雜合基質和雜合基質混合物的製作方法
2023-12-08 23:23:31
專利名稱：雜合基質和雜合基質混合物的製作方法
本申請書要求對1999年10月5日提交的美國申請系列號09/413,715和2000年9月14日提交的美國申請系列號09/662,037的優先權。
本發明領域是在體內或在體外用於生產和輸送醫學上有用的物質的醫學裝置。
背景技術：
用來輸送醫學上有用的物質的裝置能顯著影響其效能。許多這樣的物質的標準施用途徑是口服、靜脈內或皮下。其每一種均有固有的局限，這可影響所輸送的物質的治療效果。而且，許多基於蛋白質的藥物具有較短的半衰期和較低的生物利用度，這是在其配製和輸送中必須考慮的因素。儘管已經研製了許多裝置來輸送醫學上有用的物質，包括可攜式泵和導管，但仍然十分需要改進的輸送裝置。
許多醫學上有用的物質(包括蛋白質、糖蛋白和某些肽和非肽激素)可由培養的細胞比通過人工合成途徑更有效地產生。合適的細胞一般在生物反應器中培養，並且從中純化希望的產物，用來通過標準方法對患者施用，例如口服或靜脈內或皮下注射。此外，也能直接將細胞植入患者體內，在此產生並輸送希望的產物(參見，例如，美國專利號6,063,630和6,054,288)。儘管該方法比注射產物本身具有許多理論上的優點，包括可以控制正常細胞反饋機制以輸送生理學合適水平的產物的可能性，但它引起了額外的複雜性。其中之一涉及細胞植入時的適宜環境。將植入的細胞以與包含植入物的細胞型天然體內環境相容的方式組織起來將是希望的(例如，成纖維細胞在主要由膠原組成的胞外基質的豐富網絡中天然存在)。有時也需要確保植入的細胞仍位於患者體內的特定部位，使得能監測它們，並且或許可在不再需要時去除。
為此目的測試的一種技術使用一種由包埋有細胞的固體、單片膠原凝膠(一種「膠原基質」)組成的植入裝置(例如，Bell，美國專利號4,485,096和美國專利號5,965,125)。在膠原植入體中也可含有其它物質，如聚四氟乙烯(PTFE)纖維(Moullier等人，Nature Genetics，4154，1993；WO 94/24298)，以賦予膠原凝膠強度和其它希望的特性。
發明概述曾經發現，向膠原基質中加入微載體(即任何形狀的小球體)，由此形成此處所說的「雜合基質」，能大大提高膠原基質的功能。這在膠原膠凝形成基質前將微載體與細胞和可溶性膠原混合可以實現。為了提高包埋細胞的生存力、生長和/或功能，本發明的基質可含有用下列一種或多種試劑包被或包封的固體底物(例如，瓊脂糖珠、膠原珠、膠原線或膠原或非膠原纖維)。
申請人也已經發現，通過將微載體和細胞(和任選的與下列一種或多種試劑結合(例如，結合、包被或包封)的固體底物)在液體中懸浮，並通過如注射將該懸液導入體內，能將細胞導入動物體內。懸液除了細胞、微載體和上處所述任何試劑包被或包封的固體底物之外，還可包含可溶性膠原。這些成分混合在一起，並作為液體懸液輸送到動物體內。輸送可以通過可注射系統，如連有一個針頭或導管的注射器。使用大孔微載體可顯著提高細胞附著的表面積，也能為附著並遷移到微載體孔中的細胞提供保護。在含有膠原的混合物中，膠原部分聚合，在動物體的輸送部位形成膠原凝膠固體塊。該凝膠在懸浮成分(細胞、微載體和任選的固體底物)周圍原位形成。凝膠有助於使注射的成分保持一定的距離，其大小將取決於植入材料的體積、植入部位的空間大小和周圍組織的結構。膠原的存在能保護細胞免於在植入過程中產生的剪切應力。另外，通過提供保護性屏障，膠原可幫助降低宿主炎症細胞對植入細胞的潛在破壞。含膠原的混合物被稱為「膠原基質混合物」(CMM)，用CMM(在體內或體外)形成的固體基質被稱為「膠原基質」(CM)。
希望時，微載體和細胞能一起培養一段時間，使得在加入非膠凝的膠原溶液和固體底物之前，細胞附著於微載體；此外，也能將三種或四種成分基本上同時或以任何希望的順序混合，希望時，隨後可溶性膠原在體外膠凝，形成由不溶性膠原原纖維、細胞和微載體組成的凝膠混合物。凝膠混合物通過液體的排除逐漸變小，形成固體、相對有彈性的可植入單位，其中含有在不溶性膠原原纖維網絡中包埋的微載體和細胞(和任選的與下列任何試劑結合(例如，結合、包被或包封)的固體底物)。當含有微載體時，得到的CMM在此被稱為「雜合膠原基質混合物」(HCMM)，由這種HCMM產生的基質被稱為「雜合膠原基質」(HCM)。不含膠原或含膠原替代物(見下文)的混合物被稱為「基質混合物」；當這些混合物含有微載體時，它們也被命名為「雜合基質混合物」(「HMM」)。應當理解，微載體可以由膠原或除膠原之外的物質組成。
本發明因此包括具有由基質材料製成的主體的製品、組合物或裝置，基質材料包含不溶性膠原原纖維，並在主體中分散有(a)大量脊椎動物細胞(特別是哺乳動物細胞，如來自人、黑猩猩、小鼠、大鼠、倉鼠、豚鼠、兔、母牛、馬、豬、山羊、綿羊、狗或貓的細胞)；(b)與固體底物結合(例如，結合、包被或包封)的一種或多種試劑(見下文)；和(c)大量微載體，每一種優選地主要由(即，其乾重的50％以上是)一種或多種選自膠原(優選地I型膠原)、聚苯乙烯、葡聚糖、聚丙烯醯胺、纖維素、藻酸鈣、乳膠、聚碸、玻璃(例如，凝膠(如膠原)包被的玻璃，以提高細胞的粘附)和明膠(例如多孔明膠)的物質組成。一般每種微載體乾重的至少70％、優選地至少80％(最優選地約90％-100％，例如，至少95％)是一種或多種所列物質。所述基本由純化膠原組成的微載體的商品實例包括ICN CellagenTM珠和Hyclone GelatinCultisphere。微載體優選地具有多孔一致性，但也可以是光滑的，一般是直徑約為0.1-2mm(例如約0.3-1mm)的近似球形的形狀。當然，來自任一批次或製品的微載體的形狀和大小將在製造公差內變化。
能使製品成形，以便植入動物(例如哺乳動物，如病人)體內，或者能設計用於在體外生產細胞產物；例如，在體外生物反應器裝置中(其具有一個使血液從動物分流到製品、然後回到動物血管中的工具)，或在一種生物反應器或其它容器中(能從中回收含有希望的細胞產物的培養基，用於藥劑的純化和製備)。
細胞可以來源於取自患者的一種或多種細胞，優選地是含有編碼一種或多種多肽(例如，醫學上有用的多肽，如酶、激素、細胞因子、集落刺激因子、血管生成因子、疫苗抗原、抗體、凝集因子、調節蛋白、轉錄因子、受體或結構蛋白)的外源DNA的遺傳工程(例如轉染的)細胞。這些多肽的例子包括人生長激素(hGH)、因子VIII、因子IX、促紅細胞生成素(EPO)、白蛋白、血紅蛋白、α-1抗胰蛋白酶、降鈣素、葡糖腦苷脂酶、低密度脂蛋白(LDL)受體、IL-2受體、珠蛋白、免疫球蛋白、催化抗體、白介素、胰島素、胰島素樣生長因子1(IGF-1)、促胰島素(insulinotropin)、甲狀旁腺激素(PTH)、肥胖蛋白、幹擾素(IFN)(例如IFN-α、IFN-β或IFN-γ)、神經生長因子、鹼性成纖維細胞生長因子(bFGF)、酸性FGF(aFGF)、表皮生長因子(EGF)、內皮細胞生長因子、血小板衍生生長因子(PDGF)、轉化生長因子、內皮細胞刺激血管生成因子(ESAF)、血管生成素、組織纖溶酶原激活劑(t-PA)、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、促卵泡激素(FSH)、α-半乳糖苷酶、β-gluceramidase、α-艾杜糖醛酸苷酶、艾杜糖-2-硫酸酯酶、葡糖胺-N-硫酸酯酶、α-N-乙醯氨基葡糖苷酶、乙醯輔酶Aα-氨基葡糖苷酶-N-乙醯轉移酶、N-乙醯葡糖胺-6-硫酸酯酶、β-半乳糖苷酶、N-乙醯半乳糖胺-6-硫酸酯酶、β-葡糖醛酸酶、血管內皮生長因子(VEGF)、VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C和VEGF-D。此外，外源DNA還可含有調節序列，任選地可激活內源基因表達的其它元件(例如，利用如WO94/12650-PCT/US93/11704所述的同源重組，在此引用作為參考)。
在本發明的基質中通常能使用可附著膠原和/或微載體，並顯示希望的性質(如醫學上有用的細胞產物的表達，或必需結構或代謝功能的表現)的任何類型的細胞。例子包括脂肪細胞、星形細胞、心肌細胞、軟骨細胞、內皮細胞、上皮細胞、成纖維細胞、神經節細胞、腺細胞、膠質細胞、造血細胞、肝細胞、角質細胞、成肌細胞、神經細胞、成骨細胞、胰腺β細胞、腎細胞、平滑肌細胞和橫紋肌細胞，以及上述任一種的前體。希望時，在特定基質中能包含一種以上的細胞。細胞能以純系(clonal)或異系群體存在。
儘管本發明的基質不需要含有膠原，但它們優選地含有。基質材料中的膠原優選地是I型，但可以是其它任何類型的膠原。基質材料能任選地包含兩種或多種類型的膠原(例如，選自I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX、X和XI型)，以及能賦予產生的基質希望的特性的其它任何成分例如，瓊脂糖、藻酸鹽、纖連蛋白、層粘連蛋白、透明質酸、硫酸乙醯肝素、硫酸皮膚素、硫酸軟骨素、硫酸蛋白聚糖、血纖蛋白、彈性蛋白、細胞粘合素、肝素或多糖(如纖維素、澱粉、葡聚糖或殼聚糖)。此外，代替膠原或除膠原以外，基質中能包含下列物質，來賦予它們膠原的性質，或增強這些性質絞碎的脂肪組織、絞碎的網膜組織、甲基纖維素、藻酸鹽、明膠或血纖蛋白。上述任何膠原或非膠原的成分都能來自人類來源或其它動物或植物來源。如果來自動物來源並且可能具有免疫原性，優選地動物與將要植入的受者相同。在該裝置中也能包含膠原或非膠原纖維。膠原纖維可以是在基質材料主體內分散的交聯的膠原線形式。非膠原纖維能由例如包括尼龍、滌綸、聚四氟乙烯、聚乙醇酸、聚乳酸/聚乙醇酸聚合物混合物、聚苯乙烯、聚氯乙烯共聚物、獸腸線、棉花、亞麻、聚酯或絲在內的材料製成。
雜合基質中能含有大量細胞。例如，能製備雜合基質，假定接種的細胞數和最初產量相等，其含有至少約為單獨用可溶性膠原製備的基質兩倍(優選地約三倍)的細胞。在一定時間內，在特定雜合基質中包埋的細胞所表達的多肽(例如醫學上有用的多肽)的總量一般顯著高於由等量原材料製備的標準膠原基質所達到的(例如，至少高50％，優選地至少高100％，更優選地至少高200％)。
本發明的雜合基質也含有一種或多種(例如至少2、3、4、5、6、8或10種)試劑，旨在改善基質功能，例如提高增殖和/或細胞保持。例如，這些試劑可包括促進血管形成的因子、細胞因子或生長因子。儘管在特定雜合基質中使用的試劑和基質中細胞產生的多肽(例如醫學上有用的多肽)可以是同一物質，但這兩種物質一般是不同的。該試劑與加入同一混合物中的固體底物結合(例如，結合、包被或包封)。固體底物可以是微載體本身，或者可以是獨立的物體(例如，包埋於基質中的多個固體底物顆粒，或單片)。固體底物可以與肝素或硫酸乙醯肝素蛋白聚糖結合，作為促進試劑結合的工具。這種固體底物的一個例子是主要由瓊脂糖組成的底物(例如，Sepharose、Affi-GelTM、肝素凝膠或肝素-瓊脂糖)，含或不含與之結合的肝素或硫酸乙醯肝素蛋白聚糖；這種固體底物也可含有藻酸鈣。能用來生產固體底物的其它物質包括膠原、明膠、乙烯-醋酸乙烯酯共聚物、聚乳酸/乙醇酸共聚物、血纖蛋白、八硫酸蔗糖、葡聚糖、聚乙二醇、藻酸鹽、聚丙烯醯胺、纖維素、乳膠、聚羥乙基丙烯酸酯、尼龍、滌綸、聚四氟乙烯、聚乙醇酸、聚乳酸、聚苯乙烯、聚氯乙烯共聚物、獸腸線、棉花、亞麻、聚酯和絲。固體底物可以呈多種物理形式，例如，珠、不規則顆粒、片或線。當試劑包封於固體底物中時，該試劑隨時間逐漸釋放。這些固體底物能作為微載體，以及試劑庫。因此，當本發明的特殊基質包括能作為微載體的固體底物時，含有上述任何微載體不是必需的。
能在基質中使用的試劑的例子包括鹼性成纖維細胞生長因子(bFGF)、VEGF、VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、酸性成纖維細胞生長因子(aFGF)、內皮細胞生長因子、血小板衍生生長因子(PDGF)、內皮細胞刺激血管生成因子(ESAF)、白三烯C4、前列腺素、胰島素樣生長因子1(IGF-1)、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、血管生成素、轉化生長因子-α(TGF-α)、轉化生長因子-β(TGF-β)、抗壞血酸、表皮生長因子(EGF)、制瘤素M或angiopoietin 1、2、3或4。
每種試劑的生物活性濃度非常不同。初始範圍由廠商提供，通常是根據利用如細胞增殖程度作為終點的標準生物活性測定。一般而言，試劑可以以任何濃度範圍(最低是出售者報導具有生物活性的濃度，最高是報導濃度的約1000倍)與底物(如肝素-Sepharose珠)結合；這些珠摻入HCM中；用合適的檢測系統(例如免疫測定)監測試劑隨時間的體外釋放。對於這些釋放測定，基質被置於含10％血清的生長培養基中。一旦確定基質釋放出可檢測量的試劑，即進行生物活性測定。含一定濃度範圍的試劑的基質能被置於多孔插入物(3-8μm孔)上，其位於例如眾所周知應答該試劑增殖的細胞(例如對於VEGF和bFGF為內皮細胞，對於bFGF和PDGF為成纖維細胞，如廠商所述)之上，並確定細胞生長曲線。估測體外生物活性測定結果，記錄認為沒有生物活性的劑量以及確定為「毒性」(即，導致細胞數低於對照)的劑量。為了確定每一基質的試劑最佳濃度，能將根據體外生物活性結果含一定濃度範圍的試劑的基質植入無免疫應答小鼠中。每一基質的最佳試劑濃度一般是使最大量治療蛋白質在體內釋放最長時間的濃度。
代替在基質材料主體內與固體底物結合或包封的所述試劑(或除它們之外)，雜合基質除可表達一種多肽(例如醫學上有用的多肽)的第一種培養的遺傳工程脊椎動物細胞群之外，還可含有表達和分泌一種或多種(例如至少2、3、4、6、8或10種)試劑的第二種培養的脊椎動物細胞群。第二種培養的脊椎動物細胞群可遺傳改造(如下所述)以表達該試劑，或者可以是產生該試劑的細胞，而沒有遺傳工程的益處。對於後者，如果細胞不組成型產生多肽，或極低量地產生，則能通過基因激活誘導細胞產生該試劑，或更高量地產生。本發明的基質可含有另一群培養的脊椎動物細胞，它們表達和分泌上述試劑的其它實例。產該試劑的群體的培養的脊椎動物細胞可以是，例如脂肪細胞、星形細胞、心肌細胞、軟骨細胞、內皮細胞、上皮細胞、成纖維細胞、神經節細胞、腺細胞、膠質細胞、造血細胞、肝細胞、角質細胞、成肌細胞、神經細胞、成骨細胞、胰腺β細胞、腎細胞、平滑肌細胞、橫紋肌細胞，或上述任一種的前體。細胞優選地是人細胞，但也可以是任何脊椎動物(例如，哺乳動物，如非人靈長類動物，豬、母牛、馬、山羊、綿羊、狗、貓、小鼠、大鼠、兔、豚鼠或倉鼠)的細胞。當基質中包含產生該試劑的細胞時，也可任選地包含固體底物，以在從細胞分泌時結合一部分試劑。這提供了一種控制從雜合基質釋放試劑的速率的方法。
在一個優選實施方案中，本發明的雜合基質含有角質細胞，例如，(a)作為產生多肽(例如，醫學上有用的多肽)的細胞，(b)作為產生試劑的細胞，(c)(a)和(b)兩者，或(d)作為既不產生多肽又不產生試劑的群體。加入角質細胞的雜合基質優選地含有成纖維細胞作為產生上述多肽(例如，醫學上有用的多肽)和/或試劑的細胞。角質細胞和成纖維細胞能從同一個體獲得，並且能向雜合基質中加入一種或多種角質細胞分化因子(例如，濃度為1.5-2mM的鈣離子、TGF-β或角質細胞分化因子-1(KDF-1))。
類似地，優選地除產生多肽(例如，醫學上有用的多肽)的成纖維細胞外，甚至除成纖維細胞和角質細胞外，本發明的雜合基質還能含有內皮細胞。能向雜合基質中加入一種或多種內皮分化因子(例如，10ng-10μg的VEGF或bFGF)，誘導基質內內皮管的形成。分化因子能在形成過程中直接加入基質中，或加入基質生長培養基中，或此兩者。
本發明的雜合基質一般通過包括下列步驟的方法製備形成一種混合物，該混合物包含(a)大量脊椎動物細胞；(b)大量微載體，每一種均優選地主要由一種或多種選自膠原、聚苯乙烯、葡聚糖、聚丙烯醯胺、纖維素、藻酸鈣、乳膠、聚碸和玻璃的物質組成；(c)一種含有可溶性膠原的溶液；和(d)一種或多種與固體底物結合(例如，結合、包被或包封)的上述試劑；和使該混合物中的可溶性膠原形成包埋有細胞和微載體的不溶性膠原原纖維凝膠；和將凝膠置於可使凝膠通過液體排除而變小的培養條件下，從而形成製品主體。膠凝一般通過將相對酸性膠原溶液的pH提高到5以上來引發，例如，加入濃縮的、緩衝的培養基，於是膠原形成不溶性原纖維。當該步驟在模子中進行時，凝膠將成為模子內部的形狀。凝膠的收縮一般受混合物中的細胞影響，它們附著於原纖維，使凝膠收縮為模製形狀(例如，當模子是圓柱形的培養皿時，為圓盤)的較小形式。基質能在生產後立即使用，能培養提高基質中存在的細胞數量，或改進其作用，或能在0℃以下無限期凍存。它們也能臨時貯存在較高溫度的冰箱中，例如約4℃。
為了製備這些含有一種或多種上述試劑的雜合基質，向混合物中加入有關試劑(結合或包封於上述任一種固體底物中)，以及以上所列的其它成分。試劑和固體底物能一起或以任何順序分開加入混合物中。另外，混合物也可含有第二種(任選地，第三、第四、第五、第六或更多種)培養的脊椎動物細胞群，它們分泌一種或多種所述試劑。該混合物也可含有一種或多種上述固體底物，它們包含一種或多種與試劑結合的物質(例如肝素或硫酸乙醯肝素)。為了製備含角質細胞的雜合基質，能在收縮步驟之前向混合物中加入角質細胞，或者能在凝膠收縮後加入組合物主體中。
在製備本發明的任一種雜合基質中，能在填充混合物至深度約為0.18cm(例如，約0.1-0.3cm，優選地約0.15-0.21cm)的平底模子中形成凝膠。例如，能使用體積(V)的混合物，在內半徑(r)的平底圓柱形模子中形成凝膠，使r2/V約為1.8(例如1.5-2.0)。本發明包括使用特定深度的混合物和/或特定r2/V比產生的雜合基質，因此具有特有的厚度。例如，能使用4ml的體積，在半徑約為2.65cm的圓柱形模子中形成凝膠，或在半徑不是2.65cm(即更大或更小)的模子中形成，所用混合物的體積成比例改變。
多肽(例如，醫學上有用的多肽)，如以上所列的，可以通過一種處理方法輸送給患者，該方法包括提供含有可分泌目的多肽的細胞的雜合基質，將製品植入患者的所選部位，例如皮下、腹膜內、網膜內、腎小囊下、腹股溝、肌內或鞘內部位。當多肽是促進創傷癒合的多肽(例如PDGF或IGF-I)時，能將基質植入預先存在的創傷部位。如上所述，細胞可來源於取自患者的一種或多種細胞，優選地用編碼該多肽的外源DNA體外轉染。此外，它們也可以是自然分泌多肽或行使希望的代謝功能的細胞(例如角質細胞或胰腺β細胞)。細胞能通過基因激活誘導，分泌多肽，分泌較高量的多肽，或行使希望的代謝功能。用於對患者施用多肽的合適的雜合基質可以是上述任一種。
在另一個實施方案中，可通過上述裝置分流患者的部分血液，使雜合基質中的細胞分泌的多肽與血液混合，來對患者施用多肽(例如醫學上有用的多肽)。本領域技術人員公知的任何這類裝置一般都適於容納本發明的基質。例如，分流到含有圍繞本發明的基質的滲透選擇性膜的裝置中的血液將使基質的治療產物輸送到血液中。一種類似於人工胰臟的裝置(Sullivan等人，Science 252718-721，1991)能用於該目的。另外，此處所述的任何雜合基質都能用於這些裝置。
本發明的雜合基質的另一種用途是作為體外生產希望的多肽(例如，此處所列的任何多肽)的工具。該方法包括下列步驟將雜合基質置於基質中的細胞可表達並分泌多肽的條件下；將基質與液體接觸，使細胞向液體中分泌多肽；從液體中獲得多肽，例如，通過適合於特定多肽的標準純化技術。在一個實施方案中，將基質錨定於一種表面，並用液體洗浴；此外，基質也可自由漂浮於液體中。包埋於雜合基質中的細胞在小空間中高水平地作用。而且，與大多數標準細胞培養方法相比，使用這些基質，純化表達的多肽的第一步(從培養基中去除細胞)明顯更有效。
本發明也包括一種液體混合物，其含有(a)培養的脊椎動物群(例如，以上所列的任何哺乳動物)，其通常表達一種多肽；(b)大量微載體，如以上所列；和(c)至少一種選自促進血管形成的因子、細胞因子、生長因子和抗壞血酸的試劑，至少一種試劑與膠原溶液中懸浮的固體底物結合(例如結合、包被或包封)。
細胞可以是上述可在基質中使用的任何細胞，並且可以類似地遺傳改造以表達相同的多肽。
儘管本發明的液體混合物不需要含有膠原，但它們優選地含有。混合物中的膠原可以是此處所列的任何類型，或是任何類型的組合。混合物中有足量的膠原，使混合物在pH5以上膠凝。液體混合物也可含有以上列出的其它任何成分。代替膠原或除膠原以外，混合物中能包含下列物質，以賦予由該混合物產生的基質膠原的性質，或增強這些性質絞碎的脂肪組織、絞碎的網膜組織、甲基纖維素、藻酸鹽、明膠和血纖蛋白。
微載體允許在本發明的混合物中含有高濃度的細胞。例如，當使用可溶性膠原使植入的混合物形成原位雜合基質時，這種雜合基質將具有體外形成的雜合基質的優點(見上文)。
本發明的混合物也可含有一種或多種(例如，至少2、3、4、5、6、8或10種)上述試劑，旨在改進由該混合物產生的基質的作用，例如，通過提高增殖和/或細胞的保持。而且，能以對於基質所述的任何形式，將試劑加入混合物中，例如，在溶液中游離，或包被於固體底物上。
測定在本發明的混合物中使用的每種試劑生物活性濃度的方法與以上對於基質所述的方法基本相同。然而另外，也能向小鼠中導入混合物，使得在進行所述體內測定之前原位形成雜合基質。
代替加入混合物中的所述試劑本身(或除它之外)，混合物中除表達一種多肽(例如，醫學上有用的多肽)的第一種培養的脊椎動物細胞群之外，還可含有以上對於本發明的基質所述的任何第二種培養的脊椎動物細胞群。
在一個優選實施方案中，本發明的混合物含有能獲得的角質細胞，它們與在基質中起相同的作用，並以相同方式作用。另外，混合物也可含有上述相同的角質細胞分化因子。而且，如對於基質所述，本發明的混合物可含有內皮細胞，和任選地，上述內皮分化因子。
本發明的混合物一般如下製備在水溶液中合併(a)上述任一細胞群；和(b)大量上述任一微載體。優選地也向混合物中加入可溶性膠原，或上述一種或多種替代物。
為了製備這些含有一種或多種上述試劑的混合物，向混合物中加入有關試劑(結合或包封於上述任一種固體底物中)，以及上述其它成分。試劑和固體底物能一起或以任何順序分開加入混合物中。另外，也能向混合物中加入分泌一種或多種所述試劑的第二種(任選地，第三、第四、第五、第六或更多種)培養的脊椎動物細胞群。此外，也能向混合物中加入一種或多種上述固體底物，它們包含一種或多種與試劑結合的物質(例如肝素或硫酸乙醯肝素)。也能向混合物中加入角質細胞。
多肽(例如，醫學上有用的多肽)，如以上所列的，可以通過一種處理方法輸送給患者，該方法包括提供含有細胞(例如，分泌目的多肽的細胞)的本發明的上述任一種混合物，將製品導入患者的所選部位，如皮下、腹膜內、網膜內、腎小囊下、腹股溝、肌內或鞘內部位。當細胞產生的多肽是促進創傷癒合的多肽(例如PDGF或IGF-I)時，能將混合物導入預先存在的創傷部位。向患者中導入混合物可通過適合於液體懸液的任何工具例如，移液管、導管或任選地加有注射針頭或導管的皮下注射器。本發明包括一種方法，其中向動物中導入混合物與由成分(例如，培養的脊椎動物細胞、微載體和膠原)形成混合物基本上同時發生。如上所述，細胞可來源於取自患者的一種或多種細胞，優選地用編碼多肽的外源DNA體外轉染。此外，它們也可以是自然分泌多肽或行使希望的代謝功能的細胞(例如角質細胞或胰腺β細胞)。細胞能通過基因激活誘導，分泌多肽，分泌更大量的多肽，或行使希望的代謝功能。用於向患者輸送多肽的合適的液體混合物可以是(a)上述任一種；或(b)缺少微載體的上述任一種。
本發明也包括含有本發明的上述任何液體混合物的容器。容器可以是，例如，玻璃或塑料皮下注射器、瓶、試管、搖瓶或小瓶。也可以是塑膠袋，例如，血袋。例如，容器能用於將本發明的混合物從生產地點或零售點運輸到使用地點，例如醫院或醫務室或獸醫室。例如，將容器的內容物保持在約8℃以下，能抑制在向患者中導入混合物之前的膠凝作用。在使用另一種容器(例如小瓶或瓶)時，可在基本上發生膠凝之前，將混合物轉移到一種適於向患者中導入該混合物的裝置(例如皮下注射器或血袋)中。本發明的這種容器可與運輸材料(例如運輸容器)一起包含於一個試劑盒中。
本發明也表徵了一種包含運輸容器的試劑盒，其包含(a)第一個容器，其中含有(i)表達一種多肽的培養的脊椎動物細胞群(例如表達多肽的遺傳工程化細胞)，和(ii)大量微載體；(b)第二個容器，含有膠原溶液；和(c)第三個容器，含有液體培養基。
在膠原溶液中有足量的膠原，使得通過混合容器(a)、(b)和(c)內容物形成的混合物膠凝。膠原溶液可以是酸性pH，培養基可以是鹼性pH。欲導入動物中的混合物用試劑盒製備，包括(a)合併第二個和第三個容器中的內容物，形成膠原/培養基溶液；和(b)將膠原/培養基溶液與第一個容器的內容物合併，形成混合物。步驟(b)及向患者導入液體混合物應當在膠原/培養基溶液形成後不久進行，即，在膠原恰好膠凝之前，混合物不再是液體時。第二個容器中膠原溶液的酸性pH(約pH2.0-pH4.0)防止膠原在貯存中膠凝。因此，直到用鹼性培養基將酸性膠原溶液中和為約pH7.2-7.8、優選地約7.4-7.8時才發生混合物膠凝，形成固體基質。此外，第二個容器中的膠原溶液可以約為pH7.2-7.8，優選地約7.4-7.8，通過將膠原溶液保持在低於10℃的溫度下(例如，約3℃-8℃)，直到混合併導入動物中之前，來抑制膠凝。在這兩種情況中，待形成混合物後，立即導入動物中，即，在聚合繼續超過能容易地將混合物轉移到植入部位時之前。試劑盒優選地包含包裝材料和根據本發明的方法的使用說明書。
此外，試劑盒也可包含運輸容器，包括兩個容器(a)第一個容器，其中含有(i)表達一種多肽的培養的脊椎動物細胞群(例如表達多肽的遺傳工程化細胞)，和(ii)大量微載體；和(b)第二個容器，含有膠原溶液。
在膠原溶液中有足量的膠原，使得通過混合容器(a)和(b)的內容物形成的混合物膠凝。膠原溶液可以是酸性pH。此時，可在混合物形成之前，用鹼性溶液(如濃度約為0.01N-1.0N的NaOH溶液)將膠原溶液的pH調節為約7.2-7.8，優選地約7.4-7.8。試劑盒可任選地包含(1)第三個容器，其中含有這種鹼性溶液，和/或(2)一種pH指示劑，如pH試紙、度量計或含染料的溶液。此外，第二個容器中的膠原溶液也可包含pH指示劑染料。
在另一個實施方案中，第二個容器中的膠原溶液約為pH7.2-7.8，優選地約7.4-7.8，通過將第二個容器的內容物保持於8℃以下，直到混合物形成前，來抑制膠凝作用。另外，在混合物形成之後一般立即將混合物導入動物中，除非混合物保持在8℃以下，以防止膠凝作用。
在所有情況下，試劑盒優選地包含合適的包裝材料和標籤和/或詳細使用說明書。包裝材料可能包括，例如，適於將混合物成分運輸到零售商處或使用地點(例如醫院或醫務室)的容器。合適的運輸容器包括，例如塑料(或其它合成聚合物)、泡沫聚苯乙烯、紙板、木材或金屬盒。紙或塑料(或其它合成聚合物)袋、包裹或薄膜包裝也能用作運輸容器。運輸容器也可包括防撞擊材料，如塑料(例如聚苯乙烯)纖維或碎屑、泡沫包裹或碎紙，或具有適於容納容器的狹槽的模製塑料，並且可以是隔熱的。
這些試劑盒中使用的容器可以是玻璃或塑料皮下注射器、瓶、試管、搖瓶或小瓶。也可以是塑膠袋，類似於血袋。它們能置於隔熱容器中，以使一種或多種成分保持在恆定溫度，例如，約8℃以下的溫度。
在這些試劑盒中，膠原可以是此處列出的任何類型。而且，膠原能用此處所述的任何替代物代替或補充。培養的脊椎動物細胞可以是所列出的任何細胞，它們能用此處所述的任何方法產生和/或遺傳改造。這些細胞表達的多肽和微載體可以是上述任何種類。在任一種或多種容器中能含有上述非膠原纖維。
這些試劑盒在任何容器中還可含有一種或多種(例如，二、三、四、五、六、七、八、九或十種)試劑，例如，促進血管形成的因子、細胞因子、生長因子或抗壞血酸。試劑可以是此處列出的任何試劑。與試劑任選地結合的固體底物的例子如上所述。在試劑盒的容器中任選地也含有第二種、第三種、第四種、第五種、第六種、第七種、第八種、第九種或第十種培養的脊椎動物細胞群，它們分泌一種或多種(例如，二、三、四、五、六、七、八、九或十種)試劑，例如，如上所述的促進血管形成的因子、細胞因子或生長因子。
當試劑盒包含成纖維細胞作為培養的脊椎動物群之一時，試劑盒的容器還可含有如上所述的內皮細胞和/或角質細胞，和任選地角質細胞分化因子(例如，濃度為1.5-2mM的鈣離子)。例如，成纖維細胞和內皮細胞和/或角質細胞能從同一個體獲得。
本發明也表徵了一種將混合物導入患者內的裝置。該裝置包括至少兩個(例如，兩個、三個、四個、五個或六個)容器，每一個都有一個與輸送工具液體連通的出口。該裝置可含有(a)膠原水溶液，其中膠原可以是此處列出的任何膠原，(b)表達此處公開的任何多肽的培養的脊椎動物細胞群(例如表達任何這種多肽的遺傳工程細胞)，和(c)大量上述任一種微載體。每個容器中都能含有(a)、(b)或(c)中的一種或多種。在膠原溶液中有足量的膠原，使得通過混合成分(a)、(b)或(c)形成的混合物膠凝。一個或多個容器能與具有兩端的活塞結合，第一端適於插入容器的內部，第二端適於從容器內部延伸出來。輸送工具可以是注射針頭或導管或其它管，它們有(a)兩個或多個適於與容器出口液體連通的入口，和(b)一個出口。此外，輸送工具也可以是一個轉接器，它具有一個與每個容器的出口液體連通的連接體、一個混合室和一個與注射針頭、導管或其它管液體連通的出口；該連接體可包括至少兩個入口(例如，兩個、三個、四個、五個或六個)，每一個均只與一個容器的出口液體連通。該裝置還可含有一個或多個物理連接至少兩個容器的連接體。另外，每個活塞的第二個末端也可與壓力板連接。該裝置也可包含其它任何細胞群，膠原、非膠原纖維或此處所述的試劑的替代物。
在此使用時，「固體底物」是一種物體，或大量物體(成形的，例如，作為顆粒或線)，用作固體底物中所含或與之結合的物質(例如，促進血管形成的因子)的貯存器或庫。該物質逐漸從固體底物釋放到環境中。當固體底物是珠形時，珠一般近似於球形，直徑約為0.005-2.0mm。當固體底物是線形時，線的直徑一般約為0.01-1.0mm。在凝膠形成之前，線可以編織或摺疊到網篩中，或切割成(約5-10mm的)小片。當線摺疊時，其長度應當約為用來生產相關雜合基質的模子的直徑的1-3倍(例如約2倍)。在此使用時，「固體底物」不是細胞。
除非另外說明，此處使用的所有技術和科學術語具有與本發明所屬領域技術人員通常理解的相同的含義。如果衝突，以本文件(包括定義)為準。優選的方法和材料在以下敘述，儘管在實施或測試本發明時也能使用與此處所述類似或相當的其它方法和材料。此處描述的材料、方法和實施例只是說明性的，並非旨在限制。此處提及的所有公開文本、專利申請書、專利和其它參考文獻均完整引用作為參考。
根據權利要求書，和以下的詳述，本發明的其它特點和優點將是顯然的。
附圖簡述
圖1是hFVIII表達質粒pXF8.198的圖譜。
圖2是一張線圖，顯示植入了肝素-Sepharose雜合膠原基質(HSHCM)的小鼠血漿中的人因子VIII(hFVIII)水平，該HSHCM中含有產生hFVIII的細胞和用鹼性成纖維細胞生長因子(bFGF)包被或未包被的肝素-Sepharose珠。
圖3是一張線圖，顯示植入了HSHCM的小鼠血漿中的hFVIII水平，該HSHCM中含有產hFVIII的細胞、兩種微載體之一和bFGF包被或未包被的肝素-Sepharose珠。
圖4是一張線圖，顯示植入了HSHCM的小鼠血漿中的hFVIII水平，該HSHCM中含有產hFVIII的細胞和用不同濃度bFGF包被的肝素-Sepharose珠。
圖5是一張線圖，顯示植入了HSHCM的小鼠血漿中的hFVIII水平，該HSHCM中含有產hFVIII的細胞、bFGF包被的肝素-Sepharose珠、血管內皮生長因子(VEGF)包被的肝素-Sepharose珠，或bFGF包被的肝素-Sepharose珠和VEGF包被的肝素-Sepharose珠的混合物。
圖6是描述pXVEGF.1質粒的圖示。
圖7是一張線圖，顯示植入了HSHCM的小鼠血漿中的hFVIII水平，該HSHCM中只含有產hFVIII的第一種細胞群，或者還含有產生VEGF的第二種細胞群。
圖8是一張線圖，顯示皮下注射1mL或2mL I-HSHCMM的小鼠血漿中的hFVIII水平，該I-HSHCMM中含有產hFVIII的細胞和bFGF包被的肝素-Sepharose珠。
圖9是hFVIII表達質粒pXF8.186的圖譜。
圖10是一張線圖，顯示網膜內注射下列物質的小鼠血漿中的hFVIII水平產hFVIII的細胞，產hFVIII的細胞和bFGF(50ng)包被的肝素-Sepharose珠，或產hFVIII的細胞和VEGF(100ng)包被的肝素-Sepharose珠。
圖11是一張線圖，顯示網膜內注射下列物質的小鼠血漿中的hFVIII水平產hFVIII的細胞，產hFVIII的細胞和bFGF(500ng)包被的肝素-Sepharose珠，或產hFVIII的細胞和VEGF(100ng)包被的肝素-Sepharose珠。
圖12是一張線圖，顯示網膜內注射下列物質的小鼠血漿中的hFVIII水平產hFVIII的細胞和微載體，微載體和肝素-Sepharose珠，微載體和bFGF(500ng)包被的肝素-Sepharose珠，或微載體和VEGF(100ng)包被的肝素-Sepharose珠。
圖13A是能用來同時形成本發明的混合物並將其輸送給患者的裝置的圖示。
圖13B是圖13A所示裝置的轉接器4組件的橫斷面視圖。
發明詳述以下所述的實施例說明本發明的幾個實施方案。這些實施例只是為了說明目的，並非意在限制。
實施例I肝素-Sepharose雜合膠原基質(HSHCM)概述HSHCM是通過將下列成分混合在一起產生的濃縮的Dulbecco’s改良Eagle’s培養基(DMEM)、膠原(例如，鼠尾I型或合適的備選物，例如，人胎盤I型或III型膠原)、微載體(例如，如上所述的膠原大孔微載體或多孔明膠微載體)、未包被或用血管生成因子、細胞因子或生長因子(例如鹼性成纖維細胞生長因子(bFGF)、血管內皮生長因子(VEGF)或血小板衍生生長因子(PDGF))包被的肝素-Sepharose珠，和表達治療蛋白的細胞。在一個備選實施方案中，將多種細胞株混合到基質中，一種細胞株表達目的治療蛋白，另一種細胞株表達血管生成因子、細胞因子或生長因子。也能使用既表達治療蛋白又表達血管生成因子或生長因子的一種細胞株。在該實施方案中，肝素-Sepharose珠成分可能未包被，或用引入細胞株表達的相同或不同的生長因子包被，或者能同時省去。
微載體的製備用於生產基質的膠原微載體的製備如下。將膠原微載體(CellexBiosciences cat.#YB00-0015UW)從廠商提供的原始瓶(每瓶約10ml)中轉移到50ml錐形管中(每瓶一管)。使微載體在管中沉澱，吸去貯存緩衝液。加入微載體洗滌培養基(含1％小牛血清和1％青黴素/鏈黴素的DMEM)，至刻度管的50ml刻度，使微載體沉澱，吸去培養基。這一系列洗滌步驟總共重複4次。用25ml塑料移液管將微載體轉移到250ml三角燒瓶中，微載體的體積限制為每個250ml燒瓶100ml。加入微載體洗滌培養基至250ml刻度，燒瓶加蓋，並置於37℃的組織培養箱中2-3小時。從培養箱中取出燒瓶，使微載體沉澱，吸去洗滌培養基。這一系列溫育和洗滌步驟總共重複3次。
明膠微載體的製備如下進行。將1克幹Cultisphere-GLTM明膠微載體(Hyclone目錄#DG-1001-00)置於含50ml無鈣或鎂磷酸緩衝液(PBS)的100ml玻璃瓶中。使明膠微載體在室溫下水合至少1小時。在121℃下高壓滅菌15分鐘。去除PBS，用DMEM+1％小牛血清+1％青黴素-鏈黴素洗滌3次(每次洗滌50ml)，使明膠微載體適用於基質。在洗滌之間輕輕渦旋明膠微載體並使之沉澱。調節的明膠微載體能在使用之前貯存於4℃。
肝素-Sepharose珠的製備與Sepharose瓊脂糖珠偶聯的肝素為肝素結合生長因子(如bFGF、VEGF和PDGF)的附著提供了固體支持。Sepharose是Pharmcia Biotech生產的一種高度交聯的瓊脂糖樹脂，並且是廠家的註冊商標。能使用與不同類型支持基質(例如聚合物)連接的肝素，代替肝素-瓊脂糖珠。肝素-Sepharose6 Fast Flow珠(Pharmcia BiotechCat#17-0998-03)用dH2O洗滌3次，每次洗滌用5倍珠體積。加入dH2O後輕輕渦旋珠，並在每次洗滌步驟之間以500×g離心。121℃高壓滅菌20分鐘。將珠平衡為pH7.2-7.4，方法是用PBS充分洗滌，直到珠PBS的1∶1漿液的pH為7.2-7.4。將珠以與PBS 1∶1的漿液貯存於4℃下。
血管生成因子和生長因子如下與肝素-Sepharose珠結合。將平衡珠置於適當大小的無菌管中(例如，1.5ml Eppendorf管或15ml錐形管)，500×g離心4分鐘。用PBS洗滌2次，每次洗滌之間有一個離心步驟。將血管生成因子和生長因子(例如，對於bFGF為50μg/ml)加到PBS中的珠中，PBS體積與珠的堆積體積相等，產生1∶1的珠∶PBS漿液，在室溫下旋轉(例如，用NutatorTM平臺)進行結合1小時。從珠中吸去含任何未結合生長因子的PBS，用體積與珠堆積體積相等的PBS洗珠1次。去除PBS，將珠置於冰上直到基質形成。
HSHCM的製備用來製備HSHCM的不同成分在表1和表2中列出。這些表描述了用膠原微載體(表1)或明膠微載體(表2)生產HSHCM。每張表都列出了每ml生產培養基的每種成分的體積，以及生產例如10×4mlHSHCM所必需的體積。(下文中基質的體積和濃度分別是指收縮前的體積和濃度。)基質「預混合物」由10×DMEM、7.5％NaHCO3、1MHEPES、青黴素-鏈黴素、L-穀氨醯胺和dH2O組成。預混合物一般在與膠原、細胞和血管生成因子包被珠混合前1小時或2小時製備，並保存於4℃。通過胰蛋白酶消化收穫將要包埋在HSHCM中的細胞，並測定細胞數。在室溫下，以1500轉/分(500×g)離心需要數量的細胞(每個基質的細胞數乘以產生的基質的總數)。將細胞沉澱重懸浮於體積等於如表1和表2所示的HSHCM生產培養基總體積10％的生長培養基中。每ml基質的細胞密度必要時可改變(例如，每ml基質0.1-10×106細胞)。由於是以生產培養基總體積10％的體積加入細胞懸液，所以每ml懸液的細胞數是每ml基質希望的細胞密度的10倍(例如，1-1000×106細胞/ml)。將適當體積的微載體置於錐形管中，向微載體中加入細胞懸液。用10ml塑料移液管，將細胞和微載體混合在一起，並在室溫下放置約10-15分鐘，之後加入生產培養基中。將預混合物置於冰上，向預冷的預混合物中加入膠原溶液(例如鼠尾膠原(RTC))，並用10ml塑料移液管充分混合。然後通過加入如表1或表2所示體積的1N NaOH，將生產培養基的pH調節為約7.8。將細胞/微載體混合物加到中和的生產培養基中，並用10ml塑料移液管混合。向珠中加入體積等於肝素-Sepharose珠堆積體積的生長培養基，將珠轉移到生產培養基中，並用10ml塑料移液管混合。將一定體積的終HSHCM生產培養基加入適當大小的培養皿中。例如，4ml HSHCM生產培養基一般加到60mm培養皿中，10ml加到100mm培養皿中，30ml加到150mm培養皿中。改變生產培養基體積與培養皿表面積之比能改變HSHCM的厚度。將含有HSHCM生產培養基的培養皿轉移到溫度為37℃、溫度為95％-98％、CO2水平為5％的培養箱中。1小時後，從培養箱中取出培養皿並檢查。如果HSHCM生產培養基已經膠凝，則加入5ml生長培養基補充HSHCM。否則，將培養皿放回培養箱中再放置1小時，或者直到聚合完成，此時加入5ml生長培養基補充HSHCM。向生長培養基中補充10-100ng/ml用來包被HSHCM的肝素-Sepharose珠的相同生長因子或血管生成因子。
表1 HSHCM生產培養基組成膠原微載體組成
*在調節pH後加到生產培養基中表2 HSHCM生產培養基組成明膠微載體組成
*在調節pH後加到生產培養基中
HSHCM的體外保存和評價通過在第1天、然後每周2-3次補充基質，將HSHCM培養保存，使用下列方案1.小心吸去培養基2.加入需要體積的合適的生長培養基，考慮每種基質使用的培養皿的大小。培養基中可補充抗壞血酸2-磷酸和/或TGF-β(例如10-50μg/ml抗壞血酸2-磷酸和/或1-10ng/ml TGF-β)。用來補充基質的生長培養基的體積一般是能加入每個培養皿大小的最大體積，例如，每個60mm培養皿10ml，每個100mm培養皿20-30ml，每個150mm培養皿100-150ml。
基質直徑和每個基質的細胞數量如下確定。
HSHCM的直徑能用下列步驟確定1.將含待測基質的培養皿放置在暗背景上的米尺上方。
2.如希望地記錄直徑(釐米)例如，前2周每日，前2周後每隔一天，實驗過程中細胞定量當天。
可如下從HSHCM中回收細胞並定量1.酶消化雜合膠原基質a.製備膠原酶IA的PBS溶液(HSHCM為1.0mg/ml，補充有抗壞血酸2-磷酸和/或TGF-β的HSHCM為2.0mg/ml)。
b.將膠原酶溶液分配到15ml錐形離心管中，對於接種1-5×106細胞的基質為每個基質1ml的體積，對於接種超過5×106細胞的基質為5ml。製備與將要計數的基質一樣多的膠原酶管。
c.用扁平鉗從培養皿中取出每個基質，用吸收紙巾(如果細胞在計數後棄去)或用無菌吸收墊從基質中仔細吸乾過量的液體。
d.將每個基質置於單個含膠原酶管中，蓋緊，置於組織培養箱中設為40轉/分的軌道搖床上。
e.溫育基質約1小時，或直到消化完全。為了加速消化，以5分鐘的間隔通過移液破碎沉澱。
2.細胞計數
a.利用離心管側的刻度測量消化的每種細胞懸液的總體積。
b.為了測定細胞生存力，吸出0.1ml細胞懸液加到1.5ml微量離心管中的0.1ml 0.08％臺盼藍中。輕拍離心管混合。
c.用血球計數器計數存活和死亡的細胞。必要時，在加入臺盼藍之前進一步用PBS稀釋細胞懸液。計算細胞總數，考慮在步驟2a中測量的總體積。
實施例II該實施例描述了如實施例I所述製備的HSHCM的體內植入。含有未包被的肝素-Sepharose珠或bFGF包被的肝素-Sepharose珠(50μg/ml堆積珠；10μg總bFGF/基質)的HSHCM如表1所述製備。每4ml基質用5×106HF743 B1-35細胞形成，這是一種含有質粒pXF8.198(圖1)並以20 000-30 000mU/24h/106細胞的水平表達hFVIII的人包皮成纖維細胞克隆。製備和轉染適用於本發明的基質和混合物的細胞的更詳細步驟在WO93/09222(PCT/US92/09627)中提供，在此引用作為參考。HSHCM在植入之前培養保存2天。為了皮下輸入基質，Rag-2小鼠(129S6/SvEvTac-[KO]Rag2，Taconic Farms)如下麻醉和準備。小鼠以0.0175ml/g體重的劑量腹膜內注射AvertinTM(2％w/v2，2，2-三溴乙醇和2％v/v 2-甲基2-丁醇溶液)。使麻醉的小鼠側臥，植入部位剃毛並用乙醇和BetadineTM(0.75％碘溶液)消毒。在動物左側、肋骨的下部和尾部的皮層上切一個2cm的切口，清洗皮膚和外斜肌層之間的筋膜，並用無菌平頭剪擴大。用10ml PBS洗滌2次製備用於植入的HSHCM。每個基質用無菌匙形刀折成四分之一，用無菌刀插入清洗過的皮膚間隙中。切口用創傷夾閉合。
在將小鼠置於含有甲氧氟烷(Pittman-Moore)的大燒杯中直到達到輕度麻醉後，通過眼眶後採血收集血液。利用基於兩種小鼠單克隆抗體的hFVIII ELISA測定血漿hFVIII[Hornsey等人(1992)Transfus.Med.2(3)223-229]。通過消化並計數為此目的從HSHCM中回收的細胞確定估計的每個基質的細胞數。含有未包被的肝素-Sepharose珠的HSHCM平均每個基質有2.8×106個細胞，含有bFGF包被的肝素-Sepharose珠的HSHCM平均每個基質有3.1×106個細胞(每種條件下n＝3個基質)。植入當天，對於含有未包被的和bFGF包被的珠的HSHCM(每種條件下n＝3個基質)，每種基質類型的hFVIII體外產量分別是71 165mU/24h和85 657mU/24h。如圖2所示，與不含生長因子的HSHCM相比，含有bFGF包被的肝素-Sepharose珠的HSHCM導致在宿主小鼠中檢測到明顯升高的血漿hFVIII水平(每種條件下n＝10隻小鼠)。在第0天沒有可檢測到的hFVIII，在第14天達到血漿峰水平。
下列實施例描述了包括向Rag-2小鼠中皮下植入HSHCM(如實施例1所述製備)的其它研究，使用以上介紹的HF743-B1-35 hFVIII分泌細胞克隆。
實施例III含有未包被的肝素-Sepharose珠或bFGF包被的肝素-Sepharose珠的HSHCM(50μg/ml堆積珠，10μg總bFGF/基質)，以及膠原微載體或明膠微載體，分別如表1和表2所述製備。植入當天每個基質的平均細胞數和每個基質的hFVIII產量(每種條件下n＝3個基質)在表3中列出。
表3 植入當天每個HSHCM的細胞數和hFVIII產量概況
該實驗中包括皮下(SC)細胞對照，其如下製備。以與製備HCM相同的方法通過胰蛋白酶消化收集細胞。計數胰蛋白酶消化的細胞，以500×g離心，在Hank’s緩衝液(不含鈣和鎂)中重懸浮，離心，在一定體積的PBS中重懸浮，根據收集後的原始細胞計數，得到100×106細胞/ml。計數細胞/PBS漿液中的細胞，將懸液中的細胞密度調節為50×106細胞/ml PBS。對於每次注射，將總共0.15ml的細胞漿液吸到1cc GlasspakTM注射器中，該注射器加上22G/1英寸針頭。向小鼠左側、肋骨下部和尾側皮下注射細胞漿液。考慮針頭的空隙容積，向每隻對照動物中注射總共0.1ml或5×106個細胞(每種條件下n＝5隻小鼠)。
圖3顯示，與其它條件下相比，含有明膠微載體和bFGF包被的肝素-Sepharose珠的HSHCM在植入小鼠中時產生水平明顯升高的hFVIII(每種條件下n＝10隻小鼠)。表達模式類似於在實施例II中觀察到的，直到第7天才可檢測到hFVIII，在第14天有最高表達。在植入1天後的任何時間點，接受皮下細胞注射的小鼠血漿中都沒有可檢測到的hFVIII。
實施例IV含有未包被的或bFGF包被的肝素-Sepharose珠(12.5、25或50μg/ml堆積珠)的HSHCM用膠原微載體配方製備(表1)。摻入包被的珠後每個基質的bFGF總量估計分別約為2、4和10μg。植入當天每個基質的平均細胞數和每個基質的hFVIII產量(每種條件下n＝3個基質)總結於表4中。
表4 植入當天每個HSHCM的細胞數和hFVIII產量概況
圖4表明，與含有4μg和2μg bFGF的基質相比，在植入含有10μg bFGF的基質後，血漿hFVIII水平明顯升高(每種條件下n＝5隻小鼠)。表達模式類似於在實施例II和III中觀察到的。
實施例V含有未包被的、bFGF包被的或bFGF和VEGF兩者包被的肝素-Sepharose珠的HSHCM根據明膠微載體配方製備(表2)。對於含有兩種生長因子包被的珠的HSHCM組，每個基質接受0.1ml bFGF包被的珠和0.1mlVEGF包被的珠，以使珠體積與以前的實驗一致。對於該條件，每種生長因子的包被濃度是100μg/ml堆積珠，使每個HSHCM含有總共大約10μg的每種生長因子。在HSHCM+bFGF+VEGF中，含有大約每種10μg的bFGF和VEGF。植入當天每個基質的平均細胞數和每個基質的hFVIII產量(每種條件下n＝3個基質)總結於表5中。
表5 植入當天每個HSHCM的細胞數和hFVIII產量概況
實驗中包括網膜內(IO)植入對照，以便將皮下輸送來自HSHCM的hFVIII與已經在小鼠模型中證明成功用於輸送hFVIII的另一種植入方法相比較。IO對照如下製備。以與製備HCM相同的方法通過胰蛋白酶消化收集細胞。計數胰蛋白酶消化的細胞，以500×g離心，在Hank’s緩衝液(不含鈣和鎂)中重懸浮，再次離心，在一定體積的PBS中重懸浮，根據收集後的原始細胞計數，得到15×106細胞/ml。計數細胞/PBS漿液中的細胞，將體積等於5×106細胞的細胞懸液分配到1.5ml無菌微量離心管中，並在微量離心機中以500×g離心4分鐘。含有細胞沉澱和PBS的離心管置於冰上，用下列方法將每種細胞沉澱植入Rag-2小鼠的網膜隱窩中。在植入細胞之前，用1.25％AvertinTM麻醉小鼠，使其側臥。肋骨之間的左脅與膝用酒精墊擦拭，並用BetadineTM預備。在肋骨後部和脊柱腹側切一個小(0.5-1.0cm)切口。暴露脾臟，並輕輕取出。沿顱側和內側之上的脾臟軸線向與脾臟門表面相鄰的薄膜內注射細胞。將脾臟放回腹腔中，閉合切口。
圖5表明，與第14天和第21天的其它條件相比，對於含有bFGF和VEGF組合的HSHCM，血漿hFVIII水平明顯升高(每種條件下n＝5隻小鼠)。網膜內注射細胞導致第1天血漿hFVIII水平明顯升高，但到下一時間點(第7天)，IO對照中觀察到的水平下降到用含有生長因子的植入體獲得的水平之下(每種條件下n＝5隻小鼠)。
實施例VI製備含有2種成纖維細胞克隆(表達hFVIII的HF743 B1-35，和含有質粒pXVEGF.1並表達VEGF的HF811-M15(圖6))組合的HSHCM用於植入[Kock等人，Science 2461309-1312，1989]。HF811-M15克隆在植入時平均產生85ng VEGF/24h/106細胞。按照膠原微載體配方(表1)製備基質。肝素-Sepharose珠成分未包被。兩組HSHCM用一種或另一種克隆以每個基質5×106細胞製備。另兩組用恆定數量的HF743 B1-35細胞(5×106)和另外1×106或2.5×106個HF811-M15細胞製備。表6總結了不同條件和每種條件下hFVIII和VEGF的體外產生水平(每種條件下n＝5個基質)。
表6 植入當天每個HSHCM的hFVIII和VEGF產量概況
圖7顯示了每種HSHCM條件下隨時間變化的血漿hFVIII水平。含有2.5×106個HF811-M15細胞的HSHCM組產生最高的hFVIII血漿水平，在第14天時達到峰值，在第42天前下降，此時hFVIII不可檢測到。含有1×106個HF811-M15細胞的HSHCM產生略低於含有2.5×106個HF811-M15的組，但明顯高於不含產VEGF細胞的HSHCM的血漿hFVIII水平，表明VEGF對植入物輸送hFVIII產生劑量依賴的影響。
血漿標本中VEGF的量通過ELISA檢測(RD系統VEGF免疫測定試劑盒)。結果總結於表7中。在植入由2.5×106或5×106個HF811-M15細胞製成的HSHCM的小鼠的血漿中，從第14天到第28天可檢測的VEGF下降。在植入不含HF811-M15細胞或由1×106個HF811-M15細胞製成的HSHCM的動物血漿中，VEGF水平不可檢測。第1天和第7天的血漿標本不可測定，但數據表明VEGF水平在植入時與第14天之間的某一點達到峰值。
表7植入含有不同數量HF811-M15細胞的HSHCM的Rag-2小鼠血漿中VEGF表達概況
實施例VII用來製備本發明的基質的混合物的體積基於0.18cm的液柱高度(即深度)。發現在60mm培養皿(半徑2.65cm)中體積為4ml的混合物可產生對於該尺寸培養皿最佳的細胞生存力和蛋白質表達。根據公式V＝πr2h，其中V＝混合物體積，r＝培養皿半徑，h＝液柱高度(即培養皿中混合物的深度)，最佳體積4ml＝π(2.65cm)2h，因此最佳深度＝0.18cm，最佳r2/V比＝1.8。下表(表8)表明不同培養皿尺寸的最佳體積，包括得出0.18cm的高度的60mm尺寸。
表8 不同尺寸培養皿的最佳體積和r2/V比
*根據方程式體積＝πr2×0.18cm儘管發現約1.8的比率對於細胞生存力和蛋白質表達是最佳的，但約1.0-3.0、優選地1.5-約2.0的比率是足夠的。這分別對應於約0.21cm和約0.16cm的深度。
實施例VIII如下製備本發明的HSHCM用於植入人體中。
從組織培養皿中收集希望的細胞，一般是來自患者的穩定轉染的自體細胞，處理用於通過上述任何方法生產HSHCM。根據使用較大或較小基質，向患者體內植入不同數量的基質，和/或當構建基質時使用每種細胞表達不同水平產物的細胞，對於特定患者的劑量(即，基質產生的生理有效量的治療產物)可能不同。患者中產生的治療產物的量也可能由於基質中的細胞暴露於改變治療基因表達的藥理或生理信號而改變。例如，如果治療基因位於糖皮質激素反應性啟動子控制之下，則細胞在體內暴露於藥物(如地塞米松)(以確保藥物到達植入體的方式對患者施用藥物)將改變治療基因的表達。
一般植入在60mm培養皿中產生、每個基質含有約10×106個細胞的大量小直徑基質(約1-2cm)。因此，用10個小基質能植入約1億個細胞。使用細胞密度明顯提高的基質(例如，通過摻入抗壞血酸2-磷酸產生的)將產生特定患者所需的較少量基質。此外，較大的培養皿(直徑＞150mm)也能用作模子來生產能直接植入或切成可植入的較小片的較大基質。
在植入之前，基質能在生長培養基或者能使細胞保持存活的其它任何溶液中貯存或運輸。此外，基質也能通過在合適的冷凍培養基中冷凍而冷藏，這些培養基能在植入前洗掉。
基質能在多個部位植入，包括但不限於皮下、腹膜內、脾內、網膜內、腹股溝、鞘內、心室內和肌內部位，以及淋巴結內或脂肪組織內。在適當部位切開一個手術切口，插入基質，閉合切口。
實施例IX有許多靜態和灌注大規模體外培養系統適合用於利用在本發明的雜合基質中保存的細胞進行蛋白質生產。這些選擇在靶蛋白純化之前的必要補料和培養基收穫步驟中提供了不同水平的便利。以下敘述幾點。
1.HSHCM在常規培養皿中形成並成熟後(例如，在10-25天溫育後)，能將大量HSHCM無菌轉移到無菌微載體搖瓶中(250-100ml容量)。這些HSHCM在可使每種基質內的存活細胞密度達到最大的條件下生產並保存。對於每1ml基質體積，一般需要5-20ml的培養基。配製蛋白質生產培養基，使之含有最少的不確定成分(例如血清)，可包含添加的旨在使每個細胞的蛋白質產量達到最大的因子。將搖瓶放置在位於設置為30-70轉/分的磁力攪拌平臺上的37±1℃、5％±1％CO2潮溼培養箱中。1-3天後，將搖瓶轉移到等級100的生物安全櫃中，在不幹擾沉澱的基質的情況下，無菌吸去含有表達的蛋白質的生產培養基。向搖瓶中加入相當體積的新鮮蛋白質生產培養基，將搖瓶放回培養箱內的攪拌平臺中。
2.可將以上(1)中所述的基質無菌轉移到具有一個可控攪拌葉輪軸的1-5L生物反應器中(例如Brunswick)。通過生物反應器控制系統設置生產培養基水平。培養基收穫和補充由無菌封閉系統控制，以使汙染達到最小。
3.為產生大體積的HSHCM，由組成成分形成基質，並使之在組織培養滾瓶中膠凝。這些滾瓶以靜態直立位置溫育，直到基質收縮產生自由浮動結構(3-5天)。然後補充生長培養基，瓶中充5％CO2，置於37℃培養箱內的滾動裝置中。每2-3天補充生長培養基，直到HSHCM成熟(總溫育10-25天後)，此時HSHCM暴露於蛋白質生產培養基。1-3天後，將瓶轉移到等級100的生物安全櫃中，在不幹擾基質的情況下，無菌吸去含有表達的蛋白質的生產培養基。向瓶中加入相當體積的新鮮蛋白質生產培養基，將搖瓶放回滾動裝置中。
4.將HSHCM的成分通過可密封口無菌導入無菌透氣TeflonTM袋中。使成分在袋內膠凝，具有它的形狀和結構。將袋子在37±1℃、5％±1％CO2潮溼培養箱中溫育。當HSHCM收縮，體積減少時，調節生長培養基體積補償。培養基收穫和補充通過嵌入袋內的無菌連接管系統完成。使用有口的培養箱和延伸的管路能設計循環收穫/泵料系統，這將不需要在生產過程中從培養箱中取出袋子。
5.能將HSHCM的成分無菌導入定製設計的大容量熱成型盤中。最簡單的結構是具有氣體交換能力的開蓋矩形盤，其設計在CO2組織培養箱中使用。另一種設計包括一個封閉系統，它具有與培養基庫的通路，用於控制補料及培養基收穫，類似於生物反應室。
實施例X可注射肝素-Sepharose雜合膠原基質混合物(I-HSHCMM)的概述通過將下列成分混合在一起製備I-HSHCMM濃縮DMEM(不含酚紅)、鼠尾I型膠原(或合適的替代物，例如，人胎盤I型或III型膠原)；多孔微載體(例如，膠原大孔微載體或多孔明膠微載體)；任選的未包被或用血管生成因子或生長因子(例如鹼性成纖維細胞生長因子(bFGF)、血管內皮生長因子(VEGF)或血小板衍生生長因子(PDGF))包被的肝素-Sepharose珠；和表達治療蛋白的細胞。在一個備選實施方案中，將細胞株組合混合到膠原溶液中，一種細胞株表達目的治療蛋白，另一種細胞株表達血管生成因子或生長因子。也能使用同時表達治療蛋白和血管生成因子或生長因子的一種菌株。在該實施方案中，肝素-Sepharose珠成分可以不包被，或用引入細胞株表達的相同或不同的生長因子包被，或者能同時省去。本發明的可注射基質混合物包括不含膠原或此處公開的任何膠原替代物的基質。而且，本發明中包括不含血管生成因子或生長因子來源的混合物。也應當理解，混合物可能缺乏微載體，但這些混合物一般包含一種試劑，如血管生成因子、細胞因子、生長因子或抗壞血酸。儘管不是必要條件，但這些試劑能與此處所述的任何固體底物結合。這些固體底物能用作細胞附著的微載體，也能作為相關試劑的貯存庫。
微載體的製備和肝素-Sepharose珠的製備微載體和肝素-Sepharose珠如以上實施例1所述製備。在混合物形成前，通過用無血清PBS洗滌3-5次除去血清蛋白。
I-HSHCMM的製備用來製備I-HSHCMM的不同成分在表9中列出，表9描述了用明膠珠作為微載體的I-HSHCMM的製備。該表給出了每ml生產培養基的每種成分的體積，以及生產例如10×1ml和10×2ml I-HSHCMM所需的體積。基質「預混合物」由不含酚紅的4×DMEM、7.5％NaHCO3、1M HEPES、青黴素-鏈黴素、L-穀氨醯胺和dH2O組成。預混合物通常提前1小時或2小時製備並在4℃下保存。從組織培養容器中收穫將與基質成分一起注射的細胞，以500×g離心10分鐘獲得細胞沉澱。細胞沉澱用PBS洗滌1次，去除PBS，將沉澱重懸浮於體積等於I-HSHCMM生產培養基總體積10％的不含酚紅的1×DMEM中，如表9所示。每ml基質生產培養基的細胞密度可適當變化(例如每ml可注射基質0.1-10×106個細胞)。由於加入體積為生產培養基總體積10％的細胞懸液，每ml懸液的細胞數應當比每ml基質混合物的希望的細胞密度高10倍(例如，每ml 1-100×106個細胞)。在錐形離心管中放入適當體積的微載體(例如，Cultipheres)，將細胞懸液加到微載體中。用10ml玻璃移液管將細胞和微載體混合在一起，在摻入生產培養基中之前在室溫下放置約10-15分鐘。預混合物置於冰上，向預冷的預混合物中加入膠原溶液(例如鼠尾膠原(RTC))，並用10ml玻璃移液管充分混合。然後通過加入體積如表9所示的1N NaOH，將生產培養基調節為約pH7.8。以500×g離心5分鐘沉澱細胞/微載體混合物，吸去上清液，向管中加入一定體積的不含酚紅的DMEM，達到等於細胞懸液體積加微載體體積的終體積，如表9所示。向中和的生產培養基中加入細胞/微載體懸液，用10ml玻璃移液管混合。向珠中加入體積等於肝素-Sepharose珠包裝體積的不含酚紅的DMEM，將珠轉移到中和的生產培養基中，並用10ml玻璃移液管混合。在注射前一直將完全生產培養基置於冰上，注射時將其裝入適當大小的注射器中(例如10cc)。裝入後，注射器加上針頭(例如規格16)，並注射到希望的部位(例如皮下)。
表9 可注射HSHCMM生產培養基組成
*在調節pH後加入生產培養基中膠凝的混合物的體外評估如上所述，通過用16G針頭注射器注射，向適當大小的培養皿中加入一定體積的終I-HSHCMM生產培養基。例如，向35mm培養皿中加入2ml I-HSHCMM生產培養基，向60mm培養皿中加入4ml，向100mm培養皿中加入10ml，向150mm培養皿中加入30ml。改變生產培養基體積與培養皿表面積之比能改變HSHCM的厚度。然後將含有I-HSHCMM生產培養基的培養皿轉移到溫度為37℃、溼度為95％-98％、CO2水平為5％的培養箱中。1小時後，從培養箱中取出培養皿並檢查。如果I-HSHCMM生產培養基已經膠凝，則加入5m不含酚紅的DMEM補充HSHCM，否則，將培養皿放回培養箱中再放置1小時，或者直到聚合完成。
HSHCM在培養中保存希望的時間。用來補加基質的培養基體積一般是能加到每種培養皿大小中的最大體積，例如，每個35mm培養皿5ml，每個60mm培養皿10ml，每個100mm培養皿20-30ml，每個150mm培養皿100-150ml。每個基質的細胞數、細胞生存力和多肽生產水平如上所述測定。
實施例XI本實施例描述如實施例X所述製備的I-HSHCMM混合液的體外注射。含bFGF包被的肝素-Sepharose珠的I-HSHCMM混合液如表9所示製備，2ml注射體積以100μg/ml堆積珠，1ml注射體積以200μg/ml堆積珠(每個植入體輸送10μg總bFGF)。每個注射體積，摻入HF743 B1-35(一種含質粒pXF8.198(圖1)並以20000-30000mU/24h/106細胞的水平表達hFVIII的人包皮成纖維細胞克隆)以及微載體，以達到每次注射總共5×106個細胞。為了皮下導入混合物，Rag-2小鼠(129S6/SvEvTac-[KO]Rag-2，Taconic Farms)如上所述麻醉及準備。位於動物左側肋骨下部和尾側的植入部位剃毛，並用酒精和BetadineTM消毒。注射前，將完全I-HSHCMM混合液裝入10cc注射器中，其體積略高於希望的注射體積，以補償針頭的空隙體積。裝好的注射器加上16G針頭，立即向皮下部位注射I-HSHCMM。注射的溶液在皮膚組織與外斜肌之間的間隙內擴散。對注射點施加微小的壓力，從皮膚中緩慢拔出針頭。注射的溶液在注射後幾秒鐘之內開始凝固。在注射後立即將小鼠置於熱墊上，以防止可能的體溫過低。
如實施例II所述收集血液，利用基於兩種小鼠單克隆抗體的hFVIII ELISA測定血漿hFVIII。通過消化並計數為此目的從培養皿中形成的HSHCM(35mm培養皿中2ml)中回收並放置的細胞，確定每個膠凝基質的估計的細胞數。在評價細胞數和生存力之前，HSHCM培養保持2天，並如實施例X所述在無血清DMEM中保存。膠凝的HSHCM(每種條件下n＝3個基質)平均每個基質有3.51×106±0.8×106個細胞。回收細胞的生存力是84.5±2.4％。膠凝基質的hFVIII體外產量是68 851±199mU/24h。圖8顯示在向Rag-2小鼠中皮下注射HSHCM生產培養基後，隨時間變化的血漿hFVIII水平。誤差線表明平均值的標準誤(每個注射體積n＝5隻小鼠)。在注射1天後達到峰值表達。
實施例XII本實施例描述向裸鼠中單獨(即不含微載體)網膜內注射表達hFVIII的兔成纖維細胞，或與生長因子包被的肝素-Sepharose珠一起注射。肝素-Sepharose珠如實施例X所述用bFGF(1μg/ml堆積珠)或VEGF(2μg/ml堆積珠)包被。將包被珠分配到1.5ml聚丙烯微量離心管中，達到每個管50μl堆積珠的體積。用無菌吸收紗布通過毛細作用去除珠中的過量PBS。用常規方法從組織培養瓶中收穫RF261B2-106細胞，它是一種含有質粒pXF8.186(圖9)並以20000-25000mU/24h/106細胞的水平表達hFVIII的兔皮膚成纖維細胞克隆。離心沉澱胰蛋白酶消化的成纖維細胞(500×g，10分鐘)，用Hank’s平衡鹽溶液(HBSS)洗滌，離心，重懸浮於一定體積的PBS中，達到約為15×106細胞/ml的細胞密度。向空1.5ml微量離心管或含有50μl肝素-Sepharose珠的離心管中加入體積等於5×106的細胞，以500×g離心懸液3分鐘。通過去除PBS將含有珠和細胞的離心管的終容積調節為100μl。每種條件進行12個重複。含有細胞沉澱和細胞/珠漿液的離心管置於冰上，並運送到動物設施。
為了網膜內注射(IO)細胞和珠，如實施例II所述麻醉和準備裸鼠(NIH Swiss nude(nu-nu，TacNIH(S)-Hfh1 1nu，Taconic Farms))。使動物側臥，肋骨與膝之間的左脅用酒精墊擦拭，並用BetadineTM準備。在肋骨後部和脊柱腹側切一個小(0.5-1.0cm)切口。暴露脾臟，並輕輕取出。用20規格的插管沿顱側和內側之上的脾臟軸線向與脾臟門表面相鄰的薄膜內注射細胞沉澱和細胞/珠漿液。將脾臟放回腹腔中，閉合切口。
血液收集和hFVIII的測定方法如實施例II所述。圖10顯示在單獨注射細胞、注射細胞和bFGF包被(每個植入體總共50ng)的肝素-Sepharose珠、注射細胞和VEGF包被(每個植入體總共100ng)的肝素-Sepharose珠後，隨時間改變的血漿hFVIII水平。誤差線表明平均值的標準誤(每種條件n＝12隻小鼠)。在第1天達到峰值表達。與其它條件相比，細胞/珠/VEGF組合在第28天與第70天之間達到顯著升高的hFVIII水平。
實施例XIII本實施例描述向裸鼠中單獨網膜內注射表達hFVIII的兔成纖維細胞，或與生長因子包被的肝素-Sepharose珠一起注射。
肝素-Sepharose珠如實施例1所述未包被，或用bFGF(10μg/ml堆積珠)或VEGF(2μg/ml堆積珠)包被。將未包被的和生長因子包被的珠如實施例XII所述分配到離心管中。用常規方法從組織培養瓶中收穫RF302 B2-383細胞，它是一種含有質粒pXF8.186並以20000-25000mU/24h/106細胞的水平表達hFVIII的兔皮膚成纖維細胞克隆。如實施例VI所述處理細胞，分配到空的微量離心管或含有肝素-Sepharose珠的離心管中。網膜內注射、血液收集和hFVIII測定如圖11顯示在單獨注射細胞、注射細胞和未包被的肝素-Sepharose珠、細胞和bFGF包被(每個植入體總共500ng)的肝素-Sepharose珠、細胞和VEGF包被(每個植入體總共100ng)的肝素-Sepharose珠後，隨時間改變的血漿hFVIII水平。誤差線表明平均值的標準誤(每種條件n＝12隻小鼠)。hFVIII峰值表達在第1天發生，在第1、7和14天與其它所有條件相比，bFGF組顯著增高。在第7天，與單獨的細胞和細胞/未包被的珠組合相比，細胞/珠/VEGF組合達到顯著升高的hFVIII水平。
實施例XIV本實施例描述向裸鼠中網膜內注射表達hFVIII的兔成纖維細胞，以及大孔膠原微載體，或微載體與生長因子包被的肝素-Sepharose珠。
肝素-Sepharose珠如實施例I所述用未包被或用bFGF(10μg/ml堆積珠)或VEGF(2μg/ml堆積珠)包被。微載體和細胞如下所述製備。大孔膠原微載體(Cellex Biosciences)如實施例I所述處理。製備微載體的漿液(微載體∶條件培養基體積為1∶1)，向1.5ml微量離心管中加入0.1ml等份。這些離心管以500×g離心4分鐘，吸乾，用PBS洗滌2次。除去PBS，離心管在冰上貯存。向含有微載體的離心管中加入0.1ml肝素-Sepharose珠(未包被、bFGF包被或VEGF包被的)與PBS的1∶1(體積/體積)漿液，珠/微載體混合物以500×g離心4分鐘。每個管中都除去PBS，珠/微載體沉澱貯存於冰上。RF302 B2-383細胞如實施例XII所述處理。向每個只含有微載體或含有微載體和肝素-Sepharose珠的管中加入含有5×106個細胞的細胞懸液，離心管以500×g離心4分鐘。棄去每個管的上清液，加入10μl PBS。將離心管置於冰上並運送到動物設施。網膜內注射、血液收集和hFVIII測定如圖12顯示在注射細胞和微載體、細胞和微載體和未包被的肝素-Sepharose珠、細胞和微載體和bFGF包被的珠(每個植入體總共500ng)、細胞和微載體和VEGF包被的珠(每個植入體總共100ng)後，隨時間改變的血漿hFVIII水平。誤差線表明平均值的標準誤(每種條件n＝12隻小鼠)。hFVIII峰值表達在第1天發生，在第1、7和14天，與其它所有條件相比，bFGF組顯著增高。
實施例XV角質細胞是皮膚的表皮細胞，在組織中通常與成纖維細胞相鄰。對於適當的營養、分化信號和周圍胞外基質的產生和保持，這兩種細胞型彼此依賴。向此處所述含有成纖維細胞的任何基質或可注射混合物中添加角質細胞能以類似於皮膚中發生的方式有益於成纖維細胞。角質細胞和成纖維細胞能從同一皮膚活組織檢查中分離。在混合物形成時能同時加入角質細胞和成纖維細胞，或者能接種到含有成纖維細胞的收縮基質上。能刺激基質內或基質上的角質細胞分化，或者不刺激，這取決於生長培養基組成和培養條件。例如，生長培養基中鈣離子濃度提高，以及基質一側暴露於空氣，都能使基質內的角質細胞以類似於皮膚中發生的方式分層(Bell等人，J.Biomech.Eng.113113-119，1991；Parenteau等人，J.Cell.Biochem.45245-251，1991)。一旦分化，角質細胞落在由膠原、葡糖胺聚糖和層粘連蛋白組成的基底層上。例如，在基質植入患者中或由導入患者中的混合物在體內形成基質後，這些基底層成分以及胞外基質蛋白(可以是成纖維細胞合成的或生產培養基中含有的)提供了一個有利於成纖維細胞存活的生理框架。
實施例XVI內皮細胞形成血管和毛細胞血管腔。血管由分裂和分化構成鄰管的一種內皮細胞形成。在必需環境因素存在下能刺激分化過程。這些因素包括膠原、細胞(如成纖維細胞和/或角質細胞)產生的胞外基質蛋白和生長因子(例如，鹼性成纖維細胞生長因子或血管內皮生長因子)。如果分別向基質生產培養基或混合物中加入內皮細胞以及成纖維細胞，植入的基質，或在向患者中導入本發明的混合物後在體內形成的基質，能為內皮管形成提供適宜的環境。添加角質細胞能通過分泌因子(如血管內皮生長因子)有助於誘導內皮細胞分化以及基底層的產生。在基質內形成內皮管能通過先前存在的內皮管與生長的宿主血管連接，加速植入後基質的血管形成(Black等人，FASEB J.121331-1340，1998；Black等人，Cell Biol.Toxicol.15(2)81-90，1999)。內皮細胞通過釋放促進新血管形成的因子也可能是有益的。
實施例XVII如下製備本發明的混合物用於向人體內導入。
從組織培養皿中收集希望的細胞，一般是來自患者的穩定轉染的自體細胞，處理用於通過上述任何方法生產HCMM或PCHCMM。根據向患者體內導入較大或較小體積的混合物，和/或在製備混合物時使用每個細胞表達不同水平產物的細胞，對於特定患者的劑量(即，基質產生的生理有效量的治療產物)可能不同。患者中產生的治療產物的量也可能由於混合物中的細胞暴露於可改變治療基因表達的藥理或生理信號而改變。例如，如果治療基因位於糖皮質激素反應性啟動子控制之下，則細胞在體內暴露於藥物(如地塞米松)(以確保藥物到達植入體的方式對患者施用藥物)將改變治療基因的表達。其它藥理反應性控制元件在Clackson，Gene Therapy 7120-125，2000中有述，在此完整引用作為參考。這些元件包括抗生素四環素或其類似物(例如強力黴素)、昆蟲類固醇蛻皮激素或其類似物，抗孕酮米非司酮，和化學「二聚物」如納巴黴素及其類似物(「rapalogs」)調節的元件。
混合物能含有任何微載體、膠原(或替代物)、試劑(任選地與固體底物結合的)和產生此處所述試劑的細胞。它們也能任選地含有角質細胞和/或內皮細胞。載有此處所述任何細胞的微載體能夠冷凍，然後在用於可注射混合物中之前融解。
混合物能在多個部位導入，包括但不限於皮下、腹膜內、脾內、網膜內、腹股溝、鞘內、心室內和肌內部位，以及淋巴結內或脂肪組織內。例如，能用任選地加有針頭或導管的皮下注射器(塑料或玻璃的)導入混合物。針頭或導管的直徑優選地大於微載體的直徑(例如大於0.5mm)，以使對懸浮細胞和微載體的損傷減至最小。使用腹腔鏡能幫助向適當內部部位的輸送。在特定環境下，形成手術切口，導入混合物，然後閉合切口是希望的。
本發明的混合物能同時形成並導入患者中(或其它任何動物)。為此可構建一種合適的裝置。圖13A顯示了這種裝置的一個實例。該裝置可包括兩個或多個容器1，全部都通過出口2與轉接器4內的入口3連接。圖13B顯示這種轉接器4的橫斷面視圖。轉接器4內的入口3與兩個或多個容器的出口2優選地以不透液體的方式液體連通。此外，轉接器4也可包含一個連接體，它優選地以不透液體的方式與容器1的所有出口2液體連通。轉接器也包含一個混合室5和一個出口6，出口6與注射針頭8的針芯7中的一個入口優選地以不透液體的方式液體連通。這樣，當使容器的內容物從容器1的出口2流出時(通過同時對活塞12施加壓力)，它們進入轉接器4中的混合室5，在此混合，產生的混合物從轉接器4中的出口5流出，並流入注射針頭8中。然後將混合物推入注射針頭中的針頭部分13，於是流入針頭插入的動物組織或身體間隙中。容器通過固體連接體9彼此物理連接。其中包括一個與活塞12的頂部連接的「壓力板」10，以便於同時推出容器的內容物。
在另一個實施方案中，代替轉接器，能改造注射針頭的針芯部分，使之具有分開的入口，它們優選地以不透液體的方式與容器中的各個出口液體連通。當所有容器的內容物由容器出口流出時(例如，當容器是注射器時，通過對活塞同時施加壓力)，它們通過針芯的合適的入口進入注射針頭的針芯，在針芯內形成的小室中混合，之後進入裝置的針頭部分。在此使用時，「輸送工具」可以是(a)如述改造的注射針頭，(b)上述轉接器4和注射針頭8，(c)導管，(d)插管，(e)移液器或適當改造的、如述起作用的任何管狀物體。
在一種具有兩個容器的裝置中，一個容器可包含例如細胞、微載體和營養培養基中的試劑，另一個可包含膠原溶液。在三容器裝置中，一個容器可包含例如細胞、微載體和營養培養基中的試劑；第二個容器可包含酸性pH的膠原溶液；第三個可包含鹼性pH的培養基或稀釋劑，使得當所有三個容器的內容物混合時，形成pH約為7.2-7.8，優選地7.4-7.8的水溶液。然而，應當理解，本發明的雜合基質混合物的不同成分可以以任何方便的組合分配於裝置的兩個或三個容器中。當使用這種裝置時，在由成分形成混合物之後不久向動物中導入混合物，對於本發明，這兩個事件可認為是同時發生。
本發明包括一個含有此處公開的任何混合物的容器(見「發明概述」)。這種容器能與運輸材料(例如運輸容器)一起包含於試劑盒中。評估了在一個含有所有成分的容器中運輸可注射混合物的可行性。用可注射HSHCM混合液進行了兩個研究。對於兩者，肝素-Sepharose珠成分用50μg/ml堆積珠濃度的bFGF包被。向三個10cc塑料注射器的每一個中加入如表9所示製備的體積為10ml的完全生產培養基，然後加蓋，並在4℃下貯存24小時。從4℃環境中取出注射器，加16G針頭，將內容物注射到100mm培養皿中。培養皿置於溫度為37℃、溼度為95％-98％、CO2水平為5％的培養箱中。1小時後，取出培養皿，加入20ml不含酚紅的DMEM補充，並放回培養箱中。在37℃下溫育24小時後，測定凝固基質的直徑相對於混合液直徑的降低(「直徑減少」)、細胞數和細胞生存力。「直徑減少」的測量方法包括將尺子放置在每個培養皿下，以釐米為單位測量基質直徑，100mm培養皿直徑減去基質直徑。然後直徑差除以100mm培養皿的直徑，表示為百分數。細胞數和生存力如上所述評估。表10概括了兩次貯存實驗的結果。如述，實驗#1和#2在每ml生產培養基中摻入的細胞數方面不同。(每次研究n＝3個注射器)表10 可注射HSHCM貯存研究
此外，由於中和的膠原溶液將比酸性膠原溶液更快地膠凝，為了將材料運送到現場，在一個試劑盒中分開可注射材料的成分是有利的。例如，一個試劑盒可包含三個容器(例如，管、注射器、瓶或小瓶)，其內容物在導入患者體內之前(即，在混合物凝固成不能容易地流經注射器、插管或用來輸送懸液的任何裝置的程度之前)立即合併。例如，成分以下列方式分開容器1可含有細胞+微載體，和任選地肝素-Sepharose珠漿液；容器2可含有酸性pH(約2.0-4.0)的膠原溶液；容器3可含有不含血清的鹼性pH(約9.0-12.0)的濃縮培養基(例如，營養培養基或其它稀釋劑)。選擇濃縮培養基的pH，以確保在合併培養基和膠原溶液時，膠原溶液能中和為生理pH(例如pH7.4)。在向患者體內注射之前，立即將容器3的內容物(培養基)與容器2的內容物(膠原溶液)混合。然後將合併的培養基+膠原(此時已中和為生理pH)加入細胞/微載體/肝素-Sepharose珠漿液中，充分混合，形成終混合物。然後任選地使用皮下注射器或試劑盒提供的其它液體分配裝置，將終混合物注射到患者體內。
此外，試劑盒也可包含兩個容器，第一個容器含有與上述試劑盒中的容器1相同的成分。第二個容器可含有膠原溶液，其中膠原溶解於如營養培養基中，為酸性pH。在注射之前立即用一種鹼性溶液(例如NaOH溶液)將膠原溶液的pH調節為約7.2-7.4，優選地約7.4-7.8。試劑盒的第三個容器中任選地包含一等份這種鹼性溶液。
也能提供ph約為7.2-7.4、優選地約7.4-7.8的溶液，而不是提供酸性pH的膠原溶液，只要在與其它成分混合併導入患者中之前保持低溫(例如低於8℃)。
本發明的試劑盒可任選地包含標籤或試劑盒使用說明書，例如，關於如何合併容器內容物並對患者施用產生的混合物的說明書。使混合物保持低溫可防止膠原膠凝。
其它實施方案本發明的基質和混合物適用於輸送大量細胞產物，不僅包括hGH和因子VIII，而且包括因子IX、促紅細胞生成素(EPO)、白蛋白、血紅蛋白、α-1抗胰蛋白酶、降鈣素、葡糖腦苷脂酶、低密度脂蛋白(LDL)受體、IL-2受體、珠蛋白、免疫球蛋白、催化抗體、白介素、胰島素、胰島素樣生長因子1(IGF-1)、促胰島素、甲狀旁腺激素(PTH)、肥胖蛋白、幹擾素(IFN)(例如IFN-α、IFN-β或IFN-γ)、神經生長因子、鹼性成纖維細胞生長因子(bFGF)、酸性FGF(aFGF)、表皮生長因子(EGF)、內皮細胞生長因子、血小板衍生生長因子(PDGF)、轉化生長因子、內皮細胞刺激血管生成因子(ESAF)、血管生成素、組織纖溶酶原激活劑(t-PA)、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、α-半乳糖苷酶和FSH。例如，混合物中或包埋在基質中的細胞可以是因應血糖升高自然分泌胰島素，因此能在糖尿病或前驅糖尿病患者中補充不充分胰島素反應的胰腺β細胞。此外，它們也可以是在患者中表達和分泌高水平必需多肽(如凝集因子)的任何類型的遺傳工程細胞。這種構建體能在組成型激活的啟動子或適當生理或藥理調節的啟動子控制之下。
混合物或基質的膠原凝膠部分可完全由膠原組成，或者代替它(或除它之外)可含有其它成分例如，瓊脂糖；藻酸鹽；葡糖胺聚糖，如透明質酸、硫酸肝素、硫酸皮膚素、硫酸軟骨素；硫酸蛋白聚糖；纖連蛋白；層粘連蛋白；彈性蛋白；血纖蛋白；細胞粘合素；絞碎的脂肪組織；絞碎的網膜組織；甲基纖維素；或明膠。這些成分(特別是在動物組織的胞外基質中發現的)有助於本發明的雜合基質和本發明的混合物體內凝固獲得的基質的結構穩定性，和/或為基質中的細胞和基質植入部位的宿主組織提供另外的附著力。它們在導入動物中或在體外膠凝之前將混合到基質混合物中。
儘管本發明的混合物優選地含有膠原(或上述一種或多種替代物)，但應當理解，本發明也包括缺乏膠原的混合物(或上述任何替代物)。在這種情況中(即，當不使用基質材料時)，注射的溶液在動物體內不凝固形成分散塊。注射物質從值入部位分散的程度取決於該部位的結構特徵。微載體結合的細胞的分散在某些情況中可能是優選的。
其它可能的添加劑包括用於優化細胞保存或促進與宿主組織有益相互作用(例如血管形成)的細胞因子和/或生長因子，包括bFGF、aFGF、內皮細胞生長因子、PDGF、內皮細胞刺激血管生成因子(ESAF)、白三烯C4、前列腺素(例如PGE1、PGE2)、IGF-1、GCSF、血管生成素、TGF-α、TGF-β、抗壞血酸、制瘤素M、VEGF、VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C和VEGF-D。這些添加劑能摻入基質中，方法包括將它們在膠凝或導入動物之前與膠原溶液混合，將它們導入微載體的空隙中，或在洗滌基質的培養基中含有它們。它們也可以結合或包封在基質或混合物中包含的分開的固體底物中(例如，肝素包被的瓊脂糖珠或PLGA微膠囊)。此外，細胞也能遺傳改造以表達希望的產物。例如，基質的細胞能用編碼血管生成因子的DNA和編碼第二種治療蛋白的DNA共轉染，或用與合適的表達控制序列連接的編碼兩種類型蛋白質的一種DNA構建體轉染。
抗壞血酸通過促進原膠原的合適的翻譯後修飾促進成纖維細胞產生成熟的膠原。在基質或混合物中包埋的成纖維細胞產生膠原將提高基質的物理強度，並提供能提高動物中細胞存活率的生理結構。
在基質和混合物中使用的膠原可以是任何合適的類型(例如I-XI型)，或是任兩種或多種混合物。在膠原膠凝之前可在模子中放置纖維，使它們成為基質的整體部分，並有助於基質的堅固和易處理性。如果添加纖維，它們將主要由膠原(例如，貓腸)或非膠原材料(如尼龍、滌綸、聚四氟乙烯(Gore-TexTM或TeflonTM)、聚苯乙烯、聚氯乙烯共聚物、纖維素(例如棉花或亞麻)、聚酯、人造絲或絲製成。基質中的纖維能紡織成網或布，或用作單獨的線。
人們能使用主要由另一種類型的膠原、聚苯乙烯、葡聚糖(例如CytodexTM，Pharmacia)、聚丙烯醯胺、纖維素、藻酸鈣、乳膠、聚碸、玻璃(用促進細胞粘附的物質如膠原包被的)、明膠或膠原與以上任一種物質的組合物組成的微載體，而不是以上實施例中描述的I型膠原微載體。這些微載體可商品購得，或者能通過標準方法製備，然後滅菌，以在本發明的基質或混合物中使用。
其它實施方案在下列權利要求書中。
權利要求
1.一種組合物，其含有包含不溶性膠原原纖維的基質材料主體，在基質材料主體內包埋有(a)經遺傳工程化以表達一種多肽的培養的脊椎動物細胞群；(b)大量微載體；和(c)與包埋在基質材料主體內的固體底物結合的一種試劑，其中該試劑選自促進血管形成的因子、細胞因子、生長因子和抗壞血酸。
2.權利要求1的組合物，其中所述固體底物包括(a)肝素或(b)硫酸乙醯肝素蛋白聚糖。
3.權利要求1的組合物，其中所述固體底物包括含有與肝素或硫酸乙醯肝素蛋白聚糖結合的瓊脂糖。
4.權利要求3的組合物，其中所述固體底物還包含藻酸鈣。
5.權利要求1的組合物，其中所述固體底物還包含藻酸鈣。
6.權利要求1的組合物，其中所述固體底物包含一種選自膠原、明膠、乙烯-醋酸乙烯酯共聚物、聚乳酸/乙醇酸共聚物、血纖蛋白、八硫酸蔗糖、葡聚糖、聚乙二醇、藻酸鹽、聚丙烯醯胺、纖維素、乳膠和聚羥乙基丙烯酸酯的物質。
7.權利要求6的組合物，其中肝素或硫酸乙醯肝素蛋白聚糖與所述底物結合。
8.權利要求1的組合物，其中所述組合物還包含選自促進血管形成的因子、細胞因子和生長因子的第二種試劑。
9.權利要求1的組合物，其中所述固體底物為珠形。
10.權利要求1的組合物，其中所述固體底物為線形。
11.權利要求1的組合物，其中所述試劑是鹼性成纖維細胞生長因子(bFGF)。
12.權利要求1的組合物，其中所述試劑選自酸性成纖維細胞生長因子(aFGF)、內皮細胞生長因子、血小板衍生生長因子(PDGF)、內皮細胞刺激血管生成因子(ESAF)、白三烯C4、前列腺素、胰島素樣生長因子1(IGF-1)、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、血管生成素、轉化生長因子-α(TGF-α)、轉化生長因子-β(TGF-β)、抗壞血酸、表皮生長因子(EGF)和制瘤素M。
13.權利要求1的組合物，其中所述試劑選自血管內皮生長因子(VEGF)、VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C和VEGF-D。
14.權利要求1的組合物，其中所述試劑是angiopoietin 1、2、3或4。
15.權利要求1的組合物，其進一步含有分泌該試劑的細胞。
16.權利要求1的組合物，其中培養的脊椎動物細胞選自脂肪細胞、星形細胞、心肌細胞、軟骨細胞、內皮細胞、上皮細胞、成纖維細胞、神經節細胞、腺細胞、膠質細胞、造血細胞、肝細胞、角質細胞、成肌細胞、神經細胞、成骨細胞、胰腺β細胞、腎細胞、平滑肌細胞、橫紋肌細胞和上述任一種的前體。
17.權利要求1的組合物，其中培養的脊椎動物細胞是人細胞。
18.權利要求1的組合物，其中所述多肽選自酶、激素、細胞因子、集落刺激因子、疫苗抗原、抗體、凝集因子、調節蛋白、轉錄因子、受體和結構蛋白。
19.權利要求1的組合物，其中所述多肽是因子VIII。
20.權利要求1的組合物，其中所述多肽是人生長激素。
21.權利要求1的組合物，其中所述多肽是因子IX。
22.權利要求1的組合物，其中所述多肽是促紅細胞生成素。
23.權利要求1的組合物，其中所述多肽選自VEGF、VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C和VEGF-D。
24.權利要求1的組合物，其中所述多肽是促胰島素。
25.權利要求1的組合物，其中所述多肽選自α-1抗胰蛋白酶、降鈣素、葡糖腦苷脂酶、低密度脂蛋白(LDL)受體、IL-2受體、珠蛋白、免疫球蛋白、催化抗體、白介素、胰島素、胰島素樣生長因子1(IGF-1)、甲狀旁腺激素(PTH)、肥胖蛋白、神經生長因子、鹼性成纖維細胞生長因子(bFGF)、酸性FGF(aFGF)、表皮生長因子(EGF)、內皮細胞生長因子、血小板衍生生長因子(PDGF)、轉化生長因子、內皮細胞刺激血管生成因子(ESAF)、血管生成素、組織纖溶酶原激活劑(t-PA)、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)和粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)。
26.權利要求1的組合物，其中所述小球體是I型膠原珠。
27.權利要求26的組合物，其中所述微載體是多孔的。
28.權利要求1的組合物，其中所述微載體是多孔的明膠珠。
29.權利要求1的組合物，其中所述大多數微載體近似於球形，直徑約為0.1-2mm。
30.權利要求1的組合物，其中所述基質材料還含有一種選自第二種類型的膠原、瓊脂糖、藻酸鹽、纖連蛋白、層粘連蛋白、透明質酸、硫酸乙醯肝素、硫酸皮膚素、硫酸蛋白聚糖、血纖蛋白、彈性蛋白和細胞粘合素的物質。
31.權利要求1的組合物，其還含有在基質材料主體內分散的非膠原纖維。
32.權利要求31的組合物，其中所述非膠原纖維含有一種選自尼龍、滌綸、聚四氟乙烯、聚乙醇酸、聚乳酸/聚乙醇酸共聚物、聚苯乙烯、聚氯乙烯、獸腸線、棉花、亞麻、聚酯和絲的材料。
33.權利要求1的組合物，成形以便植入患者體內。
34.權利要求33的組合物，其中培養的脊椎動物細胞來源於取自患者的一種或多種細胞。
35.權利要求34的組合物，其中培養的脊椎動物細胞由無性群體組成。
36.權利要求1的組合物，其中每一種微載體主要由一種或多種選自膠原、聚苯乙烯、葡聚糖、聚丙烯醯胺、纖維素、藻酸鈣、乳膠、聚碸和玻璃的物質組成。
37.權利要求1的組合物，其中培養的脊椎動物細胞是成纖維細胞。
38.權利要求1的組合物，其中所述微載體近似於球形。
39.權利要求37的組合物，其進一步含有角質細胞。
40.權利要求39的組合物，其中所述角質細胞和成纖維細胞從同一個體獲得。
41.權利要求39的組合物，其進一步含有一種或多種角質細胞分化因子。
42.權利要求41的組合物，其中所述角質細胞分化因子含有濃度為1.5-2mM的鈣離子。
43.權利要求1的組合物，其進一步含有內皮細胞。
44.權利要求37的組合物，其進一步含有內皮細胞。
45.權利要求44的組合物，其中所述內皮細胞和成纖維細胞從同一個體獲得。
46.權利要求1的組合物，其中所述多肽選自幹擾素-α(IFN-α)、幹擾素-β(IFN-β)、幹擾素-γ(IFN-γ)、促卵泡激素(FSH)、α-半乳糖苷酶、β-gluceramidase、α-艾杜糖醛酸苷酶、艾杜糖-2-硫酸酯酶、葡糖胺-N-硫酸酯酶、α-N-乙醯氨基葡糖苷酶、乙醯輔酶Aα-氨基葡糖苷酶-N-乙醯轉移酶、N-乙醯葡糖胺-6-硫酸酯酶、β-半乳糖苷酶、N-乙醯半乳糖胺-6-硫酸酯酶和β-葡糖醛酸酶。
47.權利要求1的組合物，其中基質材料還含有一種選自肝素、纖維素、澱粉和葡聚糖的物質。
48.一種製備組合物的方法，該方法包括形成一種混合物，該混合物包含(a)大量培養的可表達一種多肽的遺傳工程化脊椎動物細胞；(b)大量微載體；(c)一種含有可溶性膠原的溶液；和(d)一種與固體底物結合的試劑，其中該試劑選自促進血管生成的因子、細胞因子、生長因子和抗壞血酸；將該混合物中的可溶性膠原置於可有效形成凝膠的條件下；和將凝膠置於可使凝膠收縮的培養條件下，從而形成組合物主體。
49.權利要求48的方法，其中溶液是可溶性膠原的一種酸性水溶液，而膠凝是通過提高溶液的pH而實現的。
50.權利要求48的方法，其中膠凝步驟在模子中發生，因此，在收縮步驟之前，凝膠為模子的形狀。
51.權利要求48的方法，其中在與溶液混合之前，在微載體存在下培養所述培養的脊椎動物細胞。
52.一種對需要的患者施用多肽的方法，包括提供權利要求33的組合物，其中培養的脊椎動物細胞可分泌多肽；和將該組合物植入患者體內。
53.權利要求52的方法，其中培養的脊椎動物細胞來源於取自患者的一種或多種細胞，並且已經在體外遺傳改造而表達和分泌多肽。
54.權利要求52的方法，其中在患者的皮下部位施行植入。
55.權利要求52的方法，其中在患者的腹膜內、腎小囊下、腹股溝、肌內、心室內、網膜內或鞘內部位施行植入。
56.權利要求52的方法，其中多肽是促進創傷癒合的一種多肽，在患者的預先存在的創傷部位施行植入。
57.權利要求48的方法，其中在填充混合物至深約0.18mm的平底模子中形成凝膠。
58.通過權利要求57的方法產生的一種組合物。
59.權利要求48的方法，其中在內半徑(r)的平底圓柱形模子中形成凝膠；混合物體積為(V)；當r以cm表示，V以ml表示時，r2/V約為1.8。
60.製備權利要求39的組合物的一種方法，包括形成一種混合物，該混合物含有(a)大量培養的可表達一種多肽的遺傳工程化脊椎動物細胞；(b)大量微載體；和(c)一種含有可溶性膠原的溶液；將該混合物中的可溶性膠原置於可有效形成凝膠的條件下；將凝膠置於可使凝膠收縮的培養條件下，從而形成組合物主體；和在凝膠收縮後向組合物主體中加入角質細胞。
61.一種組合物，其含有含不溶性膠原原纖維的基質材料主體，在基質材料主體內包埋有(a)第一種培養的可表達一種多肽的遺傳工程化脊椎動物細胞群；(b)第二種培養的脊椎動物細胞群，它們可分泌一種選自促進血管形成的因子、細胞因子和生長因子的試劑；和(c)大量微載體。
62.權利要求61的組合物，其中第二種培養的脊椎動物細胞群被遺傳改造而表達該試劑。
63.權利要求61的組合物，其還含有第三種培養的脊椎動物細胞群，它們表達和分泌選自促進血管形成的因子、細胞因子和生長因子的第二種試劑。
64.權利要求61的組合物，成形以便植入患者體內。
65.一種製備權利要求61的組合物的方法，包括形成一種混合物，該混合物含有(a)第一種培養的可表達一種多肽的遺傳工程化脊椎動物細胞群；(b)第二種培養的脊椎動物細胞群，它表達並分泌一種選自促進血管形成的因子、細胞因子和生長因子的試劑；(c)大量微載體；和(d)一種含有可溶性膠原的溶液；將該混合物中的可溶性膠原置於可有效形成凝膠的條件下；和將凝膠置於可使凝膠收縮的培養條件下，從而形成組合物主體。
66.一種對需要的患者施用多肽的方法，包括提供權利要求64的組合物，其中第一種培養的脊椎動物細胞群分泌該多肽；和將該組合物輸入患者體內。
67.一種製備組合物的方法，該方法包括形成一種混合物，其含有(a)大量培養的可表達一種多肽的遺傳工程化脊椎動物細胞；(b)大量微載體；和(c)一種含有可溶性膠原的溶液；將該混合物中的可溶性膠原置於可有效形成凝膠的條件下；和將凝膠置於可使凝膠收縮的培養條件下，從而形成組合物主體，其中在填充該混合物至深度約為0.18cm的平底模子中形成凝膠。
68.通過權利要求67的方法產生的一種組合物。
69.一種製備組合物的方法，該方法包括形成一種混合物，其含有(a)大量培養的可表達一種多肽的遺傳工程化脊椎動物細胞；(b)大量微載體；和(c)一種含有可溶性膠原的溶液；將該混合物中的可溶性膠原置於可有效形成凝膠的條件下；和將凝膠置於可使凝膠收縮的培養條件下，從而形成組合物主體，其中在內半徑(r)的平底圓柱形模子中形成凝膠；混合物體積為(V)；當r以cm表示，V以ml表示時，r2/V約為1.8。
70.一種組合物，其含有含不溶性膠原原纖維的基質材料主體，在基質材料主體內包埋有(a)大量培養的可表達一種多肽的遺傳工程化成纖維細胞；(b)大量角質細胞；和(c)大量微載體。
71.權利要求70的組合物，其中角質細胞和成纖維細胞從同一個體獲得。
72.一種製備權利要求70的組合物的方法，包括形成一種混合物，其含有(a)大量培養的可表達一種多肽的遺傳工程化成纖維細胞；(b)大量角質細胞；(c)大量微載體；和(d)一種含有可溶性膠原的溶液；將該混合物中的可溶性膠原置於可有效形成凝膠的條件下；和將凝膠置於可使凝膠收縮的培養條件下，從而形成組合物主體。
73.一種組合物，其含有含不溶性膠原原纖維的基質材料主體，在基質材料主體內包埋有(a)大量培養的可表達一種多肽的遺傳工程化成纖維細胞；(b)大量內皮細胞；和(c)大量微載體。
74.權利要求73的組合物，其中內皮細胞和成纖維細胞從同一個體獲得。
75.一種混合物，在膠原水溶液中懸浮有(a)大量培養的可表達一種多肽的遺傳工程化脊椎動物細胞；(b)大量微載體；和(c)至少一種選自促進血管形成的因子、細胞因子、生長因子和抗壞血酸的試劑，其中至少一種試劑與膠原溶液中懸浮的固體底物結合，其中在混合物中有足量的膠原，使混合物在pH5以上時膠凝。
76.一種製備混合物的方法，該方法包括合併(a)大量培養的可表達一種多肽的遺傳工程化脊椎動物細胞，(b)大量微載體，(c)至少一種選自促進血管形成的因子、細胞因子、生長因子和抗壞血酸的試劑，和(d)一種含有可溶性膠原的溶液，其中在混合物中有足量的膠原，使混合物在pH5以上時膠凝。
77.一種混合物，在膠原水溶液中懸浮有(a)第一種培養的可表達一種多肽的遺傳工程化脊椎動物細胞群；(b)第二種培養的脊椎動物細胞群，它們可分泌一種選自促進血管形成的因子、細胞因子和生長因子的試劑；和(c)大量微載體，其中在混合物中有足量的膠原，使混合物在pH5以上時膠凝。
78.一種製備權利要求77的混合物的方法，該方法包括合併(a)第一種培養的可表達一種多肽的遺傳工程化脊椎動物細胞群；(b)第二種培養的脊椎動物細胞群，它們可表達和分泌一種選自促進血管形成的因子、細胞因子和生長因子的試劑；(c)大量微載體；和(d)一種含有可溶性膠原的溶液，其中在混合物中有足量的膠原，使混合物在pH5以上時膠凝。
79.權利要求78的方法，該方法還包括在混合物中含有含與該試劑結合的物質的固體底物。
80.一種對需要的患者施用多肽的方法，該方法包括提供一種組合物，該組合物包含培養的可表達該多肽的遺傳工程化脊椎動物細胞群，大量微載體，至少一種與基質材料主體內包埋的固體底物結合的試劑，其中至少一種試劑選自促進血管形成的因子、細胞因子、生長因子和抗壞血酸，和膠原，和將該組合物導入患者體內。
81.一種對需要的患者施用多肽的方法，該方法包括提供一種組合物，該組合物包含第一種培養的可表達一種多肽的遺傳工程化脊椎動物細胞群，第二種培養的脊椎動物細胞群，它們分泌一種選自促進血管形成的因子、細胞因子和生長因子的試劑，大量微載體，和膠原，和將該組合物導入患者體內。
82.一種對需要的患者施用多肽的方法，該方法包括提供一種液體混合物，在水溶液中懸浮有培養的可表達該多肽的遺傳工程化脊椎動物細胞群，大量微載體；和將該液體組合物導入患者體內。
83.權利要求82的方法，該混合物還含有可溶性膠原。
84.權利要求82的方法，該混合物還含有選自絞碎的脂肪組織、絞碎的網膜組織、甲基纖維素、藻酸鹽、明膠和血纖蛋白的物質。
85.權利要求82的方法，其中向患者中導入混合物是通過皮下注射器。
86.權利要求85的方法，其中注射器加有注射針頭或導管。
87.權利要求82的方法，其中向患者導入通過導管。
88.權利要求82的方法，其中向患者導入通過移液管。
89.權利要求83的方法，其中合併培養的脊椎動物細胞、微載體和可溶性膠原形成混合物與向患者導入混合物同時進行。
90.一種對需要的患者施用多肽的方法，該方法包括提供一種液體混合物，其含有膠原水溶液，在該溶液中懸浮有表達該多肽的培養的遺傳工程化脊椎動物細胞群，大量微載體；和將該液體混合物導入患者體內。
91.一種包含運輸容器的試劑盒，其包含(a)第一個容器，其中包含(i)表達一種多肽的培養的遺傳工程化脊椎動物細胞群；和(ii)大量微載體；(b)第二個容器，含有膠原溶液；和(c)第三個容器，含有培養基。
92.權利要求91的試劑盒，其中膠原溶液為酸性pH，培養基為鹼性pH。
93.權利要求91的試劑盒，其中膠原溶液溫度低於8℃。
94.一種用權利要求91的試劑盒製備混合物的方法，該方法包括(a)合併第二個和第三個容器的內容物，形成稀釋的膠原溶液；和(b)合併稀釋的膠原溶液與第一個容器的內容物，形成混合物。
95.權利要求94的方法，還包括在混合物凝固之前向患者導入該混合物的步驟。
96.一種包含運輸容器的試劑盒，其包含(a)第一個容器，其中包含(i)表達一種多肽的培養的遺傳工程化脊椎動物細胞群；和(ii)大量微載體；和(b)第二個容器，含有膠原溶液。
97.權利要求96的試劑盒，其中膠原溶液為酸性pH。
98.權利要求96的試劑盒，其中膠原溶液溫度低於約8℃。
99.權利要求96的試劑盒，其還包括含有鹼性pH的溶液的第三個容器。
100.一種用權利要求96的試劑盒製備混合物的方法，該方法包括合併第一個和第二個容器的內容物形成混合物。
101.權利要求100的方法，其還包括在混合物凝固之前向患者化導入混合物的步驟。
102.一種包含運輸容器的試劑盒，包括一個含有膠原水溶液的容器，該溶液中懸浮有(a)表達一種多肽的培養的遺傳工程化脊椎動物細胞群；和(b)大量微載體，其中水溶液溫度低於約8℃。
103.一種對需要的患者施用多肽的方法，該方法包括提供一種液體混合物，在膠原水溶液中懸浮有表達該多肽的培養的遺傳工程化脊椎動物細胞群；和將該液體混合物導入患者，其中在混合物中有足量的膠原，使混合物在pH5以上時膠凝。
104.一種將混合物導入患者體內的裝置，該裝置包括至少兩個容器，每一個容器都有一個與輸送工具液體連通的出口，其中該裝置包含(a)一種膠原水溶液，(b)表達一種多肽的培養的遺傳工程化脊椎動物細胞群，和(c)大量微載體。
105.權利要求104的裝置，其中每個容器含有(a)、(b)、(c)之一或更多。
106.權利要求104的裝置，其中一個或多個容器與一個具有兩端的活塞結合，第一端適合插入容器的內部，第二端適合從容器的內部延伸出來。
107.權利要求104的裝置，其中輸送工具是一種注射針頭，它具有(a)一個或多個適合與容器出口液體連通的入口，和(b)一個出口。
108.權利要求104的裝置，其中輸送工具包括一個轉接器，其具有一個與每個容器出口液體連通的連接體，一個混合室和一個與注射針頭液體連通的出口。
109.權利要求108的裝置，其中所述連接體包括至少兩個入口，每一端只與一個容器的出口液體連通。
110.權利要求104的裝置，其進一步含有一個或多個物理連接至少兩個容器的連接體。
111.權利要求106的裝置，其中每個活塞的第二個末端與一個壓力板連接。
112.一種容器，含有一種混合物，其在膠原水溶液中懸浮有(a)表達一種多肽的培養的遺傳工程化脊椎動物細胞群；(b)大量微載體，和(c)一種與固體底物結合的試劑，其中該試劑選自促進血管形成的因子、細胞因子、生長因子和抗壞血酸，其中在混合物中有足量的膠原，使混合物在pH5以上時膠凝。
113.一種容器，含有一種混合物，在膠原水溶液中懸浮有(a)表達一種多肽的第一種培養的遺傳工程化脊椎動物細胞群；(b)第二種培養的脊椎動物細胞群，它們可分泌一種選自促進血管形成的因子、細胞因子和生長因子的試劑；和(c)大量微載體，其中在混合物中有足量的膠原，使混合物在pH5以上時膠凝。
全文摘要
一種組合物,具有由不溶性膠原原纖維組成的基質材料主體,其中分散有:a)大量脊椎動物細胞;b)大量微載體;和c)一種試劑,如促進血管形成的因子、細胞因子、生長因子或抗壞血酸。本發明也表徵了一種對動物施用多肽的方法。該方法包括向動物中導入一種流體混合物,該混合物含有:a)表達該多肽的培養的遺傳工程脊椎動物細胞群;和b)大量微載體。
文檔編號A61P17/02GK1377257SQ00813699
公開日2002年10月30日 申請日期2000年10月4日 優先權日1999年10月5日
發明者R·米尼奧－翰施克, J·C·拉姆薩, D·阿巴羅斯－克勒 申請人:核轉移治療公司