凝結芽孢桿菌製備治療炎症性腸病藥物中的應用的製作方法

2023-12-10 06:31:42 1

專利名稱：凝結芽孢桿菌製備治療炎症性腸病藥物中的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及酪酸梭菌、凝結芽孢桿菌的藥物新用途，具體涉及酪酸梭菌和凝結芽 孢桿菌單獨或組合作為藥物活性成份在製備治療炎症性腸病，即潰瘍性結腸炎和克羅恩病 藥物中的應用，屬於生物藥領域。
背景技術：
炎症性腸病Gnflammatory bowel disease, IBD)是潰蕩性結腸炎(Ulcerative colitis, UC)和克羅恩病(Crohn』 s disease, CD)的統稱，傳統醫學認為病因不明。潰瘍 性結腸炎是一種非特異性的慢性結腸炎，病變主要局限於結腸的黏膜層和黏膜下層，表現 為炎症和潰瘍，多先累及直腸和遠端結腸，而後向近端擴展，以至遍及全結腸，臨床表現為 持續或反覆發作的粘液血便伴腹痛，可有不同程度的全身症狀，如關節、皮膚、眼、口及肝膽 等腸外表現，病程越長癌變率越高。克羅恩病則是一種胃腸道的慢性、反覆發作性和非特異 性的全腸壁炎，病變呈節段性分布，可發生於胃腸道的任何部位。由於潰瘍性結腸炎和克羅 恩病的患病人數逐年增多，加之其病程的遷延，診斷、治療的困難，已使本病引起醫藥行業 人士的廣泛重視。但迄今為止，臨床上炎症性腸病的防治仍頗為棘手，存在的問題較多，傳 統的治療並未獲得突破性進展。IBD的傳統治療藥物包括氨基水楊酸類、抗生素及皮質激 素等，因其療效不高，不良反應較大使患者常不能耐受，導致在臨床上應用存在一定的局限 性。應用免疫抑制劑如硫唑嘌呤(AZA)、6_巰基嘌呤(6-MP)、甲氨嘌呤(MTX)和環孢黴素等 能使多數IBD病人，特別是頑固性病例獲得一定程度的臨床緩解，然而這些免疫抑制劑仍 有毒性大、選擇性差且有可能發生繼發性感染及致畸等不足之處，故臨床上應用仍不盡理 想。本發明的藥物新用途在治療炎症性腸病上取得重大突破，解決了傳統治療藥物療效差 和毒副作用大的難題，可作為治療藥物應用並能預防復發，社會意義巨大，特申請此發明專 利。

發明內容
傳統醫學認為，炎症性腸病的發病原因和發病機制仍不明確，對於發病原因人們 傾向於免疫學異常，各種發病假說也未得到充分的證實。但本發明人通過深入研究和分析 認為炎症性腸病的發病原因是長期的腸道菌群失調不能及時恢復，有益菌群的減少，造成 腸黏膜再生和代謝所需的酪酸、乳酸等短鏈脂肪酸合成不足，腸黏膜營養不良，此時，泛濫 的有害菌產生了胺、氨、噴哚等大量毒素，使虛弱的腸黏膜中毒、發炎，導致腸道免疫反應異 常，並引起過度的炎症反應，使腸黏膜，甚至整個腸壁損傷，潰瘍和結節病樣肉芽腫等形成， 具體的引發機制還有待於進一步深入研究，但目前的研究發現正常的腸道菌群對機體尤其腸道免疫機制的形成和免疫功能的平衡具有非常重要的影響作用，可以調節免疫使之處於 正常的水平。基於以上對炎症性腸病的發病認識，通過基礎和臨床研究發現和證實，用酪 酸梭菌和凝結芽孢桿菌單獨或組合治療炎症性腸病療效顯著，這主要由於酪酸梭菌和凝結 芽孢桿菌能分泌腸黏膜再生和修復所需的重要營養物質酪酸和乳酸，營養腸道，又可以從 恢復腸道菌群平衡等多個方面發揮作用，有別於目前的治療藥物，能有效的治療潰瘍性結 腸炎和克羅恩病，而且由於酪酸梭菌和凝結芽孢桿菌是益生菌，沒有毒副作用，病人易於接 受。本發明人經深入的基礎、臨床研究和分析發現酪酸梭菌和凝結芽孢桿菌治療潰瘍 性結腸炎和克羅恩病的作用機理主要為以下幾個方面1、抗炎和調節機體與黏膜免疫酪酸梭菌、凝結芽孢桿菌能刺激腸黏膜增加分泌 性IgA等的分泌量，恢復和增強黏膜免疫功能，提高黏膜的抗病能力；能抗炎和調節異常過 度的免疫反應，使之恢復正常，消除異常炎症反應和免疫反應對腸壁及腸黏膜的損傷。從而 達到改善炎症或預防炎症復發的目的。2、腸道生物屏障是維持正常的腸道功能的重要屏障，炎症性腸病患者腸道菌群嚴 重失調，生物屏障嚴重破壞，進而導致腸黏膜結構、功能及腸道免疫的異常變化，酪酸梭菌、 凝結芽孢桿菌能定植在腸黏膜發炎部位拮抗有害菌，從而快速修復腸道生物屏障。3、酪酸梭菌和凝結芽孢桿菌能大量產生酪酸和乳酸等短鏈脂肪酸，這些短鏈脂肪 酸是腸黏膜上皮細胞的營養物質和能量來源，是修復炎症性腸病患者腸道黏膜潰瘍的重要 物質。本發明所述酪酸梭菌選自但不限於酪酸梭菌(Clostridium butyricum)、CGMCC、 保存編號0313. 1。本發明所述凝結芽孢桿菌選自但不限於凝結芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)、 CGMCC、保存編號1207。本發明以酪酸梭菌、凝結芽孢桿菌為藥物活性成份製成的製劑，可以是以酪酸梭 菌、凝結芽孢桿菌單獨為藥物活性成份分別製成相關劑型；也可以是酪酸梭菌與凝結芽孢 桿菌組合作為藥物活性成份分別製成相關劑型。本發明所述的酪酸梭菌、凝結芽孢桿菌指活生物個體。本發明是以有效劑量的酪酸梭菌、凝結芽孢桿菌根據上面所述單獨或組合作為藥 物活性成份，按照一定的製劑工藝，加入常規的賦性劑、調味劑、崩解劑、防腐劑、潤滑劑、溼 潤齊 、黏合劑、溶劑、增稠劑、增溶劑等藥物輔料，製成任何一種適合於臨床上使用的劑型， 如片劑、膠囊劑、顆粒劑、口服液體製劑等口服劑型。本發明所指有效劑量是指以酪酸梭菌、凝結芽孢桿菌根據上面所述單獨或組合作 為藥物活性成份，即以酪酸梭菌；凝結芽孢桿菌；酪酸梭菌和凝結芽孢桿菌等組合分別為 藥物活性成份製成的活菌製劑包含的總活菌數不能低於lX106CFU/g，一般在lX107CFU/g 以上，最高可達到1 X 1012CFU/g或1 X 1012CFU/g以上。本發明優選的製劑工藝為，先在液體培養基中接種菌種，進行培養或多級擴增培 養，然後將液態培養物離心，收集溼菌泥，並將所述菌泥乾燥、粉碎，得到乾燥菌粉。將所得 乾燥菌粉與藥用載體混合，製成最終劑型。由於本發明首次公開了以酪酸梭菌、凝結芽孢桿菌為藥物活性成份在製備治療潰瘍性結腸炎和克羅恩病的藥物中的應用，特別是在製備治療潰瘍性結腸炎的藥物中的應 用，因此，以酪酸梭菌、凝結芽孢桿菌單獨或組合作為藥物活性成份與輔料組合製成藥劑， 只要是該藥劑用於治療潰瘍性結腸炎或克羅恩病，均屬於本發明的保護範圍。本發明的酪酸梭菌、凝結芽孢桿菌在製成任何一種劑型時，均具有治療潰瘍性結 腸炎或克羅恩病的作用。任何藥劑，如果其組份中含有酪酸梭菌、凝結芽孢桿菌中的一種或 兩種成份製備成藥，在其包裝或說明書等標識上或者在其他任何宣傳品上只要註明或提示 具有治療潰瘍性結腸炎或克羅恩病的作用，則落入本發明的保護範圍之內。本發明的酪酸梭菌、凝結芽孢桿菌是益生菌。因此，也可以將酪酸梭菌、凝結芽孢 桿菌製成保健食品或保健藥品。將酪酸梭菌、凝結芽孢桿菌製成的保健食品或保健藥品，如 果在其包裝或說明書等標識上或者在其他任何宣傳品上只要註明或提示具有治療潰瘍性 結腸炎或克羅恩病的作用，則落入本發明的保護範圍之內。
具體實施例方式藥物製備例說明以酪酸梭菌為藥物活性成分製成膠囊劑為例，說明製備方法。酪 酸梭菌、凝結芽孢桿菌按上面所述單獨或組合作為藥物活性成份，製備方法同下，製備方法 不只局限以下的方法，公知的方法均可以。所配成的製劑含兩種菌可分別發酵或混合發酵， 然後製成單一組份菌粉或混合組份菌粉，最後按常規方法製備成所需的劑型。藥物製備實施例1、酪酸梭菌活菌菌粉製備取酪酸梭菌活菌菌種管一支，溶於已滅菌裝有IOml生理鹽水和玻璃珠的IOOml三 角瓶中，活化10分鐘，用Iml無菌吸管吸取Iml菌懸液接種裝有50ml擴增培養基的250ml 三角瓶中，置搖擺床內37°C恆溫振蕩(190rpm)培養M小時，轉接裝有450ml擴增培養基 2500ml檔板三角瓶中，37°C恆溫振蕩培養M小時，鏡檢無雜菌後再轉接於裝有4. 5L擴增 培養基的種子罐中，厭氧培養(充氣量3 1) M小時，鏡檢無雜菌後轉接有45L發酵培養 基的發酵罐中，37°C厭氧培養M小時，鏡檢芽孢率達80%以上，停止培養。用連續離心機， 12000rpm離心。收集溼菌泥，稱重，按1 1 (w/v)添加適量脫脂奶粉等保護劑後，乾燥，粉 碎，常溫保存備用。藥物製備實施例2、酪酸梭菌活菌膠囊製備成份％ (重量)酪酸梭菌活菌菌粉20. 00份微晶纖維素40. 00份葡萄糖40. 00份將上述組份中1 3組中充分拌勻，然後利用常規灌裝膠囊技術按單位劑量製成膠囊。基礎實驗例1、酪酸梭菌、凝結芽孢桿菌對免疫性大鼠炎症性腸病的治療作用1實驗材料與方法1. 1實驗動物雄性SD大鼠，180_220g，購自維通利華實驗動物中心，清潔級，合格 證號為SCXP(京)0002)-0003。1. 2 實驗藥物美沙拉嗪(200mg/ml)；酪酸梭菌(CGMCC No. 0313. 1 株，IO8CFU/ ml)，凝結芽孢桿菌(CGMCC No. 1207株，108CFU/ml)由青島東海藥業有限公司提供。
1. 3實驗試劑弗氏完全佐劑(sigma)，MTT (sigma)，伴刀豆素球蛋白(ConA) (Sigma)；脂多糖(LPS) (Sigma) ；MTT (Sigma)，購自北京舒伯偉化工儀器有限責任公 司；1640培養液(Gibco)；牛結腸黏膜蛋白凍乾粉(自製)；IL-8ELISA試劑盒(BD)； TNF α ELISA試劑盒(Ebioscience)；大鼠IgG參考血清；兔抗大鼠IgG抗血清，外購。2實驗方法2. 1牛結腸黏膜蛋白凍乾粉的製備取新生小牛結腸，刮取牛結腸黏膜，反覆凍溶法 獲取牛結腸黏膜蛋白，純化濃縮，真空凍幹後於4°C保存備用。2. 2大鼠免疫性炎症性腸病模型的建立取牛結腸黏膜蛋白與完全弗氏佐劑 (1 1)製成完全抗原，選用體重在200士20g的SD大鼠，造模大鼠首次每隻足蹠內注射抗 原細8，於第10、17、24、31天分別於足蹠、背部、腹股溝、腹腔內注射抗原6!^，最後1次注射 不加佐劑，至血清抗結腸抗體達到一定效價。第35天模型組大鼠用異戊巴比妥鈉腹腔注射 麻醉，並分別進行下列處理(處理前禁食Mh)，先用2%的甲醛溶液1. 5mL灌腸，留置lh，用 生理鹽水洗淨後排去。再用抗原液(^ig/mL，不加佐劑)2mL灌腸，留置2h，然後洗淨排去。 3d後，隨機抽取2隻模型組大鼠處死，取其結腸標本(肛門向上10釐米)，病理檢查確認有 充血、水腫、炎細胞浸潤、潰瘍形成等一系列炎症性腸病的病理變化。2. 3動物分組及治療設正常對照組(8隻)。造模成功後，將造模大鼠隨機分組，1) 模型對照組(10隻)，給予生理鹽水灌胃；2)陽性藥(美沙拉嗪，200mg/ml)治療組(10隻)； 3)酪酸梭菌(108CFU/ml)治療組(10隻)；4)凝結芽孢桿菌(108CFU/ml)治療組(10隻)。 每次lml/100g 體重，1次/天，灌胃，連續給生理鹽水或治療藥21天。期間每周稱一次體 重，並持續觀察動物一般情況及糞便性狀。2. 4指標測定給生理鹽水或藥物至第21天後，斷頭處死動物，測定模型對照組和 3個治療組結腸溼重指數、黏膜潰瘍指數、黏膜損傷指數、腸繫膜淋巴細胞轉化率、IL-8、 TNF-α禾口 IgG等指標。2. 4. 1結腸溼重指數結腸溼重指數=結腸溼重(g)/100g.體重。2. 4. 2黏膜潰瘍指數將新鮮結腸腸管縱行切開，清除腸內容物，將結腸中上段及結 腸下段兩部分分別編號，固定在硬紙板上，新鮮標本拍照後，在10%的甲醛液中固定，用卡 尺測量結腸黏膜上細條索狀或線形出血性病變，以全部病變總長度加以測量。潰瘍指數的 計算病灶長度小於Imm為1分，l-2mm為兩分，2_3mm為3分，3_4mm為4分，如病灶長度大 於4mm，將其分為若干段，每段按上法計分，當病灶寬度大於2mm時，其得分加倍。一隻動物 全結腸各病灶得分的總和為其潰瘍指數。2. 4. 3黏膜損傷指數將結腸段修成塊，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，切片厚度5 μ m， HE染色，光鏡檢查，顯微組織彩色照相，根據病變嚴重程度打分(輕度1分黏膜表面有少 量分泌物，黏膜下層輕微充血、水腫，少量炎性細胞浸潤；中度2分黏膜表面有較多分泌 物，少量黏膜上皮脫落，黏膜下層明顯充血、水腫，固有層大量炎性細胞浸潤；重度3分粘 膜表面分泌物多，黏膜上皮脫落多，黏膜全層炎症，杯狀細胞減少，出現潰瘍病灶)，分別計 算每組每隻動物直腸及結腸下端和結腸中上端的病變積分，得出平均數。2. 4. 4腸繫膜淋巴細胞轉化率無菌環境下取大鼠腸繫膜淋巴細胞，過200目細胞 篩，無菌PBS洗滌兩次，IOOOrpm, 5min。用完全1640培養液調整細胞濃度為5X IO5個/ml， 每孔100 μ 1，接種於96孔圓底細胞板中，同時加ConA (終濃度為3μ g/ml)或LPS (終濃度為5 μ g/ml)，100 μ 1/孔。另設定空白對照孔(未加誘導劑)，37°C、5% (X)2孵育72h，培養 結束前4h，加MTT (5mg/ml) 20 μ 1，培養結束後，測定540nm處測定OD值，計算淋巴細胞刺激 指數。淋巴細胞刺激指數(Si)=刺激組OD值/未刺激組OD值藥物。2. 4. 5IL-8、TNF-α 和 IgG 斷頭處死大鼠，取血，4°C靜置過夜，3000rpm，20min 離 心，取上清，分裝，放於-20°C待測。使用ELISA試劑盒，按照說明書，測定大鼠血清中大鼠 IL-8及TNF-a的含量。使用單向免疫擴散法測定血清中IgG的含量。2. 5統計學處理各組間的數據差異的統計學顯著性檢驗，用t-student't檢驗，差 異顯著性界限為P <0. 05。3實驗結果3. 1糞便性狀、結腸溼重指數模型對照組大鼠在造型期間排白色粘液性軟便。治療組大鼠在治療前也排白色粘 液性軟便，治療21天後均排正常便。美沙拉嗪治療組、酪酸梭菌治療組、凝結芽孢桿菌治療組治療21天後結腸溼重指 數與模型對照組的比較呈顯著性降低(P < 0. 05)，3個治療組大鼠治療後結腸溼重指數比 較無顯著性差異，見表1。表1免疫性炎症性腸病大鼠結腸溼重指數變化情況G士 S)
權利要求
1.凝結芽孢桿菌在製備治療炎症性腸病藥物中的應用。
2.凝結芽孢桿菌在製備治療克羅恩病藥物中的應用。
3.按權利要求1或2所述應用，其特徵在於凝結芽孢桿菌包含凝結芽孢桿菌TBC169保 藏編號 CGMCC No. 1207。
4.按權利要求1或2所述應用，其特徵在於將有效劑量的權利要求1或2所述的凝結 芽孢桿菌和藥學上可接受的不同載體製成片劑、膠囊劑、散劑、口服液體製劑。
5.按權利要求4所述，其特徵在於所述有效劑量是指製劑包含的總活菌數不能低於 lXl(fCFU/g。
6.按權利要求4所述，其特徵在於所述有效劑量是指製劑包含的總活菌數優選 lXl(fCFU/g 及以上。
7.按權利要求4所述，其特徵在於所述有效劑量是指製劑包含的總活菌數優選 lX1012CFU/g 及以上。
全文摘要
本發明公開了凝結芽孢桿菌的藥物新用途，具體涉及凝結芽孢桿菌製備治療炎症性腸病藥物中的應用，炎症性腸病是指潰瘍性結腸炎和克羅恩病，凝結芽孢桿菌選自但不限於凝結芽孢桿菌(Bacillus coagulans)、CGMCC、保存編號1207。凝結芽孢桿菌作為藥物活性成份用於治療克羅恩病療效顯著，屬生物藥領域。
文檔編號A61P1/00GK102091099SQ20101000470
公開日2011年6月15日 申請日期2007年1月29日 優先權日2007年1月29日
發明者崔雲龍 申請人:北京普爾康醫藥高科技有限公司, 青島東海藥業有限公司