一種牡蠣活性肽的製備方法及用途
2023-12-05 18:05:21
一種牡蠣活性肽的製備方法及用途
【專利摘要】本發明提供一種牡蠣活性肽的製備方法，通過將新鮮牡蠣肉高速勻漿、離心、調pH至中性，得牡蠣粗蛋白；將牡蠣蛋白懸濁液離心，高速分散器均質，加入Papain，維持溶液pH值恆定，將反應物加熱滅酶，冷卻，得到牡蠣蛋白凍乾粉；再配成溶液攪拌、離心，上清液用生物傳感器測定高溫滅酶後的牡蠣酶解液中胺基酸的含量，通過SephadexG-25層析柱對牡蠣酶解液進行分離，洗脫，凍幹後凝膠柱脫鹽得到牡蠣活性肽。本發明得到的牡蠣酶解液中總胺基酸的含量高，有效保護了生物成分活性，可顯著拮抗雙酚A所致的卵巢顆粒細胞功能干擾效應，可在製備治療化學環境幹擾物雙酚A暴露所致的卵巢功能紊亂的藥物中應用。
【專利說明】一種牡蠣活性肽的製備方法及用途
【技術領域】
[0001]本發明屬海洋天然產物與醫藥【技術領域】，涉及一種牡蠣活性肽的製備方法，以及在製備治療化學環境幹擾物雙酚A暴露所致的卵巢功能紊亂的藥物中應用。
【背景技術】
[0002]海洋食品牡蠣具有巨大的食用價值和藥用價值，是世界上第一大養殖貝類，在我國浙江省等沿海地區都進行大規模養殖。浙江寧海一帶被譽為「牡蠣之鄉」，已有700年的牡蠣養殖史。牡蠣的營養價值極高，牡蠣中的蛋白質含量高達45%-57%，其胺基酸組成完善。根據世界糧農組織評定，牡蠣肉中必需胺基酸完全程度和質量比例優於人乳和牛乳。古人將牡蠣稱為「水產品之最貴者」，古羅馬人把它譽為「海中美味-聖魚」，西方人稱之為「神賜魔石」、「海中牛奶」，日本人則譽之為「根之源」。
[0003]牡蠣中豐富的生物活性肽、蛋白質、糖原、牛磺酸等生物活性成分為其在食品和醫藥領域的應用提供了巨大的支持。牡蠣是中國衛生部公布的第一批68種藥食同源的食品之一。早在我國漢代《傷寒論》、明代《本草綱目》等醫療史籍中就已有關於牡蠣藥用價值的記載。目前牡蠣產品的研發大多只關注牡蠣中牛磺酸的生理功能或牡蠣的全營養功能，而忽略其它成分的獨特作用。
【發明內容】
[0004]本發明的目的是提供一種牡蠣活性肽的製備方法，通過以下步驟實現:
1.新鮮牡蠣去殼、洗淨，得新鮮牡蠣肉。在新鮮牡蠣肉中加入預冷的雙蒸水，高速勻漿後放入4 °C冰箱內靜置I hr，以8000r/min，4 °C離心30min，取上清液，冷藏備用。取上清液以HCL (1:1)調溶液pH至4,8000r/min離心1min,取上清液，以5mol/L NaOH調pH至9,再離心分離，上清液以HCL調至中性即為牡蠣粗蛋白。
[0005]2.用蒸餾水準確配製5.0%的蛋白懸濁液，先將牡蠣蛋白懸濁液放置於4°C冰箱12小時，再用高速冷凍離心機4°C，7000-8000r/m，離心2次。收集上清液。採用高速分散器均質1min,放置於250 mL的恆溫酶反應器內預熱至木瓜蛋白酶(Papain)的最適反應溫度50°C。然後用0.5mol/L NaOH調節至Papain的最適pH值8.5,繼續攪拌20min,然後加入Papain啟動反應，反應過程中連續攪拌，滴加0.2 mo I/L NaOH維持溶液pH值恆定，反應結束後，將反應物立即在95 0C加熱10 min滅酶，然後迅速用流水冷卻，酶解物4 °C、離心，收集上清液冷凍乾燥，得到牡販Papain蛋白凍乾粉。
[0006]3.取牡蠣蛋白凍乾粉，用雙蒸水配成20 mg/mL的溶液，在磁力攪拌器上攪拌，用HCL或NaOH調pH值至8.5，待pH穩定後再連續攪拌浸提25 min，離心，上清液定容至50 mL。用生物傳感器測定高溫滅酶後的牡蠣酶解液中胺基酸的含量。通過Sephadex G_25層析柱對牡蠣酶解液進行分離，以超純水為洗脫液洗脫，收集各洗脫峰，凍幹後，凝膠柱脫鹽得到牡蠣活性肽(CGE)。
[0007] 本發明的另一個目的是提供所述方法獲得的牡蠣活性肽在製備治療化學環境幹擾物雙酚A暴露所致的卵巢功能紊亂的藥物中應用。
[0008]本發明的有益之處是:(1)得到的牡蠣酶解液中總胺基酸的含量高；(2)有效保護了生物成分活性。 申請人:首次發現CGE可顯著拮抗雙酚A (BPA)所致的卵巢顆粒細胞功能干擾效應；同時發現CGE的這種拮抗作用是通過提高卵泡刺激素受體(FSHR)蛋白在顆粒細胞上的表達水平而實現的。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0009]圖1是不同溫度下的酶解反應進程曲線。
[0010]圖2是血清中FSH，LH, E2的水平測定。
[0011]圖3是免疫組化法測定卵巢組織中FSHR的表達。
[0012]圖4是卵巢組織中FSHR的表達水平比較。
【具體實施方式】
[0013]本發明通過附圖和具體實施例作進一步的說明。
[0014]實施例1 一種牡蠣活性肽的製備方法
取新鮮牡販去殼、洗淨，得新鮮牡販肉:按料水比1:3 (mg: ml)比例加入預冷的雙蒸水，高速勻漿5min後放入4 °C冰箱內靜置I hr，以8000r/min，4 °C離心30min，取上清液，冷藏備用。取上清液以HCL (1:1)調溶液pH至4，8000r/min離心10min，取上清液，以5mol/L NaOH調pH至9，再離心分離，上清液以HCL調至中性即為牡蠣粗蛋白。用蒸餾水準確配製5.0%的蛋白懸濁液，先將牡蠣酶解液放置於4°C冰箱12小時，再用高速冷凍離心機4°C，7000-8000r/m，離心2次。收集上清液。採用高速分散器均質lOmin，放置於250 mL的恆溫酶反應器內預熱至木瓜蛋白酶(Papain)的最適反應溫度。然後用0.5mol/L NaOH調節至Papain的最適pH值8.5，繼續攪拌20min，然後加入酶啟動反應，反應過程中連續攪拌，滴加0.2 mol/L NaOH維持溶液pH值恆定，反應結束後，將反應物立即在95 V加熱10min滅酶，然後迅速用流水冷卻，酶解物8 °C,4000 rpm離心15 min，收集上清液冷凍乾燥，得到Papain蛋白酶解液。取牡販蛋白，配成20 mg/mL的溶液。在磁力攪拌器上攪拌,用
0.1-0.2mol/L HCL或NaOH調pH值至預定值。待pH穩定後再連續攪拌浸提25 min, 3000rpm離心10 min,上清液定容至50 mL。用生物傳感器測定高溫滅酶後的牡蠣酶解液中胺基酸的含量，與其他酶解方法總胺基酸含量約為45%相比較，本方法酶解液中總胺基酸含量較高，為55.1%。通過Sephadex G_25層析柱對牡蠣酶解液進行分離，以超純水為洗脫液洗脫，收集各洗脫峰，凍幹後，凝膠柱脫鹽得到牡蠣活性肽。活性篩選方法參見實施例3，實施例5。
[0015]實施例2反應溫度對牡蠣蛋粗白水解度的影響
控制反應體系PH8.5，加酶量40AU/kg，反應時間為2小時，反應溫度為40°C、50°C、60°C條件下進行酶水解。不同溫度下的牡蠣勻漿蛋白質酶解進程見圖1，圖1所示對不同溫度下的酶解反應進程進行研究，計算並比較水解度DH(% )。隨著溫度的升高，耗鹼量增加，說明酶解程度加大，綜合考慮經濟、能耗、溫度過高可能導致酶失活等原因，所以選擇反應溫度為 50。。。
[0016]實施例3本實施例中所用到的牡蠣活性肽(CGE)為實施例1中製備的的CGE。
[0017]選取4周齡Sprague Dawley (SD)雌性大鼠，正常飼養12天,通過陰道塗片觀察到2個連續4-5天的性周期者入選為實驗動物。隨機分為正常對照組(Control)、模型對照組(BPA)，牡蠣活性肽+雙酚A處理組(CGE+BPA)，每組6隻。在普通飼料餵養基礎上，Control組每天餵飼玉米油；BPA組每天餵飼含BPA (按50mg/kg餵飼；BPA為99%純度)的玉米油；CGE+BPA組每天餵飼含BPA (按50mg/kg餵飼；雙酚A為99%純度)的玉米油再加上牡蠣活性肽同時餵飼。各組大鼠每天餵飼I次，處理期間每天稱重，根據體重調整劑量。連續餵飼6周。從治療開始後的第6天起，各組大鼠同時陰道脫落塗片，觀察有無排卵。6周處理結束後，肝門靜脈取血，同時迅速剝離子宮、卵巢。測定各組大鼠血清卵泡刺激素(FSH)，促黃體生成素(LH)，雌二醇(E2)的水平。參見圖2，血清中E2，FSH，LH的測定結果表明，對照組的血清E2水平明顯高於其他組，血清FSH水平明顯低於BPA組和BPA+ CGE組(P〈0.05)。對照組的血清LH水平顯著高於BPA組(P〈0.05)，然而，BPA+ CGE組和BPA組之間沒有顯著差異(P >0.05)。與BPA組比較，BPA+ CGE組血清中的E2水平顯著升高，FSH的血清水平顯著降低(P〈0.05)，表明用上述方法製備的CGE在減輕雌性大鼠雙酚A暴露導致的卵巢功能紊亂有積極影響，該製備方法有效保護了生物活性成分。
[0018]實施例4 一種牡蠣活性肽的製備方法
新鮮牡販去殼、洗淨，得新鮮牡販肉:按料水比l:2(mg: ml)比例加入預冷的雙蒸水，高速勻漿1min後放入4 °C冰箱內靜置I hr，以8000r/min，4 °C離心30min，取上清液，冷藏備用。取上清液以HCL (1:1)調溶液pH至4，8000r/min離心10min，取上清液，以5mol/L NaOH調pH至9，再離心分離，上清液以HCL調至中性即為牡蠣粗蛋白。用蒸餾水準確配製5.0%的蛋白懸濁液，先將牡蠣酶解液放置於4°C冰箱12小時，再用高速冷凍離心機4°C，7000-8000r/m，離心2次。收集上清液。採用高速分散器均質lOmin，放置於250 mL的恆溫酶反應器內預熱至木瓜蛋白酶(Papain)的最適反應溫度。然後用0.5mol/L NaOH調節至Papain的最適pH值，繼續攪拌20min，然後加入酶啟動反應，反應過程中連續攪拌，滴加0.2mol/L NaOH維持溶液pH值恆定，反應結束後，將反應物立即在95 V加熱10 min滅酶，然後迅速用流水冷卻，酶解物8 0C >6000 rpm離心10 min，收集上清液冷凍乾燥，得到Papain蛋白酶解液。取牡蠣蛋白，配成20 mg/mL的溶液。在磁力攪拌器上攪拌，用0.2mol/L HCL或NaOH調pH值至預定值。待pH穩定後再連續攪拌浸提25 min, 2500 rpm離心15 min,上清液定容至50 mL。用生物傳感器測定高溫滅酶後的牡蠣酶解液中胺基酸的含量，與其他酶解方法總胺基酸含量約為45%相比較，本方法酶解液中總胺基酸含量較高，為53.8%。通過Sephadex G_25層析柱對牡蠣酶解液進行分離，以超純水為洗脫液洗脫，收集有活性的各峰，凍幹後，凝膠柱脫鹽得到牡蠣活性肽。
[0019]實施例5
本實施例中所用到的牡蠣活性肽(CGE)為實施例3中製備的的CGE。
[0020]選取4周齡Sprague Dawley (SD)雌性大鼠，正常飼養12天,通過陰道塗片觀察到2個連續4-5天的性周期者入選為實驗動物。隨機分為正常對照組(Control)、模型對照組(雙酚A, BPA)，牡蠣活性肽+BPA處理組(CGE+BPA)，每組6隻。在普通飼料餵養基礎上，Control組每天餵飼玉米油；BPA組每天餵飼含雙酹A (按50mg/kg餵飼；雙酹A為99%純度)的玉米油；CGE+BPA組每天餵飼含雙酚A (按50mg/kg餵飼；雙酚A為99%純度)的玉米油再加 上牡蠣活性肽同時餵飼。各組大鼠每天餵飼I次，處理期間每天稱重，根據體重調整劑量。連續餵飼6周。從治療開始後的第6天起，各組大鼠同時陰道脫落塗片，觀察有無排卵。6周處理結束後，肝門靜脈取血，同時迅速剝離子宮、卵巢。如圖2所示，用免疫組化法檢測FSH及其受體在卵巢組織中的情況。牡蠣活性肽可有效地緩解雌性大鼠暴露於雙酚A所導致的卵巢功能障礙，該製備方法有效保護了生物活性成分。
【權利要求】
1.一種牡蠣活性肽的製備方法，其特徵在於，通過以下步驟實現: (1)在新鮮牡蠣肉中加入預冷的雙蒸水，高速勻漿後放入4°C冰箱內靜置，4°C離心，取上清液，冷藏，取上清液以HCL調溶液pH至4，8000r/min離心，取上清液，用NaOH調pH至9，再離心分離，上清液以HCL調至中性即為牡蠣粗蛋白； (2)用蒸餾水準確配製5.0%的蛋白懸濁液，先將牡蠣蛋白懸濁液置於4°C冰箱12小時，再用高速冷凍離心機離心，收集上清液，用高速分散器均質，置於恆溫酶反應器內預熱至溫度50°C，然後用NaOH調節至pH值8.5，繼續攪拌，然後加入木瓜蛋白酶啟動反應，反應過程中連續攪拌，滴加NaOH維持溶液pH值恆定，反應結束後，將反應物立即在95 V加熱10min滅酶，然後迅速用流水冷卻，酶解物4 °C、離心，收集上清液冷凍乾燥，得到牡蠣蛋白凍乾粉； (3)取牡蠣蛋白凍乾粉，用雙蒸水配成20mg/mL的溶液，攪拌，用HCL或NaOH調pH值至8.5，待pH穩定後再連續攪拌浸提，離心，上清液用生物傳感器測定高溫滅酶後的牡蠣酶解液中胺基酸的含量，通過Sephadex G_25層析柱對牡蠣酶解液進行分離，以超純水為洗脫液洗脫，收集各洗脫峰，凍幹後，凝膠柱脫鹽得到牡蠣活性肽。
2.根據權利要求1所述方法獲得的牡蠣活性肽在製備治療化學環境幹擾物雙酚A暴露所致的卵巢 功能紊亂的藥物中應用。
【文檔編號】A61K38/01GK104031964SQ201410180185
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2014年5月1日 優先權日:2014年5月1日
【發明者】周珏, 曲凡, 葉婧, 曲道峰 申請人:浙江工商大學