玉米肌動蛋白解聚因子的啟動子和內含子的製作方法

2023-12-10 04:32:36 4

專利名稱：玉米肌動蛋白解聚因子的啟動子和內含子的製作方法
技術領域：
本發明涉及植物基因工程技術，提供了用於控制植物中重組基因表達的DNA序列和構建體。更具體地，本發明提供了來源於玉米肌動蛋白解聚因子(ADF)的新的調控序列。
背景技術：
植物基因工程技術需要使用用於調節轉基因表達的各種不同遺傳元件，比如啟動子和內含子。
轉錄的起始由啟動子調控。一個典型的方案一般要使用幾種不同地啟動子。例如，一個啟動子用來啟動目的基因，另一個啟動子用來啟動可選擇性標記基因。
真核基因經常被稱為內含子的非編碼序列所中斷。真核基因轉錄的最初產物是含有與內含子相應的序列的前體mRNA。轉錄後加工過程中除去內含子產生mRNA，該mRNA翻譯產生蛋白質。對內含子在基因表達調節中的作用的研究表明，玉米的醇脫氫酶基因(Adh-1)的第一個內含子在厭氧條件下能夠增強表達。Callis J.，M.Fromm，和V.Walbot.(1987)，Gene Dev.11183-1200。在非厭氧條件下該內含子也能促進表達(較低程度的)。這種增強被認為是核內前體mRNA穩定化作用的結果。Mascarenhas等報導利用Adh-1內含子使CAT的表達提高了12倍和20倍。Mascarenhas等，″Intron-Mediated Enhancementof Heterologous Gene Expression in Maize，″Plant MolecularBiology，15913-920，1990。從玉米和其他單子葉植物中已經分離了另外幾種能增強基因表達的內含子。Vain，P.等(1996)，Plant CellReports 15489-494，也參見WO98/5921。
玉米ADF的cDNA序列是已知的(GenBank的登記號為X97726)，但是基因組ADF序列沒有公開。特別地，迄今為止ADF啟動子的序列沒有被公開，也沒有任何ADF內含子被鑑定。序列的簡要描述
SEQ ID NO1是AP2/BC294 PCR產物的DNA序列，包括ADF啟動子和ADF內含子1的序列。
SEQ ID NO2是pDAB305的DNA序列。發明概述
本發明提供了與ADF啟動子和ADF內含子1相應的或來源於ADF啟動子和ADF內含子1的DNA分子。
本發明的另一個方面是提供了DNA構建體，該構建體包含從5』到3』方向操作性地連接的
a)玉米ADF啟動子；
b)非翻譯前導序列；
c)內含子；
d)目的基因；和
e)3』UTR。
在優選的實施方式中，ADF啟動子包含SEQ ID NO 1的bp 1-734，內含子選自Adhl內含子1和ADF內含子1(SEQ ID NO1的bp882-2161)。
本發明的另一個方面是提供了DNA構建體，該構建體從5』到3』方向含有
a)在植物中具有功能的啟動子；
b)非翻譯前導序列；
c)ADF內含子1；
d)克隆位點；
e)3』UTR。
本發明的另一個方面是提供了一種質粒，該質粒含有玉米ADF啟動子，優選SEQ ID NO1的bp1-878，或含有玉米ADF內含子1序列，優選SEQ ID NO1的bp882-2161。
本發明的另一個方面是提供一種轉化植物，該轉化植物至少含有一個包含本發明DNA構建體的植物細胞。該植物可以是單子葉植物或雙子葉植物，優選的植物是玉米、稻、棉花和菸草。
本發明的另一個方面是提供包含本發明的DNA構建體的種子或穀粒。
本發明的一個方面是本發明涵蓋了所有提供功能性植物啟動子的任何ADF啟動子缺失型變體，這種啟動子都屬於「ADF啟動子」。為了本申請的目的，用實施例5的方法分析時，如果一個序列能代替pDAB621的bp3056-3790或pDAB625的bp3962-4694而產生一種使GUS發生本底水平以上瞬時表達的構建體，那麼該序列就認為是提供了「功能性」啟動子。本領域的普通技術人員能夠理解，在不破壞序列的啟動子功能的前提下，對SEQ ID NO1中作為ADF啟動子的733bp的序列可以作各種不同的缺失。缺失試驗是現有技術。優選地，本發明的ADF啟動子包含200個連續鹼基對，該連續鹼基對與SEQ ID NO1的bp1-734所定義序列的200個連續鹼基對一致。更優選的是這樣的ADF啟動子，其包含500個連續鹼基對，該連續鹼基對與SEQ ID NO1的bp1-734所定義序列的500個連續鹼基對一致。
相似地，本發明涵蓋了與啟動子一起使用時具有增強表達功能的ADF內含子缺失型變體。術語「ADF內含子1」包含了這種缺失型變體。優選地，本發明的ADF內含子1包含600個連續鹼基對，該連續鹼基對與SEQ ID NO1的bp882-2161所定義序列的600個連續鹼基對序列一致。更優選這樣的ADF內含子，其包含SEQ ID NO1的bp882-2161所定義序列的1000個連續鹼基對。本發明的詳細描述
ADF啟動子優選地用在含有內含子的構建體中，該內含子被插入在目的基因5』端和啟動子3』端的非翻譯前導區中。適合的內含子包括ADF內含子1、Adhl內含子1、泛素內含子1和Bronze2內含子1。
用於本發明構建體的非翻譯前導序列可以來自任何合適的來源，並可以進行特定的修飾以增加mRNA的翻譯。5』非翻譯區可以來源於啟動子的天然前導序列、待表達基因或編碼區域的天然前導序列、病毒RNAs、合適的真核基因，也可以是合成的序列。
用於本發明構建體的目的基因可以是希望在植物中表達的任何基因。特別有用的基因是那些能夠提供除草劑、昆蟲或病毒耐性的基因和能夠改善植物的營養價值或加工特性的基因。合適的農藝學有用基因的例子包括能提供昆蟲抗性的來源於蘇雲金芽苞桿菌的殺蟲基因，和5』-烯醇式丙酮醯-3』-磷酸莽草酸合成酶(5』-enolpyruvyl-3』-phosphoshikimate synthase，EPSPS)基因及其提供草甘膦除草劑抗性的任何變體。本領域的普通技術人員能很容易地理解，能夠賦予期望性狀的任何農藝學重要基因都是可用的。
本發明的構建體所用的3』UTR，或3』端非翻譯區是能夠使mRNA進行有效加工，能夠保持信息的穩定和指導腺苷核糖核苷酸加到轉錄後mRNA序列3』末端的3』UTR。此3』UTR可以是啟動子區天然的，結構基因天然的，或者來自其他來源。許多在植物宿主中能夠表達的基因來源的各種終止區域都是可用的，所述基因例如，細菌基因、冠癭鹼基因、病毒和植物基因。合適的3』UTRs包括但不限於以下的舉例pre53』UTR(WO98/56921)、胭脂鹼合成酶(nos)基因的3』UTR、tmL3』、或acp3』。
本發明一般適用於在單子葉植物和雙子葉植物中表達結構基因。本發明特別適合於單子葉植物種類的任何成員，包括但不限於玉米、稻、大麥、燕麥、小麥、高粱、裸麥、甘蔗、菠蘿、洋芋、洋蔥、香蕉、椰子、和海棗。本發明優選的應用是生產轉基因玉米植物。本發明特別適用於禾本科(Graminaceae)植物，特別是玉米、小麥、稻、燕麥、大麥和高粱。雙子葉植物種包括菸草、西紅柿、向日葵、棉花、甜菜、馬鈴薯、萵苣、瓜類、大豆和canola(菜子油菜)。
除了ADF啟動子外，ADF內含子1可以和其它啟動子一起使用以增強表達。和ADF內含子1一起使用的啟動子可以是適合用於植物的任何啟動子。所選擇的啟動子單獨使用應能使目的蛋白充分表達，但尤其是當和ADF內含子1一起使用時應如此，導致產生有效量的目的蛋白，從而使植物細胞和由此再生的植物顯現出由該表達蛋白所導致的表型特徵。合適的啟動子可以有不同的來源，比如植物或植物DNA病毒。優選的啟動子是ADF啟動子、per5啟動子、35T啟動子(在實施例20和23中描述)和泛素啟動子。有用的啟動子包括那些從花椰菜病毒類中分離出來的啟動子，比如花椰菜花葉病毒19S和35S(CaMV19S和CaMV35S)轉錄啟動子。其他有用的啟動子包括Kat等(1987)Science2361299-1302描述的CaMV35S增強啟動子(eCaMV35S)和核酮糖1，5二磷酸羧化加氧酶(RUBISCO)的小亞基啟動子。其它適當啟動子例如稻肌動蛋白啟動子、親環蛋白啟動子、泛素啟動子、ADH1啟動子。Callis等，同上；Class I patatin promoter，Bevan等(1986)Nucleic Acids Res.14(11)，4675-4638；ADP glucosepyrophosphorylase promoter；. beta.-conglycinin promoter，Tiemey等(1987)Planta 172356-363；E8 promoter，Deikman等(1988)Embo J.7(11)3315-3320；2AII promoter，Pear等(1989)Plant Mol.Biol.13639-651；acid chitinase promoter，Samac等.(1990)Plant Physiol.93907-914。
可容易地構建利用ADF啟動子或ADF內含子1的基因盒，所用的技術是已知的，比如在如下文獻中所公開的技術Sambrook等，(1989)，Molecular CloningA Laboratory Manual，第二版，冷泉港出版社；和Ausubel等.(1987)Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley和Sons，紐約，NY。編碼ADF啟動子的DNA可以用已知的方法從染色體DNA來製備或直接合成。基因組DNA可以用標準的方法分離，Sambrook等.(1989)；Mullis等.(1987)，Meth.Enz.，155335；Horton等。(1989)，Gene，7761.；Erlich(ed.)(1989)).PCR TechnologPrinciples and Applications for DNAAmplification。用寡核苷酸合成法製備合成序列也是可行的，參見Caruthers(1983)inMethodology of DNA and RNA，(ed.)Weissman，和Beaucage等.(1981)，Tetrahedron Letters，221859-1962)。
本發明也包括與本發明具體公開的調控序列有實質性序列同源性，以致對表達有所公開作用的DNA序列。
本發明中的術語「實質性序列同源性」是指一個核苷酸序列(在DNA或RNA的情況下)或胺基酸序列(在蛋白質或多肽的情況下)與另一個核苷酸序列或胺基酸序列表現出實質性功能或結構等同性。具有實質性序列同源性的序列之間的任何功能或結構的差別是微小的(de minimis)，也就是說不影響該序列發揮本申請所指功能的能力。與本文公開的序列具有實質性序列同源性的序列通常是本文所公開序列的變體，如突變體，但也可以是合成序列。
在大多數情況下，與本申請具體公開的序列有95％同源性的序列能行使等同的功能，有時，更低的同源性，如75％或80％也能接受。確定這些序列非關鍵部分的位置是費時的，但對於本領域的普通技術人員來說是常規技術且容易實現。
可以想像，相應於上面提及序列的序列在野生型序列的基礎上可以含有一個或更多個的修飾，但相對於本發明的教導而言，仍使相應的元件具有可比性。例如正如上文提到的，可使用片斷。可在分離的序列中引入修飾，包括有限數量的各種核苷酸的插入、缺失、或非保守性替換或多個核苷酸的保守性替換。而且，這種DNA分子構建可使用以下來源，此來源已顯示能增強置於其調節控制之下的異源基因的表達。修飾寡核苷酸序列的示例性技術包括採用多核苷酸介導的定點誘變，參見Zoller等.(1984)，DNA，3479；Higuchi等.(1988)，Nucl.Acids Res.，167351-7367；Horton等.(1989)，Gene，7761；和PCRTechnologyPrinciples and Applications for DNA Amplification，(ed.)Erlich(1989)。
將生物材料導入到宿主細胞中的常規技術包括電穿孔(參見Shigekawa和Dower(1988)，Biotechniques，6742；Miller，等(1988)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85856-860；和Powell，等(1988)，Appl.Environ.Microbiol.，54655-660)、直接DNA攝取機制(參見Mandel和Higa(1972)，J.Mol.Biol.，53159-162；Dityatkin，等(1972)，Biochimica et Biophysica Acta，281319-323；Wigler，等.(1979)，CeU，1677；和Uchimiya，等.(1982)，InProc.5th Intl.Cong.Plant Tissue and Cell Culture，A.Fujiwara(ed.)，Jap.Assoc.for Plant Tissue Culture，Tokyo，pp.507-508)；融合機制(參見Uchidaz，等.(1980)，InIntroduction of Macromolecules Into Viable Mammalian Cells，Baserga等.(eds.)Wistar Symposium Series，1169-185)；感染因子(參見Fraley，等.(1986)，CRC Crit.Rev.Plant Sci.，41-46)；和Anderson(1984)，Science，226401-409)；顯微注射機制(參見Crossway，等.(1986)，Mol.Gen.Genet.，202179-185)；和高速微粒轟擊機制(參見授予Miller，Schuchardt，Skokut和Gould的專利EPO 0 405 696，(The Dow Chemical Company)。
可以根據所用的宿主細胞選擇合適的轉化宿主細胞的方法。根據迄今為止的經驗，一旦基因插入到細胞中，轉化方法本身引起的基因表達差異很小。一旦導入植物組織中，結構基因的表達可以用一個瞬時表達系統來檢驗，或者通過選擇植物基因組中的穩定整合來檢驗。
體外培養植物組織以及，在許多情況下，使之再生成完整植株的技術是現有技術。生產成熟轉基因植物的合適方法可以根據所用的植物種類來選擇。再生隨著植物種類的不同而不同。有效的再生受培養基、基因型和培養史的影響。一旦獲得了完整植株，他們就能進行有性或無性繁殖，使繁殖的後代細胞中至少含有一個拷貝的上述序列。收集再生植物的種子作進一步的研究，這些種子能長成植株。從最初的轉化植物轉移導入的基因至商業上有用的栽培品種中的步驟對於本領域的普通技術人員來說是已知的。
在下文的實施例中，所有的分子生物學操作都是按照《分子克隆實驗室指南》(Maniatis，T.，Fritsch，E.F.，Sambrook，J.，1982，冷泉港實驗室)中的描述進行的。
實施例1
ADF5』側翼序列
從玉米基因組DNA，var.OQ414(Dow AgroSciences proprietaryline)中分離出肌動蛋白解聚因子基因(Zmbap3)的5』側翼序列。用含有AmpliTaq聚合酶FS的ABI Prism DNA序列分析試劑盒根據廠商(Perkin Elmer/Applied Biosystems Division，福斯得市，加拿大)的描述測定DNA序列。測序反應在Applied Biosystem373A型DNA測序儀(Perkin Elmer/Applied Biosystems Division)上進行。
ADF5』側翼序列與公開的cDNA序列相比發現不同，其緊接ATG起始密碼子的3』端存在一個內含子。
下表列出了AP2/BC294 PCR產物(SEQ ID NO1)的特徵
AP2/BC294 PCR產物的特徵
該內含子的頭兩個鹼基和最後兩個鹼基是該內含子內在的共有內含子拼接位點序列。緊靠內含子外的序列也接近一致。
在下面的實施例中，用基於質粒pDAB305的表達載體來檢測ADF啟動子和ADF內含子。pDAB305是一個5796bp的質粒，包括含串聯拷貝花椰菜花葉病毒35S增強子(35S)的啟動子、Adhl內含子1的缺失型變體、與uidA基因融合的來源於玉米條斑花葉病毒外殼蛋白的非翻譯前導區、和隨後的nos3』UTR。
pDAB305的序列如SEQ ID NO2所示。下表描述了該序列的特徵。pDAB305的特徵
實施例2
pDAB620的構建
質粒pDAB620基本上是pDAB305，但用ADF啟動子替換了CaMV35S雙增強啟動子和ADH內含子的I/MSV內含子前導區。為了克隆GUS編碼區後的不含內含子的ADF啟動子，用含有5』Hind III位點和3』Nco I位點的引物擴增ADF啟動子。PCR擴增使用70ng模板DNA(克隆進PCR2.1-Topo載體的SEQ ID NO1)，GeneAmp10 x PCR Buffer(Perkin Elmer/Applied Biosystems Division)，引物各50皮摩爾，和5單位的AmpliTaq GoldTM聚合酶(Perkin Elmer/AppliedBiosystems Division)，反應總體積為100μl。擴增在GeneAmp9600型PCR儀(PE/ABI)中進行，使用的循環條件為96℃ 10分鐘，94℃，1分鐘，55℃ 2分鐘，72℃ 3分鐘，20個循環，接著72℃延伸7分鐘。把906bp PCR終產物克隆進PCR2.1-Topo(Invitrogen)中。挑選出單個克隆，抽提出DNA，用上文描述的方法測序。為了把ADF啟動子克隆進pDAB305中，用Nco I和Hind III限制內切酶(NewEngland Biolabs，Inc.，Beverly，MA)消化重組PCR2.1-Topo(Invitrogen)克隆的Hind III和Nco I片斷，從中分離出ADF啟動子片斷。該ADF片斷用製備型瓊脂糖凝膠純化，用GenElute AgaroseSpin Columns(Supelco，Inc.，Bellefonte，PA)抽提DNA。用Hind III和Nco I(New England Biolabs)消化質粒pDAB305以除去其含有的啟動子和內含子。被消化的質粒在瓊脂糖凝膠(FMC)上跑電泳，切下質粒片斷，用GenElute Agarose Spin Columns(Supelco，Inc.)從凝膠中抽提出DNA。Hind III/Nco I ADF啟動子片斷與該缺失型pDAB305載體混合，依照製造商的說明用快速DNA連接試劑盒(Rapid DNALigation Kit)(Roche Diagnostics formerly Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)連接。再按說明書用連接混合物轉化亞克隆高效DH5αTM感受態細胞(Gibco/BRL，Gaithersburg，MD)，在含有75μg/ml氨苄青黴素的LB培養基上塗平板，37℃下過夜培養。挑選單菌落，抽提出DNA，用上文描述的方法測序。替換CaMV啟動子/ADH內含子I/MSV前導區片斷而含有ADF啟動子的質粒稱為pDAB620。
pDAB 620的特徵
實施例3
pDAB621的構建
質粒pDAB621和實施例2中的pDAB620不同在於該質粒的ADF啟動子的3』端緊接有ADH/MSV內含子前導區。為了將ADF啟動子克隆到修飾過了的ADH內含子I/MSV前導區之前，用PCR擴增分別在ADF啟動子的5』端和3』端引入Hind III位點和BamH位點。ADF啟動子的PCR擴增是在RobocyclerGradient96 Temperature Cycler(Stratagene)中進行的，條件如下70ng克隆到PCR2.1-Topo載體中的DNA(SEQ ID NO1)，15μl GeneAmpXL PCR試劑盒中的3.3xXL Buffer II(Perkin Elmer/Applied Biosystems Division)，引物各50pmol，1mM醋酸鎂，dNTP各0.2mM，1.5μl rTth DNA聚合酶(Perkin Elmer/Applied Biosystems Division)。擴增產物克隆到PCR2.1 Topo(Invitrogen)中。挑選單個的克隆，用鹼裂解法抽提出DNA，該ADF片斷用瓊脂糖凝膠純化和用GenElute Agarose SpinColumns(Supelco，Inc.，Bellefonte，PA)抽提出DNA。為了把ADF啟動子克隆進pDAB305中，從重組PCR2.1-Topo(Invitrogen)中以BamHI和Hind III片斷的形式分離出ADF啟動子。質粒pDAB305經Hind III和BamHI(New England Biolabs)消化以除去其含有的啟動子來製備。Hind III/BamHI ADF啟動子片斷與該缺失型pDAB305載體混合，依照製造商的說明用快速DNA連接試劑盒(Rapid DNA LigationKit)(Roche Diagnostics formerly Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)連接。用連接混合物轉化亞克隆高效DH5αTM感受態細胞(Gibco/BRL，Gaithersburg，MD)。細胞在含有75μg/ml氨苄青黴素的LB培養基上塗平板。37℃下隔夜培養。挑選單個菌落，抽提出DNA，用上文描述的方法測序。含有替換了CaMV啟動子的ADF啟動子片段的質粒稱為pDAB621。
pDAB621的特徵
實施例4
pDAB625的構建
質粒pDAB625和質粒pDAB620有本質的不同，該質粒的ADF啟動子的3』端緊接有ADF內含子1。為了構建ADF啟動子/ADF內含子載體，用PCR剪接重疊延伸策略(PCR ProtocolsA Guide to Methods andApplications，ed.Innis，M.；Gelfand，D.；Sninsky，J.；White，T.，1990，Academic Press)使該啟動子和該增強子序列融合。用合適的引物在不同反應中分別擴增ADF啟動子和ADF內含子。反應條件如下10ng模板DNA(克隆進PCR2.1-Topo載體的SEQ ID NO1)，10μlGenekmp10x PCR緩衝液(PE/ABI)，引物各100pmoles，5單位的AmpliTaq GoldTM聚合酶(PE/ABI)，總體積100μl。在GeneAmpPCRSystem9600溫度循環儀中進行循環，條件如下95℃ 10min，(94℃30sec，60℃ 30sec，72℃ 1min)15個循環，72℃反應5min。再進行PCR反應使啟動子片斷和內含子產物融合，該反應包括如下成分PCR產物各50ng，30μl 3.3x XL Buffer(PE/ABI)，4μl 25mM醋酸鎂，10μl 2mM dNTPs，引物各100pmoles，6單位的rTth DNA聚合酶(PE/ABI)，總體積50μl。反應在RoboCyclerGradient96Temperature Cycler(Stratagene)中進行，循環條件如下94℃ 1min，(94℃ 30sec，70℃ 4min)×20循環，72℃ 10min。2148bp的終產物在瓊脂糖凝膠(FMC)上跑電泳。切下目標片斷，用GenEluteAgarose Spin Columns(Supelco，Inc.)抽提出DNA。進行另一個PCR反應擴增該2148bp的片斷，將反應產物克隆到PCR2.1-Topo(Invitrogen)中。挑選出單個菌落，抽提出DNA，用上文描述的方法測序。為了把ADF啟動子/ADF內含子融合物克隆進pDAB305中，用NcoI和Hind III限制內切酶(New England Biolabs，Inc.，Beverly，MA)消化重組PCR2.1-Topo(Invitrogen)克隆，以Hind III和Nco I片斷從中分離出融合產物。質粒pDAB305以Hind III和Nco I(NewEngland Biolabs)消化以除去其含有的啟動子和內含子/前導區。HindIII/Nco I的ADF啟動子/ADF內含子片斷與該Hind III/Nco I缺失型pDAB305載體混合，依照製造商的說明用快速DNA連接試劑盒(RapidDNA Ligation Kit)(Roche Diagnostics formerly BoehringerMannheim，Indianapolis，IN)連接。再用連接混合物轉化亞克隆高效DH5αTM感受態細胞(Gibco/BRL，Gaithersburg，MD)，在含有75ug/ml氨苄青黴素的LB培養基上塗平板，37℃下隔夜培養，挑選單個菌落，抽提出DNA，用上文描述的方法測序。將含有替換CaMV啟動子/ADH內含子的ADF啟動子/ADF內含子片斷的質粒稱為pDAB625。
pDAB625的特徵
實施例5
ADF-GUS結構的瞬時測試
II型愈傷組織的培養是從基因型為″Hi-II″的未成熟合子胚開始的(Armstrong等.(1991)Maize Genet.Coop.News Lett.6592-93)。胚從Hi-II親本A與Hi-II親本B雜交產生雜種的溫室培養的植物穗中分離，或從Hi-II植物自花授粉或同胞授粉產生的F2胚中分離獲得。未成熟胚(1.5-3.5mm)培養在15AglO愈傷組織起始培養基中，該培養基包含N6鹽和維生素(Chu等，(1978)，N6 medium and itsapplication to anther culture of cereal crops.Proc.Symp.PlantTissue Culture，北京出版社，43-56)、1.0mg/L2，4-D、25mM L-脯氨酸、100mg/L酪蛋白水解產物、10mg/L AgNO3，2.5g/L脫乙醯吉蘭糖膠(GELRITE)(Schweizerhall，South Plainfield，NJ)、和20g/L蔗糖，pH為5.8。4到6星期後，將愈傷組織接種到保持培養基中(在起始培養基的基礎上去掉AgNO3，同時將L-脯氨酸的量減到6mM)。約12-16周後挑選II型愈傷組織。
根據下文的實驗方案，每一個用於測試的GUS結構和pDeLux(含有一個帶有Nos 3』UTR的修飾35S啟動子驅動的螢光素酶)一起共沉澱到金顆粒上。使用等摩爾量的GUS質粒。總共70μg DNA35μg的pDeLux加上35μg的測試DNA和BluescriptTM DNA(Stratagene，La Jolla，CA)(必要時)用蒸餾水稀釋到150μL。再把該DNA和水加到30mg表面無菌的1.0μm金顆粒球中(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)。短時間渦旋該混合物(大約15秒)後，加入37μL的2.5M氯化鈣和15μL的0.1M亞精胺(游離鹼)。渦旋30秒後，DNA和金從溶液中沉澱出來，去掉上清液，加入1mL乙醇。DNA/金混合物以1∶4的比例稀釋後用於轉化。
II型愈傷組織在滲透培養基(osmotic medium)中預處理約16小時。滲透培養基是在保持培養基的基礎上還含有0.2M山梨糖醇和0.2M甘露糖醇。然後，將愈傷組織放在盛有滲透培養基的60×20mm培養皿中用於氦轟擊，該培養基含有2％的瓊脂糖而固化。每個靶(500-600mg的愈傷組織)用104μm的網篩覆蓋，以阻止組織濺出和丟失。在Dow AgroSciences Helium Blast Device1.0(美國專利No.5,141,131)中每個靶都分別用DNA/金混合物轟擊。在25英寸Hg的部分真空，轟擊距離為10cm，壓強為1500psi的條件下，DNA/金混合物轟擊每個靶4次，每次轟擊的送出體積為20μl。還在該程序中途時混合組織，以暴露未轟擊的愈傷組織。轟擊結束後，將靶組織放在原先的滲透培養基中黑暗條件下26℃過夜培養。
每個試驗挑選4個II型愈傷組織細胞系。每一結構要用到來源於每一個細胞系的兩個靶。還包括由來源於全部上述4個細胞系的混合組織構成的兩個非轉化對照組織(NTC)。根據上述相同的方案將該對照組織轉移到滲透和轟擊培養基中，然而並不進行氦轟擊。
轟擊後大約20小時，將每種靶組織各200-400mg轉移到1.5mL樣品管中(Kontes，Vineland，NJ)。為了抽提蛋白質，用由0.35A、40W馬達驅動的不鏽鋼Kontes Pellet Pestle(Model102，RaeCorporation，McHenry，IL)勻漿愈傷組織，設置為″90″。以螢光素酶分析試劑盒(Promega，Madison，WI)的細胞培養物裂解試劑作為抽提緩衝液。向裂解緩衝液中加入蛋白酶抑制劑苯甲磺醯氟(PMSF)和亮抑酶肽半硫酸鹽(leupeptin hemisulfate salt)使其終濃度分別為1mM和50μM。再研磨前向樣品管中每1mg組織加入0.5L裂解緩衝液。每隔25秒研磨一次，反覆進行4次以勻化愈傷組織，每個研磨期後在冰上保溫10秒鐘。之後向樣品中每1mg組織加入1.0μL裂解緩衝液，樣品放在冰上直到全部樣品研磨完。然後在5℃全速離心樣品2次(Eppendorf Centrifuge Model5415)，每次時間為7分鐘。轉移第一次離心後的上清液，去掉其沉澱。第二次離心後收集愈傷組織提取物(上清液)，在冰上保溫以進行GUS和LUC分析。
根據製造商的指導，製備LUC分析試劑盒的LUC分析緩衝液。將緩衝液加熱到室溫，加到自動發光光度計(Model1251 Luminometerand Model1291 Dispenser，Bio-Orbit，Finland)的分配泵中。每個樣品分析三份，向三個聚丙烯光度計分析皿(Wallac，Gaithersburg，MD)中各加20μl抽提物。每管加入100μl分析緩衝液，45秒整合(integration)期後檢測發光。「空白反應」是用20μl的抽提緩衝液代替愈傷組織抽提物並在每個試驗中進行測定。
為了分析GUS活性，使用一種GUS-LightTM分析試劑盒(Tropix，Bedford，MA)。同樣，每個樣品分析三份，每個光度計分析皿中加20μl抽提物。根據製造商的指導用分析試劑盒製備GUS-LightTM反應緩衝液。該緩衝液加熱到室溫，間隔10秒向每個光度計分析皿中等份加入180μl。室溫下保溫1小時後，加入300μL GUS-LightTM光發射加速緩衝液，5秒的整合期過後檢測發光。在GUS分析中也包括「空白反應」，用20μl的抽提緩衝液代替愈傷組織抽提物。
GUS和LUC結果用相對光單位(RLU)表示。樣品RLU的讀數減去空白和NTC讀數。為了便於比較各個GUS結構，取平方根使GUS讀數相對於LUC讀數標準化，計算每個測試樣品的GUS/LUC比率值。每種結構所有樣品的該比值取平均值，用統計顯著性分析T檢驗法進行比較，一種修飾35S啟動子(35T)/GUS/Nos多聚A結構(pDAB305)作為每個試驗的對照。測試結構的表達水平表示為pDAB305活性的百分比。
相對於35T對照，質粒pDAB620被證明沒有高於本底水平的表達。然而，將pDAB621和pDAB625進行重複試驗，平均分別能達到標準表達水平的62％和82％。pDAB621的表達水平一直比對照要顯著地低。但是pDAB625的表達有點更不穩定，有時和pDAB305的表達水平一樣好。
實施例6
在玉米中穩定表達
ADF啟動子的活性用質粒pDAB630(ADF啟動子/ADF內含子/PAT/nosA)轉化的玉米組織在含選擇劑的培養基中形成愈傷組織的頻率來表徵。產生含有在稻肌動蛋白啟動子控制下的PAT的轉基因玉米事件為內對照。在15個並行試驗中，ADF構建體恢復除草劑抗性分離株的效果和稻肌動蛋白啟動子構建體一樣好，或超過了稻肌動蛋白啟動子構建體。Southern分析證實所有產生的ADF事件中均含有PAT基因。
實施例7
轉基因玉米
分析從兩例轉化了質粒pDAB625的事件來源的轉基因植物在葉組織中的GUS表達。在定量分析中，觀察到GUS水平佔總的可提取蛋白的0.02％。
序列表Rubin-Wilson，Beth
Smith，Kelley A玉米肌動蛋白解聚因子的啟動子和內含子50695US60/167，1111999-11-232PatentIn Ver.2.012253DNA人工序列人工序列說明AP2/BC294 PCR產物1cgcccgggca ggtaaatagc aagtgatttt ctctctatgg attccatcta ttttcctggc 60caccaaacta gccttaagat ttgttttgtc tggatagcac aaaaattgtc catcttgctt 120gcacccataa cactgccttg aacagaagat gcatgattac ctgcatgcat tgaacgacat 180accagataag tgccaccagt accacaaact tacatctcgg agacacctta ctatatgatt 240tatgttgtca caacatacag gtattatact cacttcttag agttgtattt ttatattcgt 300attgtagtgt aatttgattt gtattagttt agttctgtat tggttgtttc taaaaaaatc 360gttagattat atcgataata tatgtggtat tcgtttttac gtaatcattg tgcactaaca 420ttttgttgaa tatattatat accgttgcaa cgcacgggca cccaactagt ctattcatta 480ttttcccagg atgctcattc cgaaatctct ctcgcggaga agaaaacgaa cgaaagatca 540cgaaagatcg cgcatcggcg gcccgtccat ctcgacatcc gacgaccgcg caagctcgca 600gtgggccgct ccgttccgtc gcggggcagc taccgcctac cacacccccg ctccccgcac 660cgcacggacc ggggtggtaa aacccggcga ccacatcaaa acacgaggcg tccccgactc 720cgcagtccgc aggaccggtc actcggcacg caggctagca gcacagcagc 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1.含有ADF啟動子的分離的DNA分子。
2.分離的DNA分子，其含有SEQ ID NO1第1-734位鹼基對，或該序列保持有充當植物細胞啟動子的能力的片斷、遺傳變體或缺失型(deletion)。
3.權利要求2的分子的片斷、遺傳變體或缺失型，其特徵是含有至少200個連續鹼基對，該連續鹼基對與SEQ ID NO1第1-734位鹼基對所定義序列的200個連續鹼基對一致。
4.具有20個鹼基對的核苷酸部分的分離的DNA分子，該核苷酸部分在序列上與SEQ ID NO1第1-734位鹼基對所示序列的20個連續鹼基對的部分一致。
5.含有ADF內含子1的分離的DNA分子。
6.分離的DNA分子，其含有SEQ ID NO1第882-2161位鹼基對，或在植物細胞中和啟動子一起使用時保持有增強表達的能力的該序列的片斷、遺傳變體或缺失型。
7.權利要求6的分子的片斷、遺傳變體或缺失型，其特徵是含有至少600個連續鹼基對，該連續鹼基對與SEQ ID NO1第882-2161位鹼基對所定義序列的600個連續鹼基對一致。
8.具有20個鹼基對的核苷酸部分的分離DNA分子，該核苷酸部分在序列上與SEQ ID NO1第882-2161位鹼基對所示序列的20個連續鹼基對的部分一致。
9.含有與異源核酸序列可操作地連接的啟動子的DNA構建體，其中該啟動子選擇性地與SEQ ID NO1雜交。
10.權利要求9的DNA構建體，其中啟動子包含
(a)SEQ ID NO1第1-734位的鹼基對，或
(b)至少200個連續鹼基對，該連續鹼基對與SEQ ID NO1第1-734位鹼基對所定義序列的200個連續鹼基對一致，或
(c)20個鹼基對的核苷酸部分，該核苷酸部分在序列上與SEQ IDNO1第1-734位鹼基對所示序列的20個連續鹼基對的部分一致。
11.含有與異源核酸序列連接的內含子的DNA構建體，其中所述內含子選擇性地與SEQ ID NO1雜交。
12.被轉化的植物，該植物含有至少一個包含權利要求9的DNA構建體的植物細胞。
13.被轉化的植物，該植物含有至少一個包含權利要求11的DNA構建體的植物細胞。
14.含有權利要求9的DNA構建體的種子或穀粒。
15.含有權利要求11的DNA構建體的種子或穀粒。
16.在植物中表達異源核酸序列的方法，包括
a)將含有與異源核酸序列可操作地連接的ADF啟動子的載體導入到植物細胞中；和
b)將所述細胞再生成植物。
17.產生種子的方法，包括
a)將含有與異源核酸序列可操作地連接的ADF啟動子的載體導入到植物細胞中；
b)將所述細胞再生成植物；和
c)將所述與所述異源核酸序列可操作地連接的ADF啟動子以有性的方式傳遞給後代。
18.權利要求17的產生種子的方法，包括收集所述後代產生的種子的額外步驟。
全文摘要
來自玉米肌動蛋白解聚因子的啟動子和內含子、及其遺傳變體或缺失型，可用於控制植物中轉基因的表達。
文檔編號A01H5/00GK1409762SQ0081701
公開日2003年4月9日 申請日期2000年11月22日 優先權日1999年11月23日
發明者B·羅賓－威爾森, K·A·史密斯 申請人:道農業科學公司