利用幼穗拯救獲得轉基因小麥的方法
2023-12-10 04:15:26
專利名稱：利用幼穗拯救獲得轉基因小麥的方法
技術領域：
本發明涉及一種利用幼穗拯救獲得轉基因小麥的方法。
背景技術：
轉基因技術是利用異源基因進行種質資源創新的良好途徑，但轉化效率低下是限制轉基因技術在小麥上應用的世界性難題。迄今為止，已報導的小麥轉基因方法主要有花粉管法、基因槍法和農桿菌介導法。其中，花粉管法是利用小麥花粉萌發形成的花粉管通道，將外源基因導入受體。該項技術不需要愈傷組織的培養過程，相比於基因槍法既簡單又經濟，但因其重複性差，很難獲得分子證據，在小麥上的應用越來越少。基因槍法是以金粉或鎢粉作為載體，通過高壓轟擊受體組織將外源基因導入到受體細胞中，並實現基因整合。但基因槍法除了需要消耗昂貴的大載體、可裂膜、阻擋網等一次性耗材外，插入到受體細胞中的基因往往是隨機整合，並且是多拷貝插入。因為小麥是異源六倍體，基因組非常龐大，多拷貝插入除了影響基因的表達效率外，轉基因後代純合較慢，難以迅速獲得純合株系。另夕卜，篩選標記難以去除也是限制基因槍轉化小麥的主要因素之一。農桿菌法則克服了上述兩種方法的缺點，其原理是先用目標基因替換根癌農桿菌上的致癌基因，在農桿菌侵染受體材料時，目標基因被釋放整合進入受體細胞，這種插入往往以單拷貝或低拷貝的形式發生，而且作為質粒複製所需要的篩選標記被留在受體細胞外，提高了轉基因的安全性。
農桿菌介導法的上述優點，賦予它具有極大的應用潛力。但是農桿菌的天然寄主是雙子葉植物，對許多單子葉植物侵染困難。近年來，通過科學家的不斷努力，水稻、玉米、小麥等重要的單子葉植物的轉化相繼成功。就水稻而言，以明恢63成熟胚愈傷組織為受體的農桿菌轉化，其效率已經達到90%。而農桿菌轉化小麥效率低下仍然是一世界性難題。目前，通過農桿菌介導進行轉化的方法主要有兩種:一是農桿菌侵染幼胚、成熟胚及其誘導形成的愈傷組織，通過後續的愈傷誘導、篩選和再生獲得轉基因小麥，但農桿菌侵染後的愈傷組織，往往因為農桿菌的毒性而褐變，無法繼續生長，造成轉化效率低下。二是莖尖分生組織侵染法，即利用農桿菌侵染創傷的莖尖分生組織，不經過愈傷組織的篩選過程，直接收穫種子，然後對獲得的後代進行篩選和鑑定。在這個轉化過程中，因為莖尖是一個高度分化的器官，其中只有部分細胞被轉化，因此，轉化體為轉化細胞與非轉化細胞共存的嵌合體，而且轉化細胞最終發育成為可遺傳器官的機率微乎其微。因此，單純的莖尖轉化法在轉化當代(Ttl代)檢測的陽性比率高達75 %，但是在T1代中的比率極少。發明內容
本發明的目的是 提供一種培育轉基因小麥的方法，包括通過農桿菌介導將目的DNA轉入小麥細胞的步驟，所述方法包括如下步驟:
I)將含有目的DNA表達載體的重組農桿菌接種於胚芽鞘長為1.0mm-1.2mm的露白小麥種子的莖尖分生組織中，培養所述露白小麥種子獲得處於雌雄蕊分化期的幼穗；
2)取步驟I)得到的處於雌雄蕊分化期的幼穗進行離體脫分化得到愈傷組織，保留含有所述目的DNA的愈傷組織，得到所述轉基因小麥。
在上述方法中，步驟I)中所述接種是在所述胚芽鞘長為1.0mm-1.2mm的露白小麥種子的莖尖分生組織中注入I U L所述含有目的DNA表達載體的重組農桿菌菌液。
在上述方法中，所述重組農桿菌菌液的0D_為0.6。
在上述方法中，所述重組農桿菌菌液中含有乙醯丁香酮0.4mmol/L0
在上述方法中，所述農桿菌可為根癌農桿菌，具體可為根癌農桿菌EHA105。
在上述方法中，步驟2)中所述離體脫分化按照包括如下步驟的方法進行:將所述處於雌雄蕊分化期的幼穗接種於脫分化培養基中培養，獲得愈傷組織。
在上述方法中，步驟2)中所述離體脫分化得到愈傷組織，保留含有所述目的DNA的愈傷組織後，還包括將所述含有所述目的DNA的愈傷組織接種於分化培養基中培養，獲得具有根莖葉的小麥植株的步驟。
在上述方法中，所述脫分化培養基和所述分化培養基的基礎培養基為MS培養基。
在上述方法中，所述脫分 化培養基中含2.5mg/L 2，4_D和/或150mg/L特美汀和/或篩選轉化體的抗生素，PH值為5.8 ;所述分化培養基中含2mg/L KT和/或篩選轉化體的抗生素，pH值為5.8。
在上述方法中，所述分化培養基中培養的光照條件為:連續光照，所述連續光照的光照強度為1500LUX。
本發明將幼穗拯救法與萌發種子轉化法相結合獲得轉基因小麥，轉化效率達到12%。本發明的方法既克服了一般莖尖轉化法形成嵌合體的問題，又解決了農桿菌直接侵染小麥幼胚、幼穗、成熟胚等所造成的組織褐化死亡問題，對小麥品種的遺傳改良和種質創新具有十分重要的意義。
圖1為農桿菌侵染所用的小麥露白種子。
圖2為共培養三天後種子的萌發生長情況。
圖3為轉化後Gus基因在Ttl代轉化植株中的嵌合表達。
圖4為轉化後Gus基因在Ttl代轉化植株根部的表達。
圖5為幼穗拯救適宜的小麥幼穗大小。
圖6為幼穗拯救過程中愈傷組織的切塊培養。
圖7為用於分化再生的胚性愈傷組織。
圖8為Ttl代轉基因植株的PCR檢測。其中，I為分子量標準DL2000，從上到下依次為 2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、IOObp ;2_16 為部分 Ttl 代轉基因植株；17 為質粒PCAMBIA2301 (陽性對照);18為非轉基因植株(陰性對照)。
圖9為Ttl代轉基因植株中Gus基因在根部的表達情況。其中，左側的2個為非轉基因陰性對照，右側的2個為Ttl代轉基因陽性植株。
圖10為Ttl代轉基因植株中Gus基因在葉子中的表達情況。左側的2個為Ttl代轉基因陽性植株，右側的2個為非轉基因陰性對照。
圖11為Ttl代轉基因植株中Gus基因在籽粒中的表達情況。左側的2個為Ttl代轉基因陽性植株，右側的I個為非轉基因陰性對照。
具體實施方式
下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
實驗所用的質粒pCAMBIA2301 (GenBank AF234316，其部分序列見序列表序列3)和根癌農桿菌EHA105 (Agrobacterium tumefaciens)均購自中國質粒載體菌株細胞株基因保藏中心。質粒DNA和轉基因小麥基因組DNA的提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司，培養基配製所需的無機鹽購自國藥集團，維生素、抗生素、激素以及Gus染色所需的藥品均購自Sigma-Aldrich中國公司。
用於進行基因轉化的小麥品係為K35(隋新霞，黃承彥，楚秀生，李根英，樊慶琦.易花葯培養的早熟小麥新種質K35.山東農業科學，2007年第一期，116-117頁)，公眾可從山東省農業科學院作物研究所和中國農業科學院作物科學研究所獲得。
YEP液體培養基:胰化蛋白腖10g/L，酵母提取物10g/L，NaCl 5g/L，用水定容，pH值為7.0。
YEP固體培養基:在上述 YEP液體培養基中添加瓊脂7g/L。
MS培養基的溶質見表1，溶劑為超純水，調節pH值為5.8，再按7%的質量百分比添加瓊脂後製成固體培養基。
表1.MS培養基的溶質及其濃度
權利要求
1.培育轉基因小麥的方法，包括通過農桿菌介導將目的DNA轉入小麥細胞的步驟，其特徵在於，所述方法包括如下步驟: 1)將含有目的DNA表達載體的重組農桿菌接種於胚芽鞘長為1.0mm-1.2mm的露白小麥種子的莖尖分生組織中，培養所述露白小麥種子獲得處於雌雄蕊分化期的幼穗； 2)取步驟I)得到的處於雌雄蕊分化期的幼穗進行離體脫分化得到愈傷組織，保留含有所述目的DNA的愈傷組織，得到所述轉基因小麥。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於:步驟I)中所述接種是在所述胚芽鞘長為1.0mm-1.2mm的露白小麥種子的莖尖分生組織中注入I y L所述含有目的DNA表達載體的重組農桿菌菌液。
3.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於:所述重組農桿菌菌液的OD_為0.6。
4.根據權利要求2或3所述的方法，其特徵在於:所述重組農桿菌菌液中含有乙醯丁香麗 0.4mmol/L0
5.根據權利要求1-4中任一所述的方法，其特徵在於:所述農桿菌為根癌農桿菌。
6.根據權利要求1-5中任一所述的方法，其特徵在於:步驟2)中所述離體脫分化按照包括如下步驟的方法進行:將所述處於雌雄蕊分化期的幼穗接種於脫分化培養基中培養，獲得愈傷組織。
7.根據權利要求1-6中任一所述的方法，其特徵在於:步驟2)中所述離體脫分化得到愈傷組織，保留含有所述目的DNA的愈傷組織後，還包括將所述含有所述目的DNA的愈傷組織接種於分化培養基中培養，獲得具有根莖葉的小麥植株的步驟。
8.根據權利要求6或7所述的方法，其特徵在於:所述脫分化培養基和所述分化培養基的基礎培養基為MS培養基。
9.根據權利要求7或8所述的方法，其特徵在於:所述分化培養基中培養的光照條件為:連續光照，所述 連續光照的光照強度為1500LUX。
全文摘要
本發明公開了一種利用幼穗拯救獲得轉基因小麥的方法。該方法通過農桿菌介導將目的DNA轉入小麥細胞，包括如下步驟1)將含有目的DNA表達載體的重組農桿菌接種於胚芽鞘長為1.0mm-1.2mm的露白小麥種子的莖尖分生組織中，培養所述露白小麥種子獲得處於雌雄蕊分化期的幼穗；2)取步驟1)得到的處於雌雄蕊分化期的幼穗進行離體脫分化得到愈傷組織，保留含有所述目的DNA的愈傷組織，得到所述轉基因小麥。本發明將幼穗拯救法與萌發種子轉化法相結合獲得轉基因小麥，轉化效率可達12％。本發明的方法既克服了一般莖尖轉化法形成嵌合體的問題，又解決了農桿菌直接侵染小麥幼胚、幼穗、成熟胚等所造成的組織褐化死亡問題，對小麥品種的遺傳改良和種質創新具有十分重要的意義。
文檔編號C12N15/82GK103205455SQ201210006728
公開日2013年7月17日 申請日期2012年1月11日 優先權日2012年1月11日
發明者李根英, 夏先春, 李玉蓮, 高潔, 宋國琦, 宋華東, 何中虎, 黃承彥, 樊慶琦, 隋新霞, 楚秀生 申請人:山東省農業科學院作物研究所, 中國農業科學院作物科學研究所