隔一天施用16mg/kg)進行的第一次CIA研究中，幾乎未或者沒有發現有效性。然而，在如圖46A-C中所示，在多項研究中，每周一次施用8mg/kg的368D04可顯著地阻斷疾病演變。
當在CIA模型中進行每周一次給藥時，人類抗IL-22抗體可顯著阻斷疾病演變的能力表示當對人類施用時，可以以類似的給藥頻率或甚至更延長的給藥頻率，諸如每兩周一次，施用抗體。
也通過爪的組織病理分析而評估抗IL-22抗體的療效。於研究結束時，使動物安樂死，採取爪，並經10％福馬林固定以進行組織研究，脫鈣並包埋於石蠟中以進行切片及標準H&E染色。根據5級記分法(0至4)對該爪記分以表徵關節炎的強度及程度。除了與諸如血管翳形成、滑膜的纖維狀、關節軟骨腐損和/或軟骨下的骨質破壞的炎症有關的其它變化外，使用發炎性浸潤物以進行評分。使用各爪的讀數以決定組織學等級NAD＝0或未發現異常；1＝輕微至中度；2＝輕度至中度；3＝顯著；4＝嚴重。抗IL-22抗體治療性給藥的組織效應示於圖16A-F、42A-C、43及45A-B中。如圖16A-F、42A-C、43及45A-B所示，在多項研究中，施用356A11改善了小鼠的膠原誘導的關節炎症狀。類似地，在多項研究中，每隔一天施用8mg/kg的368D04改善了小鼠的膠原誘導的關節炎症狀，見圖47A-C。
除了組織病理評估外，也檢查經治療小鼠的骨質破壞。於研究結束時，將爪以側位固定並使用Faxitron機器取得X射線照片。Faxitron提供高分辨X射線照片，且高放大能力提供增加的影像性能。Faxitron X射線照片與目測總爪評分相關聯，且表明與使用同種型對照抗體(未顯示數據)進行治療比較，使用抗IL-22抗體進行治療防止了骨質破壞。
實施例14通過ELISA進行血清IL-22的檢測及使用356A11體內處理的血清IL-22的增加性檢測 至今，IL-22基因表達的檢測僅已經在RNA水平報告。使用下述的ELISA，在正常小鼠中並未能檢測出IL-22。然而，我們已發現此ELISA可檢測罹患關節炎小鼠的體內循環中的IL-22。而且，給藥356A11抗體可檢測含量高10倍的IL-22。於所示劑量下的356A11抗體螯合(sequestered)細胞因子，因此中和其如先前實施例中所示的活性。由於該抗體在血流內循環，所以使用此ELISA可檢測較高含量的經抗體螯合的IL-22。其是起因於構成MIL-22 ELISA的捕獲抗體與檢測抗體的獨特及不同表位。該ELISA可同等地檢測IL-22/356A11、IL-22BP/IL-22、IL-22BP/356A11/IL-22及裸露IL-22。
就先前討論的CIA研究(實施例13)而言，每隔一天以16mg/kg的356A11抗體治療罹患關節炎的小鼠。於膠原加強後第30天時，在宰殺後，自小鼠收集血清。然後通過ELISA而測定IL-22在血清樣品中的含量。
就ELISA方式而言，將1mGIL 19P3/1，其是大鼠IgG 1κ單克隆抗鼠IL-22抗體，包被在96孔微量滴定ELISA板上以作為捕獲抗體。連續稀釋得自罹患關節炎小鼠的血清樣品，然後添加至包被的微量滴定板上。在微量滴定板內使樣品與1mGIL 19P3/1培育後，洗滌板，並添加2hmGIL 19P3/5-bio(其是與生物素綴合的大鼠IgG2ak單克隆抗IL-22抗體)至板以作為檢測抗體。經另一次培育及洗滌步驟後，添加綴合鏈黴抗生物素的辣根過氧化物酶(HRP)(其可將四甲基聯苯胺(TMB)轉化成藍色色素且可經分光光度計定量)，培養並洗滌板。在經TMB最後培育，繼而添加稀H2SO4以停止酶促的反應後，使用分光光度計測定450nm的吸光度。或者，且由於該檢測抗體的同種型(大鼠IgG2ak)不同於包被的抗體同種型，所以也可使用與大鼠IgG2a結合的經HRP-綴合的二抗。使用該夾層ELISA，我們已證明添加增量的mIL-22BP和/或356A11並不會影響其檢測固定濃度的鼠IL-22的能力。已使用此ELISA檢測小鼠在i.p(腹膜內)LPS注射後的血清中的IL-22。
如上述，當對CIA小鼠施用356A11抗體時，在血清內檢測出的IL-22含量範圍為約1ng/ml至約9ng/ml。見圖17。相反地，接受人類IgG1λ同種型對照抗體的對照治療組中，罹患關節炎小鼠的IL-22的體內含量明顯較低(小於1ng/ml)。見圖17及18。因此，356A11抗體捕獲體內IL-22以產生能循環的穩定的抗體/細胞因子複合物。如圖16所示，其隨後允許在增高的靈敏性下檢測體內IL-22。與用於上述研究中的大量抗體不同，已提議也可施用相當低量的356A11且具有相同效果。
實施例15牛皮癬的治療 使用定量PCR測定得自人牛皮癬病患的成對組織樣品(損害對非損害)的IL-22及IL-22R的RNA含量。該研究證實在牛皮癬損害中，IL-22及IL-22R的含量被上調。見圖19。其它證據表示IL-22與牛皮癬的形成有關。例如組成性表達IL-22的轉基因小鼠會產生厚皮、單核免疫細胞浸潤(其是牛皮癬損害的特徵)並在出生後不久即死亡。見WO 03/083062。類似地，對小鼠施用IL-22可誘導皮膚的增厚及單核免疫細胞浸潤。見WO 03/083062。IL-22也誘導人類角化細胞增生，表明IL-22在皮膚發炎過程中起重要作用。見Boniface等人，J.Immunol.，2005，1743695-3702。
SCID小鼠中的異種移植術為用於研究牛皮癬的公認模型，參見例如Boehncke等人，Br.J.Dermatol.2005，153(4)758-66。在局部麻醉下，自罹患慢性斑塊期牛皮癬的病患切除損害性裂層皮(厚約0.5毫米)。將人類裂層移植物移植在6至8周嶺的SCID小鼠的背部上。使小鼠接受該移植物並癒合，費時3周。移植法後第22天時，每隔一天對小鼠腹膜內注射8mg/kg的人類抗IL-22抗體，諸如種系化的087B03、368D04、354A08或356A11。作為陰性對照組，使小鼠每日接受胃內給藥200μl PBS。作為陽性對照組，使小鼠每日接受胃內給藥2mg/kg地塞米松的200μl PBS溶液。陰性對照組可形成牛皮癬的特徵，其包括棘皮病、乳頭狀瘤病、角質化不全，及稠密單核浸潤物。在移植後第50天時處死小鼠，並切除帶有周圍皮膚的移除物。將一半移植物固定在福馬林中，且另一半冷凍在液態氮中。進行常規蘇木精及曙紅染色，並定性(表皮分化)及定量(表皮厚度、發炎性浸潤)分析移植物的病理變化。使用目鏡測微尺測定自表皮突的頂部至活性表皮的邊緣的平均表皮厚度。通過計算在3處鄰接放大視野中細胞數而計算發炎性浸潤物的密度。使用組織分析測定牛皮癬的特徵(諸如棘皮病、乳頭狀瘤病、角質化不全、發炎性浸潤，及角膜與顆粒層的出現)以評估疾病的演變。
在移植物移植後，注射200μl PBS或同種型相配的對照抗體的陰性對照組小鼠漸進性地發展為牛皮癬。由於牛皮癬損害表達較高含量的IL-22，所以如以下報告的過繼轉移研究中所確認的，使用抗IL-22抗體(例如種系化的087B03、368D04、354A08或356A11)進行的治療預期可抑制或延緩牛皮癬。
CD4+CD45rb高T細胞在scid/scid小鼠中的過繼轉移為研究小鼠牛皮癬的另一種公認模型。見Hong等人，J.Immunol.，162(1)7480-91(1999)。在該模型中，於CD4+CD45rb高T細胞過繼轉移後第一天對scid/scid小鼠共施用LPS及IL-12或葡萄球菌腸毒素B誘導了顯示人類牛皮癬中所發現特徵的皮膚損害。
使用稍作改進的本模型，於過繼轉移後第一天，在共施用或未共施用LPS及IL-12的情況下，使CD4+CD45rb高CD25-T細胞轉移至scid/scid小鼠體內。當轉移入scid/scid小鼠內時，甚至當在無LPS及IL-12施用時，CD4+CD45rb高CD25-T細胞可誘導牛皮癬損害。因此，在過繼轉移後，施用IL-12及LPS似乎不會改變抗IL-22抗體在此模型內的有效性。
使用稍微改進的前述方法，製備用於過繼轉移的細胞。自6至8周齡的BALB/cBy供體小鼠(Jackson Laboratory，Bar Harbor，Maine)收集脾臟並通過全脾臟的機械均質化而分離脾細胞。使用鼠CD4富集試劑盒(R&D)，根據廠商的指示選擇CD4+T細胞。CD4富集的T細胞用抗CD4-PE(Pharmingen)、抗CD45RB-FITC及抗CD25-APC(Pharmingen)標記。使用Moflo(Becton Dickinson，San Jose，CA)細胞分選器分選細胞。收集CD4+CD45Rb高CD25-細胞，且其純度>95％。以2×106個細胞/毫升使細胞再懸浮於鹽水中並以i.p.法將4×105個細胞注射入C.B-17/Prkdc scid/scid小鼠(Jackson Laboratory，Bar Harbor，Maine)體內。在某些情況下，在第一天時，對接受CD4+CD45Rb高細胞的受體小鼠以i.p.方法施用10ng IL-12及20μgLPS，並在第3天時，再施用一劑量的IL-12。在過繼轉移的當天對小鼠施用16mg/kg的同種型對照抗體或抗IL-22抗體(356A11或368D04)，並在其後，每周一次給藥，費時10周。一周兩次監測小鼠的皮膚損害的臨床症狀。於該研究結束時，採集小鼠耳、皮膚、淋巴結及脾臟以進行進一步離體研究。
臨床評估 在過繼轉移後10天開始，每周兩次通過盲試的研究者評估小鼠。根據身體外觀提供自0至6的半定量臨床分數以記錄疾病演變0＝無皮膚或耳症狀；0.5＝在耳及眼瞼上有輕微紅斑；1＝具有耳輕度增厚(小於身體表面的2％)的耳或眼瞼上有輕度、中度紅斑；2＝在2至10％身體表面上有中度至嚴重的紅斑，輕度鱗屑；3＝在10至20％身體表面上有嚴重的紅斑及鱗屑；4＝在20至40％身體表面上有很嚴重、密集的紅斑及鱗屑；5＝在40至60％身體表面上有很嚴重、密集的紅斑及鱗屑；6＝在超過60％身體表面上有很嚴重、密集的紅斑及乾癬。根據毛皮狀況、耳症狀、眼瞼外觀，及四肢與尾上的炎症記錄具體觀察結果。
在未共施用LPS及IL-12的研究中，當與對照抗體治療的小鼠比較時，抗體356A11及368D04可顯著地抑制皮膚炎症，就356A11而言，其作用早在第21天時開始而就368D04而言，則在第35天開始(圖20A-B)。於過繼轉移後的第一天時在共施用LPS及IL-12的研究中可發現類似結果，當與對照抗體比較時，356A11及368D04可顯著抑制皮膚損害，其作用早在過繼轉移後第28天即開始(圖27A及B)。於過繼轉移後第一天時在未進行(圖34A-B)或進行(圖37A-B)LPS及IL-12共施用的分別研究中，當與對照抗體治療的小鼠比較時，356A11可顯著抑制皮膚炎症，其作用早在第21天開始。
細胞因子檢測 使用ELISA試劑盒(R&D系統)定量小鼠血清或得自細胞培養物上清液的IL-6、IFNγ及TNFα。用於IL-22、IL-17A、IL-17F及IL-17A/F異源二聚體的ELISA包括於4℃下以100μl的抗IL-22(Ab-01)、抗IL-17A(R&D)或抗IL-17F(RK015-01)抗體的2μg/ml的PBS溶液包被96孔平底板(Costar)一夜。然後以PBS/Tween(在PBS中的0.05％Tween-20)洗滌板，並於RT下用200μlPBS加1％BSA封閉一小時。通過如Li等人在Int.Immunopharmacol.4693-708(2004)中所述的方法而產生鼠IL-22的抗體(Ab-01、Ab-02及Ab-03)及鼠IL-17F的抗體(RK015-01)。在所有以下步驟之間，以PBS/Tween洗滌板。然後添加IL-22(R&D)、IL-17A(R&D)、IL-17F及IL-17A/F標準物、樣品上清液及血清樣品(經PBS 1:5稀釋)。然後將1％ BSA/PBS溶液中的0.5μg/ml的抗IL-22(Ab-03)、抗IL-17A(R&D)及抗IL-17F(RK015-01)的生物素醯化的二抗添加至各板內，並於37℃下培育一小時。根據廠商的指示，添加聚HRP標記的鏈黴抗生物素(Pierce)培養15分鐘。通過添加TMB底物而使該板顯色15至30分鐘。然後在Molecular Devices(Sunnyvale，CA)板式測讀機上讀取試驗值並使用SOFTmax軟體分析數據。
在未共施用LPS及IL-12的研究中，與對照抗體治療的小鼠比較，356A11治療的小鼠體內可檢測出較高含量的血清IL-22，表明如實施例14中述，356A11捕獲並穩定體內的IL-22(圖21)。在過繼轉移後第一天時，在共施用LPS及IL-12的用356A11治療的小鼠中也可發現類似結果(圖28)。在過繼轉移後第一天時在未進行(圖35)及進行(圖38)LPS及IL-12共施用的分別研究中可複製這些結果。在368D04治療的小鼠中並未在血清中檢測出IL-22(圖21)。
在未共施用LPS及IL-12的研究中，在356A11及368D04治療的小鼠中檢測出顯著低血清含量的IL-17F、IL-17A、IL-17A/F(圖22A-C)。也發現在356A11及368D04治療的小鼠體內IL-6血清含量有漸減的趨勢(圖22D)。在得自對照抗體、356A11或368D04抗體治療的小鼠血清中，IFNγ及TNFα的含量低於檢測極限。在過繼轉移後於第一天進行共投LPS及IL-12的356A11治療的小鼠體內也發現類似結果(圖29A-D)。在過繼轉移後第一天的未進行(圖39A-B)及進行(圖39C-D)LPS及IL-12共施用的分別研究中，356A11治療的小鼠體內也可發現明顯較低的IL-17A及IL-6血清含量。
淋巴結細胞分離及刺激 本模型中的牛皮癬損害通常自耳、眼、臉及頸部發展至身體的其餘部位。經治療劑治療的小鼠通常僅在眼及耳周圍產生輕度的皮膚損害。因此，自各小鼠分離排洩臉廢物的頸淋巴結以獲得最高數量的活化細胞。通過機械均質化作用而回收淋巴結(LN)細胞。自每群約9至10隻小鼠匯集LN細胞並以1×106個/毫升再懸浮於補充10％ FBS(HyClone)、5×10-5M 2-ME(Sigma)、2mM穀氨醯胺(Life Technologies，Gaithersburg，MD)、10U/ml青黴素、100μg鏈黴素(Life Technologies)及15mM HEPES的完全RPMI 1640培養基內。然後將總共200μg/孔的懸浮液放在96孔板內，並用抗CD3加抗CD28(各1μg/ml)刺激48小時。
細胞內細胞因子染色 為檢查IL-22中和作用對效應T細胞群體的影響，在頸淋巴結細胞上進行細胞內細胞因子染色。以50ng/ml PMA(Sigma)、1μg/ml離子黴素(Sigma)及GolgiPlug(Pharmingen)刺激細胞12小時。首先對表面抗原(CD4)進行細胞染色，然後根據廠商指示，用Cytofix/Cytoperm(Pharmingen)處理。使用IFNγ、IL-22、IL-17A、IL-17F、TNFα及相關IgG同種型對照抗體進行細胞內細胞因子染色。根據廠商指示，使Alexa 647(Molecular Probes)標記抗IL-22(Ab-02)，並使FITC(Pierce Biotechnologies)標記抗IL-17F(RK015-01)。
在門控的CD4+群上進行細胞分析。FACS分析結果顯示當與同種型對照處理的小鼠比較時，356A11及368D04(未共施用LPS及IL-12)處理的小鼠中，有較低百分比的CD4+T細胞產生IL-22、IL-17A及IL-22與IL-17F兩者，但是有較高百分比的CD4+T細胞產生IFNγ(圖23)。過繼轉移後第一天共施用LPS及IL-12的356A11處理的小鼠中也可發現類似結果(圖31)。
細胞因子轉錄物的定量 使用Qiagen Rneasy試劑盒(Qiagen)自小鼠耳或LN細胞(刺激後)分離RNA。使用預限定的引物及探針(Applied Biosystems)進行細胞因子轉錄物的定量PCR。使用ΔΔCt方法以將轉錄物標準化為GAPDH，並相對於對照組小鼠，計算誘導倍率(fold induction)。
使用得自小鼠耳的RNA的定量PCR結果顯示當與對照抗體處理的小鼠比較時，356A11及368D04處理的小鼠具有較低的IL-22、IL-17F、IL-17A及IL-6基因表達，但有增強的IFNγ表達(圖24A-E)。過繼轉移後第一天進行共施用LPS及IL-12的356A11治療的小鼠中也發現類似結果(圖30A-E)。在使用356A11(未共施用LPS及IL-12)的分別研究中可複製這些結果，其中也發現與對照抗體處理的小鼠比較，356A11處理的小鼠具有較低IL-1家族6蛋白質(IL-1F6)基因表達及未改變的IL-22結合蛋白與IL-22受體亞基(IL-22R1)基因表達(圖36A-H)。
使用得自如上述抗CD3及抗CD28刺激48小時的淋巴結細胞的RNA的定量PCR結果顯示356A11及368D04抑制離體IL-22、IL-16、IL-17A及IL-17F基因表達，但是對IFNγ基因表達的影響並無顯著變化(圖26A-E)。過繼轉移後第一天，在共施用LPS及IL-12的356A11治療的小鼠中發現類似結果(圖33A-E)。
使用如前述的ELISA試劑盒(R&D系統)收集得自如上述抗CD3及抗CD28刺激的淋巴結細胞的上清液以進行細胞因子分析。反映LN基因表達數據的細胞因子ELISA結果顯示356A11及368D04抑制IL-22、IL-6、IL-17A及IL-17F的離體分泌，但是對從刺激的細胞分泌IFNγ並無顯著變化(圖25A-F)。過繼轉移後第一天時，在共施用LPS及IL-12的356A11治療的小鼠中發現類似結果(圖32A-E)。
組織病理學分析 一旦體內研究結束時，在小鼠組織上進行屍檢。收集得自耳、軀幹皮膚的組織樣品，並固定在10％福馬林溶液內以作為切片標本及進行分析。為記錄疾病嚴重性，根據炎症的嚴重性指定自0至5的半定量組織學得分。通過有合格證照的病理學家以盲式形式進行組織學評估。0＝在正常極限內；1＝最低；2＝輕度；3＝中度；4＝顯著；5＝嚴重。
免疫組織化學分析 收集組織樣品並包埋在Tissue Tek OCT(Miles，Elkhurt，IN)化合物中，經乾冰冷凍以進行恆冷切片機切片。將組織切片(5μm)固定在100％丙酮內並用抗CD4、抗CD11b及抗嗜中性白細胞抗體(PharMingen)染色。根據可視螢光顯微術檢測，組織的評分如下陰性＝0、輕度＝1、中度＝2，且嚴重＝3。
組織學研究結果證明與同種型對照物處理比較，356A11及368D04處理的小鼠的皮膚罹患較少的角質化細胞增殖、表皮突及發炎性細胞浸潤。另外，免疫組織化學研究結果顯示356A11降低CD4+、CD11b+(巨噬細胞)及嗜中性白細胞在表皮、真皮，及皮下組織層中的數量。組織學研究結果反映了臨床研究結果並支持使用IL-22拮抗劑(諸如本發明抗體)作為治療劑以治療牛皮癬及其它似牛皮癬皮膚病。
總的結果證明本發明抗體(諸如087B03、368D04、354A08或356A11)對該牛皮癬的鼠模型有效，且表明使用抗IL-22抗體(包括087B03、368D04、354A08或356A11)的治療提供了人類牛皮癬的治療性介入的有效策略。
實施例16病患的治療 可用本發明抗體治療的病患類型包括罹患自身免疫病症；呼吸系統病症；皮膚、心血管系統、神經系統、腎、肝臟及胰臟等炎症的病患或進行移植的病患。作為例證的治療方法及預期結果如下文提供。也可使用非表14內所述的給藥劑量或給藥頻率。若必要，熟練的技術人員可根據給藥途徑或其它已知變數，諸如待治療病患的年齡、體重、病症、性別、病況的嚴重性等而調整治療方式。
表14治療方式 根據本專利說明書內所列舉的參考文獻的教導可最徹底了解本專利說明書。本專利說明書內的實施方案是供闡明本發明實施方案且不應被視為對本發明範圍的限制。熟練的技術人員很容易了解本發明所包含的許多其它實施方案。本公開內容中所列舉的所有公開申請及專利的全文在此併入本申請以作為參考資料。當併入本申請以作為參考資料的材料存在與本專利說明書牴觸或不一致時，本專利說明書優先於這些材料。文中任何參考文獻的引證並非承認此類參考文獻為本發明的在先技術。
除非另有指定，表示用於本專利說明書(包括權利要求)中的成分、反應條件等的數量欲被理解為在所有情況下由術語「大約」所修飾。因此，除非另外相反指出，數字參數為近似值，且可根據欲通過本發明所獲得的所期望性質而不同。至少，且並非作為限制權利要求範圍等價物的原理的應用的嘗試，各數值參數應該根據有效位數的數值及一般捨入方法而推斷。
除非另有指定，在一系列元素前的術語「至少」應理解為意指該系列中的每一種元素。僅使用常規實驗方法，本領域技術人員可了解或可確定文中所述本發明的特定實施方案的許多同等物。此類同等物也意欲涵蓋在以下權利要求內。
序列表
惠氏公司
使用抗人IL-22抗體的方法
8702.0203-00304


60/774,595
2006-02-21
634
PatentIn version 3.3
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3
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小鼠
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63權利要求
1.一種治療或者預防受試者的與IL-22相關的病症的方法，包括用足以抑制或降低受試者體內免疫細胞活性的量向受試者施用特異性結合至人IL-22的抗體或者其抗原結合片段，從而治療或者預防該病症，其中該抗體或者其抗原結合片段包括含有至少一個重鏈可變區的VH結構域以及含有至少一個下述序列任何之一的輕鏈可變區的VL結構域SEQ ID NO11，12，13，29，30，31，47，48，49，65，66，67，83，84，85，101，102，103，119，120，121，137，138，139，155，156，157，173，174，175，191，192，193，209，210，211，227，228，229，245，246，247，263，264，265，281，282，283，299，300，301，317，318，319，335，336，337，371，372，373，389，390，391，407，408，409，425，426，427，443，444，445，461，462，463，479，480，481，497，498，499，515，516，517，533，534，535，551，552，553，569，570，571，587，588，589，605，606，607，623，624或625。
2.一種治療或者預防受試者的與IL-22相關的病症的方法，包括用足以抑制或降低受試者體內免疫細胞活性的量向受試者施用特異性結合至人IL-22的抗體或者其抗原結合片段，從而治療或者預防該病症，其中該抗體或者其抗原結合片段包括含有至少一個輕鏈可變區的VL結構域以及含有至少一個下述序列任何之一的重鏈可變區的VH結構域SEQ ID NO8、9、10、26、27、28、44、45、46、62、63、64、80、81、82、98、99、100、116、117、118、134、135、136、152、153、154、170、171、172、188、189、190、206、207、208、224、225、226、242、243、244、260、261、262、278、279、280、296、297、298、314、315、316、332、333、334、350、351、352、368、369、370、386、387、388、404、405、406、422、423、424、440、441、442、458、459、460、476、477、478、494、495、496、512、513、514、530、531、532、548、549、550、566、567、568、584、585、586、602、603、604、620、621或622。
3.權利要求1的方法，其中該至少一個重鏈可變區包括下述序列的任何之一SEQ ID NO8、9、10、26、27、28、44、45、46、62、63、64、80、81、82、98、99、100、116、117、118、134、135、136、152、153、154、170、171、172、188、189、190、206、207、208、224、225、226、242、243、244、260、261、262、278、279、280、296、297、298、314、315、316、332、333、334、350、351、352、368、369、370、386、387、388、404、405、406、422、423、424、440、441、442、458、459、460、476、477、478、494、495、496、512、513、514、530、531、532、548、549、550、566、567、568、584、585、586、602、603、604、620、621或622。
4.權利要求1-3中任意一項的方法，其中該VL結構域包括下述序列任何之一的胺基酸序列SEQ ID NO6、24、42、60、78、96、114、132、150、168、186、204、222、240、258、276、294、312、330、348、366、384、402、420、438、456、474、492、510、528、546、564、582、600或618。
5.權利要求1-4中任意一項的方法，其中該抗體或者其抗原結合片段包括具有下述序列任何之一的胺基酸序列的VH結構域SEQ ID NO5、23、41、59、77、95、113、131、149、167、85、203、221、239、257、275、293、331、329、347、365、383、401、419、437、455、473、491、509、527、545、563、581、599或617。
6.權利要求3的方法，其中該VH結構域包括SEQ ID NO5、23、41、59、77、95、113、131、149、185、221、239、257、275、331、329、365、383、401、419、437、455、473、509、527、563或581中任何之一的胺基酸序列，以及該VL結構域包括SEQ IDNO6、24、42、60、78、96、114、132、150、186、222、240、258、276、312、330、366、384、402、420、438、456、474、510、528、564或582中任何之一的胺基酸序列。
7.權利要求6的方法，其中該VH結構域包括SEQ ID NO167或491的胺基酸序列，以及該VL結構域包括SEQ ID NO168或492的序列。
8.權利要求6的方法，其中該VH結構域包括SEQ ID NO293或545的胺基酸序列，以及該VL結構域包括SEQ ID NO294或546的序列。
9.權利要求6的方法，其中該VH結構域包括SEQ ID NO203或617的胺基酸序列，以及該VL結構域包括SEQ ID NO204或618的序列。
10.權利要求6的方法，其中該VH結構域包括SEQ ID NO347或599的胺基酸序列，以及該VL結構域包括SEQ ID NO348或600的序列。
11.一種治療或者預防受試者的與IL-22相關的病症的方法，包括用足以抑制或降低受試者體內免疫細胞活性的量向受試者施用特異性結合至人IL-22的抗體或者其抗原結合片段，從而治療或者預防該病症，其中該抗體或者其抗原結合片段特異性結合至人IL-22，並對人IL-22具有至少為1010M-1的結合常數。
12.權利要求11的方法，其中對人IL-22的結合常數為至少1011M-1。
13.一種治療或者預防受試者的與IL-22相關的病症的方法，包括用足以抑制或降低受試者體內免疫細胞活性的量向受試者施用特異性結合至人IL-22的抗體或者其抗原結合片段，從而治療或者預防該病症，其中該抗體或者其抗原結合片段以150pM或較小的IC50阻斷IL-22調節的BAF3細胞增殖，其中該BAF3細胞包含人IL-22受體。
14.權利要求13的方法，其中該抗體或者其抗原結合片段以100pM或較小的IC50阻斷IL-22調節的BAF3細胞增殖。
15.一種治療或者預防受試者的與IL-22相關的病症的方法，包括用足以抑制或降低受試者體內免疫細胞活性的量向受試者施用特異性結合至人IL-22的抗體或者其抗原結合片段，從而治療或者預防該病症，其中該抗體或者其抗原結合片段以1nM或較小的IC50阻斷IL-22調節的從HT29細胞分泌GROa。
16.權利要求15的方法，其中該抗體或者其抗原結合片段以150pM或較小的IC50阻斷IL-22調節的從HT29細胞分泌GROa。
17.權利要求1-16中任意一項的方法，其中與IL-22相關的病症選自炎症性腸病、胰腺炎、多發性硬化、類風溼性關節炎、系統性紅斑狼瘡、HIV、舍格倫症候群、幼年類風溼性關節炎、骨關節炎、銀屑病關節炎、強直性脊椎炎、牛皮癬、移植排斥和節段性迴腸炎。
18.權利要求1-17中任意一項的方法，還包括向受試者施用另一種治療劑，該治療劑選自細胞因子抑制劑、生長因子抑制劑、免疫抑制劑、消炎劑、代謝抑制劑、酶抑制劑、細胞毒劑和細胞生長抑制劑。
19.權利要求18的方法，其中該治療劑選自TNF拮抗劑、IL-12拮抗劑、IL-15拮抗劑、IL-17拮抗劑、IL-18拮抗劑、IL-19拮抗劑、IL-20拮抗劑、IL-21拮抗劑、IL-23拮抗劑、T細胞清除劑、B細胞清除劑、氨甲蝶呤、來氟米特、西羅莫司(瑞帕黴素)或其類似物、Cox-2抑制劑、cPLA2抑制劑、NSAID和p38抑制劑。
20.權利要求1-19中任意一項的方法，其中受試者是哺乳動物。
21.權利要求1-19中任意一項的方法，其中受試者是人。
22.權利要求1-19中任意一項的方法，其中該抗體以選自下列範圍的量施用1μg/kg至20mg/kg、1μg/kg至10mg/kg、1μg/kg至1mg/kg、10μg/kg至1mg/kg、10μg/kg至100μg/kg、100μg至1mg/kg、250μg/kg至2mg/kg、250μg/kg至1mg/kg、500μg/kg至2mg/kg、1mg/kg至5mg/kg、5mg/kg至10mg/kg、10mg/kg至20mg/kg、10mg/kg至25mg/kg及20mg/kg至30mg/kg。
23.權利要求1-22中任意一項的方法，其中與IL-22相關的病症是關節炎，炎症性腸病或者牛皮癬。
24.權利要求23的方法，其中與IL-22相關的病症是類風溼關節炎。
25.權利要求23的方法，其中與IL-22相關的病症是牛皮癬。
26.一種治療或者預防受試者的過度增生性病症的方法，包括用足以抑制或降低受試者體內IL-22-和/或IL-22R和/或IL-10R2響應細胞過度增生的量向受試者施用特異性結合至人IL-22的抗體或者其抗原結合片段，並使得抗體治療或者預防該病症，其中抗體或者其抗原結合片段包括至少一個下述序列任意之一的重鏈可變區SEQ ID NO8、9、10、26、27、28、44、45、46、62、63、64、80、81、82、98、99、100、116、117、118、134、135、136、152、153、154、170、171、172、188、189、190、206、207、208、224、225、226、242、243、244、260、261、262、278、279、280、296、297、298、314、315、316、332、333、334、350、351、352、368、369、370、386、387、388、404、405、406、422、423、424、440、441、442、458、459、460、476、477、478、494、495、496、512、513、514、530、531、532、548、549、550、566、567、568、584、585、586、602、603、604、620、621或622。
27.一種治療或者預防受試者的與IL-22相關病症的方法，包括用足以抑制或降低受試者體內免疫細胞活性的量向受試者施用抗體或者其抗原結合片段，該抗體或者其抗原結合片段特異性結合至由GIL01、GIL16、GIL45、GIL60、GIL68、GIL92、097D09、062A09、062G05、087B03、367D04、368D04、166B06、166G05、375G06、376B10、354A08、355B06、355E04或356A11所識別的IL-22表位，因此該抗體競爭性抑制GIL01、GIL16、GIL45、GIL60、GIL68、GIL92、097D09、062A09、062G05、087B03、367D04、368D04、166B06、166G05、375G06、376B10、354A08、355B06、355E04或356A11與人IL-22的結合，從而治療或者預防該病症。
28.權利要求27的方法，其中該抗體特異性結合至由087B03所識別的IL-22表位，因此該抗體競爭性抑制087B03與人IL-22的結合。
29.權利要求27的方法，其中該抗體特異性結合至由354A08所識別的IL-22表位，因此該抗體競爭性抑制354A08與人IL-22的結合。
30.權利要求27的方法，其中該抗體特異性結合至由368D04所識別的IL-22表位，因此該抗體競爭性抑制368D04與人IL-22的結合。
31.權利要求27的方法，其中該抗體特異性結合至由356A11所識別的IL-22表位，因此該抗體競爭性抑制356A11與人IL-22的結合。
全文摘要
本申請提供可特異性結合至人白介素-22(IL-22)的人抗體及其抗原結合片段，及使用此類抗體以例如診斷、治療或預防炎症、自體免疫疾病、過敏、敗血症性休克、感染病、移植排斥、癌及其它免疫系統病症的方法。
文檔編號A61P1/18GK101426528SQ200780013768
公開日2009年5月6日 申請日期2007年2月21日 優先權日2006年2月21日
發明者L·A·福瑟爾, M·黑根, D·P·拉克森伯格, M·奧圖爾 申請人:惠氏公司