用於動物細胞的表達載體的製作方法

2023-12-05 22:23:16 1

專利名稱：用於動物細胞的表達載體的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種用於動物細胞的表達載體，特別是，含有核基質著絲溢痕成分(在其後稱作「MAR成分」)和胃泌素基因的轉錄終止位點的表達載體。
然而，微生物表達體系的應用在某些方面是有限的。首先，儘管基因在微生物中被表達，但被表達的蛋白的結構和特性與其動物蛋白的並不同，因為微生物具有不同的表達蛋白的機制和蛋白的修飾機制，如糖基化，磷酸化和胺基化。因此，由微生物產生的重組蛋白幾乎沒有被修飾，或者它在蛋白質的修飾和結構的差別不足以影響蛋白產物的功能的蛋白質的產生中受限制。另外，使用微生物表達的重組蛋白時，被汙染的微生物或毒素的清洗步驟是必要的。
雖然動物細胞適用於動物蛋白的表達，但一般不使用採用動物細胞的表達體系，因為與微生物和動物細胞的表達體系相比，歸因於重組蛋白的更低表達效率，採用動物細胞的表達體系會造成更高的生產成本。
用於工業生產的動物細胞，它目前被用於包括CHO(中國鼠的卵巢)、BHK(幼鼠的腎)和骨髓瘤的表達體系，表達載體被導入到這種動物細胞並像在微生物中一樣產生希望的外源蛋白。
由於通常表達少量的外源蛋白，因此，通過各種方法修飾基因表達體系。例如，CHO的細胞毒株在含有氨甲蝶呤(其後稱作「MTX」)的培養基中培養，氨甲蝶呤是DHFR(二氫葉酸還原酶)的抑制劑，以便獲得存活依賴於MTX濃度的CHO的毒株，並且歸因於基因複製數的增加更高地表達蛋白。
通常，當外源基因在一種動物細胞中被表達時，外源基因被具有選擇性標記物的載體共轉染，在選擇性培養基培養數小時後選擇轉化的細胞。然而，能夠完成的高表達細胞的克隆的頻率是低的。外源基因表達的低頻率是由於在動物體系中外源基因的染色體的插入不像微生物那樣。另外，儘管外源基因的插入過程是成功的，但不能期待外源基因的表達，原因是每個基因的插入位點不同而且基因表達要依靠插入位點。(Grindley等，1987.Trends Genet.3，16-22；Kucherlapati等，1984.Crit.Rev.Biochem.16，349-381；Palmiter等，1986.Annu.Rev.Genet.20，465499)。所以，儘管外源基因是穩定地完整的，其表達量也可能很低，因為在動物細胞中大部分的基因表達被鄰近的核苷酸抑制(Eissenberg等，1991.Trends Genet.7，335-340；Palmiter等，1986.AnnuRev.Genet.20，465-499)。
為了保護外源基因的表達不受位置效應，在幾個體系中應用核基質成分的可能性已有報導。可效仿的核成分包括絕緣體成分，核基質著絲溢痕(其後稱作「MAR」)，支架結構著絲溢痕(其後稱作「SAR」)。
Kalos(Kalos等，1995 Mol.Cell.Biol.15，198-207)提出當阿樸脂蛋白BMAR組合最小的啟動子反基因構建子時，外源基因被穩定的導入到宿主的染色體，這樣轉錄物的表達量增加了200倍。和上述方法類似，已經報導小雞溶解酶A MAR和β-幹擾素SAR能夠增加外源基因在脊椎動物細胞中的表達水平，而不用考慮染色體的插入位點(Eissenberg等，1991.Trends Genet.7，335-340；Klehr等，1991.Biochemistry30，1264-1270)。然而，並沒有核實MAR和SAR能夠增加在CHO細胞毒株中蛋白的產生，或者MAR和SAR適用於常規用途。
當動物細胞基因被表達，mRNA的合成從啟動子出現並在終止位點停止。蛋白的表達水平通常受轉錄終止的效率以及合成mRNA的穩定性的影響。
包含在表達載體中的轉錄的終止位點控制聚腺苷酸化，並影響mRNA的穩定性。終止位點包括聚-A信號，分裂位點，終止位點，並且聚腺苷酸化信號是AATAAA，它已經被很好地研究。然而，發生聚腺苷酸化的分裂位點和基因轉錄通過RNA聚合酶II完成的終止位點是未知的。另外，儘管報導了除了三種臨界區域外富含GU/U的區域控制mRNA的聚腺苷酸化，但其詳細機理是未知的。
通常用於動物細胞的表達載體包含SV40病毒和BGH(牛生長素)的聚-A信號，並且沒有提出為了使用動物細胞表達載體而研發這種提高mRNA穩定性和表達水平的特別終止子。
為了達到這些目的，本發明提供一種包括MAR(核基質著絲溢痕)成分或其啟動子在5』-末端的互補序列的表達載體。
同樣，本發明提供了一種包括SV40病毒的聚-A(聚腺苷酸化)信號和胃泌素基因轉錄終止位點組成的構建子的動物細胞的表達載體，其中的構建子具有序列SEQ ID No.3。
同樣，本發明提供了一種如序列SEQ ID No.8所示的載體pMSGKCCM10202，它包括人β-珠蛋白5』MAR(核基質著絲溢痕)的互補序列，其構建子由SV40病毒的聚-A信號和胃泌素基因的轉錄終止位點組成。
同樣，本發明提供了一種通過使用動物細胞的表達載體製備生物活性物質的方法，載體包括β-珠蛋白MAR成分，或者β-珠蛋白在啟動子5』-末端的互補序列，包括如序列SEQ ID No.3所示的SV40病毒的聚-A(聚腺苷酸化)信號和胃泌素基因的轉錄終止位點的載體，和pMSG載體。
圖7顯示在以pMS-β-gal或作為對照的pSV-β-gal轉化的動物細胞中，表示β-Gal基因的複製數和β-Gal表達產量之間關係的曲線；圖8顯示在各種細胞系中pMS-β-gal載體的表達效價；圖9顯示在以pMS-β-gal載體或對照載體轉化的細胞中依靠MTX濃度的外源蛋白的表達量；

圖10顯示與對照組相比，scu-PA(單鏈尿激酶)被插入到pMS載體和pMC載體之後，scU-PA的表達效價；圖11顯示包括胃泌素基因的轉錄終止位點和SV40的聚-A信號的構建子；圖12顯示在包括含胃泌素基因轉錄終止位點和SV40聚-A信號的構建子的表達載體中β-Gal的表達量；
圖13顯示本發明的pMSG的結構；圖14顯示通過抗原-抗體反應證實的pMSG載體中TGF-βSRII的表達；圖15顯示TGF-βSRII表達量，它通過將TGF-βSRII基因克隆到pMSG載體，在CHO細胞中轉染它們，在加入MTX的條件下培養而製備。
發明人克服了當外源基因在動物細胞系中表達時特異位點效應引起的問題，並設計增加了基因的表達量的最佳表達載體。
本發明的動物細胞表達載體包括合適的鹼基序列，並進一步加入了常規的表達載體。合適的鹼基序列包括核基質著絲溢痕(下文稱作「MAR」)和支架結構著絲溢痕(下文稱作「SAR」)，它們從插入位點的位置效應刺激如CHO(中國鼠卵巢)和BHK(幼鼠腎)的宿主外源基因的表達，增加了外源基因的表達量。
MAR或SAR成分加入到啟動子5』-末端，分析本發明的表達載體的效率。從細胞分離染色體DNA，接著通過PCR(聚合酶鏈式反應)和亞克隆在大腸桿菌E.coli中克隆染色體DNA，這樣以致於獲得含MAR和SAR成分的DNA。
更優選的，MAR或SAR成分從由小雞溶解酶5』MAR(Phi-Van，L.andStratling，W.H.，Biochemistry35，10735-10742(1996)，gene bank#X98408)，小雞pia珠蛋白5』MAR(Krevskii，V.A.，Mikhailov，V.S.andRazin，S.V.，Mol.Biol.26，672-678(1992)，gene bank#X64113)，人β-珠蛋白5』MAR(Yu，J.，Bock，J.H.，Slightom，J.L.and Villeponteau，B.，Gene139(2)，139-145(1994)，gene bank#L22754)，CHO DHFR內含子MAR((Kas，E.andChasin，L.A.，J.Mol.Biol.198(4)，677-692(1987)，gene bank#X06654)，人HPRT內含子MAR(Sykes，R.C.，Lin，D.，Hwang，S.J.，Framson，P.E. and Chinaμlt，A.C.，Mol.Gen.Genet.212.301-309(1988)，genebank#X07690)，人CSP-B基因旁側的SAR(Handson，R.D.and Ley，T.J.，gene bank#M62716)，和人幹擾素β-基因旁側的SAR(Mielke，C.，Kohwi，Y.，Kohwi Shigematsu，T.and Gode，J.，Biochemistry 29，7475-7485(1990)，genen bank#M83137)組成的組中選擇。
在動物細胞表達載體中整合MAR和SAR，為了確定MAR/SAR和表達效價之間的關係，誘導載體的β-Gal表達。
pSV-β-gal啟動子的5』-末端通過體外PCR誘變與多克隆位點(下文稱作「MCS」)結合，這樣獲得了重組載體(I和II型載體)，如圖1所示。插入MAR或SAR至重組載體pSV-β-galI或II型的SV40啟動子的5』-末端的前面，準備好試驗載體，試驗載體被轉化到CHO DG44中。在包含G418(新黴素)的培養基上選擇轉化的CHO DG44，通過著色β-Gal(用IPTG和X-Gal的藍著色)計算表達效價。為測量表達效價，計算表達頻率、表達細胞數量、和β-Gal表達的數量。
圖2顯示本發明使用的種種MAR和SAR成分誘導的β-Gal的表達頻率。pSV-β-gal載體的β-Gal表達頻率為大約20到30％，而包括β-珠蛋白MAR，和CSP-B SAR或幹擾素βSAR的試驗載體增加了在陽性細胞系中的表達頻率，更優選，包括β-珠蛋白MAR的試驗載體的β-Gal表達頻率為大約70到80％。
另外，依照各種MAR成分和SV40啟動子組合製備構建子，並且SV40病毒啟動子與重組蛋白表達的影響進行比較。為了比較β-Gal產物的產量，實施β-Gal著色法和β-Gal酶計算法，並且在相同數目的陽性細胞系中分析β-Gal活性，原因是表達頻率依每個MAR成份而不同；圖3顯示使用β-珠蛋白MAR，CSP-B SAR和幹擾素β-SAR成分時，與pSV-β-gal的相比，根據各種MAR和SAR成分、每陽性細胞的β-Gal的量或者β-Gal增加的活性，表達的的β-Gal的活性。據觀察含β-珠蛋白MAR成分的載體表達量增加了7倍或更多。
從而，在MAR成分中，β-珠蛋白MAR成分在本發明中是更優選的。
為了研究β-珠蛋白MAR成分的影響和效率，分析MAR成分的DNA序列。
β-珠蛋白成分包括2,999個鹼基，它們的功能未被詳細了解。β-珠蛋白MAR成分包括共有序列和位於800bp區域的3』端的alu成分244個鹼基對，並且這裡存在富含A+T(腺嘌呤，胸腺嘧啶)的序列。據報導alu位點包括兩條直接重複單體單元的300個鹼基對，其重組經常發生在這個位點，原因是在真核細胞的染色體中存在成千上萬的同源位點。(Jagadeeswaran等，1982.Nature 296，469-470；Rogers.1985.Int.Rev.Cytol.93，187-279)。當β-珠蛋白MAR的alu位於SV40啟動子的上遊時，細胞進行較長時間的培養，重組可以發生。
因此，發明人設計了沒有上述不好的效應的β-珠蛋白MAR突變株。
圖4顯示了β-珠蛋白MAR突變株，它通過製備MAR的互補序列b，缺失突變體c，d，e，f，g和i，以及將它們整合到pSV-β-GalI型中而生產。
包括β-珠蛋白MAR的突變株的載體被導入到CHO細胞之後，計算β-Gal表達的細胞數和β-Gal的數量，結果如圖5所示。大多數的β-珠蛋白MAR突變株的β-Gal表達效價降低；相反，以包括β-珠蛋白MAR互補序列的pMS-β-gal載體轉化的細胞系的效價高。圖6和7顯示重組蛋白表達量和整合基因的複製數之間的關係，pSV-β-Gal的表達量獨立於整合基因的複製數，含pMS-β-Gal的轉化載體的表達量和整合基因的複製數是成比例的。由於β-珠蛋白MAR的互補序列允許alu存在於啟動子的另一側，載體重組的可能性減少，通過防止插入位點的特異性作用使得表達量增加。因此，β-珠蛋白MAR互補序列在本發明是優選的。
經核實MAR或SAR成分位於載體的啟動子的常規表達的5』端，並且MAR或SAR突變株，或互補序列被整合到常規的表達載體中，這樣外源蛋白的表達效價增加。因此，本發明提供一種包括MAR或SAR成分的表達載體，和包括MAR或SAR突變株的表達載體，或者它們的互補序列。MAR或SAR是從由pi-a MAR(小雞piα-珠蛋白5』MAR)，β-珠蛋白MAR(人β-珠蛋白5』MAR)，DHFR MAR(CHO DHFR內含子MAR)，HPRT MAR(人HPRT內含子MAR)， CSP-B SAR(人CSP-B基因旁側的SAR成分)，幹擾素-β SAR成分(人幹擾素-β基因旁側的SAR成分)，和溶MAR(小雞溶菌酶5』MAR)組成的組中優選。
在它們中間，本發明的載體pMS(KCCM10203)由包含在SV40病毒啟動子的5』末端的人β-珠蛋白MAR互補序列和多克隆位點的6287個鹼基對組成，並且能夠通過基因整合到多克隆位點表達重組蛋白。pMS鹼基序列被編譯為序列表軟體中的序列SEQ ID No.l。
使用β-珠蛋白MAR互補序列時，與僅使用SV40啟動子時外源基因的表達頻率和表達量相比，外源基因的表達頻率和表達量分別增加3到4倍，和7到10倍。此外，pMS-β-gal載體適於圖8顯示的各種各樣的動物細胞，並且pMS-β-gal載體系統優選適用於BHK，CHO，NIH3T3，和HEK293。圖9表示當外源基因在pMS-β-gal載體系統表達時藉助於加入MTX(新黴素)的表達效價增量。
為依照MAR或SAR來計算外源蛋白的表達效價，使用CMV啟動子(巨細胞病毒)。由於依靠於啟動子的種類和細胞株的不同，外源基因的表達效價也不同，因此CMV啟動子也在被測試。為了驗證β-珠蛋白MAR互補序列對CMV啟動子功能的影響，通過與製備pMS相類似的方法製備pMC載體，並將scu-PA基因整合到pMS，pMC，和對照載體中。
圖10顯示的為scu-PA在由pMSPUK，pMCPUK，pSPUK，和pMCPUK載體轉化的CHO中的表達效價，它通過將scu-PA整合到pMS，pMC，pSV，和pCMV中來製備，pMS和pMC的基因表達比pSV和pCMV的增加了4倍。因此，本發明所述的β-珠蛋白MAR互補序列可以通過與所期望的啟動子適當的結合用於動物細胞的蛋白表達。
由於本發明包括β-珠蛋白MAR互補序列的載體和外源基因被整合成為宿主細胞，以常規的方法可從動物細胞中獲得有用的蛋白。
在本發明中，製備人胃泌素基因的轉錄聚-A信號、分裂位點和人胃泌素終止位點，它們被應用於本發明的表達載體中以便增加mRNA的穩定性，從而增加了表達載體的效率。
人胃泌素基因，3』端的轉錄調節區域包括包含信號聚-A、分裂位點、終止位點和人胃泌素基因的鹼基序列的605個鹼基對，3』端的轉錄調節區域如序列SEQ ID No.2所示。分裂位點位於從信號聚-A開始下遊的第15個鹼基對，終止位點位於從信號聚-A開始下遊的第220個鹼基對。胃泌素在終止位點完成轉錄，在分裂位點發生分裂和mRNA的聚腺苷酸化。
本發明人期望由SV40聚-A和胃泌素基因的轉錄終止位點組成的構建子如圖所示，它能夠增加基因的表達效價。
圖11顯示由胃泌素基因的轉錄終止位點和SV40聚-A組成的構建子，這類構建子優選從pSV-SPA(SPA；SV40聚腺苷酸化的信號)為″a″，pSV-SPA-GTF(GTF；胃泌素基因的轉錄終止位點)為″b″，pSV-SPA-GTR(GTR；GTF的互補序列)為″c″，pSV-GPA(GPA；胃泌素的聚腺苷酸化的信號)為″d″，pSV-GPA-GTF為″e″，pSV-GPA-GTR為″f″，pSV-GMPA(GMPA；GPA突變體)為″g″，pSV-GMPA-GTF為″h″，pSV-GMPA-GTR為″i″中選擇。SPA-GTF，SPA-GTR，SPA-GPA，SPA-GPMA的基本序列在序列表中分別為S EQ ID No.3，No.4，No.5，和No.6。為了計算β-Gal的表達效價，所有的構建子被分別整合到pSV-β-gal中，並進一步導入到COS-7細胞株中。表達效價是β-Gal的表達量，如圖12所示。含有由SV40信號聚-A和胃泌素基因轉錄終止位點組成的構建子的pSG載體，具有增加蛋白表達量4倍的作用。因此，終止位點優選使表達效價增加的SPA-GTF(SV40信號聚-A和胃泌素基因轉錄終止位點)。本發明中，構建子用做常規的表達載體的終止位點，這樣以致於外源蛋白的表達量增加。可效仿的本發明表達載體包括pSG.。
pSG載體是一種在其終止位點與SPA-GTF整合的載體，含3309鹼基對。pSG.載體的鹼基序列列於序列表SEQ ID No.7。β-Gal插入pSG.載體以便計算表達效價，從通過由胃泌素基因的轉錄終止位點和SV40病毒的信號聚-A組成的構建子而穩定的mRNA中得到pSG.的表達效價是pSV載體的4倍多。
因此，包含SPA-GRF的載體可以在動物宿主中以常規的方法表達外源基因，可以獲得如具有生物活性物質的有用的蛋白。
另外，本發明提供了一種表達載體，它包括兩個可以增加外源基因表達效價的位點。這兩個位點是以SV40聚-A，和β-珠蛋白MAR互補序列連接胃泌素基因轉錄終止位點的轉錄終止位點。
圖13顯示了本發明的pMSG結構，總鹼基序列為6347個鹼基對，如序列表列出的SEQ ID No.8，pMSG被保藏在韓國微生物保藏中心KCCM10202。下述表1是pMSG的詳細說明圖。

表1TGF-βSRII基因的蛋白，能夠通過選擇性結合活性人蛋白TGF-β而預防TGF-β副作用。為了分析本發明的pMSG的作用和效率，表達TGF-βSRII。結果如圖14所示，由於TGF-βSRII蛋白具有一個糖基化結構，該蛋白具有比其同源蛋白大的分子量，和典型的動物細胞具有的一樣。TGF-βSRII初始的表達量為大約100ng/106細胞/天，大部分細胞被相同的表達。另外，如圖15所示，當1μM的MTX加入到TGF-βSRII細胞時，至多獲得的10μg/106細胞/天。TGF-β在人體中具有許多種功能，特別是，已發現它是導致炎症的因子，如腎小球硬化體，肝硬變，表皮細胞角質化和軟骨咬合面，TGF-βSRII可以用於TGF-β-過度表達疾病的治療。
本發明的pMSG載體克服了一個常見的問題，即低表達產量和獲得轉化突變型的困難，並且它能夠大量產生各種重組蛋白，如具有生物活性的物質。
另外，pMS載體(KCCM-10203)被開發，它不會被插入位點的鄰近鹼基而抑制它的表達，pMS產生的重組蛋白大約是常規的SV40啟動子的8倍多。
而且，製備pSG載體，它包括轉錄終止位點，該轉錄終止位點能夠在特定的轉錄位點感應轉錄子的轉錄終止位點並比常規的聚-A位點組成增加了3倍。
本發明的pMSG載體(KCCM-10202)是通過功能性DNA片斷和可適用於外源基因的多克隆位點的連接來製備的，並且TGF-β在動物細胞中被表達時，表達量為10μg/106細胞/天。從而，本發明的表達載體適合於表達重組蛋白，依照本發明，來源於在原核生物中表達的真核細胞的蛋白可以在動物細胞中生產為具有和野生型蛋白相同的結構和功能的重組蛋白。
下述實施例進一步詳細說明本發明，但並不構成對其範圍的限制。
實施例1pMS-β-gal載體的製備(1)pMS-β-gal載體的製備按如下方法製備pMS-β-gal載體。
①為了獲得人β-珠蛋白MAR的鹼基序列，從G-2細胞分離基因組DNA用Wizard基因組DNA純化試劑(Promega Co.生產的)從人宿主的G-2細胞分離基因組DNA，接著是生產公司提供的實驗方法後的純化步驟。
②基因組PCR和亞克隆的完成為了獲得人β-珠蛋白5』MAR的片段，純化的基因組DNA用作模板，β-珠蛋白MAR的正向引物BML 1和反向引物BMR 1用於基因組聚合酶鏈式反應(PCR)中。BML1和BMR1在序列表中分別為SEQ ID No.9和SEQID No.10。PCR循環執行32次。表2中顯示循環次數。

表2PCR之後，PCR的產物插入到pT7blue載體中(Novagen Co.)，製備pT7blue/β-珠蛋白MAR載體。pT7blue載體是一種能夠直接克隆PCR產物的TA克隆載體。
③製備包含多克隆位點(MCS)的重組載體pSV-β-gal I和II型為了在pSV-β-gal載體啟動子的上遊插入pT7blue載體的β-珠蛋白MAR，製備pSV-β-gal I型和II型。
首先，為了製備pSV-β-gal載體I型，用Spe I和Hind III處理pSV-β-gal之後，包含SV40啟動子的Spe I/Hind III的443個鹼基對的片斷被含基因清洗試劑III(BIO 101 Co.)的瓊脂糖凝膠純化。該片斷通過Spe I/Hind III消化被連接到線性pBluescript SK(+)(Stratagene Co.)，並且製備pBluescrip/SV40I啟動子載體。
然後，以Sca I和Hind III處理pBluescrip/SV40 I啟動子載體，包含SV40啟動子的片斷採用如上述同樣的方式由瓊脂糖凝膠純化，該片斷通過Sca I和Hind III的消化被連接到線性的pSV-β-gal載體，這樣I型載體製備完成。
另外，為了生產pSV-β-gal II型載體，在以EcoR I和Hind III處理pSV-β-gal之後，採用上述同樣的方式通過瓊脂糖凝膠純化包含SV40啟動子的EcoR I/Hind III的420個鹼基對的片斷，該片斷通過EcoR I和Hind III的消化被連接到線性的pBluescript SK(+)，這樣pBluescript/SV40 II型啟動子載體製備完成。
為了按如上述相同的方式通過瓊脂糖凝膠純化包含SV40啟動子的片斷，以Sca I和Hind III處理pBluescript/SV40 II型的啟動子載體，該片斷通過Sce I和Hind III的消化被連接到線性的pSV-β-gal載體，這樣pSV-β-gal載體II型製備完成。
④製備pMS-β-gal載體以Spe I和Sma I處理pT7blue/β-珠蛋白MAR載體，瓊脂糖凝膠純化包含β-珠蛋白MAR的大小為3kb DNA片斷，通過Spe I和Sma I片斷將片斷連接到線性重組pSV-β-gal I型載體，這樣克隆β-珠蛋白MAR。為了確定β-珠蛋白MAR的定向，位於pSV-β-gal I型載體和β-珠蛋白MAR中的Hind III限制性酶被處理，確定了β-珠蛋白MAR被逆向克隆到pSV-β-gal I型載體中。
(2)pMS-β-gal載體的表達效價包含βMS-β-gal載體的2μg試驗載體採用DOSPER(Roche產品)被共轉染到含pSV2neo載體的CHO DG44中，pSV-β-gal載體作為對照載體以相同方式共轉染。在選擇性培養基中培養轉染的CHO DG44細胞，該培養基是包括補加10％熱-非活性FBS和850μg/ml G418的硫酸鹽的核苷的MEM-α培養基(Calbiochem Co.產品)。大約2周後產生staly-轉染的G418-抗性轉染子，表達了對照載體的β-Gal的20個穩定克隆與G418-抗性的轉染子中pMS-β-gal載體分離。為了計算β-Gal和新基因的複製數以及從pSV-β-gal和pMS-β-gal轉錄的β-Gal RNA的量，通過DNA和RNA印跡來分析40陽性克隆。
圖6顯示在pSV-β-gal或pMS-β-gal載體表達β-Gal的陽性克隆(下文指「陽性克隆」)中，用於確認β-Gal基因複製數(a對照組，b本發明)，RNA數(c對照組，d本發明)，以及作為選擇性標記的新基因的複製數(e對照組，f本發明)的DNA和RNA印跡，並且圖7顯示在pSV-β-gal或pMS-β-gal載體的陽性克隆中的β-Gal表達產量和β-Gal基因的複製數之間關係的曲線。如圖6a和6b所示，由於β-Gal基因在每個陽性克隆中的複製數是不同的，每個陽性克隆可被分成兩組，其一為具有β-Gal基因的高複製數，另一為具有β-Gal基因的相對的低複製數，各組相互分析。具有β-Gal基因高複製數的一組，儘管對照組具有表示為「a」的β-Gal基因的高複製數，在這些克隆中的β-Gal基因的RNA的量相對於DNA的複製數也是低的，如「c」所示。然而，本發明的pMS-β-gal中的陽性克隆的RNA量是高的，表示為「d」。另外，具有β-Gal基因低複製數的一組中，β-Gal的複製數和pMS-β-gal載體陽性克隆的RNA的量遠遠高於對照組載體的陽性克隆中的量，如圖6中所示。圖7表示基因的複製數和表達量之間的關係。在圖7中，在pMS-β-gal載體克隆中的β-Gal基因平均複製數和表達水平(●)與對照載體克隆的那些(○)相比，相當於大約10倍。另外，β-Gal基因的高複製組中，β-Gal基因在對照載體克隆中的表達獨立於基因的複製數，並且pMS-β-gal如圖7所示。
(3)在各種細胞體系中pMS-β-gal載體的表達模式在動物細胞的外源基因的表達中，像CHO一樣使用各種各樣的細胞，外源基因的表達量在各種細胞中是不同的。本發明中，闡明了當在CHO細胞宿主中使用pMS-β-gal載體時，在轉染CHO細胞中的外源基因的表達效價和表達頻率增加了。所以，已經實驗了本發明的載體是否適用於來源和形態與CHO細胞不同的動物細胞。
pSV-β-gal和pMS-β-gal載體分別與載體pSV2neo共轉染到幼鼠腎細胞(BHK)，鼠纖維細胞(NIH3T3)，人胚腎細胞(HEK293)之後，在包含G418的培養基中培養它們大約14天，在穩定的轉染子中，對於每個載體，陽性細胞表達β-Gal的頻率和表達效價以與(2)相同的方式計算。
圖8顯示各種細胞系中pMS-β-gal的表達效價。當BHK用於宿主細胞系時，基因的表達和在CHO細胞系中的類似。當NIH 3T3用於宿主細胞系時，對表達量的增加的影響是低的。當HEK293用於宿主細胞時，表達作用和量與對照組相似。陽性克隆的頻率與上述情況類似。因此，本發明所述的表達載體在各種細胞中的效果是不同的，特別是，它們適用於通常在動物細胞表達中使用的CHO，BHK和NIN 3T3細胞。
(4)pMS-β-gal載體的表達體系的確定在常規的表達載體體系中，應經冗長的步驟選擇高表達克隆，以儘可能在主要的轉染子的集合體中分離，並且長時間培養這些克隆以增加外源基因的表達水平。為了克服這些問題和最大化外源基因的表達水平，用CHODG44細胞系將DHFR/MTX放大系統建立在表達系統上。
pMS-β-gal載體被轉染到DHFR-CHO DG44(下文稱作「CHO DG44」)細胞系，pMS-β-gal載體的轉染子適合於MTX，接著計算蛋白的表達量。pMS-β-gal載體和對照載體(pSV-β-gal載體)通過具有DHFR基因的pDCHlP載體分別共轉染至缺失DHFR基因的CHO DG44。在選擇培養基中培養DHFR-轉染的細胞株，該培養基為缺失10％熱非活性透析FBS補充的核苷的MEM-α培養基。穩定的DHFR+轉染子在大約2周後產生，在穩定的DHFR+轉染子中的表達β-Gal的陽性克隆通過β-Gal染色分離。對於染色為DHFR+轉染子中的表達β-Gal的篩選陽性克隆的β-Gal，通過在含2％甲醛和0.2％戊二醛的PBS中於4℃培育10分鐘固色細胞，以PBS清洗兩次，並用X-Gal處理。當β-Gal被表達時，由於歸因於通過β-Gal蛋白的X-Gal分解產生藍色產物，因此細胞出現藍色。選擇性克隆通過成倍地逐步增加MTX濃度如10nM，20nM，50nM，100nM，400nM和1μM來處理。克隆大約需要2到3周的時間以適合每種培養的MTX濃度。以傳統的ELISA分析通過MTX適合的基因放大期間β-Gal的表達量。
圖9表示重組蛋白在分別以pMS-β-gal和對照物轉染的細胞中的重組蛋白的表達量，並且適應1μM MTX濃度。據報導，當重組蛋白的表達通過CHO細胞系中的DHFR.MTX放大系統放大時，表達水平上升到大約10μg/106細胞/天，相當於總蛋白量的2.5％(Kaufman，1997，Methods MolBiol62，287-300)。本發明中，據觀察，通過逐漸增加MTX的量，大約有100到1000複製數被放大。計算β-Gal在對照組pMS-β-gal載體克隆中的表達量。β-Gal在對照克隆的表達量與每個克隆不同。考慮到在動物細胞的重組蛋白的生產中20μg/106細胞的工業價值，對照載體的25％的克隆屬於其中，本發明pMS-β-gal載體克隆88％產生了大於20μg/106細胞的重組蛋白。與具有最大表達量的細胞株相比，本發明的pMS-β-gal具有大量的表達的蛋白，大量的蛋白通過將外源基因插入到pMS(KCCM10203)而產生。因此，當本發明的表達載體被用於表達外源基因時，將帶來高表達產量和高效率。
實施例2製備pSPUK，pMSPUK，pCPUK，和Pmcpuk(1)製備pCMV載體為了易於克隆scu-PA基因的CMV啟動子和SV40啟動子，製備pCMV載體。實施得到CMV啟動子、MCS位點和pcCDNA3.1(+)(由Invitrogen Co.生產的)轉錄終止位點的PCR。PCR的正向引物為CMVL1(SEQ ID No.11)，反向引物為PAR1(SEQ ID No.12)。CMVL1引物具有Sac II，Cla I，Nru I位點，PAR1引物具有Bsm I位點。為了製備pCMV，1.4kb的PCR產物被Sac II和Bsm I消化後，連接到線性重組pMS-β-gal I型中。
(2)製備pSPUK，pMSPUK，pCPUK，和pMCPUK為了在動物細胞中製備適於scu-PA表達的重組表達載體，通過PCR得到scu-PA基因，為了由來源於人TCL-598細胞株的具有scu-PA基因作為模板的CHO細胞株分離基因組DNA。正向引物PKL1為序列SEQ ID No.13，反向引物的PKR1序列為SEQ ID No.14。PKL1引物具有Hind III限制性位點，PKR1引物具有Sma I限制性位點。
從引物獲得的大約1.3kb scu-PA的PCR產物(DNA片斷，具有人scu-PA的鹼基NO.-6-NO.1293)被Sma I和Hind III剪切，並且插入它到質粒中，和為了製備pCPUK表達載體通過Hind III和EcoR V剪切的pCMV。
另外，為了從中分離含SV40啟動子的片斷，以Sma I和Hind III處理重組pSV-β-gal I型載體。為了製備pSPUK表達載體，由Nru I和Hind III將片斷插入並與對照的線性pCPUK連接。
為了插入MAR成分到其中，以Sac II和Nru I處理pCPUK。為了製備pMCPUK載體，線性的pCPUK插入β-珠蛋白MAR成分並與其連接，這種成分通過以Sma I和SacII處理pMS-β-gal載體製備。
為了將β-珠蛋白MAR成分插入其中，用Stu I和Sac II處理載體pSPUK。將用Stu I和Sac II處理pMS-β-gal載體產生的β-珠蛋白MAR成分，插入到pSPUK載體，pMSPUK載體製備完成。
簡而言之，pSPUK載體構建子為通過插入scu-PA基因到重組載體和pSV-β-gal I型產生的形式，其中pSV-β-gal I型的β-Gal基因被除去，並且插入β-珠蛋白MAR互補序列到pSPUK載體中以便製備pMSPUK載體。pCPUK載體構建子是插入Scu-PA到pCMV載體而產生的形式，並且插入β-珠蛋白MAR互補序列到pCPUK中以便製備pMCPUK載體。
(3)pSPUK，pMSPUK，pCPUK，和pMCPUK載體效率的檢測①重組scu-PA基因轉染到細胞中，選擇基因的轉化體和放大為了獲得足夠穩定的細胞系以表達scu-PA，將pSPUK，pMSPUK，pCPUK，和pMCPUK四種重組表達質粒，分別地導入到DHFR-CHO細胞中(CHO DG44)。2×105的CHO細胞置於6-孔平板中，在含5％CO2，37℃的培養箱中培育24小時。1μg的pSPUK，pMSPUK，pCPUK，和pMCPUK質粒和10ng的DHFR微量基因分別按100∶1的比率混合，混合物以細胞轉染試劑，(GiboBRL)，或DOSPER(Loche)法轉染到CHO細胞。6小時後，更換新鮮的常規培養基，細胞被進一步培養48小時。細胞按比率10∶1在培養基進行次培養到選擇培養基大約2周或更長，為了形成細胞群落，大約每4或5天要更換培養基。單獨或一起培養細胞群落。
②分泌在細胞的培養液中的scu-PA的活性的計算採用S-2444作為基礎計算細胞培養基的醯胺化活性，並將結果與相應的尿激酶活性相比較。1×106細胞被置於含2ml培養液的6-孔平板中，在含5％CO2，37℃的培養箱中培育17小時。為了計算上清液的活性，50μl連續稀釋的上清液置於96-孔平板中，並和30μl緩衝液混合(50mM Tris/HCI(pH8.8)，80mM NaCI，0.02％Twin80)。為了活化重組scu-PA，將10μl纖溶酶(0.5U/ml)進一步混入到混合物中，混合物在37℃反應20分鐘。為了抑制纖溶酶的活性將10μl抑酶肽(100KIU/ml)加入到混合物中，100μl顯色底物溶液(緩衝溶液和6mM的S-2444的混合物)進一步加入到混合物中，在37℃反應1小時。scu-PA在培養基中的活性和濃度通過最後的溶液在微量閱讀器的405nm處的吸收值(光學密度)來計算，結果與相應的尿激酶的相比較。
圖10顯示依照轉染pMSPUK，pMCPUK，pSPUK和pCPUK至CHO細胞中的scu-PA的表達效價。pMS和pMC載體的表達水平比作為對照的pSV和pMC的增加了4倍多。
實施例3pSG-β-gal載體的製備(1)胃泌素基因的轉錄終止位點和pSG-β-gal載體的製備合成胃泌素基因的正義鏈的轉錄終止位點SEQ ID No.15和反義鏈SEQID No.16之後，兩者被退火。用BamH I和Pst I處理退火的片斷，並由BamHI和Pst I在SV40 p(A)3』末端消化，整合和連接到線性pSV-β-gal載體(由Promega Co.生產的載體)，這樣pSG-β-gal載體完成製備。
(2)計算pSG載體的效率為了計算β-Gal的表達效價，用DOSPER(Roche)將pSG-β-gal載體和pSV2neo載體共轉染到Cos-7細胞中。
圖12顯示β-gal在pSG-β-gal載體中的表達效價，並且包括由SV40聚-A和胃泌素基因的轉錄終止位點組成的構建子的pSG-β-gal載體產生的β-Gal是包括SV40聚-A的常規載體的4倍多。因此，通過克隆在pSG載體中外源基因的轉染可以產生大量的重組蛋白。
實施例4(1)pMSG載體的製備如圖13所示，含有β-珠蛋白MAR互補序列和SPA-GTF的載體由PCR製備。為了製備pMSG載體，pMS-β-gal和pSG-β-gal用作模板，PCR實施三次，PCR的產物用特殊的限制性酶來處理，並連接在一起。
①β-珠蛋白MAR成分的PCR正向引物ML1(序列17)和反向引物MR1(序列18)用於PCR。PCR產物以Sac II和Cla I處理後，與通過Sac II和Cla I消化的線性pMS-β-gal載體整合，pMS-β-gal/sc載體製備完成。
②包含多克隆位點和轉錄終止位點的PCR正向引物TL1(序列19)和反向引物TR1(序列20)用於pSG載體的胃泌素基因轉錄終止位點的PCR。PCR產物以pGEM-T(Promega Co.生產)亞克隆，它是能夠直接克隆PCR產物的一種TA克隆載體，這樣pGEM-T/MCSp(A)製備完成。
③含SV40啟動子和多克隆位點的PCR正向引物PL1(序列21)和反向引物PR1(序列22)用於SV40啟動子和圖1所示的1型載體的多克隆位點的PCR。PCR產物用Apa I和BgI II處理，然後將其整合到被Apa I和BgI II消化的線性pGEM-T/MCSp(A)載體中，這樣pGEM-T/SVMCSp(A)載體製備完成。
④pMS和pMSG載體的製備為了純化由SV40啟動子，多克隆位點和SV40終止位點組成的DNA片斷，用Apa I和BamH I處理實施例4中的pGEM-T/SVMCSp(A)，並將純化的片斷整合到實施例4的①中的由Apa I和BamH I消化的線性pMS-β-gal/sc載體，這樣pMS載體製備完成。為了分離具有GTF鹼基對的950bp的DNA片斷，用BamH I和Sca I處理Psg載體，通過BamH I和ScaI消化將它與線性pMS載體連接，從而pMSG載體製備完成。
(2)pMSG載體的表達效價的計算為了檢驗pMSG載體在CHO宿主細胞系中的表達效率和pMSG載體的工業應用，用正向引物TRI(SEQ ID NO.23)和反向引物TRR1(SEQ ID NO.24)完成TGF-βSRII(TGF-β可溶性受體II，糖基化蛋白)的PCR。PCR產物，放大的TGF-βSRII在Nhe I和Xho I位點插入到pMSG和pSV載體，生成的每個載體共轉染到具有含DHFR基因的pDCHlP的CHO DG444細胞中。它們在選擇性培養基中培養，這裡僅有具有DHFR基因的細胞株可以生長。大約在2周後產生穩定的DHFR+轉染子，分離20DHFR+克隆，用蛋白質印跡法分析這些克隆以便計算TGF-βSRII的量和尋找它的特性。
圖14顯示表明TGF-βSRII表達的蛋白質印跡圖，其中「a」是TGF-βSRII在pSV載體的克隆表達，「b」是TGF-βSRII在pMSG載體的克隆表達。對照載體克隆的情形下，25個克隆中檢測到一個克隆內的TGF-βSRII表達。同時在27個克隆中檢測到23個克隆內的TGF-βSRII表達，更一步檢測到高水平的更多的表達TGF-β的克隆。另外，當TGF-βSRII由pMSG表達載體表達時，它具有糖基化結構，這樣如典型的動物細胞中糖蛋白一樣它的分子量增加。pMSG載體的主要克隆的平均表達水平為100ng/106細胞/天。
通過MTX量逐步成倍地增加(如10nM，40nM，200nM，和1M)的處理，本發明的pMSG/TGF--βSRII載體的主要的穩定克隆適合於DHFR/MTX放大體系，以便增加TGF-βSRII的表達量。
圖15顯示TGF-βSRII的表達量，它通過將TGF-βSRII克隆到pMSG載體、將它們轉染到CHO細胞中、以及適應1μM MTX濃度而生產。在對照載體的克隆中，許多克隆不能適應MTX處理的基因放大過程期間的每個MTX濃度，而與對照載體克隆相比，pMSG/TGF-βSRII載體的克隆良好地適應。假設pMSG表達載體的MAR成分增加了DHFR基因以及外源基因的表達量。如圖15所示，當加入1μM濃度的MTX時，獲得許多pMSG載體克隆，它以大約10μg/106細胞/天產生TGF-β。
據報導TGF-β，細胞生長的有效調節物和分化，是損傷反應中心。在大量的上皮細胞中，重複或延長的損傷導致了進行性纖維樣變性和基本上不必要的過度瘢痕的發展。另外，TGF-β導致疾病，例如如腎小球體化，腎硬化，肝硬化，表皮細胞角質化，和軟骨炎症。TGF-βSRII如同TGF-β拮抗物一樣起作用。因此，通過TGF-βSRII作為藥物治療阻止TGF-β。與從原核生物如大腸桿菌E.coli或Pichia pastoris表達的蛋白相比，從本發明的CHO細胞系表達的TGF-βSRII具有優良的治療效果，本發明的具有提高的外源基因表達效價的表達載體可以用於動物細胞。
微生物或其它生物材料的保藏證明(PCT條約13bis)



布達佩斯條約關於為遞交專利而保藏微生物的國際證明國際表

適用於條約6.4(d)，該日期為獲得國際保藏局資格的日期其中當保藏是在布達佩斯條約之外且在得到國際保藏局身份之後進行時，該保藏被轉成布達佩斯條約之下，該日期是微生物被國際保藏局收到的日期。
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布達佩斯條約關於為遞交專利而保藏微生物的國際證明國際表

適用於條約6.4(d)，該日期為獲得國際保藏局資格的日期其中當保藏是在布達佩斯條約之外且在得到國際保藏局身份之後進行時，該保藏被轉成布達佩斯條約之下，該日期是微生物被國際保藏局收到的日期。
序列表110Mogam Biotechnology Research InstitutePan-Gen Biotech Laboratories Inc.120用於動物細胞的表達載體130opp010629kr150KR10-2000-439961512000-7-2916024170Kopatentln 1.5521012116287212DNA213人工序列220223pMS載體序列220221啟動子222(1)..(419)223SV40病毒220221基因222(3305)..(6269)223人β珠蛋白MAR成份4001gcgcagcacc atggcctgaa ataacctctg aaagaggaac ttggttaggt accttctgag60gcggaaagaa ccagctgtgg aatgtgtgtc agttagggtg tggaaagtcc ccaggctccc 120cagcaggcag aagtatgcaa agcatgcatc tcaattagtc agcaaccagg tgtggaaagt 180ccccaggctc cccagcaggc agaagtatgc aaagcatgca tctcaattag tcagcaacca 240tagtcccgcc cctaactccg cccatcccgc ccctaactcc gcccagttcc gcccattctc 300cgccccatgg ctgactaatt ttttttattt atgcagaggc cgaggccgcc tcggcctctg 360agctattcca gaagtagtga ggaggctttt ttggaggcct aggcttttgc aaaaagcttg 420ctagcggccg cagatctgtt aactcgagaa cttgtttatt gcagcttata atggttacaa 480ataaagcaat agcatcacaa atttcacaaa taaagcattt ttttcactgc actctagttg 540tggtttgtcc aaactcatca atgtatctta tcatgtctgg atcctctaga gtcgacctgc 600aggcatgcaa gctggcactg gccgtcgttt tacaacgtcg 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2212105211217212DNA213人工序列220223SV40病毒聚-A信號和胃泌素聚-A信號220221聚A-信號222(1)..(135)220221終止子222(136)..(217)4005aacttgttta ttgcagctta taatggttac aaataaagca atagcatcac aaatttcaca60aataaagcat ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt ccaaactcat caatgtatct 120tatcatgtct ggatccggga tcccctgaaa aactgatcaa aaataaacta gtttccagtg 180gatcaatgga ctgtgtcagt gttgtagggc tgcagtt2172106211217212DNA213人工序列220223SV40病毒聚-A信號和最少的胃泌素聚-A信號220221polyA_signal222(1)..(135)220221終止子222(136)..(217)4006aacttgttta ttgcagctta taatggttac aaataaagca atagcatcac aaatttcaca60aataaagcat ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt ccaaactcat caatgtatct 120tatcatgtct ggatccggga tcccctgaaa aactgatcaa aaataaacta gtttttccac 180tgcattctag ttgtgttagt gttgtagggc tgcagtt 21721072113309212DNA213人工序列220223pSG載體序列220221啟動子222(1)..(419)4007gcgcagcacc atggcctgaa ataacctctg aaagaggaac ttggttaggt accttctgag60gcggaaagaa ccagctgtgg aatgtgtgtc agttagggtg tggaaagtcc ccaggctccc 120cagcaggcag aagtatgcaa agcatgcatc tcaattagtc agcaaccagg tgtggaaagt 180ccccaagctc cccagcaggc agaagtatgc aaagcatgca tctcaattag tcagcaacca 240tagtcccgcc cctaactccg cccatcccgc ccctaactcc gcccagttcc gcccattatc 300cgccccatgg ctgactaatt ttttttattt atgcagaggc cgaggccgcc tcggcctctg 360agctattcca gaagtagtga ggaggctttt ttggaggcct aggcttttgc aaaaagcttg 420ctaacggccg cagatctgtt aactcgagaa cttgtttatt gcagcttata atggttacaa 480ataaagcaat agcatcacaa atttcacaaa taaagcattt ttttcactgc attctagttg 640tggtttgtcc aaactcatca atgtatctta tcatgtctgg atccaggata atatatggta 600gggttcatag ccagagtaac cttttttttt aatttttatt ttattttatt tttgagctgc 660aggcatgcaa gctggcactg gccgtcgttt tacaacgtcg tgactgggaa aaccctggcg 720ttacccaact taatcgcctt gcagcacatc cccctttcgc cagctggcgt aatagcgaag 780aggcccgcac cgatcgccct tcccaacagt tgcgcagcct gaatggcgaa tggcgcctga 840tgcggtattt tctccttacg catctgtgcg gtatttcaca ccgcatatgg tgcactctca 900gtacaatctg ctctgatgcc gcatagttaa gccagccccg acacccgcca acacccgctg 960aagcgccctg acgggcttgt ctgctcccgg catccgctta cagacaagct gtgaccgtct 1020ccgggagctg catgtgtcag aggttttcac cgtcatcacc 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6120ggagcaagaa agaggagcca tttgatcaag aatagcagaa aaaggaaagg caagtcatat 6180taacaaatga ttgtcatgcc aacagtacag ataactctgc taataaaggt agaggcataa 6240tacaggtagt agcagatatc tacatagtag ttaaaggaca tggccatcag tacagaagat 6300tccataaagg agaacctaaa gaggaagaaa tcgataagct tgatccc 6347210921120212DNA213人工序列220223人β珠蛋白核基質著絲溢痕成份的引物RML1220221引物222(1)..(20)4009ttcttcctc tttaggttctc202101021120212DNA213人工序列220223人β珠蛋白核基質著絲溢痕成份的引物BMR1220221引物222(1)..(20)223orimer40010cctcctgagt agctgggact202101121141212DNA213人工序列220223pcCNA3.1載體的引物CMVL1220221引物222(1)..(41)223引物40011attccgcgga tcgattcgcg atgtacgggc cagatatacg c 412101221123212DNA213人工序列220223pcCDNA3.1載體的引物PAR1220221引物222(1)..(23)223primer40012attgaatgca gagaaaaaaa tgc 232101321139212DNA213人工序列220223scu-PA基因的引物PKL1220221引物222(1)..(39)223引物40013cccaagctta tgagagccct gctggcgcgc ctgcttctc 392101421127212DNA213人工序列220223asc-PA基因的引物PKR1220221引物222(1)..(27)223引物40014tcccccgggt cagagggcca ggccatt 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權利要求
1.一種用於動物細胞的表達載體，包括β-珠蛋白MAR序列或其啟動子的5』終止末端上的互補序列。
2.如權利要求1所述的表達載體，其中用於動物細胞的表達載體是SEQID No.l的pMS KCCM10203。
3.如權利要求1所述的表達載體，其中用於動物細胞的表達載體是pMC。
4.一種用於動物細胞的表達載體，包括由SV40病毒的聚-A(聚腺苷酸化)信號和胃泌素基因的轉錄終止位點組成的構建子，其中構建子具有序列SEQ ID No.3。
5.如權利要求4所述的表達載體，其中表達載體是SEQ ID NO.7中的pSG 。
6.一種具有序列SEQ ID NO.8的pMSG KCCM10202載體，包括人β-珠蛋白5』MAR(核基質著絲溢痕)互補序列，以及由SV40病毒聚-A信號和胃泌素基因轉錄終止位點組成的構建子。
7.一種在動物細胞中由表達載體製備生物活性物質的方法，該載體選自按照權利要求1，4和6的表達載體組成的組。
8.按照權利要求7所述的方法，其中生物活性物質是由按照權利要求6的表達載體製備的TGF-βSRII。
全文摘要
本發明涉及一種用於動物細胞的表達載體。特別是，本發明涉及的一種表達載體，pMS載體，pSG載體和pMSG載體，包括人β－珠蛋白5』MAR的互補序列和/或胃泌素基因的轉錄終止位點。採用本發明的表達載體的表達體系可以成功地在各種動物細胞中生產重組蛋白，並且重組蛋白具有單一的結構和功能。
文檔編號C07K14/435GK1444657SQ01813557
公開日2003年9月24日 申請日期2001年7月27日 優先權日2000年7月29日
發明者金鍾默, 金正燮, 吳先模, 尹在承, 白光熙, 鄭守一, 樸鬥鴻, 尹燁 申請人:(材)牧巖生明工學研究所, 盼展生物技術實驗室有限公司