修飾a型dna聚合酶的製作方法

2023-11-06 06:04:57

專利名稱：修飾a型dna聚合酶的製作方法
修飾A型DNA聚合酶本申請要求於2008年11月3日提交的美國臨時專利申請序列號61/110，877的優先權，將其全部披露內容以引用方式結合於本文。
背景技術：
DNA聚合酶是一種酶家族，其使用單鏈DNA作為模板來合成互補DNA鏈。尤其是， DNA聚合酶可以將游離核苷酸加入新形成鏈的3』端，從而導致新鏈在5』 -3』方向的延伸。 大多數DNA聚合酶是具有聚合和核酸外切活性(例如，3』 - > 5』外切核酸酶或5- > 3』外切核酸酶活性)的多功能蛋白。DNA聚合酶，像其它天然酶一樣，已經發展超過百萬年以在它們的天然細胞環境中是有效的。它們中的許多近乎完美地適合於在這種環境中工作。在這樣的環境下。蛋白質可以進化的方式受到許多要求的限制；蛋白質必須與其它細胞成分相互作用，它必須在細胞質中(即，特定的PH、離子強度、在有特定化合物存在的條件下等)發揮作用以及它不能引起會降低親本有機體作為整體的適合度的致命或不利的副作用。當DNA聚合酶被從它們的天然環境中去除並用於工業或研究應用時，酶在其下工作的環境和條件不可避免地大大不同於它在其中進化的那些環境和條件。許多限制蛋白質可以採用的進化方向的約束條件會消失。因此，存在巨大潛力來改善DNA聚合酶，以用於工業或研究應用。

發明內容
本發明提供了改進的DNA聚合酶，尤其是，A型DNA聚合酶，其可以更好地適合應用於重組DNA技術。尤其是，本發明提供了修飾DNA聚合酶，該修飾DNA聚合酶源自用來選擇突變的定向進化實驗，上述突變在用於工業或研究應用的條件下賦予有利的表型。因此，在一個方面，本發明提供了修飾A型DNA聚合酶(修飾的A型DNA聚合酶)， 該修飾A型DNA聚合酶包含對應於一個或多個位置的一個或多個胺基酸改變(例如，一個或多個取代、缺失、或插入)，上述位置選自相對於對應親代或野生型酶的在表2中確定的位置。在一些實施方式中，上述胺基酸改變會改變(例如，增加或減小)酶活性、保真性 (fidelity)、持續合成能力、延伸率、穩定性、引物二聚體形成、抗鹽性、可溶性、表達效率、 摺疊穩健性(摺疊堅固性，folding robustness)、熱穩定性、聚合活性、濃度穩健性(濃度堅固性，concentration robustness)、抗雜質性、鏈置換活性、核苷酸選擇性、改變的核酸酶活性、對核酸增補染料(插入染料)的抗性和/或與DNA聚合過程有關的其它性能和特性。在一些實施方式中，本發明的修飾A型DNA聚合酶包含在一個或多個位置的胺基酸改變，上述位置對應於 Taq 聚合酶的 P6、K53、K56、E57、K171、T203、E209、D238、L294、 V310、G364、E400、A414、E507、S515、E742或E797。例如，在一些實施方式中，上述一個或多個位置包括對應於Taq聚合酶的E507的位置。在一些實施方式中，胺基酸改變是胺基酸取代。在一些實施方式中，一個或多個胺基酸取代對應於選自表2的胺基酸取代。在一些實施方式中，一個或多個胺基酸取代對應於選自由 P6S、K53N、K56Q、E57D、K171R、T203I、E209G、E209K、D238N、L294P、V310A、G364D、 G364S、E400K、A414T、E507K、S515G、E742K或E797G、以及它們的組合組成的組中的取代。在一些實施方式中，DNA聚合酶被修飾自天然存在的聚合酶，例如，從棲熱水生菌 (Thermus aquaticus)、口譽熱棲熱菌(Thermus thermophilus) > Thermus caldophilus、絲狀棲熱菌(Thermus filiformis)、黃棲熱菌(Thermus flavus)、海棲熱袍菌(Thermotoga maritima)、嗜熱脂肪芽胞桿菌(Bacillus strearothermophilus)、或熱堅芽胞桿菌 (Bacillus caldotenax)中分離的天然存在的聚合酶。在一些實施方式中，本發明的修飾 A型DNA聚合酶(經修飾的A型DNA聚合酶)修飾自天然存在的聚合酶的截短的變體，例如，KlenTaq，其包含5'至3'外切核酸酶域的部分的缺失(參見，Barnes W. Μ. (1992)Gene 112 :29-35 ；以及 Lawyer F. C.等人(1993) PCR Methods and Applications，2 :275-287)。 在一些實施方式中，本發明的修飾A型DNA聚合酶修飾自嵌合DNA聚合酶。在一些實施方式中，本發明的修飾A型DNA聚合酶修飾自融合聚合酶。 在另一個方面，本發明的特點在於包含本文描述的修飾A型DNA聚合酶的試劑盒。 此外，本發明提供了編碼本文描述的修飾A型DNA聚合酶的核苷酸序列，以及包含根據本發明的核苷酸序列的載體和/或細胞。在另一個相關方面，本發明的特點在於包含在一個或多個位置的一個或多個胺基酸改變(例如，一個或多個取代、缺失、或插入)的修飾iTaqDNA聚合酶，上述位置選自相對於野生型酶的在表2中確定的位置。在一些實施方式中，一個或多個胺基酸改變會增加酶活性、持續合成能力、延伸率、改變的核酸酶活性、抗鹽性、對核酸增補染料或其它PCR添加物的抗性。在一些實施方式中，修飾Taq DNA聚合酶包含在一個或多個位置的胺基酸改變， 上述位置對應於 P6、K53、K56、E57、K171、T203、E209、D238、L294、V310、G364、E400、A414、 E507、S515、E742、或E797。在一些實施方式中，一個或多個胺基酸改變是取代。在一些實施方式中，一個或多個胺基酸取代選自表2。在一些實施方式中，一個或多個胺基酸取代選自由P6S、K53N、 K56Q、E57D、K171R、T203I、E209G、E209K、D238N、L294P、V310A、G364D、G364S、E400K、A414T、 E507K、S515G、E742K或E797G、以及它們的組合組成的組。在其它相關方面，本發明提供了包含胺基酸序列的修飾Taq DNA聚合酶，上述胺基酸序列選自由 SEQ ID NO :2(A3E)、SEQ ID NO :3(G9S)、SEQ ID NO :4(D5S)、SEQ ID NO 5(D2)、SEQ ID NO :6 (A5E)、SEQ ID NO :7 (B6S)、SEQ ID NO :8 (E2S)、SEQ ID NO :9 (A3)、SEQ ID NO :10 (HlO)、SEQ ID NO :11 (HIS)、SEQ ID NO :12 (F9E)、SEQ ID NO : 13 (A5S)、SEQID NO :14(ClOE)、SEQ ID NO : 15(F5S)、SEQ ID NO :16(E7S)、SEQ IDNO : 17(G6S)、SEQ ID NO: 18 (EIE),SEQ ID NO :19 (C7)、SEQ ID NO :20 (E12)、SEQ ID NO :21 (D9)、SEQ ID NO :22 (FlO)、 SEQ ID NO :23(H7)、SEQ ID NO :24(A5)以及它們的組合組成的組。本發明的特點還在於包括本文描述的修飾Taq DNA聚合酶的試劑盒、以及其應用。 另外，本發明提供了編碼本文描述的修飾Taq DNA聚合酶的核苷酸序列、以及包括核苷酸序列的載體和/或細胞。本發明進一步提供了包括利用如本文描述的修飾A型DNA聚合酶(例如，Taq DNA聚合酶)來擴增DNA片段的方法。在一些實施方式中，按照本發明擴增的DNA片段長於51Λ(例如，長於61Λ、71Λ、 8kb、9kb、10kb、12kb、或更長)。


附圖僅出於說明而不是限制的目的。圖1示出了來自嗜熱菌種的天然存在的A型DNA聚合酶的胺基酸序列的序列對比 (比對)。由定向進化實驗發現的示例性胺基酸改變示在每個序列對比的上方。定義胺基酸如在本文中所使用的，術語「胺基酸」，在最廣泛的意義上，是指可以被加入多肽鏈中的任何化合物和/或物質。在一些實施方式中，胺基酸具有一般結構 (R)-COOH0在一些實施方式中，胺基酸是天然存在的胺基酸。在一些實施方式中，胺基酸是合成胺基酸；在一些實施方式中，胺基酸是D-胺基酸；在一些實施方式中，胺基酸是L-胺基酸。「標準胺基酸」是指通常在天然存在的肽中發現的任何二十種標準L-胺基酸。「非標準胺基酸」是指不同於標準胺基酸的任何胺基酸，而不管它是合成製得或獲自天然來源。 如在本文中所使用的，「合成胺基酸」包括化學修飾胺基酸，包括但不限於鹽、胺基酸衍生物(如醯胺)、和/或取代。胺基酸，包括在肽中的羧基末端和/或氨基末端胺基酸，可以通過甲基化、醯胺化、乙醯化、和/或在沒有不利影響它們的活性的情況下用其它化學基團 (chemical)的取代，加以修飾。胺基酸可以參與二硫鍵。術語「胺基酸」可與「胺基酸殘基」 互換使用並且可以指游離胺基酸和/或指肽的胺基酸殘基。根據其中使用該術語的上下文，顯而易見的是，它是指游離胺基酸還是肽的殘基。應當指出的是，所有胺基酸殘基序列在本文中由這樣的式表示，其左方向和右方向是在氨基末端至羧基末端的常規方向。鹼基(bp):如在本文中所使用的，鹼基對是指在雙鏈DNA分子中腺嘌呤㈧與胸腺嘧啶(T)、或胞嘧啶(C)與鳥嘌呤(G)的夥伴關係。嵌合聚合酶如在本文中所使用的，術語「嵌合聚合酶」(也被稱為「嵌合體」)是指任何重組聚合酶，該重組聚合酶包含源自第一 DNA聚合酶的至少第一胺基酸序列和源自第二 DNA聚合酶的第二胺基酸序列。通常，第一和第二 DNA聚合酶的特點在於至少一種不同的功能特性(例如，持續合成能力、延伸率、保真性)。如在本文中所使用的，源自感興趣的 DNA聚合酶的序列是指在感興趣的DNA聚合酶中發現的任何序列、或任何這樣的序列，其與在感興趣的DNA聚合酶中發現的胺基酸序列至少70 % (例如，至少75 %、80 %、85 %、90 %、 91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99% )相同。根據本發明的「嵌合聚合酶」可以包含來自相關或類似聚合酶的兩個或更多個胺基酸序列(例如，共享類似序列和/或結構的蛋白)，其加以連接以形成新的功能蛋白。根據本發明的「嵌合聚合酶」可以包含來自非相關聚合酶的兩個或更多個胺基酸序列，其加以連接以形成新的功能蛋白。例如，本發明的嵌合聚合酶可以是由不同種類的生物體表達的蛋白質結構的「種間」或「基因間」融合。互補如在本文中所使用的，術語「互補」是指在兩個多核苷酸鏈的區之間或在兩個核苷酸之間通過鹼基配對的序列互補性的廣義概念。已知，腺嘌呤核苷酸能夠與核苷酸 (其是胸腺嘧啶或尿嘧啶)形成特定的氫鍵(「鹼基配對」)。類似地，已知，胞嘧啶核苷酸能夠與鳥嘌呤核苷酸鹼基配對。
DNA結合親和力如在本文中所使用的，術語「DNA結合親和力」通常是指DNA聚合酶在結合DNA核酸方面的活性。在一些實施方式中，可以用二條帶移位分析來測量DNA 結合活性。例如，在一些實施方式中(基於Guagliardi等人(1997) J. Mol. Biol. 267 841-848的測定)，利用標準方法，用32P標記雙鏈核酸(來自S. solftaricus IacS基因的 452-bpHindIII-EcoRV 片段)達到至少約 2. 5X 107cpm/μ g(或至少約 4000cpm/fmol)的比活性。參見，例如，Sambrook 等人 Q001)Molecular Cloning :A Laboratory Manual (3rd ed. ,Cold Spring Harbor Laboratory Press,NY)的9. 63-9. 75 (描述核酸的末端標記)。製備反應混合物，該反應混合物包含在約10 μ 1結合緩衝液(50mM磷酸鈉緩衝溶液(pH 8. 0)、 10%甘油、25mMKCl、25mM MgCl2)中的至少約0. 5 μ g多肽。將反應混合物加熱至37°C，時間為10分鐘。將約1 X IO4至5X 104cpm(或約0. 5-2ng)的標記雙鏈核酸加入到反應混合物中並溫育另外10分鐘。將反應混合物加載到在0.5 X Tris-硼酸鹽緩衝液中的天然聚丙烯醯胺凝膠上。在室溫下對反應混合物進行電泳。乾燥凝膠並利用標準方法對其進行放射自顯影。標記的雙鏈核酸的遷移率的任何可檢出的減小表明在多肽和雙鏈核酸之間形成了結合複合物。可以利用標準光密度法來量化上述核酸結合活性以測量相對於在初始反應混合物中的放射性的總量在結合複合物中的放射性的量。延伸率如在本文中所使用的，術語「延伸率」是指DNA聚合酶延伸聚合物鏈的平均速度。如在本文中所使用的，高延伸率是指高於50nt/s的延伸率(例如，高於50、55、60、 65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140nt/s)。如在本申請中所
使用的，可互換使用術語「延伸率」和「速度」。酶活性如在本文中所使用的，術語「酶活性」是指DNA聚合酶的特異性和效率。 DNA聚合酶的酶活性也被稱為「聚合酶活性」，其通常是指DNA聚合酶在催化多核苷酸的模板定向(導向)合成方面的活性。可以利用本領域已知的各種技術和方法來測量聚合酶的酶活性。例如，可以在稀釋緩衝液(例如，20mM Tris. Cl，pH 8. 0,50mM KC1,0. 5% NP 40，以及0.5%吐溫-20)中製備連續稀釋的聚合酶。對於每次稀釋，可以除去5μ1並加入到45 μ 1反應混合物中，所述反應混合物包含25mM TAPS (pH9. 25)、50mM KCl、2mM MgCl2, 0. 2mM dATP、0. 2mM dGTP、0. 2mMdTTP、0. ImM dCTP、12. 5 μ g 激活的 DNA、100 μ M[ α -32P] dCTP(0. 05yCi/nmol)以及無菌去離子水。可以在37°C (或74°C，對於耐熱的DNA聚合酶)下溫育反應混合物10分鐘，然後通過立即將冷卻反應至4°C並添加10 μ 1冰冷的 60mM EDTA來終止。可以從每個反應混合物中除去25 μ 1等分部分。可以通過凝膠過濾從每個等分部分中除去未結合的放射性標記dCTP(Centri-kp，Princeton Separations, Adelphia，N. J.)。可以使柱洗脫液與閃爍液(Iml)混合。藉助於閃爍計數器來量化柱洗脫液中的放射性以確定通過聚合酶合成的產物量。一個單位的聚合酶活性可以定義為在30 分鐘內合成10納摩爾產物所必需的聚合酶的量(Lawyer et al. (1989) J. Biol. Chem. 264 6427-647)。測量聚合酶活性的其它方法在本領域中是已知的(參見，例如，Sambrook et al. (2001)Molecular Cloning :A Laboratory Manual(3. sup. rd ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY))。保真性(fidelity)如在本文中所使用的，術語「保真性」是指通過模板依賴性 DNA聚合酶的DNA聚合的精確度。通常通過錯誤率(加入不準確的核苷酸，S卩，並不是以模板依賴性方式加入的核苷酸的頻率)來測量DNA聚合酶的保真性。通過聚合酶活性和DNA聚合酶的外切核酸酶活性來維持DNA聚合的精確度或保真性。術語「高保真性」是指錯誤率低於 4. 45父10、例如，小於4.0\10—、3. 5 X 1(Γ6、3· 0 X 1(Γ6、2· 5 X 1(Γ6、2. 0 X 1(Γ6、1. 5Χ1(Γ6、 1. OX 10_6、0. 5Χ 10_6)突變/nt/加倍。可以利用本領域已知的測定方法來測量DNA聚合酶的保真性或錯誤率。例如，可以利用在Cline，J.et al. (96)NAR M :3M6_3551中所描述的 IacI PCR保真性分析(測定)來測試DNA聚合酶的錯誤率。簡單地說，使用在適當PCR緩衝液中的2. 5UDNA聚合酶(S卩，在30分鐘內在72°C下加入25納摩爾總dNTP所必需的酶的量)，從pPRIAZ質粒DNA擴增編碼lacIOlach靶基因的1. 9kb片段。然後將包含IacI的 PCR產物克隆到λ GTlO臂中，並用顏色篩選試驗來確定IacI突變體的百分比(MF，突變頻率)，如(Lundberg, K. S. , Shoemaker, D. D. , Adams, Μ. W. W. , Short, J. Μ. , Sorge, J. Α. , and Mathur, Ε. J. (1991)Gene 180:1-8)所描述的。錯誤率表示為突變頻率/bp/重複(MF/bp/ d)，其中bp是在IacI基因序列(349)中可檢測位點的數目而d是有效靶加倍的數目。與上述類似，包含lacIOlach靶基因的任何質粒可以被用作用於PCR的模板。可以將PCR產物克隆到不同於λ GT(例如，質粒)的載體中，其便於進行藍/白色篩選。融合DNA聚合酶如在本文中所使用的，術語「融合DNA聚合酶」是指與具有期望活性(例如，DNA-結合、穩定模板-引物複合物、水解dUTP)的一個或多個蛋白質結構域結合(例如，共價或非共價)的任何DNA聚合酶。在一些實施方式中，上述一個或多個蛋白質結構域源自非聚合酶蛋白。通常，產生融合DNA聚合酶以改善DNA聚合酶的一些功能特性 (例如，持續合成能力、延伸率、保真性、抗鹽性等)。修飾DNA聚合酶如在本文中所使用的，術語「修飾DNA聚合酶(經修飾的DNA聚合酶)」是指這樣的DNA聚合酶，所述DNA聚合酶源自另一種(即，親本)DNA聚合酶並且與親本DNA聚合酶相比包含一個或多個胺基酸改變(例如，胺基酸取代、缺失、或插入)。在一些實施方式中，本發明的修飾DNA聚合酶源自或修飾自天然存在的或野生型DNA聚合酶。 在一些實施方式中，本發明的修飾DNA聚合酶源自或修飾自重組或設計的(基因改造的) DNA聚合酶，包括但不限於嵌合DNA聚合酶、融合DNA聚合酶或另一種修飾DNA聚合酶。通常，與親本聚合酶相比，修飾DNA聚合酶具有至少一種改變的表型。突變如在本文中所使用的，術語「突變」是指引入到親本序列中的變化，包括但不限於取代、插入、缺失(包括截短)。突變的結果包括但不限於產生在由親本序列編碼的蛋白質中並不存在的新特性、性能、功能、表型或性狀。在本文中，術語「突變」可與「改變」互換使用。突變體如在本文中所使用的，術語「突變體」是指修飾的蛋白質，當與親本蛋白質相比時，所述修飾的蛋白質呈現改變的特性。連接如在本文中所使用的，「連接」是指本領域已知的用於功能上連接多肽域的任何方法，包括但不限於重組融合(有或沒有間隔域)、中間介導(inter-mediated)融合、 非共價締合、以及共價鍵合(結合)，包括二硫鍵合(結合)、氫鍵合、靜電鍵合、以及構象鍵
I=I ο核苷酸如在本文中所使用的，是指由糖部分(戊糖)、磷酸酯、以及含氮雜環鹼基構成的DNA或RNA的單體單元。鹼基經由糖苷碳(戊糖的1'碳)而連接至糖部分，以及鹼基和糖的組合是核苷。當核苷包含結合於戊糖的3』或5』位置的磷酸酯基團時，它被稱作核苷酸。可操作上連接的核苷酸的序列在本文中通常稱作「鹼基序列」或「核苷酸序列」，並且在本文中由這樣的式表示，其左方向到右方向是在5』 -末端至3』 -末端的常規方向。核酸增補染料如在本文中所使用的，術語「核酸增補染料」是指任何這樣的分子，所述分子以可逆的、非共價方式通過插入雙螺旋的鹼基對之間來結合於核酸，從而表明核酸的存在和量。通常，核酸增補染料是平面的、芳香族的、環形發色團分子。在一些實施方式中，增補染料包括螢光染料。許多增補染料在本領域中是已知的。一些非限制性的實例包括 PICO GREEN (P-7581, Molecular Probes (分子探針))、EB (E-8751，Sigma)、碘化丙啶(P-4170, Sigma)、吖啶橙(A-6014，Sigma)、7_ 氨基放線菌素 D (A-1310，Molecular Probes)、花青染料(例如，TOTO、YOYO、BOBO、以及 Ρ0Ρ0)、SYTO, SYBR Green I、SYBR Green II,SYBR DX,OliGreen,CyQuant GR,SYTOX Green、SYT09、SYT010、SYTO 17、SYBR14、FUN_1、 DEAD Red, Hexidium Iodide、二氫乙錠、乙啡啶同質二聚體、9-氨基-6-氯-2-甲氧基吖啶、0々 1、01 1、吲哚染料、咪唑染料、放線菌素0、羥芪巴脒、以及0^ 751(美國專利號 6，210，885)、Β0ΧΤ0>LC Green、Evagreen、Bebo0寡核苷酸或多核苷酸如在本文中所使用的，術語「寡核苷酸」定義為這樣的分子， 該分子包括兩個或更多個脫氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸，優選多於三個。它的確切尺寸將取決於許多因素，其又取決於寡核苷酸的最終功能或用途。可以合成或通過克隆來獲得寡核苷酸。如在本文中所使用的，術語「多核苷酸」是指這樣的聚合物分子，該聚合物分子由在鏈中共價結合的核苷酸單體組成。DNA(脫氧核糖核酸)和RNA(核糖核酸)是多核苷酸的實例。聚合酶如在本文中所使用的，「聚合酶」是指催化核苷酸的聚合(即，聚合酶活性)的酶。通常，該酶將在退火至多核苷酸模板序列的引物的3』-端開始合成，並繼續向著模板鏈的5』端。「DNA聚合酶」催化脫氧核苷酸的聚合。引物如在本文中所使用的，術語「引物」是指這樣的寡核苷酸，無論是天然存在的或是合成產生的，當被放置在其中誘導引物延伸產物(該引物延伸產物互補於核酸鏈)的合成的條件下，例如，在適當緩衝液(「緩衝液」包括PH、離子強度、輔因子(協同因子)等) 中存在四種不同三磷酸核苷和耐熱酶的條件下並在適當的溫度下，該寡核苷酸能夠作為核酸合成的起始點。引物優選為單鏈，以獲得擴增的最高效率，但可以可替換地是雙鏈。如果是雙鏈，則在用來製備延伸產物以前首先處理引物以分開其鏈。優選地，引物是寡脫氧核糖核苷酸。引物必須足夠長以在耐熱酶存在的條件下引發延伸產物的合成。引物的準確長度將取決於許多因素，包括溫度、引物源以及方法的使用。例如，取決於靶序列的複雜性，寡核苷酸引物通常包含15-25個核苷酸，雖然它可以包含更多或更少的核苷酸。短引物分子通常需要較低的溫度以與模板形成足夠穩定的雜交複合物。持續合成能力如在本文中所使用的，「持續合成能力」是指聚合酶保持附著於模板以及進行多種修飾反應的能力。「修飾反應」包括但不限於聚合、以及核酸外切剪切。在一些實施方式中，「持續合成能力」是指DNA聚合酶進行一系列聚合步驟而沒有幹預酶與增長DNA鏈的解離的能力。通常，DNA聚合酶的「持續合成能力」是通過核苷酸的長度(例如 20nts,300nts,0. 5-11Λ、或更長)來測量，其中對核苷酸進行聚合或修飾而沒有幹預DNA聚合酶與增長DNA鏈的解離。「持續合成能力」可以取決於聚合酶的特性、DNA模板的序列、 以及反應條件，例如，鹽濃度、溫度或特定蛋白質的存在。如在本文中所使用的，術語「高持續合成能力」是指與模板的高於20nts (例如，高於40nts、60nts、80nts、100nts、120nts、140nts、160nts、180nts、200nts、220nts、240nts、260nts、280nts、300nts、320nts、340nts、 360ntS、380ntS、400ntS、或更高)/締合/解離的持續合成能力。可以按照在本文中以及在 WO 01/92501A1中所定義的方法來測量持續合成能力。合成如在本文中所使用的，術語「合成」是指用於以模板依賴性方式來製備多核苷酸的新鏈或延伸現有的多核苷酸(即，DNA或RNA)的任何體外方法。根據本發明，合成包括擴增，藉助於使用聚合酶，所述擴增可以增加多核苷酸模板序列的拷貝數。多核苷酸合成(例如，擴增)導致核苷酸加入到多核苷酸(即，引物)中，從而形成與多核苷酸模板互補的新的多核苷酸分子。形成的多核苷酸分子和它的模板可以用作模板來合成另外的多核苷酸分子。如在本文中所使用的，「DNA合成」包括但不限於PCR、多核苷酸的標記(即，用於探針和寡核苷酸引物)、多核苷酸測序。模板DNA分子如在本文中所使用的，術語「模板DNA分子」是指這樣的核酸鏈，通過DNA聚合酶例如在引物延伸反應中從其合成互補核酸鏈。模板依賴性方式如在本文中所使用的，術語「模板依賴性方式」是指這樣的方法， 所述方法涉及引物分子的模板依賴性延伸(例如，通過DNA聚合酶的DNA合成)。術語「模板依賴性方式」通常是指RNA或DNA的多核苷酸合成，其中通過眾所周知的互補鹼基配對規則來決定新合成的多核苷酸鏈的序列(參見，例如，Watson, J.D. et al.，In =Molecular Biology of the Gene,4th Ed. , W. A. Benjamin, Inc. , Menlo Park, Calif. (1987))。耐熱酶如在本文中所使用的，術語「耐熱酶」是指這樣的酶，所述酶對於加熱是穩定的(也被稱為耐熱)並催化(促進)核苷酸的聚合以形成與多核苷酸模板序列互補的引物延伸產物。通常，在熱循環過程中耐熱的穩定的聚合酶是優選的，其中在PCR循環過程中通過曝露於高溫(例如，約95°C)來使雙鏈核酸變性。本文描述的有效用於PCR擴增反應的耐熱酶滿足至少一個標準，即，當經受升高的溫度為實現雙鏈核酸變性所必需的時間時， 該酶並沒有被不可逆地變性(滅活)。用於本文目的的不可逆變性是指酶活性的永久和完全喪失。變性必需的加熱條件將取決於，例如，緩衝鹽濃度以及待變性核酸的長度和核苷酸組成，但通常在約90°C至約96°C的範圍內，時間主要取決於溫度和核酸長度，通常為約0. 5 至10分鐘。當增加緩衝鹽濃度和/或核酸的GC組成時，可以容忍更高的溫度。在一些實施方式中，在約90°C -100°C下，耐熱酶將不會被不可逆地變性。通常，適用於本發明的耐熱酶具有它發揮作用的高於約40°C的最佳溫度，其是這樣的溫度，在低於上述溫度下可以促進引物與模板的雜交，雖然，取決於(1)鎂和鹽濃度以及(2)引物的組成和長度，可以在更高溫度(例如，45°C-70°C)下發生雜交。用於酶的最佳溫度越高，則引物導向(導向，引導)的延伸過程的特異性和/或選擇性越高。然而，低於40°C (例如，在37°C下)具有活性的酶也在本發明的範圍內，只要它們是熱穩定的。在一些實施方式中，最佳溫度在約50°C 至90°C (例如，60°C-80°C )的範圍內。野生型如在本文中所使用的，術語「野生型」是指這樣的基因或基因產物，所述基因或基因產物當與天然存在的源分離時具有基因或基因產物的特性。
具體實施例方式本發明尤其是提供了包含胺基酸改變的修飾DNA聚合酶(例如，A型DNA聚合酶)， 上述改變基於在用來選擇更好適合應用於重組DNA技術的酶的定向進化實驗中所確定的突變。如在實施例部分中所描述的，本發明的發明人通過模仿典型的或較不典型的環境和條件已成功開發了定向DNA聚合酶進化實驗，在所述環境和條件下酶通常用於或期望用於現實生活的(真實的)工業或研究應用。如在實施例中所描述的，在選擇過程期間已觀測到各種突變(參見表2、。許多突變賦予與酶特性有關的優點，包括但不限於表達效率、可溶性和摺疊穩健性、熱穩定性、聚合活性、持續合成能力、速度(延伸率)、濃度穩健性、抗雜質性、對化學添加劑的抗性、保真性、引物二聚體的避免性、鏈置換活性、改變的核酸酶活性、核苷酸選擇性、以及與DNA聚合過程有關的其它性能和特性。可以設想，本文確定的突變賦予各種表型，所述表型可以使DNA聚合酶更好適合應用於重組DNA技術。例如，根據本發明確定的突變可以賦予與本文描述的選擇優勢有關的酶表型。確實，本發明的發明人已確定或預期確定突變聚合酶，所述突變聚合酶表達很好，更可溶，其呈現更高活性、保真性、持續合成能力和/或速度，其在廣泛的濃度範圍內具有活性，其耐鹽、耐PCR添加物(例如，PCR增強子)和/或耐抑制劑，其在廣泛的濃度範圍內工作並具有更高保真性、以及不能立即測量的其它表型。因為許多這些表型可以取決於 DNA和聚合酶相互作用的方式，所以設想，根據本發明確定的許多突變可以影響DNA-聚合酶結合特性。另外，設想，根據本發明確定的突變可以賦予並不直接與本文描述的選擇優勢有關的酶表型。例如，一些表型可以並沒有賦予優點，而僅僅是有利突變的副作用。此外，一些突變體可以呈現能夠被認為是不利的表型。例如，一些突變賦予優點(例如，高活性)，但這種優點是有代價的(例如，高錯誤率)。如果優點超過缺點，則將仍然選擇上述突變。這樣的突變可能具有商業用途。例如，低保真性酶能夠用於易錯PCR(例如，用於誘變)。示例性突變和包含與特定表型有關的突變的組合的突變克隆描述在實施例部分中並且至少示出在表3、4、5、8、12、以及15中。進一步設想，因為許多DNA聚合酶具有類似序列、結構以及功能域，所以本文確定的突變和/或發生突變的位置可以作為通常用來修飾DNA聚合酶的基礎。例如，可以在各種 DNA聚合酶中的相應位置引入相同或類似突變、以及其它改變，以產生更好適用於重組用途的修飾酶。DNA聚合酶根據本發明的DNA聚合酶可以修飾自任何類型的DNA聚合酶，包括但不限於天然存在的野生型DNA聚合酶、重組DNA聚合酶或設計的DNA聚合酶如嵌合DNA聚合酶、融合 DNA聚合酶、或其它修飾DNA聚合酶。在特定實施方式中，適用於本發明的DNA聚合酶是耐熱DNA聚合酶(能夠PCR)。天然存在的DNA聚合酶在一些實施方式中，適用於本發明的天然存在的DNA聚合酶是A型DNA聚合酶(還稱作家族A DNA聚合酶)。A型DNA聚合酶基於與大腸桿菌聚合酶I的胺基酸序列同源性加以分類(Braithwaite and Ito, Nuc. Acids. Res. 21 :787-802,1993)，並且包括大腸桿菌(E.C0li)p0l I、棲熱水生菌DNA pol I (Taq聚合酶)、黃棲熱菌DNA pol I、 肺炎鏈球菌(Sti^ptococcus pneumoniae)DNA pol I、嗜熱脂肪芽胞桿菌(Bacillusstearothermophilus)pol I、噬菌體聚合酶T5、噬菌體聚合酶T7、線粒體DNA聚合酶pol γ、 以及以下描述的另外的聚合酶。家族A DNA聚合酶可商購獲得，包括Taq聚合酶(New England BioLabs)、大腸桿菌 pol I (New England BioLabs)、大腸桿菌 pol I 克列諾夫片段(New England BioLabs)、 T7DNA聚合酶(New England BioLabs)、以及嗜熱脂肪芽胞桿菌(Bst)DNA聚合酶(New England BioLabs)。適宜的DNA聚合酶還可以源自細菌或其它生物體，其具有類似於期望測定溫度的最佳生長溫度。例如，上述適宜的細菌或其它生物體可以呈現> 80-85°C的最高生長溫度或 > 70-80°C的最佳生長溫度。許多A型DNA聚合酶的序列信息可公開獲得。表1提供了用於示例性A型DNA聚合酶的一系列GenBank登錄號和其它GenBank登錄信息，包括它們所源自的物種。表1.用於一些A型DNA聚合酶的序列登錄信息嗜熱月旨肪土芽抱桿菌(Geobacillus stearothermophi lus)登錄(號);3BDP_A版本3BDP_A GI :4389065DBS0URCE pdb 分子!3BDP，鏈 65,2007 年 8 月 27 日發布。Natranaerobius thermophilus Jff/NM-ffN-LF登錄(號)ACB85463版本ACB85463.1GI :179351193DBS0URCE 登錄(號)CPOO1034. 1嗜熱棲熱菌 HB8 (Thermus thermophilus HB8)登錄(號)P52028版本P52028.2GI :62298349DBS0URCE蛋白序列資料庫基因座DP01T_THET8，登錄(號)P52028嗜熱棲熱菌(Thermus thermophilus)登錄(號)P30313版本P30313.1GI :232010DBS0URCE蛋白序列資料庫基因座DP01F_THETH，登錄(號)P30313Thermus caldophilus登錄(號)P80194版本P80194.2GI :2506365DBS0URCE蛋白序列資料庫基因座DP01_THECA，登錄(號)P80194絲狀棲熱菌(Thermus filiformis)登錄(號)052225版本052225.1GI :3913510DBS0URCE蛋白序列資料庫基因座DP01_THEFI，登錄(號)052225絲狀棲熱菌(Thermus filiformis)登錄(號)AARl1876版本AAR11876.1GI :38146983
DBS0URCE 登錄(號)ΑΥ247645· 1棲熱水生菌(Thermus aquaticus)登錄(號)P19821版本P19821.1GI :118828DBS0URCE蛋白序列資料庫基因座DP01_THEAQ，登錄(號)P19821Thermotoga lettinga TMO登錄(號)ΥΡ_001469790版本ΥΡ_001469790. 1 GI :157363023DBSOURCE REFSEQ 登錄(號)NC_009828. 1Thermosipho melanesiensis BI429 登錄(號)YP_001307134版本ΥΡ_001307134· 1 GI :150021780DBSOURCE REFSEQ 登錄(號)NC_009616. 1Thermotoga petrophila RKU-I登錄(號)YP_001244762版本 ΥΡ_001244762· 1GI :148270302DBSOURCE REFSEQ 登錄(號)NC_009486. 1海棲熱袍菌 MSB8 (Thermotoga maritima MSB8)登錄(號)NP_229419版本NP_229419. 1GI :15644367DBSOURCE REFSEQ 登錄(號)NC_000853. 1Thermodesulfovibrio yellowstonii DSM 11347登錄(號)YP_002249284版本 YP_002249284. 1GI :206889818DBSOURCE REFSEQ 登錄(號)NC_01U96. 1嗜熱網球菌(Dictyoglomus thermophilum)登錄(號)AARl1877版本AAR11877. 1GI :38146985DBSOURCE 登錄(號)AY247646. 1Geobacillus sp. MKK—2005登錄(號)ABB72056版本 ABB72056.1GI :82395938DBSOURCE 登錄(號)DQ244056. 1熱堅芽胞桿菌(BacilluscaldOtenax)登錄(號)BAA02361版本BAA02361. 1GI :912445DBSOURCE 基因座 BACP0LYTG 登錄(號)D12982. 1Thermoanaerobacter thermohydrosulfuricus登錄(號)AAC85580版本AAC85580. 1GI :3992153
DBS0URCE 基因座 AROO3995 登錄(號)AAC85580. 1Thermoanaerobacter pseudethanolicus ATCC 33223登錄(號)ABY95124版本ABY95124. 1GI :166856716
DBS0URCE 登錄(號)CP000924. 1腸桿菌噬菌體 T5 (Enterobacteria phage T5)登錄(號)AAS77168CAA04580版本AAS77168. 1GI :45775036DBS0URCE 登錄(號)ΑΥ543070· 1腸桿菌噬菌體 Τ7 (Enterobacteria phage T7) (Τ7)登錄(號)ΝΡ_041982版本ΝΡ_041982. 1GI :9627454DBSOURCE REFSEQ 登錄(號)NC_001604. 1適用於本發明的DNA聚合酶包括還未分離的DNA聚合酶。截短的DNA聚合酶在一些實施方式中，適用於本發明的DNA聚合酶包括天然存在的聚合酶的截短的變體(例如，起因於N-末端、C-末端或內部缺失的DNA聚合酶的片段，其保留聚合酶活性)。 適用於本發明的一種示例性截短的DNA聚合酶是KlenTaq，其包含部分的5』至3』外切核酸酶域的缺失(參見，Barnes W. Μ. (1992) Gene 112 :29-35 ；以及 Lawyer F. C. et al. (1993) PCRMethods and Applications,2 :275_287)。嵌合DNA聚合酶在一些實施方式中，適用於本發明的嵌合DNA聚合酶包括任何這樣的DNA聚合酶， 所述DNA聚合酶包含源自兩種或更多種不同DNA聚合酶的序列。在一些實施方式中，適用於本發明的嵌合DNA聚合酶包括嵌合DNA聚合酶，如在同一日期提交的題目為「Chimeric DNA polymerases(嵌合DNA聚合酶)」的共同未決申請中所描述的，將其披露的內容由此以引用方式結合於本文。適用於本發明的嵌合DNA聚合酶還包括在美國
發明者保羅·邁克瓦恩, 加文·拉什, 威廉·布爾恩, 約翰·弗斯科特, 馬裡克·阿普勒 申請人:卡帕生物系統