一種輸送抗體用於腫瘤免疫治療的MR成像聚合物膠束及其製備方法與流程
2023-12-08 23:19:42
本發明屬於高分子化學與生物醫學工程領域，更具體地，涉及一種輸送抗體用於腫瘤免疫治療的mr成像聚合物膠束及其製備方法。
背景技術：
惡性腫瘤嚴重危害人類健康，目前治療癌症的常用的方法有手術、放療、化療和免疫治療。而腫瘤免疫治療現已成為繼手術治療、放射治療和化學藥物治療之後的另一種控制腫瘤的有效療法，並廣泛應用於臨床。其中，免疫檢查點抑制劑抗體療法因其在多種腫瘤中均表現出了很好的抗腫瘤活性並顯著延長臨床生存期而得到廣泛關注。但免疫檢查點抑制劑抗體療法容易引發免疫相關的不良反應，比如心肌炎、肝炎、肺炎、皮炎等，這些都被認為是由於自身反應性t細胞的異常活化引起的。因此，有必要對其治療方法進行改進。因此需要製備一種特殊功能的免疫檢查點抑制劑抗體輸送載體：「在生理環境中時抗體被屏蔽起來，從而阻止抗體與免疫細胞的結合，當抗體到達腫瘤微環境後，抗體重新被釋放出來，恢復抗體與免疫細胞的結合功能。」使得腫瘤免疫被激活的同時降低自身反應性t細胞的異常活化率，從而降低腫瘤免疫療法的毒副作用。
磁共振(mr)成像因具有空間解析度高、軟硬組織成像好、無創性觀測等優點，在醫療診斷特別是分子影像研究方面發揮著重要作用。隨著納米技術和mr分子影像的發展與結合，以超順磁性氧化鐵(spio)納米晶體構建的mr納米探針得到了極大的關注。由於spio具有低毒性、良好的生物相容性和磁共振信號敏感性等特點，已經應用於臨床mr成像。因此，研發具有抗體輸送與磁學性能兼備的多功能磁共振分子探針，可以對抗體傳輸效率進行實時有效的評估。
技術實現要素：
本發明的目的在於針對現有技術的上述缺陷，提供一種抗體輸送與磁學性能兼備的多功能載體，即一種輸送抗體用於腫瘤免疫治療的mr成像聚合物膠束。
本發明的另一目的是提供上述輸送抗體用於腫瘤免疫治療的mr成像聚合物膠束的製備方法。
本發明目的通過如下技術方案實現：
一種輸送抗體用於腫瘤免疫治療的mr成像聚合物膠束，所述聚合物膠束為核殼結構：核負載超順磁性四氧化三鐵納米顆粒、膠束表面用基質金屬蛋白酶敏感的多肽偶聯抗體形成殼層，用酸敏鍵偶聯的單甲基醚聚乙二醇mpeg20k，作為抗體的屏蔽層；所述單甲基醚聚乙二醇mpeg20k分子量為20kda。
本發明一種輸送抗體用於腫瘤免疫治療的mr成像聚合物膠束，其表面的屏蔽層對ph敏感，在體內生理環境ph為7.4條件下，可以屏蔽血液中的免疫細胞與抗體結合，而在ph為6.5的腫瘤微環境中，該屏蔽層脫去，繼而在腫瘤微環境高表達的基質金屬蛋白酶(mmps)的作用下，釋放抗體，與免疫細胞結合，發揮免疫治療的作用；另一方面，聚合物膠束負載的超順磁性四氧化三鐵納米顆粒(spions)，可實現非侵入式的mr成像，從而實現診療一體化。
所述抗體可以是免疫治療抗體，例如pd-1抗體，也可以是本領域其他常用的抗體。
優選地，所述聚合物膠束平均粒徑為140nm～190nm。
優選地，所述超順磁性四氧化三鐵納米顆粒為油溶性。
所述聚合物膠束在腫瘤微環境，即ph小於或等於6.5時，屏蔽層脫落，在基質金屬蛋白酶的作用下，釋放抗體。
所述抗體質量佔聚合物膠束質量的1.0％～2.0％，超順磁性四氧化三鐵納米顆粒質量佔聚合物膠束質量的15％～25％。
所述輸送抗體用於腫瘤免疫治療的mr成像聚合物膠束的製備方法，包括以下步驟：
s1.以l-苯丙氨酸為原料，加入三光氣，製得l-苯丙氨酸-環碳酸酐，表述為l-phe-nca；
s2.以l-phe-nca為原料經聚合反應獲得α-疊氮基-聚乙二醇-聚苯丙氨酸，表述為n3-peg-plphe；
s3.以乙醯丙酮鐵、1,2-十六烷二醇為原料，製得超順磁性四氧化三鐵納米顆粒(spions)；
s4.以n3-peg-plphe和spions為原料，經過超聲自組裝獲得負載spions的膠束，表述為n3-peg-plphe@spions；
s5.以pd-1單克隆抗體mab和基質金屬蛋白酶底物多肽peptide為原料，經過一系列反應，將抗體偶聯在s4所製備的膠束表面，表述為mab-peptide-peg-plphe@spions；
s6.以mpeg20k-oh為原料，經過一系列反應，在s5所製備的膠束表面構建酸敏感屏蔽層，表述為mpeg20k-(mab-peptide)-peg-plphe@spions。
所述輸送抗體用於腫瘤免疫治療的mr成像聚合物膠束在腫瘤免疫治療和mr成像中的應用。
與現有技術相比，本發明具有如下有益效果：
本發明一種輸送抗體用於腫瘤免疫治療的mr成像聚合物膠束可以在體內穩定循環，並富集在腫瘤部位，阻止攜帶的抗體藥物在生理環境下與免疫細胞結合；同時該載體含有spions內核，可以實現mr成像造影功能；所述聚合物膠束還具有ph和mmps敏感性，當聚合物膠束到達腫瘤部位時，可以脫去屏蔽層，並斷裂mmps敏感多肽，釋放抗體藥物，恢復抗體與免疫細胞的結合功能，實現抗體藥物在腫瘤微環境的響應性釋放，從而增加腫瘤免疫的組織特異性並降低自身反應性t細胞的異常活化率。
附圖說明
圖1為n3-peg-nh2、l-phe-nca和n3-peg-plphe的核磁譜圖。
圖2為酸敏mpeg20k-cdm和mpeg20k-phe-alkyne的核磁譜圖。
圖3為聚合物膠束在ph7.4、ph6.5和ph6.5&mmp-2條件下的粒徑分布圖。
圖4為聚合物膠束的tem圖，(a)負載spions，未用染色劑染色，(b)負載spions，3％醋酸鈾染色1min。
圖5為聚合物膠束在ph7.4、ph6.5和ph6.5&mmp-2條件下與t淋巴細胞的結合效率圖。
圖6為聚合物膠束標記腫瘤細胞後的mr成像圖。
具體實施方式
下面結合說明書附圖和具體實施例對本發明進行進一步解釋說明，其描述較為具體和詳細，但並不能因此而理解為對本發明範圍的限制，但凡採用等同替換或等效變換的形式所獲得的技術方案，均應包括在本發明權利要求的保護範圍之內。
以下實施例和對比例中，所用原料均為市售商品。
實施例1
一種輸送抗體用於腫瘤免疫治療的mr成像聚合物膠束的製備方法，包括如下步驟：
s1.l-phe-nca(l-苯丙氨酸-環碳酸酐)聚合物的合成：具體合成步驟如下：稱取10gl-苯丙氨酸於500ml的三口瓶中，加入新蒸的100ml乙酸乙酯，90℃加熱回流後，滴入溶有10g三光氣的50ml乙酸乙酯，攪拌，加熱回流約5h至溶液呈黃色澄清溶液。恢復到室溫後，-40℃冷凍0.5h。乙酸乙酯層分別用4℃預冷飽和nahco3溶液(100ml×2)、飽和nacl溶液(50ml×2)洗滌，分液。乙酸乙酯層再用mgso4乾燥，過濾，旋蒸濃縮後在新蒸的石油醚中沉澱，抽濾，所得固體用乙酸乙酯/石油醚重結晶，抽濾，真空乾燥得白色粉末l-phe-nca6.0g，產率52％。
s2.n3-peg-plphe聚合物的合成：稱取1.0gn3-peg-nh2(α-疊氮基-ω-氨基聚乙二醇，mw為1.8k)於100ml的史萊克反應茄瓶中，70℃真空乾燥1h，通n2後恢復至室溫，加入30ml新蒸的ch2cl2溶解。將3.2gl-phe-nca溶於3ml無水dmf後，加入到上述史萊克反應茄瓶中，密封，35℃反應48h後在乙醚中沉澱，離心得白色產物n3-peg-plphe。1hnmr測得phe的單元為25，聚合物數均分子量為5525。
s3.超順磁性fe3o4納米粒子的合成：將乙醯丙酮鐵(2mmol)、油胺(6mmol)、油酸(6mmol)、1,2-十六烷二醇(10mmol)和苄醚(18ml)混合均勻，氬氣保護下迅速加熱到200℃，保持2h後，繼續升溫到300℃，回流1h。自然冷卻至室溫，在乙醇(200ml)中沉澱，離心分離後，再分散在35ml正己烷中，過濾乾燥即得fe3o4納米粒子。
s4.製備負載spions的膠束：將3mgspions、30mgn3-peg-plphe溶於8mlthf，超聲下滴加到30ml的去離子水中，用水透析以除去thf(透析袋mwco14k)，用220nm水相濾頭過濾，50krpm超高速離心去除未包裹spions的膠束，用5mmpbs(ph為7.4)復溶至約2.5mg/ml。該製備方法採用本技術領域常規技術。
s5.mab-peptide-peg-plphe@spions的合成：
首先，使pd-1抗體(goinvivotmanti-mousecd279，biolegend)巰基化，簡要操作步驟如下：取1ml1mg/ml的抗體溶液(ph為7.4)，加入10μl100mmpbs和30mmedta(ph為7.4)，加入0.7mg2-亞氨基硫烷鹽酸鹽(2-it，mw為137.6，5mm)，20℃反應45min。使用hitraptm柱進行快速脫鹽純化(puresystem)，洗脫液組成:10mmpbs+3mmedta(ph為7.4)，檢測波長：280nm，按照1ml/管收集樣品。合併含有蛋白的溶液，超濾(mwco:10k)濃縮，定量至2.5ml。用紫外分光光度法或者elisa法測定抗體濃度，回收率約80％。使用dtnb測定巰基的含量，測的平均每個抗體分子引入3.2個巰基。
其次，pd-1抗體上的巰基與mal-peptide-alkyne的馬來醯亞胺基加成，從而引入炔基(alkyne)，簡要操作步驟如下：稱取2.5mgmal-peptide-alkyne(mw為1013.5，1mm)溶於30μldmso，加入到上述巰基化的抗體溶液中，4℃攪拌過夜。使用hitraptm柱進行脫鹽純化(puresystem)，洗脫液組成:10mmpbs，ph7.4，檢測波長：280nm，按照1ml/管收集樣品。合併含有蛋白的溶液，超濾(mwco:10k)濃縮，定量至2ml。用紫外分光光度法或者elisa法測定抗體濃度，回收率約81％。最後，pd-1抗體上的炔基與膠束表面的疊氮基進行點擊反應，具體操作步驟如下：取上述製備得到的2mln3-peg-plphe@spions的膠束溶液(疊氮基約為0.72μmol)，加入10μlcu(ii)bsc(1mg/ml)後，凍融除氧，重複2次。加入上述製備的炔基化的抗體溶液(抗體約0.64mg，炔基約0.0085μmol)和2mg維生素c，室溫下反應過夜。
s6.mpeg20k-(mab-peptide)-peg-plphe@spions的合成：
mpeg20k-phe-alkyne合成反應路線如下：
首先，將2-丙酸-3-甲基馬來酸酐(cdm)用草醯氯活化成醯氯。簡要描述如下：稱取0.37gcdm(mw184.1,2.0mmol)溶於新蒸的5mlch2cl2，加入催化劑量的50μldmf，n2氣保護下，冰水浴下滴入1.27ml草醯氯(20mmol)。滴加完後，室溫下反應3h，真空旋蒸除去溶劑及多餘的草醯氯得到淺黃色粘稠液體。
第二步，合成mpeg20k-cdm。將1.0gmpeg20k-oh(0.05mmol)溶於無水的4mlch2cl2，加入到上述粘稠液體中，加入催化劑12mgdmap(mw122.17,0.1mmol)，冰水浴下逐滴滴入含有0.35ml三乙胺(mw101.2,2.5mmol)的12ml甲苯溶液，溶液呈棕灰色，反應24h。反應完後抽濾，濃縮濾液，在冷乙醚中沉澱，抽濾，濾餅用50mlch2cl2溶解。ch2cl2層分別用15ml0.5mhcl、15ml飽和nacl溶液洗滌，分層，之後用mgso4乾燥，過濾，濃縮，在冷乙醚沉澱得微黃色產物。1hnmr測得轉化率約80％。
第三步，合成mpeg20k-phe-alkyne。將0.6gmpeg20k-cdm(0.03mmol)溶於4mlch2cl2和0.2mldmf後，加入33μg丙炔胺(mw55.1，0.6mmol)，室溫下反應12h，在冷乙醚中沉澱，離心得產物，產物用ch2cl2溶解後再在乙醚中沉澱得產物，mpeg20k-phe-alkyne的結構式如上述反應路線所示。
第四步，往s5所述反應過夜後的mab-peptide-peg-plphe@spions溶液中加入29.0mgmpeg20k-phe-alkyne(1.44μmol)和2mg維生素c，繼續反應8h。反應完後，加入1ml10mmedta，50krpm超高速離心分離，所得固體用pbs(ph7.4)洗滌一次，復溶至2ml生理鹽水中，4℃保存備用。
將該溶液調至ph6.5，使peg20k從表面脫落後再用elisa法測定抗體濃度，約100ug/ml，抗體的反應效率約31％。抗體佔總質量的1.25％。mpeg20k的屏蔽層密度可以通過調整反應時間進行調控。
聚合物的結構分析和聚合物膠束的形貌表徵：取各步產物約9mg溶於適量氘代溶劑，用1h-nmr400mhz核磁共振波譜儀進行測試，檢測反應前後聚合物結構上1h化學位移的變化，如圖1和圖2。製備了不同聚合物膠束樣品，包括：n3-peg-plphe、n3-peg-plphe@spions，mpeg20k-(mab-peptide)-peg-plphe，mpeg20k-(mab-peptide)-peg-plphe@spions，用zeta電位及粒度測定儀(dls)檢測聚合物膠束的粒徑，如圖3，入射雷射波長λ＝532nm，入射角θ＝175°，溫度為25℃；粒徑值取三次測量值的平均值。
用透射電鏡(tem)觀察聚合物膠束的形貌如圖4，圖4(a)為負載spions的膠束，未染色，圖4(b)為負載spions的膠束，染色。從圖4(b)中可以看出整個聚合物膠束載體粒徑大約在170nm。簡要操作如下：取2μl樣品(0.2mg/ml)滴在純碳膜銅網上，在室溫下晾乾，用3％的醋酸鈾染色1min。用透射電鏡在120kv下觀察(所述操作採用本領域常規技術進行檢測)。
用於腫瘤免疫治療的mr成像聚合物膠束的ph和mmps雙響應性檢測：為證明實施例1製備的聚合物膠束具有ph和mmps雙響應性，分別將聚合物膠束置於ph6.5和10nmmmp-2的環境中處理4h和6h後，再與t淋巴細胞進行共孵育，使用流式細胞儀檢測處理前後抗體與t淋巴細胞的結合效率，結果如圖5所示。結果表明，游離的pd-1抗體與t淋巴細胞的結合效率可達82.85％(freeapd1)，而經聚合物膠束載體屏蔽後抗體與t淋巴細胞的結合效率降至32.00％(shielded)，說明載體在ph7.4的生理環境下可以很好地屏蔽抗體，阻止pd-1抗體與t淋巴細胞的結合。當聚合物膠束經ph6.5的弱酸性環境處理後，抗體與t淋巴細胞的結合效率可恢復至65.65％(ph6.5)，當進一步使用mmp-2酶切處理後，抗體與t淋巴細胞的結合效率可恢復到75.49％(ph6.5&mmp-2)，說明載體具有很好的ph和mmps酶響應性。
體外mri成像效果：為更進一步證明實施例1製備的聚合物膠束具有mr成像能力，以5×105/孔的b16-f10接種於96孔板中，培養24h後加入實施例1製備的聚合物膠束，使得各孔的最終鐵濃度分別為5μg/ml、10μg/ml、15μg/ml、20μg/ml、25μg/ml、30μg/ml、35μg/ml、40μg/ml，並進一步檢測孵育時間為30min、60min、90min、120min、150min、180min、210min、240min後各孔的mr成像能力。由圖6可以看到，各濃度梯度標記b16-f10在t1wi、t/2wi、ffe及t2-mapping上信號均逐漸降低，其信號的減低程度具有一定的聚合物膠束濃度的依賴性，隨著聚合物膠束含量的增高，細胞mr信號逐漸減低。說明該聚合物膠束具有很強的磁敏感性，可用於mr成像，結合孵育時間和鐵濃度結果可知，當鐵濃度為30μg/ml、孵育時間為210min時，即可達到最佳的mr成像效果。
實施例2
一種輸送抗體用於腫瘤免疫治療的mr成像聚合物膠束的製備方法，包括如下步驟：
步驟s1至s3，及s5至s6同實施例1
s4.製備負載spions的膠束：將8mgspion、30mgn3-peg-plphe溶於10mlthf，超聲下滴加到30ml的去離子水中，用水透析以除去thf(透析袋mwco14k)，用450nm水相濾頭過濾，50krpm超高速離心去除未包裹spions的膠束，用5mmpbs(ph為7.4)復溶至約2.5mg/ml。超順磁性四氧化三鐵納米顆粒(spions)質量佔聚合物膠束質量的25％。該製備方法採用本技術領域常規技術。
實施例3
一種輸送抗體用於腫瘤免疫治療的mr成像聚合物膠束的製備方法，包括如下步驟：步驟s1至s3，及s5至s6同實施例1
s4.製備負載spions的膠束：將4mgspion、32mgn3-peg-plphe溶於5mlthf，超聲下滴加到25ml的去離子水中，用水透析以除去thf(透析袋mwco14k)，用450nm水相濾頭過濾，60krpm超高速離心去除未包裹spions的膠束，用5mmpbs(ph為7.4)復溶至約2.5mg/ml。超順磁性四氧化三鐵納米顆粒(spions)質量佔聚合物膠束質量的15％。該製備方法採用本技術領域常規技術。
實施例4
一種輸送抗體用於腫瘤免疫治療的mr成像聚合物膠束的製備方法，包括如下步驟：
步驟s1至s4，及s6同實施例1
s4mab-peptide-peg-plphe@spions的合成：
首先，使pd-1抗體(goinvivotmanti-mousecd279，biolegend)巰基化，簡要操作步驟如下：取1ml1mg/ml的抗體溶液(ph為7.4)，加入10μl100mmpbs和30mmedta(ph為7.4)，加入0.7mg2-亞氨基硫烷鹽酸鹽(2-it，mw為137.6，5mm)，20℃反應45min。使用hitraptm柱進行快速脫鹽純化(puresystem)，洗脫液組成:10mmpbs+3mmedta(ph為7.4)，檢測波長：280nm，按照1ml/管收集樣品。合併含有蛋白的溶液，超濾(mwco:10k)濃縮，定量至2.5ml。用紫外分光光度法或者elisa法測定抗體濃度，回收率約80％。使用dtnb測定巰基的含量，測的平均每個抗體分子引入3.2個巰基。
其次，pd-1抗體上的巰基與mal-peptide-alkyne的馬來醯亞胺基加成，從而引入炔基(alkyne)，簡要操作步驟如下：稱取2.5mgmal-peptide-alkyne(mw為1013.5，1mm)溶於30μldmso，加入到上述巰基化的抗體溶液中，4℃攪拌過夜。使用hitraptm柱進行脫鹽純化(puresystem)，洗脫液組成:10mmpbs，ph7.4，檢測波長：280nm，按照1ml/管收集樣品。合併含有蛋白的溶液，超濾(mwco:10k)濃縮，定量至2ml。用紫外分光光度法或者elisa法測定抗體濃度，回收率約81％。
最後，pd-1抗體上的炔基與膠束表面的疊氮基進行點擊反應，具體操作步驟如下：取上述製備得到的0.5mln3-peg-plphe@spions的膠束溶液(疊氮基約為0.18μmol)，加入5μlcu(ii)bsc(1mg/ml)後，凍融除氧，重複2次。加入上述製備的炔基化的抗體溶液(抗體約0.64mg，炔基約0.0085μmol)和2mg維生素c，室溫下反應過夜。得到的載體抗體負載量大於實施例1。並且通過與實施例1的相同的步驟s6後，得到抗體佔載體質量的2.0％。