包括工程化內皮細胞的生物相容性植入物的製作方法

2023-12-03 10:23:36 2

相關申請的交叉引用

本申請要求2014年12月19日提交的美國臨時專利申請no.62/094,915的權益，其內容通過引用併入本文。

參考引用

僅出於允許通過引用併入的那些權限的目的，本文引用的每個文獻的文本通過引用整體併入本文。

背景技術：

生物相容性植入物已經用於各種應用中，包括例如修復或替代人體內損傷或缺陷的組織。一些此類植入物包括生物相容性支架材料，當將其外科植入宿主受試者的身體時，變得填入受試者的細胞並整合到受試者的組織中。為了確保足夠的氧氣和營養供應，這些植入物通常必須在外科植入後被投以內皮細胞，然後內皮細胞必須形成與受試者的現有血管系統連接的功能性血管。因此，內皮細胞浸潤這種植入的支架並形成功能性血管的程度和速度是這類植入物最終成功的重要決定因素。在體外-即在外科植入之前-產生含有預先形成的血管的三維生物相容性支架的能力可以顯著增加這類植入物在體內整合到宿主受試者的組織中的速度和效力。然而，生產這類植入物的先前嘗試成敗參半。例如，使用膠原凝膠或matrigel在體外誘導血管形成的若干先前嘗試未能導致血管萌芽或形成具有由極化內皮細胞包圍的明顯內腔(patentlumen)的血管。(關於一些這類的先前嘗試的討論，參見nakatsu等人(2003)「angiogenicsproutingandcapillarylumenformationmodeledbyhumanumbilicalveinendothelialcells(huvec)infibringels:theroleoffibroblastsandangiopoietin-1.」microvascularresearch,第66卷，第102–112頁。)其他嘗試涉及在塗布有細胞外基質組分的珠上培養內皮細胞單層，然後將珠嵌入纖維蛋白凝膠中。發現這種方法只有在皮膚成纖維細胞在凝膠頂部生長才能導致具有明顯內腔的血管形成。沒有此類成纖維細胞的共培養，發現內皮細胞最初形成短的、狹窄的索狀結構，其隨後在沒有血管形成的情況下崩解。見nakatsu等(2003年)。與這些發現一致，已報導成纖維細胞是內皮細胞內腔形成所必需的。參見newman等人(2011)「therequirementforfibroblastsinangiogenesis:fibroblast-derivedmatrixproteinsareessentialforendothelialcelllumenformation；」molecularbiologyofthecell,vol.22,pp.3791-3800。

技術實現要素：

本發明部分地基於如下驚人的發現：表達腺病毒e4orf1蛋白的工程化內皮細胞可以在體外在三維生物相容性支架內側形成具有明顯內腔的血管。儘管之前已經顯示e4orf1+內皮細胞可以在將這些細胞與液體matrigel共注射到小鼠的側腹中後在體內在matrigel塞中形成新血管，並且e4orf1+內皮細胞可以在matrigel包被的培養板上形成新血管生成管(參見美國專利8,465,732)，據申請人所知，這種細胞在體外在三維支架內形成具有開放內腔的真正血管的能力以前未被證實。如本文所述，現已出乎意料地發現，真正的e4orf1+血管可以在短短幾天的時間內在體外在三維生物相容性支架材料內形成具有開放內腔的血管-即使在不存在其它細胞類型如成纖維細胞的情況下-並且含有血管的植入物可以在體外培養和維持長達6周的一段時間。有趣的是，還發現這些植入物中的血管可以延伸超過生物相容性支架的邊界-產生似乎在圍繞支架材料的培養基中自由浮動的突出血管。基於這些發現，本發明提供適於外科植入受試者的特定的新的和改進的植入物，以及這種植入物的製造和使用方法。

因此，在一個實施方案中，本發明提供一種適於外科植入受試者的植入物，包括：(a)生物相容性支架材料和(b)設置在所述生物相容性支架材料內的血管，其中所述血管包括e4orf1+工程化內皮細胞。

在另一個實施方案中，本發明提供一種製備適於外科植入受試者的植入物的方法，所述方法包括：在體外培養與生物相容性支架材料接觸的工程化e4orf1+內皮細胞群，直到在生物相容性支架材料內形成血管，從而形成包括e4orf1+血管的植入物。

用於本發明的植入物和方法中的生物相容性支架材料通常是三維結構-使得血管可以設置在三維結構內。在一些這類實施方案中，本發明的植入物包括連接血管的網絡，其可以包括毛細血管。在一些此類實施例中，血管具有開放/明顯內腔。在一些這類實施方案中，一個或多個血管可以突出超過生物相容性支架材料的邊界。

在一些實施方案中，用於本發明的植入物和方法中的e4orf1+工程化內皮細胞還表達etv2多肽(即它們是e4orf1+etv2+內皮細胞)。在其它這類實施方案中，e4orf1+工程化內皮細胞還表達重組ets家族轉錄因子(即它們是e4orf1+ets+)。

在一些實施方案中，工程化e4orf1+內皮細胞可以是胎兒細胞，或出生後細胞或成體細胞。在一些實施方案中，用於本發明的植入物和方法的工程化e4orf1+內皮細胞是哺乳動物內皮細胞。在一些實施方案中，工程化e4orf1+內皮細胞是人內皮細胞。在一些實施方案中，工程化e4orf1+內皮細胞衍生自人臍靜脈內皮細胞(huvec)。

在一些實施方案中，用於本發明的植入物和方法的工程化e4orf1+內皮細胞是器官特異性內皮細胞。例如，在一些實施方案中，工程化內皮細胞可以是造血系統特異性內皮細胞、或神經系統特異性內皮細胞、或心臟特異性內皮細胞、或肺特異性內皮細胞、或肝特異性內皮細胞、或腎臟特異性內皮細胞、或肌肉特異性內皮細胞、或軟骨特異性內皮細胞、或肌腱特異性內皮細胞或脂肪組織特異性內皮細胞。在一些這類實施方案中，所使用的器官特異性內皮細胞衍生自要放置植入物的器官或組織。

在一些實施方案中，用於本發明的植入物和方法中的工程化e4orf1+內皮細胞衍生自將要外科植入植入物的受試者的內皮細胞-即它們是自體內皮細胞。在其它實施方案中，工程化e4orf1+內皮細胞衍生自與要外科植入植入物的受試者相同物種的供體的內皮細胞-即它們是同種異體內皮細胞。在一些這類實施方案中，同種異體供體是與要外科植入植入物的受試者組織匹配的(或部分匹配的)。例如，在一些實施方案中，供體具有與要外科植入植入物的受試者相同的mhc型(或hla型)。在一些其它實施方案中，供體具有與要外科植入植入物的受試者部分匹配的mhc型(或hla型)。還在其它實施方案中，供體具有不同於要外科植入植入物的受試者的mhc型(或hla型)。

在一些實施方案中，用於本發明的植入物和方法的生物相容性支架材料除了工程化內皮細胞之外還含有一種或多種另外的細胞類型。在一些這類實施方案中，另外的細胞類型可以經遺傳修飾。在其他這類實施方案中，另外的細胞類型可以是天然的(即不經遺傳修飾的)。在一些這類實施方案中，另外的細胞類型可以是胎兒細胞、出生後細胞或成體細胞。在一些實施方案中，此類另外的細胞類型可以是幹細胞或祖細胞。在其它實施方案中，這類其它細胞類型可以是分化的細胞。在一些實施方案中，這類幹細胞或祖細胞可以是造血幹細胞、骨幹細胞、肌肉乾細胞、神經幹細胞、上皮幹細胞、皮膚幹細胞、間充質幹細胞、腸幹細胞或精原幹細胞。在一些實施方案中，分化的細胞可以是分化的造血細胞、骨細胞、肌細胞、神經細胞、周細胞、毛囊細胞、脂肪細胞、角質細胞、上皮細胞、皮膚細胞、成纖維細胞、腸細胞或睪丸細胞。

在一些實施方案中，用於本發明的植入物和方法的生物相容性支架材料在植入物內在4℃下是固體。在一些實施方案中，生物相容性支架材料在21℃下是固體。在一些實施方案中，生物相容性支架材料包括一種或多種細胞外基質分子，例如膠原蛋白或纖維蛋白。在一些實施方案中，植入物內的生物相容性支架材料包括脫細胞動物組織，例如脫細胞豬組織。在一些實施方案中，植入物內的生物相容性支架材料不是matrigel。在一些實施方案中，植入物內的生物相容性支架材料不包括透明質酸。

在一些實施方案中，本發明的植入物不包括血清。在一些實施方案中，本發明的植入物不包括外源生長因子。在一些實施方案中，本發明的植入物不包括外源血管生成因子。在一些實施方案中，本發明的植入物不包括外源vegf。在一些實施方案中，本發明的植入物不包括外源fgf。

在一些實施方案中，本發明的植入物不包括成纖維細胞。在一些實施方案中，本發明的植入物不包括成纖維細胞衍生的血管生成因子。在一些實施方案中，本發明的植入物不包括成纖維細胞衍生的細胞外基質組分。

在一些實施方案中，本發明的植入物不包括微載體珠。在一些實施方案中，本發明的植入物不包括塗布有細胞外基質分子的微載體珠。

在一些實施方案中，本發明提供治療有需要的受試者的方法，所述方法包括將如本文所述的植入物植入受試者。在一些這類方法中，受試者具有組織缺損，並且將植入物在組織缺損部位外科植入受試者。在一些這類方法中，工程化e4orf1+內皮細胞是器官特異性內皮細胞，並且將植入物外科植入衍生所述器官特異性內皮細胞的器官中。在一些這類方法中，受試者是哺乳動物受試者。在一些這類方法中，受試者是人類受試者。在一些這類方法中，工程化e4orf1+內皮細胞衍生自受試者自己的內皮細胞-即它們是自體內皮細胞。在其他這類方法中，植入物中的工程化e4orf1+內皮細胞衍生自同種異體供體的內皮細胞，例如與受試者具有相同mhc-或hla-型的同種異體供體，或具有與受試者的mhc-或hla-型部分匹配的同種異體供體。

本發明的這些和其它實施方案在本文所附實施例、權利要求和附圖部分中進一步描述。此外，對於本領域技術人員顯而易見的是，本文描述的實施例的某些修改和組合落在本發明的範圍內，並且可以在沒有過度實驗的情況下進行。

附圖說明

圖1a和1b.已經用表達e4orf1和綠色螢光蛋白(gfp)的工程化內皮細胞接種並體外保持的植入物的螢光顯微鏡圖像-如實施例1所述。每個圖像底部的白色條代表400微米。來自內皮細胞中gfp表達的綠色螢光在黑白圖像中顯示為白色。具有開放內腔的血管結構可以在圖1a和圖1b中看到。在圖1b中，可以看到血管突出超過支架材料的邊界。

圖2a和2b.在外科植入後48小時從小鼠腹部取出後的兩個植入物的照片。圖2a中的「試驗」植入物在外科植入之前已經用e4orf1+工程化內皮細胞接種，並且保持在培養物中-如實施例1和2所述。在圖2a的圓圈區域中可以看到植入物內的血管形成和血液。圖2b中的「對照」植入物在外科植入前尚未接種內皮細胞，並且示出無可檢測的血管形成或血液流動。

圖3.外科植入後4周從小鼠腹部取出後的兩個植入物的照片。右側所示的「試驗」植入物在植入之前已經用e4orf1+工程化內皮細胞接種，並且保持在培養物中-如實施例中所述。在右側的「試驗」植入物中可以看到明顯的血管形成和血液內容物-在該黑白圖像中顯示為在植入物邊緣上的暗色/黑色區域。左側的「對照」植入物在植入前尚未接種內皮細胞。

圖4a-d.外科植入小鼠腹部並在植入後2周取出的植入物的組織切片的顯微照片。圖4a和圖4b中的「試驗」植入物已經用e4orf1+工程化內皮細胞接種，如實施例中所述。圖4c和圖4d中的「對照」植入物在植入前尚未接種內皮細胞。與圖4c和4d中的植入物相比，圖4a和4b中的「試驗」植入物顯示增加的細胞性。

具體實施方式

本專利公開內容的「發明內容」、「附圖」、「附圖說明」、「實施例」和「權利要求」部分描述了本發明的一些主要實施方案。本「具體實施方式」部分提供了與本發明的組合物和方法有關的特定附加描述，並且旨在結合本專利公開內容的所有其它部分來閱讀。此外，同樣對於本領域技術人員將顯而易見的是，貫穿本專利公開內容描述的不同實施方案可以並且旨在以各種不同的方式組合。本文描述的這類具體實施方案的組合旨在落入本發明的範圍內。

以下提供了某些定義。其他術語在本專利公開內容的其他部分中定義，具有從使用它們的上下文中是清楚的、或根據本領域常規含義使用的含義。

定義

如本文所使用的，當關於數值使用時，術語「約」和「近似」表示在所述值的+或-20％內。

本文所用的術語「培養」是指細胞在各種類型培養基上或培養基中的繁殖。「共培養」是指兩種或更多種不同類型的細胞在各種類型培養基上或培養基中的繁殖，例如，在一些實施方案中，可以共培養內皮細胞和幹細胞或祖細胞。

如本文所用，術語「有效量」是指如本文所述的指定的試劑或細胞群(例如e4orf1多肽、編碼e4orf1多肽的核酸分子或e4orf1+工程化內皮細胞群)的足以實現對於本文所述的一種或多種結果的可檢測效果的量。例如，在內皮細胞中表達e4orf1的情況下，待引入/遞送至內皮細胞的核酸分子(例如載體中的)的有效量可以是與任何合適的對照(例如e4orf1-內皮細胞)相比導致內皮細胞存活或增殖的可檢測增加的量。在將編碼e4orf1的核酸分子導入內皮細胞的情況下，核酸分子(例如載體中的)的有效量可以是與任何合適的對照(例如e4orf1-細胞)相比導致內皮細胞存活或增殖的可檢測增加的量。在涉及向受試者施用e4orf1+內皮細胞的方法的情況下，有效量可以是與任何合適的對照(例如e4orf1-內皮細胞)相比導致一種或多種期望的生物或治療指標的可檢測改善(例如，改善的內皮/血管再生，改善的血管發生，改善的植入物的存活或移植等)的量。任何個別情況下任何適當的「有效量」可以憑經驗來確定，例如使用本領域已知的標準技術，例如劑量遞增研究，並且可以考慮諸如計劃的用途、計劃的遞送/給藥方式，期望的遞送/給藥頻率等來確定。此外，「有效量」可以使用諸如本專利公開內容的實施例部分中所述的評估植入物中血管的形成和/或評估將植入物在體內整合到組織中的那些測定來確定。

當與本文中的細胞相關地使用時，術語「工程化」是指由人工程化以產生所述表型(例如e4orf1+或etv2+或表達重組ets轉錄因子)、或表達所述核酸分子或多肽的細胞。術語「工程化細胞」不旨在包括天然存在的細胞，而是旨在包括例如包括重組核酸分子的細胞、或者另外被人為改變的細胞(例如通過遺傳修飾-如下文定義)，例如使得它們表達它們不會另外表達的多肽，或者使得它們以比在非工程化內皮細胞中觀察到的程度基本上更高的水平表達多肽。

「遺傳修飾」或「基因-修飾的」或「經遺傳修飾的」是指細胞的正常核苷酸序列的任何添加、缺失或破壞。例如，在一些實施方案中，所描述的內皮細胞已經遺傳修飾，使得它們含有編碼腺病毒e4orf1多肽的核酸分子、和/或編碼本文所述的任何其它特定多肽的核酸分子(例如ets轉錄因子多肽，如etv2多肽)。類似地，在一些實施方案中，本文所述的內皮細胞或本文所述的任何其它細胞類型(例如幹細胞或祖細胞或神經細胞、肌細胞、周細胞、上皮細胞、脂肪細胞、成纖維細胞、角化細胞、單核細胞、嗜中性粒細胞、淋巴細胞、t細胞、b細胞或毛囊幹細胞)也可以根據需要包括一種或多種其它遺傳修飾。術語「遺傳修飾」包括基因遞送運載體的使用，包括但不限於轉導(體內或體外的病毒介導的核酸轉移給接受者)，轉染(分離的核酸由細胞攝取)，脂質體介導的轉移及本領域公知的其它方式。

當與本文中的細胞相關地使用時，術語「天然」或「野生型」是指未經遺傳修飾的細胞(如該術語在上文中定義的)或不是「工程化的」細胞(如該術語在上文中定義的)。例如，已經從受試者獲得並且未經人遺傳修飾的內皮細胞或其他細胞類型被認為是「天然的」或「野生型」細胞。

如本文所用，短語「分離的植入物」是指不在受試者體內而是離體/體外的植入物。例如，在培養基中的體外植入物被認為是「分離的植入物」。通常地，「分離的」植入物是在體外而不是在體內建立的，並且尚未在體內植入或孵育的。因此，通常地，分離的植入物是指在體外建立的植入物，其儘管適合於外科植入，但是尚未外科植入受試者。涉及「植入物」的本發明的所有實施方案通常涉及「分離的植入物」。

如本文所用，術語「重組」是指使用分子生物學和基因工程(例如分子克隆)的方法由人(包括由機器)產生的，並且包括不會另外天然存在的核苷酸序列的核酸分子。因此，將重組核酸分子與天然存在(例如在生物體的基因組中)的核酸分子相區分。包括mrna序列的互補dna或「cdna」拷貝的核酸分子，沒有如在相應的基因組dna序列中發現的任何介入的內含子序列，因此被認為是重組核酸分子。舉例來說，重組e4orf1核酸分子可以包括e4orf1編碼序列，其可操作地連接到啟動子和/或在天然存在的腺病毒基因組中該編碼序列通常不與其關聯的其它遺傳元件。類似地，重組etv2核酸分子可以包括etv2cdna序列(即，並非天然存在於生物體的基因組中的序列)，和/或可以包括etv2編碼序列，其可操作地連接到啟動子和/或在生物體的基因組中該編碼序列通常不與其關聯的其它遺傳元件。

術語「受試者」和「患者」在本文中可互換使用，並且除非另有說明，是指哺乳動物例如人和非人靈長類動物，以及兔、大鼠、小鼠、山羊、豬和其他哺乳動物物種。

如本文中的與細胞群相關地使用的短語「基本上純的」是指特定類型(例如通過一種或多種指定的細胞標誌物的表達、形態特徵或功能特徵來確定的)的細胞群，或兩種或更多種不同細胞類型一起使用的實施方案中的指定類型(複數)的細胞群，即，所述細胞佔總細胞群的至少約50％、優選至少約75-80％、更優選至少約85-90％、最優選至少約95％。因此，「基本上純的細胞群」是指含有少於約50％、優選少於約20-25％、更優選少於約10-15％、最優選少於約5％的不是指定的一種或多種類型的細胞。

核酸分子和多肽

腺病毒早期4(e4)區域含有至少6個開放閱讀框(e4orf)。以前已經顯示了整個e4區域調節血管生成並促進內皮細胞的存活(參見zhang等人(2004)，j.biol.chem.279(12):11760-66)。以前也已經顯示，在整個e4區域內，負責內皮細胞中的這些生物學作用的正是e4orf1序列。參見美國專利8,465,732。還參見seandel等人(2008)，「generationofafunctionalanddurablevascularnichebytheadenovirale4orf1gene,」pnas,105(49):19288-93。本文描述的本發明的幾個實施方案涉及為e4orf1+(即表達e4orf1多肽)的工程化內皮細胞。類似地，本文描述的本發明的幾個實施方案涉及為etv2+或ets+的工程化內皮細胞。這些細胞分別含有表達etv2多肽或ets家族轉錄因子多肽。所有這些多肽(e4orf1、etv2、ets)在本文統稱為「本發明的多肽」。

「本發明的多肽」由核酸分子編碼。因此，在一些實施方案中，本發明涉及編碼腺病毒e4orf1多肽的核酸分子、編碼ets轉錄因子多肽的核酸分子和/或編碼etv2轉錄因子多肽的核酸分子。此類核酸分子在本文統稱為「本發明的核酸分子」。

本發明的多肽和本發明的核酸分子可以具有本文指定的或本領域已知的胺基酸序列或核苷酸序列，或者可以具有為這些胺基酸或核苷酸序列的變體、衍生物、突變體或片段的胺基酸或核苷酸序列，條件是此類變體、衍生物、突變體或片段具有或編碼這樣的多肽：具有本文所述的一種或多種功能性質、或一種或多種本文所述用途所需的性質、或不阻止或阻遏本文所述的一種或多種性質或用途(其包括但不限於在體外促進內皮細胞存活的能力，以及內皮細胞在體外在植入物中形成血管的能力)。

在涉及ets轉錄因子多肽例如etv2多肽的實施方案中，多肽可以是任何哺乳動物ets轉錄因子多肽，例如人、非人靈長類動物、兔、大鼠、小鼠、山羊或豬多肽。在一些優選的實施方案中，多肽可以是人多肽。此類多肽的胺基酸序列和編碼此類多肽的核酸序列是本領域公知的，並且可以在眾所周知的公知資料庫如genbank資料庫中獲得。

在涉及腺病毒e4orf1多肽的那些實施方案中，所用多肽序列可以來自任何合適的腺病毒類型或腺病毒株，例如人腺病毒2型、3型、5型、7型、9型、11型、12型、14型、34型、35型、46型、50型或52型。在一些優選的實施方案中，所用多肽序列來自人腺病毒5型。此類腺病毒多肽的胺基酸序列和編碼此類多肽的核酸序列是本領域公知的並可獲自公知的公開資料庫，如genbank資料庫。例如，合適的序列包括以下：人腺病毒9(genbank登錄號cai05991)，人腺病毒7(genbank登錄號aar89977)，人腺病毒46(genbank登錄號aax70946)，人腺病毒52(genbank登錄號abk35065)，人腺病毒34(genbank登錄號aaw33508)，人腺病毒14(genbank登錄號aaw33146)，人腺病毒50(genbank登錄號aaw33554)，人腺病毒2(genbank登錄號ap.sub.--000196)，人腺病毒12(genbank登錄號ap.sub._000141)，人腺病毒35(genbank登錄號ap.sub.--000607)，人腺病毒7(genbank登錄號ap.sub.--000570)，人腺病毒1(genbank登錄號ap.sub.--000533)，人腺病毒11(genbank登錄號ap_000474)，人腺病毒3(genbank登錄號abb17792)，和人腺病毒5型(genbank登錄號d12587)。

在一些實施方案中，本發明的多肽和核酸分子具有與本文中具體描述的或本領域已知的那些相同的胺基酸或核苷酸序列(例如在公共序列資料庫如genbank資料庫中)。在一些實施方案中，本發明的多肽和核酸分子可以具有為此類序列的變體、衍生物、突變體或片段的胺基酸或核苷酸序列，例如與此類序列具有大於85％序列同一性的變體、衍生物、突變體或片段。在一些實施方案中，所述變體、衍生物、突變體或片段與已知序列具有約85％的同一性，或與已知序列具有約88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。在一些實施方案中，使用已知核苷酸序列這樣的變體、衍生物、突變體或片段，其相對於已知核苷酸序列長度變化約50個核苷酸、或約45個核苷酸、或約40個核苷酸、或約35個核苷酸、或約30個核苷酸、或約28個核苷酸、26個核苷酸、24個核苷酸、22個核苷酸、20個核苷酸、18個核苷酸、16個核苷酸、14個核苷酸、12個核苷酸、10個核苷酸、9個核苷酸、8個核苷酸、7個核苷酸、6個核苷酸、5個核苷酸、4個核苷酸核苷酸、2個核苷酸或1個核苷酸。在一些實施方案中，使用已知胺基酸序列這樣的變體、衍生物、突變體或片段，其相對於已知核苷酸序列長度變化約50個胺基酸、或約45個胺基酸、或約40個胺基酸、或約35個胺基酸、或約30個胺基酸、或約28個胺基酸、26個胺基酸、24個胺基酸、22個胺基酸、20個胺基酸、18個胺基酸、16個胺基酸、14個胺基酸、12個胺基酸、10個胺基酸、9個胺基酸、8個胺基酸、7個胺基酸、6個胺基酸、5個胺基酸、4個胺基酸、3個胺基酸、2個胺基酸或1個胺基酸。

在使用e4orf1核酸或胺基酸序列的那些實施方案中，在一些實施方案中，在沒有來自腺病毒e4區域的其他序列下-例如不在整個e4區域的核苷酸序列的背景下，或不與由e4區編碼的其他多肽一起-使用此類序列。然而，在一些其它實施方案中，此類序列可以與來自e4區域的一種或多種其它核酸或胺基酸序列例如e4orf2、e4orf3、e4orf4或e4orf5序列，或其變體、突變體或其片段結合使用。例如，雖然e4orf1序列可以用於含有其它序列、基因或編碼區(例如啟動子、標記基因、抗生素抗性基因等)的構建體(例如病毒載體)中，但是在某些實施方案中，e4orf1序列用於不含整個e4區域或不含來自整個e4區域的其它orf如e4orf2、e4orf3、e4orf4和/或e4orf5的構建體。

本發明的核酸分子可以用於含有各種其它核酸序列、基因或編碼區的構建體，這取決於期望的用途，例如抗生素抗性基因、報告基因或表達標籤(例如，諸如編碼gfp的核苷酸序列等)，或可能期望的任何其它核苷酸序列或基因。本發明的多肽可以單獨表達或作為融合蛋白的一部分表達。

在一些實施方案中，本發明的核酸分子可以在一個或多個啟動子的控制下以允許表達。可以使用能夠驅動核酸序列在期望細胞類型中表達的任何啟動子。合適的啟動子的實例包括但不限於cmv、sv40、rsv、hiv-ltr和mml啟動子。啟動子也可以是來自腺病毒基因組的啟動子或其變體。例如，在使用e4orf1的情況下，啟動子可以是用於驅動腺病毒中相應基因表達的啟動子。

在一些實施方案中，本發明的核酸分子可以置於誘導型啟動子的控制下，使得核酸序列的表達可以根據需要打開或關閉。可以使用任何合適的誘導型表達系統，例如四環素誘導型表達系統或激素誘導型表達系統。例如，本發明的核酸分子可以在需要時表達，然後當達到期望的結果時例如當內皮細胞已經有足夠的生長或增殖時關閉。打開或關閉表達的能力可以對體內應用特別有用。

本發明的核酸分子可以包括天然存在的核苷酸、合成核苷酸或其組合。例如，在一些實施方案中，本發明的核酸分子可以包括rna，例如在細胞內穩定並可用於直接在細胞內指導蛋白質表達/產生的合成修飾的rna。在其它實施方案中，本發明的核酸分子可以包括dna。在使用dna的實施方案中，dna序列可以可操作地連接到一個或多個合適的啟動子和/或調節元件以允許(和/或促進、增強或調節)細胞內的表達，並可存在於一個或多個合適的載體或構建體中。本發明的核酸分子可以在同一核酸構建體中引入內皮細胞，或者它們可以在單獨的核酸構建體中引入。

本發明的核酸分子可以使用本領域已知的任何合適的系統引入內皮細胞，所述系統包括但不限於轉染技術和病毒介導的轉導技術。可以根據本發明使用的轉染方法包括但不限於脂質體介導的轉染、聚凝胺(polybrene)介導的轉染、deae葡聚糖介導的轉染、電穿孔、磷酸鈣沉澱、顯微注射和微粒子轟擊。可以使用的病毒介導的轉導方法包括但不限於慢病毒介導的轉導、腺病毒介導的轉導、逆轉錄病毒介導的轉導、腺相關病毒介導的轉導和皰疹病毒介導的轉導。

本發明還提供載體，包括含有本發明的核酸分子的表達載體。例如，在一個實施方案中，本發明提供包括編碼ets轉錄因子多肽的核苷酸序列和編碼e4orf1多肽的核苷酸序列的表達載體。在一些這類實施方案中，ets轉錄因子是etv2。在一些這類實施方案中，表達載體是慢病毒載體。在一些實施方案中，編碼ets轉錄因子多肽的核苷酸序列和編碼e4orf1多肽的核苷酸序列處於單獨的啟動子的控制下。在一些實施方案中，編碼ets轉錄因子多肽的核苷酸序列和編碼e4orf1多肽的核苷酸序列處於相同啟動子的控制下，例如在ets和e4orf1序列之間具有內部核糖體進入位點序列(ires)。

在一些實施方案中，可以使用肽模擬物。肽模擬物是設計成模擬多肽的小蛋白質樣鏈。此類分子可以設計成模擬本發明的任何多肽(例如etv2或e4orf1多肽)。修飾肽以產生肽模擬物或以其他方式設計肽模擬物的各種不同方式是本領域已知的，並且可用於產生本發明多肽之一的肽模擬物。

本發明的多肽和核酸分子的處理、操作和表達可以使用分子生物學和細胞生物學的常規技術進行。此類技術是本領域公知的。例如，本領域技術人員可以參考sambrook、fritsch和maniatis編著的「molecularcloningalaboratorymanual，第2版，coldspringsharborlaboratorypress,1989)；系列methodsofenzymology(academicpress,inc.)或指導用於處理、操作和表達核苷酸和/或胺基酸序列的合適技術的任何其他標準文本的教導。與處理或表達e4orf1序列相關的其它方面記載於美國專利8,465,732中，其內容通過引用併入本文。

工程化內皮細胞

在一些實施方案中，本發明提供「工程化內皮細胞」。

在一些實施方案中，工程化內皮細胞是e4orf1+工程化內皮細胞。在一些實施方案中，工程化內皮細胞是e4orf1+etv2+工程化內皮細胞。在一些實施方案中，工程化內皮細胞是e4orf1+ets+工程化內皮細胞。

在其它實施方案中，工程化內皮細胞表達一種或多種標誌物。實際上，應當注意，在本文描述的涉及e4orf1+工程化內皮細胞的所有實施方案中，作為e4orf1+細胞的替代物，可以使用已經被這樣工程化的內皮細胞(例如通過用核酸分子轉染或轉導，或通過用任何其它試劑例如蛋白質或化學試劑處理)，其使得它們表達一種或多種以下標誌物，或者表達與非工程化內皮細胞相比(例如，與天然內皮細胞相比或與未經如此工程化但以其他方式類似處理的內皮細胞相比)升高水平的一種或多種以下標誌物，例如，一種或多種以下標誌物的水平高2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍或50倍。所述標誌物是：整合素α11，matrilin2，timp金屬肽酶抑制劑3，δ樣4，彈性蛋白，smoothelin樣2，syndecan1，酸性鈣調節蛋白(calponin)3，蛋白c(凝血因子va和viiia的滅活劑)，生長分化因子3，間隙連接蛋白α437kda，具有1型血小板反應蛋白基序18的adam金屬肽酶，白介素33，瘦蛋白受體，硫酸酯酶1，ephrin-a1，二肽基肽酶4，膠原，viii型，α1，趨化因子(c-c基序)配體2，軟骨酸性蛋白1，半胱氨醯白三烯受體2，成纖維細胞生長因子2(鹼性)，層粘連蛋白β3，cd82分子，胰島素受體，ephrin-b1，趨化因子(c-c基序)受體樣1，間隙連接蛋白，α4，37kda和腓骨蛋白(fibulin)2。上述標誌物及其相應的基因符號也在下表1中示出。

表1：在工程化e4orf1+內皮細胞中上調的標誌物。

*如通過rna-seq測定的，與第12代(p12)不表達e4orf1的huvec相比，在第12代(p12)表達e4orf1的huvec中的表達增加倍數。

在一些這類實施方案中，工程化內皮細胞表達或表達升高水平的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或所有29個上述標誌物。在一些這類實施方案中，工程化內皮細胞表達或表達升高水平的彈性蛋白。在一些這類實施方案中，工程化內皮細胞表達或表達升高水平的彈性蛋白、蛋白c、軟骨酸性蛋白1和腓骨蛋白2。在一些這類實施方案中，工程化內皮細胞表達或表達升高水平的彈性蛋白、蛋白c、軟骨酸性蛋白1、腓骨蛋白2、matrilin2、smoothelin樣2、生長分化因子3、白介素33、瘦蛋白受體和半胱氨醯白三烯受體2。

工程化內皮細胞可以衍生自本領域已知的任何合適的內皮細胞來源。在一些實施方案中，內皮細胞是原代內皮細胞。在一些實施方案中，工程化內皮細胞是哺乳動物細胞，例如人或非人靈長類動物細胞，或兔、大鼠、小鼠、山羊、豬或其它哺乳動物細胞。在一些實施方案中，內皮細胞是原代人內皮細胞。在一些實施方案中，內皮細胞是臍靜脈內皮細胞(uvec)，例如人臍靜脈內皮細胞(huvec)。在一些實施方案中，內皮細胞是天然的內皮細胞。在一些實施方案中，內皮細胞是遺傳修飾的內皮細胞。在一些實施方案中，工程化內皮細胞可以衍生自幹細胞或祖細胞。例如，在一些實施方案中，工程化內皮細胞可以衍生自多能幹細胞，例如誘導多能幹細胞(ips細胞)或胚胎幹細胞(es細胞)。在一些實施方案中，工程化內皮細胞可以衍生自內皮祖細胞。在一些實施方案中，工程化內皮細胞可以使用重編程方法從分化的非內皮細胞類型衍生，所述重編程方法例如直接重編程方法或者其中將分化的細胞重編程為較低分化的細胞類型(例如多能或專能細胞類型)、然後將較低分化的細胞隨後分化為內皮細胞的方法。在一些實施方案中，工程化內皮細胞是器官特異性內皮細胞。例如，在一些實施方案中，工程化內皮細胞可以是造血系統特異性內皮細胞、或神經系統特異性內皮細胞、或心臟特異性內皮細胞、或肺特異性內皮細胞、或肝特異性內皮細胞、或腎臟特異性內皮細胞、或肌肉特異性內皮細胞、或軟骨特異性內皮細胞或脂肪組織特異性內皮細胞。在一些這類實施方案中，所用器官特異性內皮細胞來源於要放置植入物的器官或組織。例如，在一些實施方案中，如果要將植入物植入肺組織中，或用於治療肺缺陷，則使用的內皮細胞可以是肺特異性內皮細胞。類似地，如果要將植入物植入肝組織，或用於治療肝臟缺陷，則使用的內皮細胞可以是肝特異性內皮細胞。可以使用的其它合適的內皮細胞包括先前描述的如美國專利號8,465,732中適於e4orf1表達的那些，其內容通過引用併入本文。

在一些實施方案中，將工程化內皮細胞進行遺傳修飾，使得除了本文所述的任何特定分子或標誌物(例如e4orf1)的表達以外，它們還包括一種或多種遺傳修飾。例如，此類細胞可以包括已知參與或疑似參與影響內皮細胞的疾病或病症的基因的校正版本，或者任何其它基因，例如可以期望在內皮細胞中提供或使用工程化內皮細胞施用或遞送的治療有用的基因。

本發明的工程化內皮細胞可以以各種形式存在或提供。例如，在一些實施方案中，工程化內皮細胞可以包括細胞群，例如分離的細胞群。在一些實施方案中，工程化內皮細胞可以包括體外細胞群-例如要添加到植入物中的細胞群或包括在植入物內的細胞群。在一些實施方案中，工程化內皮細胞可以包括基本上純的細胞群。類似地，在一些實施方案中，本發明的分離的植入物可以包括基本上純的內皮細胞群。例如，在一些實施方案中，構成總細胞群的至少約50％、優選至少約75-80％、更優選至少約85-90％、最優選至少約95％的細胞將是本發明的工程化內皮細胞。在一些實施方案中，工程化內皮細胞可以以含有工程化細胞和一種或多種另外的組分的組合物的形式提供。例如，在一些實施方案中，本發明可以提供包括如本文所述的工程化內皮細胞群連同載體溶液如生理鹽水溶液、細胞懸浮基、細胞培養基等的組合物。在一些實施方案中，此類組合物可以是治療性組合物-包括工程化內皮細胞群和適合施用於受試者如人受試者的載體溶液。如果需要，可以包括其它治療上可接受的試劑。本領域普通技術人員可以容易地根據預期用途選擇要包括在治療性組合物中的合適的試劑。

在一些實施方案中，本發明的工程化內皮細胞在使用(例如治療使用)之前經有絲分裂失活，使得它們不能複製。這可以通過例如使用化學試劑如絲裂黴素c或通過照射工程化內皮細胞來實現。

生物相容性支架

在某些實施方案中，根據本發明使用的生物相容性支架可以是或可以包括下述、基本上由下述組成、或由下述組成：生物相容性的、能夠被細胞浸潤並適用於外科植入活體受試者的任何材料(例如包括多孔結構)。這種支架的實例包括但不限於包括下述、基本上由下述組成、或由下述組成的那些支架：脫細胞化動物組織(例如脫細胞化豬組織，例如可從bard,inc.獲得的xenmatrix)，或一種或多種細胞外基質(「ecm」)組分，如膠原蛋白、層粘連蛋白和/或纖維蛋白。在一些實施方案中，生物相容性支架包括至少約5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％的膠原。在一些實施方案中，生物相容性支架包括至少約5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％的層粘連蛋白。在一些實施方案中，生物相容性支架包括至少約5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％的纖維蛋白。在一些實施方案中，生物相容性支架是在4℃下和/或室溫(約21℃)下或兩者下均為固體的生物相容性支架。在一些實施方案中，生物相容性支架不包括透明質酸。在一些實施方案中，生物相容性支架不包括超過約5％、4％、3％、2％、1％或0.5％的透明質酸。在一些實施方案中，生物相容性支架不包括matrigel。在一些實施方案中，生物相容性支架材料可以根據其要植入的組織位置來選擇，例如基於其生物力學性質或任何其它生物學特性。

植入物

本文描述的植入物包括生物相容性支架材料和工程化內皮細胞。在一些實施方案中，生物相容性支架具有三維結構，並且工程化內皮細胞在植入物內形成血管。

在一些實施方案中，植入物還可以包括除內皮細胞之外的其他細胞類型。在一些實施方案中，此類另外的細胞類型可以是幹細胞或祖細胞，例如胚胎幹(es)細胞，誘導型多能幹細胞(ipsc)，造血幹細胞，骨幹細胞，肌肉乾細胞，神經幹細胞，上皮幹細胞，皮膚幹細胞，間充質幹細胞，腸幹細胞，精原幹細胞等。在一些實施方案中，此類另外的細胞類型可以是分化的細胞如造血細胞，骨細胞，肌肉細胞，神經細胞，上皮細胞，皮膚細胞，成纖維細胞，腸細胞，睪丸細胞等。在一些實施方案中，此類其它細胞類型可以是經遺傳修飾的細胞。在一些實施方案中，此類另外的細胞類型可以是天然的(即非遺傳修飾的)細胞。可以與本發明的工程化內皮細胞一起提供或使用的細胞的其它實例在美國專利8,465,732中提供，其內容通過引用併入本文。

在一些實施方案中，取決於植入物的預期用途，植入物可以具有任何合適的尺寸和/或形狀。例如，如果植入物旨在用於替代或修復特定的組織缺損，則植入物可以配置成使得其具有適於插入該組織缺損的尺寸和形狀。

植入物的培養方法和製備方法

培養細胞的方法是本領域公知的，並且可以使用任何合適的細胞培養方法。例如，本發明的工程化內皮細胞或含有此類細胞的植入物可以使用已知用於培養其他內皮細胞的方法或已知用於培養e4orf1+內皮細胞的方法來培養，例如如美國專利8,465,732中所記載的，其內容通過引用併入本文。在一些實施方案中，本發明的工程化內皮細胞或含有此類細胞的植入物可在不存在血清或不存在外源生長因子的情況下，或在不存在血清和外源生長因子二者的情況下，或在不存在外源血管生成因子的情況下培養。

本發明的工程化內皮細胞也可以冷凍保存。用於細胞培養和細胞冷凍保存的各種方法是本領域技術人員已知的，例如在r.ianfreshney("freshney")的cultureofanimalcells:amanualofbasictechnique，第4版(2000)中記載的方法，其內容通過引用併入本文。

本發明的植入物可以通過本領域已知的任何合適的方法製備。例如，在一個實施方案中，本發明提供如本文所述的用於製備植入物的方法，包括在體外使生物相容性支架與工程化內皮細胞群接觸。在一些實施方案中，初始接觸步驟可以包括將生物相容性支架材料置於工程化內皮細胞培養物中或其上。在一些實施方案中，初始接觸步驟可以包括將工程化內皮細胞置於生物相容性支架材料上或其中。在初始接觸步驟期間，以及在其之後，工程化內皮細胞、生物相容性支架和所得的植入物可以在已知適合於內皮細胞培養的培養條件下(例如本文所述的那些)保持。生物相容性支架可以與工程化內皮細胞群一起孵育足夠的時間以使內皮細胞浸潤生物相容性支架，或者孵育足夠的時間以使內皮細胞如所預期地在生物相容性支架內形成血管。例如，在一些實施方案中，生物相容性支架可以在使用植入物例如植入受試者之前與工程化內皮細胞群孵育約1天(24小時)、2天(48小時)、3天、4天、5天、6天或7天(1周)，或約2周、3周、4周、5周或6周或更長時間。

受試者和治療方法

在一些實施方案中，可以植入本發明的植入物的受試者是可期望使用植入物來幫助治療組織缺損的任何動物物種的受試者。在一些實施方案中，受試者是哺乳動物，例如選自由靈長類動物(例如人和猴)、齧齒動物(例如小鼠、大鼠和兔)、羊物種(例如綿羊和山羊)、牛物種(如奶牛)、豬物種、馬科物種、貓科物種和犬科物種組成的組的哺乳動物。在一些實施方案中，受試者是人。

本發明的植入物可用於治療有需要的受試者的組織缺損。這樣的受試者可具有「組織缺損」。如本文所用，術語「組織缺損」旨在涵蓋組織破壞、組織損傷或組織功能障礙的各種類型的病況和類型，包括但不限於：由外傷性損傷、衰老、退行性疾病、遺傳性病症、傳染病、自身免疫性疾病或癌症引起的。本文提供的治療方法可以提供或旨在實現受試者中組織缺損的替代、重建、再生、修復或補充。例如，在一個實施方案中，本文所述的植入物可用於治療受試者的糖尿病(例如通過替代或補充缺陷型胰島素分泌組織)或治療神經病變。在另一個實施方案中，本文所述的植入物可用於治療神經病變，例如通過將植入物置於受損神經附近，例如具有損傷的、有缺陷的或不存在的髓鞘的神經，此類植入物可以在其中促進神經(包括其髓鞘)的修復。

本發明的植入物可以使用本領域已知的標準外科方法或技術經外科植入有需要的受試者。例如，根據需要，根據本發明的植入物可以在組織缺損部位或靠近組織缺損部位外科植入。

在一些實施方案中，本發明的植入物含有衍生自要植入植入物的同一受試者的工程化內皮細胞-即自體細胞。在其它實施方案中，本發明的植入物含有衍生自同種異體供體受試者的工程化內皮細胞。在一些這類實施方案中，同種異體供體與將要放置植入物的受試者具有組織匹配(例如hla匹配或mhc匹配)。在一些這類實施方案中，同種異體供體與將要放置植入物的受試者錯配或部分匹配(例如hla部分錯配或mhc部分錯配)。在工程化內皮細胞衍生自同種異體供體的實施方案中，可能需要用一種或多種免疫抑制劑治療受試者，以便降低「異源」內皮細胞排斥的風險。

試劑盒

本發明還提供用於製造本文所述的植入物並用於實施本文所述的各種方法的試劑盒。這樣的試劑盒可以包括本文所述的任何組分，包括但不限於核苷酸序列(例如編碼e4orf1)，工程化內皮細胞(例如e4orf1+內皮細胞)，天然內皮細胞，用於檢測工程化內皮細胞或其中表達的蛋白質或核酸分子的構件或組合物(例如核酸探針、抗體等)，用於培養工程化內皮細胞或用於維持或培養含有工程化內皮細胞、生物相容性支架材料的植入物的培養基或組合物，或其任意組合。所有此類試劑盒可以任選地包括使用說明書、容器、培養器皿等。標籤可隨附試劑盒，並且可以包括任何書寫或記錄材料，其可以是提供針對使用試劑盒內容物的指令或其他信息的電子的或計算機可讀的形式(例如盤，光碟，存儲晶片或磁帶)。

本發明的某些方面可以在以下非限制性實施例中進一步描述。

實施例

實施例1：含有工程化內皮細胞的植入物的體外培養

如實施例3所述培養表達腺病毒e4orf1蛋白和綠色螢光蛋白(gfp)的工程化e4orf1+人臍靜脈內皮細胞(huvec)。將工程化e4orf1+huvec在標準條件下在24孔板中鋪板並允許達到匯合。使用脫細胞化豬膠原基質(xenmatrixtmsurgicalgraft,barddavol,inc.warwick，ri)。膠原基質通過用剪刀或使用6mm真皮衝頭(dermalpunch)將基質材料切成小塊來製備。兩種替代方法用於接種含工程化huvec的膠原基質。在第一種方法中，將膠原基質直接置於在24孔板的表面上培養的工程化huvec的單層的頂部。在第二種方法中，將膠原基質置於24孔板的孔中，將從其培養器皿收穫的工程化huvec置於膠原基質的頂部。觀察到在兩種條件下的工程化huvec在24小時內生長到膠原基質中，並且在試驗的所有時間點(長達6周)內在膠原基質內保持存活。血管可以在用工程化內皮細胞接種的48小時內可視化，並且在試驗的所有時間點(長達6周)存在。工程化e4orf1+huvec形成具有開放內腔的血管結構，這在整個膠原基質中都能觀察到(參見圖1a)，並且其還從基質的邊界突出並進入周圍的培養基(參見圖1b)。

實施例2：體內植入含有工程化內皮細胞的膠原基質

如實施例1所述，用工程化huvec接種膠原基質。用工程化huvec接種後，將細胞在體外培養8天至6周，隨後植入小鼠(免疫受損的小鼠用於使對人內皮細胞的任何排斥反應最小化)。將小鼠麻醉並準備進行外科手術。在腹部皮膚上做了一個8mm切口。將鑷子插入腹肌和皮膚之間以產生將要由植入物佔據的空間。每隻動物接受一個「對照」植入物(包括已經在培養基中浸泡但尚未接種有內皮細胞的膠原基質材料)和一個「試驗」植入物(包括工程化huvec)。在植入後48小時至4周收穫植入物。當取出植入物時，發現試驗植入物比對照植入物更強烈地附著於周圍的小鼠組織。在48小時的時間點，試驗植入物已經部分吻合，如通過穿透移植物的血液的存在所證明的(圖2a)，而對照植入物沒有(圖2b)。在取出移植物期間，試驗基質也顯著地附著於周圍組織，而沒有內皮細胞的基質表現出不附著。圖3示出在植入後4周與對照相比，在試驗植入物中看到更高程度的血管形成。將植入物切片並進行組織學檢查。似乎試驗植入物比對照植入物表現出更大程度的細胞性。參見圖4。

實施例3：e4orf1+工程化內皮細胞和含有e4orf1+工程化內皮細胞的植入物的培養。

出於在膠原基質上培養內皮細胞的目的，從沒有已知疾病的自願供體獲得人臍靜脈內皮細胞(huvec)，並用腺病毒e4orf1轉導以產生e4orf1+huvec。使用本領域的方法標準將工程化huvec作為貼壁細胞生長。該標準包括在100％匯合時分裂細胞，在37℃培養，在組織培養處理的板、燒瓶或孔上擴增，並使用如下限定的培養基：補充有內皮細胞補充物(50μg/ml)、胎牛血清(fbs，終濃度：20％)、抗生素-抗真菌溶液、hepes緩衝液(10mm)、肝素(50μg/ml)和glutamax的培養基199。當細胞增殖時，培養基在繼代培養期間更換到較大的燒瓶中或如果培養基培養超過2天時更換。

當基質水合時，內皮細胞僅與基質接觸。當用膠原基質培養e4orf1+內皮細胞時，使用培養方法的幾種變體。在一種方法中，將固體膠原基質用鋒利的刀具(例如剃刀刀片，解剖刀或剪刀)切成25mm2的塊。在另一種方法中，將固體膠原基質用牙科衝頭(dentalpunch)切成圓形片。在另一種方法中，e4orf1+內皮細胞(ec)處於匯合單層中，以基質置於其頂部，並以充足培養基覆蓋基質。ec遷移到基質中。在一種培養方法中，將基質置於具有充足培養基的孔中以覆蓋基質。將e4orf1+ec加入到含有基質的孔的培養基懸浮液中。ec在基質上附著並生長，直到接觸介導的生長抑制。對於長期培養，每隔2-3天更換培養基，注意不要直接接觸基質，以防血管結構破裂。在每種方法中24小時內注意到e4orf1+ec侵襲膠原基質，越來越多的侵襲會持續數日，取決於接種的細胞數量和移植物的大小。沒有注意到過度生長(定義為e4orf1+ec以多層、球或團塊生長)-與細胞在匯合處生長停滯相一致。在48小時時注意到具有血管外觀的含有內腔的結構，並持續數周(圖1b)。

通過將這些基質外科植入到免疫受損的nodscidγ(nsg)小鼠(其不能對人e4orf1+ec產生免疫應答)中進行體內實驗。將麻醉的小鼠清潔、剃毛並穩定。在皮膚上做一個小的8mm切口。在閉合時插入平頭端的鑷子，然後在皮膚和肌肉之間插入後打開以產生空腔。以反方向重複此操作。然後將對照和試驗基質置於這些空腔中。