玉米細胞質雄性不育(cms)c型恢復系rf4基因、分子標誌物及其用途的製作方法

2023-11-11 02:57:17 2

專利名稱：玉米細胞質雄性不育(cms)c型恢復系rf4基因、分子標誌物及其用途的製作方法
技術領域：
本公開內容涉及植物能育性基因。在一些實施方案中，公開內容涉及Rf4，即能育性基因的玉米恢復系。在具體的實施方案中，公開內容涉及用於對C型細胞質雄性不育(CMS-C)恢復能育性的組合物和方法，其例如通過使用與Rf4基因連鎖的，或駐留(residing)於Rf4基因內的分子標誌物來進行。具體實施方案涉及使用特定核酸序列來鑑定包含CMS-C的能育性恢復系 的植物，及用於雜種種子生成的方法。一些具體的實施方案涉及與CMS-C的能育性恢復有關的多肽。
背景技術：
雜種植物育種的開發已經使得有可能在生產作物的質量和數量方面獲得相當大的進展。產量增加和期望特徵(諸如對疾病和昆蟲的抗性、熱和乾旱耐受性、和植物組成的變化)的組合部分由於雜交規程而均是有可能的。雜交規程依賴於對雌性親本植物貢獻來自雄性親本植物的花粉以生成所得的雜種。如果來自一朵花的花粉轉移到同一植物的同一或另一朵花，那麼植物可以自花傳粉。如果花粉起源於來自不同植物的花，那麼植物可以異花授粉。可以通過自花傳粉和異花授粉技術兩者育種玉米植物(玉蜀黍(Zea mays))。玉米植物具有雄花(其位於雄穗(tassel)上)和雌花(其位於同一植物的穗上)。在來自雄穗的花粉達到存在於接受穗頂部的絲時發生玉米中的天然傳粉。玉米雜種的形成依賴於雄性不育系統。玉米雜種的形成需要純合近交系的形成、這些品系的雜交、以及雜交的評估。譜系育種和輪迴選擇是用於從群體形成近交系的兩種育種方法。育種程序將來自兩種或更多種近交系或各種廣泛來源的期望性狀組合到育種集合中，通過自交和期望表型的選擇從所述育種集合開發新的近交系。雜種玉米品種是兩種此類近交系的雜交，每種所述近交系可以具有一種中缺乏或互補另一種的一種或多種期望的特徵。將新的近交植物與其它近交系雜交，並評估來自這些雜交的雜種以測定哪些是期望的。來自第一代的雜種後代稱作K。在雜種的開發中，僅尋求匕雜種。F1雜種通常比其近交親本更有力。例如，此雜種活力(稱作雜種優勢)通常導致增加的營養生長和增加的產量。可以通過摻入手動去雄的雄性不育系統生成雜種玉米種子。為了生成雜種種子，將雄穗從生長中的雌性近交親本除去，所述雌性近交親本可以與雄性近交親本以各種交替行樣式種植。因此，倘若從外來玉米花粉有足夠的分離，雌性近交物的穗僅會用來自雄性近交物的花粉受精。所得的種子是雜種F1種子。
手動去雄是勞動密集的且昂貴的。手動去雄還經常是無效的，例如因為植物發育中的環境變化可以導致完成雌性親本植物的手動去雄後植物雄穗抽穗(tasseling)，或者因為去雄者(detasseler)不可能完全除去雌性近交植物的雄穗。若去雄是無效的，則雌性植物會成功脫落花粉，並且一些雌性植物會自花傳粉。這會導致雌性近交物的種子與正常生成的雜種種子一起收穫。雌性近交物種子不如F1種子那樣多產。另外，雌性近交物種子的存在可以對雜種種子生產者呈現種質安全性風險。也可以通過機器將雌性近交植物機械去雄。機械去雄大致與手動去雄一樣可靠，但是更快且不太昂貴。然而，大多數去雄機器比手動去雄對植物產生更多損傷。如此，沒有去雄形式目前是完全令人滿意的。遺傳雄性不育是一種可以在雜種種子生成中使用的備選方法。可以通過使用細胞質雄性不育(CMS)近交植物在一些基因型中避免費力的去雄過程。與核基因組形成對比，在缺乏能育性恢復系基因的情況下，CMS近交物植物由於源自細胞質的因素而雄性不育。因此，雄性不育的特徵經由玉米植物中的雌性親本而得到專門遺傳，因為僅雌性對受精種子提供細胞質。用來自非雄性不育的另一近交物的花粉使CMS植物受精。來自第二近交物的花粉可以貢獻或沒有貢獻使雜種植物雄性不育的基因。通常，必須混合來自去雄正常玉米的種子和相同雜種的CMS生成的種子以保證足夠的花粉負荷在種植雜種植物時可用於受精,並且確保細胞質多樣性。CMS作為生成雜種種子的系統的缺點包括CMS的特定變體與對某些作物疾病的易感性的關聯。參見例如Beckett (1971) Crop Sciencell: 724-6。特別地,此問題已經阻礙CMS-T變體在雜種玉米種子的生產中使用，而且一般地，已經對CMS在玉米中的使用具有負面影響。細胞質雄性不育(CMS)是母系遺傳的沒有生成功能性花粉的能力。已經發現了超過40種CMS來源，並且根據玉米中差異的能育性恢復反應而分成三大組。這些組稱為CMS-T (Texas)、CMS-S(USDA)和 CMS-C (Charrua)。Beckett (1971)。在 CMS-T 組中，兩種顯性基因Rfl和Rf2 (其分別位於 染色體3和9上)是花粉能育性的恢復需要的。Duvick (1965)Adv.Geneticsl3:1-56。S-細胞質通過單一基因Rf3 (其已經在染色體2中定位)恢復。Laughnan and Gabay(1978) 「Nuclear and cytoplasmic mutations to fertility in Smale-sterile maize,，』in Maize Breeding and Genetics, PD.427—446。與CMS-T和CMS-S相比，已經發現了 CMS-C的能育性恢復在先前的分析中是非常複雜的。Duvick(1972)，「Potential usefulness of new cytoplasmic 雄性 sterile andsterility system,，，於 Proceeding of the27th annual corn and sorghum researchconference, pp.197-201，發現了 CMS-C中能育性的完全恢復受到Rf4基因的顯性等位基因控制。Khey-Pour等(1981)還發現了此基因對於CMS-C恢復是足夠的。然而，Josephson 等(1978), 「Genetics and inheritance of fertility restoration of 雄性 sterile cytoplasms in corn, 」 於 Proceedings of the33rd corn and sorghumresearch conference : 13,提出CMS-C中能育件的完全恢復以兩種某閔Rf4和Rf5 (其後來已經分別在染色體8和5上定位)的顯性等位基因的互補作用為條件。Sisco (1991) CropSc1.31:1263-6。同時，Chen 等(1979) Acta Agronom.Sin.5 (4): 21-28 認為 CMS-C 中的兩種顯性恢復系基因具有重複功能。使該系統進一步複雜，Vidakovic (1988)，Maydica33:51-65證明CMS-C中能育性的完全恢復存在三種顯性且互補的基因，添加基因Rf6。Vidakovic等，(1997a)Maize Genet.Coop.News Lett.71:10; (1997b)Maydica42:313-6後來報告了這些互補基因Rf4、Rf5、和Rf6實際上不是玉米CMS-C中能育性恢復的唯一遺傳系統。如此，CMS-C的能育性恢復機制仍然沒有解決。因此，難以為一些基因型不育系選擇恢復系品系。分子標誌物特別可用於加速經由回交將基因或數量性狀基因座(QTL)導入良種栽培種或育種系中的方法。可以使用與基因連鎖的標誌物來選擇擁有期望性狀的植物，並且可以使用遍及基因組的標誌物來選擇在遺傳上與回歸親本相似的植物(Young and Tanksley(1989)Theor.App1.Genet.77:95-101; Hospital 等(1992)Geneticsl32:1199-210)。已經經由基於圖譜的克隆策略克隆出大多數植物能育性恢復系基因。至今，已經從幾種植物物種分離出9種Rf基因，所述植物物種包括玉米(玉蜀黍)(Cui等(1996)Science272:1334-6;Liu 等(2001)Plant Celll3:1063-78)、矮牽牛(Petunia)(碧冬爺(Petunia hybrida))(Bentolila 等(2002)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA99:10887-92)、蘿蔔(蘿蔔(Raphanus sativus L.)) (Brown 等(2003) Plant J.35:262-72; Desloire等(2003)EMBO R印.4:1-7;Koizuka 等(2003)Plant J.34:407-15)、高粱(高粱(Sorghum bicolor L.)) (Klein 等(2005)Theor.Appl.Genet.1ll:994-1012)> 稻(稻(Oryza sativa L.)) (Kazama and Toriyama(2003)FEBS Lett.544:99-102;Akagi 等(2004)Theor.Appl.Genet.108:1449-57;Komori 等(2004)Plant J.37:315-25;Wang等(2006)Plant Cell 18:676-87;及 Fujii and Toriyama(2009)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA106 (23):9513-8)、和溝酸眾(Mimulus guttatus) (Barr and Fishman(2010)Geneticsl84:455-65)。除了玉米中的Rf2和稻中的Rf 17外，所有鑑定的恢復系基因編碼不同三角狀五肽重複(pentatricopeptide repeat, PPR)蛋白質。植物基因組編碼幾百種PPR蛋白，它們有許多牽涉調節細胞器基因表達。Lurin等(2004)Plant Celll6:2089-103;及Schmitz-Linneweber and Small (2008) Trends Plant Sc1.12:663-70。PPR蛋白含有 35 個氛基酸(稱作 PPR 基序)的 2 至 27 個重複。Small and Peeters, (2000) Trends Biochem.Sc1.25(2): 46-7ο 預測 PPR 蛋白結合 RNA (Delannoy 等(2007) Biochemical SocietyTransactions35:1643-7)，並且許多PPR蛋白靶向至線粒體，在那裡定位CMS關聯基因和產物。Lurin等(2004)，見上文。證據提示了 PPR蛋白直接結合CMS轉錄物。Akagi等(2004)，見上文；Gillman 等(2007)Plant J.49:217-27;及 Kazama 等(2008)Plant J.55:619-28。Rf蛋白通過改變其加工樣式(Kazama&Toriyama(2003)，見上文),降低RNA穩定性(Wang等(2006)，見上文;及Ohta等(2010) Plant Cell R印.29:359-69)，或者阻止它們被翻譯(Kazama等(2008)，supra)來降低CMS關聯轉錄物的表達。關於來自玉米、稻、矮牽牛、和蘿蔔的能育性基因的恢復系的更多信息可以參見美國專利申請流水號 US2006/0253931，and in U.S.Patent Nos.5，981，833; 5，624，842;4, 569，152; 6，951，970; 6, 392，127; 7，612，251; 7，314，971; 7, 017，375; 7，164，058;和5，644，066。發明概述

本文中描述了將玉米Rf4基因座定位至位於染色體8頂部的小的12kb區。在此區內，Rf4的唯一可能的候選物是編碼bHLH轉錄因子的基因。通過從CMS-C非恢復系和恢復系品系克隆Rf4_bHLH基因座，鑑定出許多序列變異。在蛋白質水平，CMS-C系和非恢復系品系都具有相同的序列，並且與恢復系等位基因(也彼此相同)相差4處胺基酸變化(4amino-acid changes),包括bHLH域內的保守的、親水性酪氨酸殘基(Y186),其改變為恢復系品系中疏水性本丙氣Ife殘基(F187)。在本文中鑑定出玉米Rf4基因及其編碼多肽，並且另外描述了包含Rf4基因序列的核酸分子。令人驚訝地，Rf4基因不是一種三角狀五肽重複(PPR)蛋白質基因，幾乎所有其它能育性恢復系基因亦然。此外，證明了本發明的CMS-C/Rf4系統種質中的能育性恢復受到作為單一顯性恢復系基因的Rf4控制，這由於幾個小組的新近工作而是意想不到的。參見，上文。玉米rf4-bHLH的bHLH域內的親水性酪氨酸殘基(Y186)(其在恢復系品系中改變為疏水性苯丙氨酸殘基(F187))在單子葉植物間是保守的。如此，Rf4基因和Rf4基因標誌物的鑑定可以極大地促進在植物種質中廣泛開發和部署CMS-C能育性恢復性狀。在實施方案中，rf4-bHLH第186位保守酪氨酸殘基突變為疏水性胺基酸殘基(例如，苯丙氨酸)造成Rf 4-bHLH多肽中的恢復系表型。如此，本文中描述了在所述位置(如通過序列比對鑑定的)處編碼疏水性胺基酸殘基的玉米Rf 4-bHLH或玉米Rf 4-bHLH基因的直向同系物，其中這些基因在導入植物中時促成CMS-C表型的恢復系。本文中描述了與玉米Rf4基因連鎖(例如，連鎖；緊密連鎖；或極端緊密連鎖)或駐留於玉米Rf4基因內的核酸分子標誌物。在一些實施方案中，可以使用與玉米Rf4基因連鎖(例如，連鎖；緊密連鎖；或極端緊密連鎖)或駐留於玉米Rf4基因內的標誌物，或玉米Rf4基因序列自身將玉米Rf4基因導入生物體，例如植物(例如，玉米和其它單子葉植物)中。 本文中還描述了使用與Rf4基因連鎖或駐留於Rf4基因內的核酸分子標誌物(例如但不限於)以鑑定具有C型CMS的功能性恢復系基因的植物；以將Rf4導入新的植物基因型(例如，經由標誌物輔助育種或遺傳轉化進行)；以及以從包含與Rf4基因連鎖或駐留於Rf4基因內的核酸分子標誌物的雄性植物和攜帶C型CMS的雌性植物雜交生成雜種種子的方法。進一步描述了用於對CMS-C玉米恢復能育性的手段，以及用於鑑定攜帶對CMS-C玉米恢復能育性的基因的植物的手段。在一些例子中，用於對CMS-C玉米恢復能育性的手段可以是與玉米Rf4基因連鎖(例如，連鎖；緊密連鎖；或極端緊密連鎖)或駐留於玉米Rf4基因內的標誌物。在一些例子中，用於鑑定攜帶對CMS-C玉米恢復能育性的基因的植物的手段可以是探針，該探針與同玉米Rf4基因連鎖(例如，連鎖；緊密連鎖；或極端緊密連鎖)或駐留於玉米Rf4基因內的標誌物特異性雜交。本文中還描述了可以從包含與玉米Rf4基因連鎖(例如，連鎖；緊密連鎖；或極端緊密連鎖)或駐留於玉米Rf4基因內的核酸分子標誌物的雄性植物和攜帶C型CMS的雌性植物雜交生成雜種種子的方法。此類雜種種子的生成由於消除手動或機械去雄而可以導致成本節約，而且可以進一步提高種子產量。進一步描述了使用本文中公開的核酸分子來鑑定來自與玉米不同的植物物種的同源Rf4序列的方法(例如，通過序列比較來進行)。在一些實施方案中，在與玉米不同的植物物種中工程化改造雜種種子生成的CMS-C/Rf4系統。
附圖簡述

圖1包括測定為在Rf4基因區內的197種SNP標誌物及其物理圖譜位置。圖2包括34個隨機選擇的重組植物，及其表型數據和27種SNP標誌物的相應遺傳數據的表示。 圖3包括染色體8上的Rf4基因和1.5Mb區內的基因的SNP標誌物的相對位置的表不。圖4包括染色體8上的Rf4基因和0.56Mb區和IOOkb區內的基因的SNP標誌物的相對位置的表示。圖5包括Rf4精細定位至12kb區的表示。字母指示基因型:A=BE4207 (CMS)純合的；H=雜合的。箭頭指示Rf4左側和右側邊界標誌物，以及兩種最重要的重組植物。圖6包括Rf4_bHLH等位基因的基因組結構的草圖描繪，其顯示了整個編碼區(起始至終止，1.38kb)、1.lkb5，UTR/ 啟動子、和 0.75kb3，UTR/ 終止子。圖7包括來自下列玉米基因型的Rf 4-bHLH的序列比對:B73; BE4207; B104; XJH58; BE9515;和 MLW03。翻譯起始、終止、和位於基因內的 DAS-CMS21到DAS-CMS34的標誌物位置是標記的。SNP和InDel的位置是加陰影的。圖8包括來自下列玉米基因型的Rf 4-bHLH cDNA的預測序列比對:B73;BE4207;B104;XJH58;BE9515;和 MLW03。翻譯起始、終止、和位於 cDNA 內的DAS-CMS22-25、28-29、和31的標誌物位置是標記的。圖9包括預測的Rf 4-bHLH蛋白質序列比對。保守的bHLH域、核定位信號(NLS)的位置、和DAS-CMS22、·23、和28的相應標誌物位置是標記的。bHLH域中的Tyr至Phe取代是通過與標誌物DAS-CMS24 (參見圖8和表3中的多態性ID54)緊密相鄰的(B73預測cDNA序列)第747位的AC至TT 二核苷酸取代引起的。圖10包括顯示Rf4-HLH表達樣式的數據。Ll=5周葉，L2=7周葉，L3=9周葉，T=具有形成中的花葯和花粉的雄穗，P=脫落的花粉。A=BE4207純合的，H=雜合的，B=XJH58純合的。數據代表分離的F3的每種基因型的三個植物和親本各I個植物的均值。誤差棒代表標準差。圖11包括玉米Rf 4-bHLH(來自恢復系XJH58和非恢復系BE4207)與來自其它單子葉物種的其直向同系物的比對。保守的bHLH域的位置是加下劃線的。XJH58Rf4-bHLH和BE4207Rf4-bHLH之間的4處胺基酸變化是標記的。序列表所附序列表中列出的核酸序列使用核苷酸鹼基的標準字母縮寫顯示，如37C.F.R.§ 1.822中限定的。僅顯示每種核酸序列的一條鏈，但是應當理解通過對展示鏈的任何提及包括互補鏈。為了簡單，在描述基因或基因座時，基因可以通過基因的突變體形式(例如Rf4，與rf4形成對比)描述，即使實質序列可以是相應基因組位置處的野生型基因形式。不過，應當理解兩種等位基因都具有不同序列，而且意指哪種等位基因從上下文看正會是清楚的。在所附序列表中:SEQ ID NO: 1-197顯示了與玉米Rf4基因連鎖(例如，連鎖；緊密連鎖；或極端緊密連鎖)或駐留於玉米Rf4基因內的標誌物的例示性核苷酸序列。SEQ ID NO: 198-211顯示了玉米染色體8頂部的約0.56Mb區內最初定位Rf4等位基因的核苷酸序列。SEQ ID NO:203是Rf 4-bHLH等位基因。SEQ ID NO:212-216代表CMS(BE4207)和恢復系(XJH58)玉米品系之間的例示性核苷酸序列差異。SEQ ID NO: 217顯示了來自玉米品種B73的約12kb間隔中精細定位Rf4等位基因的核苷酸序列。SEQ ID N0:218顯示了來自玉米品種B73和BE4207的rf4_bHLH等位基因的核苷酸序列。SEQ ID NO: 219顯示了來自玉米品種B104的bHLH等位基因的核苷酸序列。SEQ ID NO: 220 顯示了來自玉米品種 XJH58、BE9515、和 MLW03 的 Rf4_bHLH 等位基因的核苷酸序列。SEQ ID N0:221顯示了來自玉米品種B73和B4207的預測rf4_bHLH cDNA的核苷酸序列。SEQ ID NO:222顯示了來自玉米品種B104的預測bHLH cDNA的核苷酸序列。SEQ ID N0:223 顯示了來自玉米品種 XJH58、BE9515、和 MLW03 的預測 Rf4-bHLHcDNA的核苷酸序列。SEQ ID N0:224顯示了預測的玉米rf4_bHLH多肽的胺基酸序列。SEQ ID NO: 225顯示了預測的玉米Rf4_bHLH多肽的胺基酸序列。SEQ ID NO:226 顯不了預測的二穗短柄草(Brachypodium distachyon)rf4-bHLH多肽的胺基酸序列。 SEQ ID NO: 227顯示了預測的高粱(Sorghum bicolor)rf4_bHLH多肽的胺基酸序列。SEQ ID NO:228顯示了預測的稻(Oryza sativa)rf4_bHLH多肽的胺基酸序列。SEQ ID NO:229和230顯示了 Rf4_bHLH中預測的核定位信號(NLS)。發明詳述1.幾個實施方案的概述本文中描述了影響植物中雄性能育性的基因，即玉米Rf4及其緊密連鎖的遺傳標誌物(其在用於控制雄性能育性的多個系統中可以是有用的)的具體實施方案。此夕卜，公開的緊密連鎖的遺傳標誌物中固有的多態性容許植物育種人員在分離群體中追蹤基因的特定等位基因，即Rf4或rf4。Rf4基因最初在自四種玉米栽培種的雜交:BE4207xBE9515;BE4207x MLW03F;和BE4207x XJH58衍生的三個群體中定位至染色體8。舉例而言，在群體BE4207x XJH58中證明精細定位和基於圖譜的克隆，最終在約12kb內定位Rf4基因。多年以來，細胞質雄性不育(CMS)的恢復在雜種種子的生成中是一種常見的農業實踐。與細胞質雄性不育一起使用能育性恢復系基因(Rf)簡化種子生成程序，而且通過完全消除手動和機械去雄而降低總體成本。然而，尚未認識到對雜種種子生成應用玉米C型細胞質雄性不育的能育性恢復的遺傳學的全部益處，因為關於玉米C型細胞質雄性不育的能育性恢復遺傳學的先前研究產生矛盾的結果。鑑於細胞質雄性不育和花粉能育性恢復在玉米雜種種子生成中的實踐意義，以及細胞質來源多樣化的必要性，描述了通過使用分子標誌物及KASPar 基因型分型技術將CMS-C的玉米Rf4恢復系基因精細定位到非常小的區域及經由基於圖譜的克隆鑑定玉米Rf4基因。發現了 Rf4是三種玉米近交物:BE9515，MLW03和XJH58中CMS-C的單一顯性恢
復系基因。首先使用SSR和SNP標誌物將Rf4定位至約5.0Mb的區域，從SSR標誌物umc_1075開始至染色體8短臂的頂部。在田間創建具有500個個體的BE4207xXJH58F2確認群體，並在能育性方面評分。用確認群體篩選總共197種SNP標誌物，並在5.0Mb區內鑑定104個重組體。通過為提供信息的重組系比較表型得分和基因型數據，在約0.56Mb (14種基因)的區域內，及可能在100kM6種基因)內肯定鑑定玉米Rf4基因。如此，使用本文中公開的方法的實施方案證明Rf4基因選自下組:GRMZM2G122853(SEQ ID NO:198);AC187051.4_FG005(SEQ ID NO:199);GRMZM2G122851(SEQID NO: 200) ;GRMZM2G 1 22850 (SEQ ID NO: 20 I) ;GRMZM2G582028 ( SE QID NO:202) ;GRMZM2G02I 276 (SEQ ID NO: 203) ;GRMZM2G38 I 376 ( SE QID NO:204) ;GRMZM2G08I 127 (SEQ ID NO: 205) ;GRMZM2G085 I I I ( SE QID NO:206) ;GRMZM2G085038 (SEQ ID NO:207) ;GRMZM2G3I 7468 (SEQ IDNO:208) ;GRMZM2G328030 (SEQ ID NO:209) ;GRMZM2G029450 (SEQ ID N0:210);和GRMZM2G077212(SEQ ID NO:211)。使用約5，000個個體的大的精細定位群體，將玉米Rf4基因座定位至約12kb的小區域，其位於染色體8的頂部。由此，證明Rf4基因選自下組:植物轉座元件[GRMZM2G582028 (SEQ ID NO:202)]和鹼性-螺旋-環-螺旋(bHLH)轉錄因子(GRMZM2G021276 (SEQ ID NO: 203))。在這兩種基因中，Rf4的唯一可能的候選物是鹼性_螺旋-環-螺旋(bHLH)轉錄因子，GRMZM2G021276(SEQ ID NO:203)是Rf4基因。如此，在具體的實施方案中，Rf4基因是GRMZM2G021276(SEQ ID NO: 203)，其有時稱為Rf 4-bHLH。應當理解，Rf4基因也可以是與玉米Rf 4-bHLH基因，例如，SEQ ID NO: 203的編碼序列編碼相同多肽的DNA序列。 從玉米CMS系BE4207;玉米系B104;和三種玉米恢復系品系:XJH58，BE9515,和MLW03克隆bHLH基因座。鑑定出不同近交物間的許多序列變異。值得注意地，三種恢復系品系具有相同的Rf 4-bHLH DNA序列，而B73和BE4207 (其不含功能性Rf4恢復系)是相同的。B104序列與BE4207/B73等位基因比與恢復系等位基因更相似。在蛋白質水平，BE4207、B73、和B104都具有相同序列，並且與恢復系等位基因的基因產物相差4處胺基酸變化，包括用疏水性苯丙氨酸取代bHLH域中的保守的親水性酪氨酸。與花粉能育性恢復中的Rf4功能一致，Rf 4-bHLH的恢復系等位基因在恢復CMS-C的植物的形成中的雄穗(具有花葯和花粉)中特異性表達。玉米CMS系BE4207不施加花葯，也不形成功能性花粉。因此，在來自BE4207植物的葉和雄性生殖組織中檢出非常低的rf4-bHLH表達或沒有檢出rf4-bHLH表達。因為B73( —種既不含CMS-C細胞質也不恢復CMS-C的近交物)具有顯著的rf4-bHLH表達，所以不太可能的是，能育性恢復是由於恢復系等位基因(Rf4-bHLH)和非恢復系等位基因(rf4-bHLH)之間的表達水平差異所致。認為雄性能育性恢復是由於恢復系等位基因和非恢復系等位基因的基因產物之間的胺基酸序列差異所致。具體地，玉米rf4-bHLH的Y186位於bHLHDNA結合域內的第一個螺旋中(Carretero-Paulet 等(2010) Plant Physiol.153:1398-412;及 Piresand Dolan (2010)Mol.Biol.Evo1.27:862-74)，並且此殘基在 B73(非 CMS、非恢復系)、BE4207(CMS、非恢復系)中，及在高粱、稻、和短柄草直向同系物中是絕對保守的。此親水性殘基在三種玉米恢復系品系中改變為疏水性苯丙氨酸(F187)。此類非保守取代可以顯著改變bHLH域中的螺旋結構，並且影響DNA結合和下遊基因轉錄。鑑於前述內容，我們預測來自B104的rf4等位基因沒有恢復CMS-C能育性，因為B104bHLH與B73和BE4207rf4_bHLH具有相同的蛋白質序列，包括第186位的保守酪氨酸。在一些實施方案中，可以使用本文中所描述的基於Rf4_bHLH的或緊密連鎖的高通量分子標誌物來用Rf4恢復系鑑定基因型，將Rf4基因滲入玉米和其它植物中的新基因型中以進行雄性轉化，並從CMS雌性植物除去Rf4。憑藉手邊的標誌物和Rf4基因，現在有可能將Rf4可靠地轉移到良種種質中，以及提高使用CMS-C/Rf4系統進行雜種種子生成的規模。此系統的完全實現可以對農業和其產品的消費者提供重大的財政益處。I1.術語回交:回交方法可以用於將核酸序列導入植物中。幾十年以來已經廣泛使用回交技術來將新性狀導入植物中。Jensen, N.編Plant Breeding Methodology, Johnffiley&Sons, Inc.，1988。在一個典型的回交方案中，將感興趣的初始品種(回歸親本)與攜帶要轉移的感興趣基因的第二品種(非回歸親本)雜交。然後，將來自此雜交的所得後代與回歸親本再次雜交，並重複該過程，直到獲得如下的植物，其中在來自非回歸親本的轉移基因外，在轉化植物中恢復回歸植物的基本上所有期望形態學和生理學特徵。連鎖的、緊密連鎖的、和極端緊密連鎖的:如本文中所使用的，基因或標誌物間的連鎖指染色體上的基因或標誌物顯示一起傳遞到下一代個體的可測量概率的現象。兩種基因或標誌物彼此越接近，此概率變得越接近(I)。如此，術語「連鎖的」可以指以大於0.5的概率(其從獨立分類預期，其中標誌物/基因位於不同染色體上)與某個基因一起傳遞的一種或多種基因或標誌物。因為染色體上的兩種基因或標誌物的接近性與基因或標誌物會一起傳遞到下一代個體的概率正相關，所以術語「連鎖的」在本文中也可以指同一玉米染色體上位於在彼此的約2.0Mb內的一種或多種基因或標誌物。如此，兩種「連鎖的」基因或標誌物可以相隔約 2.1Mb; 2.0OMb;約 1.95Mb;約 1.90Mb;約 1.85Mb;約 1.80Mb;約 1.75Mb;約 1.70Mb;約 1.65Mb;約 1.60Mb;約 1.55Mb;約 1.50Mb;約 1.45Mb;約 1.40Mb;約 1.35Mb;約 1.30Mb;約 1.25Mb;約 1.20Mb;約 1.15Mb;約 1.1OMb;約 1.05Mb;約 1.0OMb;約 0.95Mb;約 0.90Mb;約 0.85Mb;約 0.80Mb;約 0.75Mb;約 0.70Mb;約 0.65Mb;約 0.60Mb;約 0.55Mb;約 0.50Mb;約 0.45Mb;約 0.40Mb;約 0.35Mb;約 0.30Mb;約 0.25Mb;約 0.20Mb;約 0.15Mb;約0.1OMb;約0.05Mb;約0.025Mb;約0.012Mb;和約0.0lMb0與Rf4 「連鎖的」標誌物的具體例子包括玉米基因組的染色體8頂部的核苷酸序列，例如SEQ ID NO: 1-197 ;和本文中稱為多態性ID N0.1-106(表3)的標誌物。如本文中使用的，術語「緊密連鎖的」可以指同一玉米染色體上位於在彼此的約0.5Mb內的一種或多種基因或標誌物。如此，兩種「緊密連鎖的」基因或標誌物可以相隔約0.6Mb;約 0.55Mb; 0.5Mb;約 0.45Mb;約 0.4Mb;約 0.35Mb;約 0.3Mb;約 0.25Mb;約 0.2Mb;約0.15Mb;約0.12Mb;約0.1Mb;和約0.05Mb。與Rf4 「緊密連鎖的」標誌物的具體例子包括 SEQ ID NO: 6-9; SEQ ID NO: 105; SEQ ID NO: 109; SEQ ID NO: 111; SEQ ID NO: 115; SEQID NOs:118-120; SEQ ID NO:123;SEQ ID NO:126;SEQ ID NO:134;SEQ ID NO:135;SEQID NO:137;SEQ ID NO:138;SEQ ID NO:144;SEQ ID NO:149;SEQ ID NO:151;SEQ IDNO:160;SEQ ID NO:163;SEQ ID NO:164;SEQ ID NO:167;SEQ ID NO:173;SEQ IDNO: 177; SEQ ID NO: 178; SEQ ID NO: 183; SEQ ID NO: 189-191;和 SEQ ID NO: 197;和本文中稱為多態性ID N0.1-106(表3)的標誌物。如本文中使用的，術語「極端緊密連鎖的」可以指同一玉米染色體上位於在彼此的約IOOkb內的一種或多種基因或標誌物。如此，兩種「極端緊密連鎖的」基因或標誌物可以相隔約 125kb;約 120kb;約 115kb;約 IlOkb;約 105kb; IOOkb;約 95kb;約 90kb;約 85kb;約 80kb;約 75kb;約 70kb;約 65kb;約 60kb;約 55kb;約 50kb;約 45kb;約 40kb;約 35kb;約 30kb;約 25kb;約 20kb;約 15kb;約 12kb;約 IOkb;約 5kb;和約 lkb。與 Rf4 「極端緊密連鎖的」標誌物的具體例子包括SEQ ID NO: 105; SEQ ID NO: 109; SEQ ID NO: 111; SEQ IDNO: 115; SEQ ID NO: 118-120; SEQ ID NO: 123; SEQ ID N0:126;和SEQ ID N0:134;和本文中稱為多態性ID N0.1-106(表3)的標誌物。Rf4的連鎖的、緊密連鎖的、和極端緊密連鎖的遺傳標誌物可用於標誌物輔助育種程序以鑑定玉米C型細胞質雄性不育基因類型的恢復系，以及以將此性狀育種到玉米品種中。基因座:如本文中使用的，術語「基因座」指基因組上與可測量的特徵(例如，性狀)對應的位置。SNP基因座通過與基因座內含有的DNA雜交的探針限定。標誌物:如本文中使用的，標誌物指可以用於鑑定具有特定等位基因，例如Rf4的植物的基因或核苷酸序列。標誌物可以描述為給定基因組基因座處的變異。遺傳標誌物可以是短的DNA序列，諸如單鹼基對變化(單核苷酸多態性，或「SNP」)周圍的序列。或長的DNA序列，例如小衛星/簡單序列重複(「SSR」)。「標誌物等位基因」指特定植物中存在的標誌物型式。如本文中使用的，術語標誌物可以指玉米染色體DNA的克隆區段(例如，如以SEQID NO: 1-197或多態性ID N0.1-106(表3)之一限定的)，並且也或備選地可以指與玉米染色體DNA的克隆區段互補的DNA分子(例如，與SEQ ID NO: 1-197或多態性ID N0.1-106(表3)之一互補的DNA)。·在一些實施方案中，可以經由使用核酸探針檢測植物中的標誌物存在。探針可以是DNA分子或RNA分子。可以通過本領域中已知的手段，例如使用DNA分子模板合成RNA探針。探針可以含有標誌物的整個或部分的核苷酸序列和來自玉米基因組的額外的、連續的核苷酸序列。這在本文中稱為「連續探針」。所述額外的、連續的核苷酸序列稱為初始標誌物的「上遊」或「下遊」，這取決於來自玉米染色體的連續核苷酸序列是在初始標誌物的5』還是3』側，如按照慣例理解的。所述額外的、連續的核苷酸序列可以位於初始標誌物和玉米基因組的染色體8上IOOkb區之間，所述IOOkb區位於圖譜位置564，922和601，460之間。如此，連續核苷酸序列可以位於初始標誌物和玉米基因組的染色體8上12kb區之間，所述12kb區位於圖譜位置86247和98188之間。如本領域普通技術人員公認的，可以幾乎無限重複用於獲得標誌物中包含的額外的、連續的核苷酸序列的方法(僅受限於染色體的長度)，由此沿著玉米染色體鑑定其它標誌物。可以在本發明的一些實施方案中使用所有上文所描述的標誌物。可以合成或通過克隆製備寡核苷酸探針序列。合適的克隆載體是本領域技術人員公知的。寡核苷酸探針可以是標記的或未標記的。存在用於標記核酸分子的極其多種技術，包括例如但不限於:通過缺口平移的放射性標記；隨機引發；用末端脫氧轉移酶(deoxytransferase)的加尾；等等，其中採用的核苷酸例如用放射性32P標記。可以使用的其它標記物包括例如但不限於:螢光團；酶；酶底物；酶輔因子；酶抑制劑；等等。或者，自身或與其它反應劑一起提供可檢測信號的標記物的使用可以用受體結合的配體替換，其中受體是標記的(例如，通過上文指定的標記物進行)，從而自身或與其它試劑一起提供可檢測信號。參見例如 Learv 等(1983)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA80:4045-9。探針可以含有與初始標誌物的核苷酸序列不連續的核苷酸序列；此探針在本文中稱為「非連續探針」。非連續探針的序列與玉米基因組上的初始標誌物的序列足夠接近地定位，從而非連續探針與相同基因(例如Rf4)遺傳連鎖。例如，在一些實施方案中，非連續探針可以位於玉米基因組上的初始標誌物的500kb; 450kb; 400kb; 350kb; 300kb; 250kb; 200kb; 150kb; 125kb; 120kb; IOOkb; 0.9kb; 0.8kb; 0.7kb; 0.6kb; 0.5kb; 0.4kb; 0.3kb; 0.2kb;或
0.1kb 內。探針可以是要檢測的標誌物的精確拷貝。探針也可以是包含核苷酸序列或由核苷酸序列組成的核酸分子，所述核苷酸序列與玉米染色體DNA的克隆區段(例如，如以SEQ IDNO: 1-197和多態性ID N0.1-106(表3)限定的)是基本上相同的。如本文中使用的，術語「基本上相同的」可以指超過85%相同的核苷酸序列。例如，基本上相同的核苷酸序列與參照序列可以是 85.5%; 86%; 87 %; 88%; 89%; 90% ;91%; 92%; 93%; 94%; 95%; 96%; 97%; 98%; 99% 或99.5%相同的。探針也可以是與要檢測的標誌物的精確拷貝(1嫩靶物」)「特異性可雜交」或「特異性互補」的核酸分子。「特異性可雜交」和「特異性互補」是如下的術語，其指示足夠的互補性程度，使得核酸分子和DNA靶物之間發生穩定的且特異性的結合。核酸分子與要特異性可雜交的其靶序列不需要是100%互補的。在存在有足夠的互補性程度以避免核酸在期望特異性結合的條件下，例如在嚴格雜交條件下對非靶序列的非特異性結合時，核酸分子是特異性可雜交的。產生特定嚴格性程度的雜交條件會隨選擇的雜交方法的性質及雜交核酸序列的組成和長度而有所變化。一般地，雜交的溫度和雜交緩衝液的離子強度(尤其是Na+和/或Mg++濃度)會決定雜交嚴格性，儘管清洗時間也影響嚴格性。關於獲得特定嚴格性程度需要的雜交條件的計算是本領域普通技術人員已知的，並且例如在Sambrook等(編)MolecularCloning:A Laboratory Manual,第 2 版，第 1-3 卷,Cold Spring Harbor LaboratoryPress, Cold Spring Harbor, NY, 1989,第 9 章和第 11 章；及 Hames and Higgins (編)Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, Oxford, 1985 中討論。關於核酸雜交的更為詳細的用法說明書和指導可以參見例如Tijssen，「0verview of principles of hybridizationand the strategy of nucleic acid probe assays, 」 於 Laboratory Techniques inBiochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes,部分 I,第 2 章，Elsevier, NY, 1993;及 Ausubel 等編,Current Protocols in MolecularBiology,第 2 章，Greene Publishing and ffiley-1nterscience, NY, 1995。如本文中所使用的，「嚴格條件」涵蓋僅在雜交分子與DNA靶物之間存在有小於25%錯配時發生雜交的條件。「嚴格條件」包括其它特定的嚴格性水平。如此，如本文中使用的，「中等嚴格性」條件是具有超過25%序列錯配的分子不會雜交的那些條件；「中間嚴格性」條件是具有超過15%錯配的分子不會雜交的那些條件；而「高嚴格性」條件是具有超過10%錯配的分子不會雜交的那些條件。「非常高嚴格性」的條件是具有超過6%錯配的分子不會雜交的那些條件。在具體的實施方案中，嚴格條件是於65° C在6x鹽水檸檬酸鈉(SSC)緩衝液、5x登哈特(Denhardt)氏溶液、0.5%SDS、和100 μ g剪切的鮭魚精巢DNA中雜交，接著於65° C在2x SSC緩衝液和0.5%SDS中，接著是Ix SSC緩衝液和0.5%SDS中，最終0.2x SSC緩衝液和0.5%SDS中序貫清洗15-30分鐘。就討論的所有探針(見上文)而言，探針可以包含其它核酸序列，例如啟動子；轉錄信號；和/或載體序列。可以使用討論的任何探針(見上文)來限定與牽涉對C型細胞質不育玉米恢復能育性的基因(例如Rf4)緊密連鎖的其它標誌物。如此鑑定的標誌物可以等同於本公開內容中命名的例示性標誌物，並且如此在本發明的範圍內。標誌物輔助育種:如本文中使用的，術語「標誌物輔助育種」可以指在一種或多種複雜性狀(例如能育性的CMS-C恢復系)方面直接育種的方法。在當前的實踐中，植物育種人員嘗試鑑定與農藝學期望的性狀連鎖的容易地可檢出的性狀，諸如花顏色、種皮外觀、或同工酶變體。植物育種人員然後通過追蹤容易地可檢出的性狀的分離來追蹤分離的育種群體中的工藝學性狀。然而，存在著可用於植物育種中使用的非常少的這些連鎖關係。標誌物輔助育種提供了用於改善植物品種的時間和成本有效的方法。應用標誌物輔助育種的幾個例子牽涉使用同工酶標誌物。參見例如Tanksley and Orton編(1983)Isozymes in Plant Breeding and Genetics, Amsterdam:Elsevier。一個例子是與對番茄中的線蟲有害生物的抗性的基因關聯的同工酶標誌物。受到稱作Mi的基因控制的抗性位於番茄的染色體6上，並且與Apsl (即一種酸性磷酸酶同工酶)非常緊密連鎖。Apsl同工酶標誌物間接選擇Mi基因的用途提供如下的優點，即可以用標準的電泳技術明確測定群體中的分離；可以在幼苗組織中對同工酶標誌物評分，消除對將植物維持至成熟的需要；以及同工酶標誌物等位基因的共顯性容許區別純合子和雜合子。參見Rick(1983)於Tanksley and Orton,見上文 。可操作連接的:當第一核酸序列在與第二核酸序列的功能性關係中時，第一核酸序列與第二核酸序列可操作連接。例如，若啟動子影響編碼序列的轉錄或表達，則啟動子與編碼序列可操作連接。在重組生成時，可操作連接的核酸序列一般是連續的，且在必需連接兩個蛋白質編碼區時，在同一閱讀框中(例如，在多順反子ORF中)。然而，核酸為了可操作連接不需要是連續的。啟動子:如本文中使用的，術語「啟動子」指可以在轉錄起始上遊，並且可以牽涉RNA聚合酶和其它蛋白質的識別和結合以啟動轉錄的DNA區。啟動子可以與細胞中表達的基因可操作連接，或者啟動子可以與編碼信號序列的核苷酸序列可操作連接，所述編碼信號序列的核苷酸序列可以與細胞中表達的基因可操作連接。發育控制下的啟動子的例子包括優先在某些組織，諸如葉、根、種子、纖維、木質部導管、管胞、或厚壁組織中啟動轉錄的啟動子。此類啟動子稱為「組織優選的」。僅在某些組織中啟動轉錄的啟動子稱為「組織特異性的」。「細胞類型特異性」啟動子主要在一種或多種器官中的某些細胞類型中，例如在根或葉中的維管細胞中驅動表達。「誘導型」啟動子可以是可在環境控制下的啟動子。可以啟動誘導型啟動子轉錄的環境條件的例子包括厭氧條件或光照的存在。組織特異性、組織優選性、細胞類型特異性、和誘導型啟動子構成「非組成性」啟動子的類別。「組成性」啟動子是可以在大多數環境條件下有活性的啟動子。可以在本發明的一些實施方案中使用任何誘導型啟動子。參見Ward等(1993)Plant Mol.Biol.22:361-366。憑藉誘導型啟動子，轉錄速率響應誘導劑而增加。例示性誘導型啟動子包括但不限於:響應銅的來自ACEI系統的啟動子；響應苯磺醯氨除草劑安全劑的來自玉米的In2基因；來自TnlO的Tet阻抑物；和來自類固醇激素基因的誘導型啟動子，該類固醇激素基因的轉錄活性可以通過激素糖皮質激素誘導(Schena等(1991)ProC.Natl.Acad.Sc1.USA88:0421)。例示性的組成性啟動子包括但不限於:來自植物病毒的啟動子,諸如來自CaMV的35S啟動子；來自稻肌動蛋白基因的啟動子；泛素啟動子；pEMU;MAS ;玉米H3組蛋白啟動子；和ALS啟動子，即在歐洲油菜(Brassica napus)ALS3結構基因5』的Xbal/Ncol片段(或與所述Xbal/Ncol片段的核苷酸序列相似性)(國際PCT公開文本W096/30530)。也可以在本發明的一些實施方案中利用任何組織特異性或組織優選性啟動子。用與組織特異性啟動子可操作連接的基因轉化的植物可以專門或優先在特定組織中生成轉基因的蛋白質產物。例示性組織特異性或組織優選性啟動子包括但不限於:根優選性啟動子，諸如來自菜豆蛋白基因的；葉特異性和光誘導性啟動子諸如來自cab或rubisco的；花葯特異性啟動子諸如來自LAT52的；花粉特異性啟動子諸如來自Zml3的；和小孢子優選性啟動子諸如來自apg的。序列同一性:如本文中在兩種核酸或多肽序列的背景中所使用的，術語「序列同一性」或「同一性」可以指兩種序列中在規定的比較窗裡為了實現最大對應性而比對時相同的
殘基。 在提及蛋白質使用序列同一性百分比時，認可的是，不相同的殘基位置經常相差保守的胺基酸取代，其中胺基酸殘基用具有類似化學特性(例如，電荷、疏水性或空間效應)的其它胺基酸殘基取代，並且因此不改變分子的功能特性。因此，在序列相差保守取代時，百分比序列同一性可以向上調節以校正不相同殘基位點處取代的保守性質。相差此類保守取代的序列被說成具有「序列相似性」或「相似性」。用於進行此調節的技術是本領域普通技術人員公知的。通常，此類技術牽涉將保守取代評分為部分的，而不是完全的錯配，由此增加百分比序列同一性。例如，在對相同的胺基酸給予0-1的得分，而對非保守取代給予O得分的情況中，對保守取代給予0-1的得分。可以計算保守取代的得分，例如如程序PC/GENE (Intelligenetics, Mountain View, CA)中執行的。如本文中所使用的，術語「序列同一性百分比」可以指在比對窗裡比較兩個最佳比對序列時測定的數值，其中為了兩個序列的最佳比對，比較窗中序列的部分與參照序列(其不包含添加或缺失)相比可以包含添加或缺失(即，缺口)。通過測定兩個序列中存在相同核苷酸或胺基酸殘基的位置的數目以產生匹配位置數目，將匹配位置的數目除以比較窗中位置的總數，並將結果乘以100以產生序列同一性百分比來計算百分比。單核苷酸多態性(SNP):如本文中使用的，術語「單核苷酸多態性」可以指在基因組(或其它共享序列)中的單核苷酸在物種成員或個體中的配對染色體間有所不同時發生的DNA序列變異。
在群體內，可以給SNP指派較小等位基因頻率，即特定群體中觀察到的某個基因座處的最低等位基因頻率。這僅是在單核苷酸多態性方面兩種等位基因頻率中的較小者。人群體間有變異，因此一個地理學或民族中常見的SNP等位基因在另一個中可以罕見得多。單核苷酸多態性可以落入基因的編碼序列、基因的非編碼區內，或基因間的基因間區中。編碼序列內的SNP由於遺傳密碼的簡併性而不會必然改變生成的蛋白質的胺基酸序列。兩種形成都生成相同多肽序列的SNP稱作「同義的」(有時稱作沉默突變)。若生成不同多肽序列，則它們稱作「非同義的」。非同義變化可以是錯義或無義，其中錯義變化導致不同胺基酸，而無義變化導致過早的終止密碼子。不在蛋白質編碼區中的SNP可以仍然具有基因剪接、轉錄因子結合、或非編碼RNA序列的後果。SNP通常是雙等位基因的，並且如此容易在植物和動物中測定。Sachidanandam(2001)Nature409:928-33。InDel:如本文中使用的，術語「InDel」一般用於描述基因中的插入或缺失。如此，「InDel」僅指可以是插入、缺失、或其組合的特定突變。性狀或表型:術語「性狀」和「表型」在本文中可互換使用。出於本公開內容的目的，特別感興趣的性狀是C型CMS的能育性恢復。II1.玉米CMS-C恢復系Rf4基因及其分子標誌物提供了與玉米CMS-C恢復系基因Rf4連鎖的(例如，緊密連鎖的)分子標誌物。鑑定含有牽涉對CMS-C植物恢復能育性的序列的DNA區段。這些區段位於與Rf4基因連鎖的(例如，緊密連鎖的)標誌物間。如此 ，還提供了包含Rf4基因的核酸分子。鑑定的區段及其標誌物在本文中部分根據其在玉米染色體8頂部的特定區域中的位置描述。在以重組頻率或圖距單位表示時，鑑定的區段及其標誌物的位置在本文中作為一般信息提供。在玉米群體BE4207x XJH58中實施本文中所描述的實施方案。然而，通過參照公眾可獲得的B73玉米近交物基因組序列(B73RefGen vl或v2)(其可以在環球網上在 www2.genome, arizona.edu/genomes/maize 或 ftp.maizesequence.0rg/current/assembly/找到)表示以圖距單位計的特定區段和標誌物的位置。玉米品種BE4207和XJH58的基因組序列尚不可獲得。預期以圖距單位對特定區段和標誌物給予的數目可以在栽培種間有所變化，並且不是DNA區段和標誌物的必需定義的一部分，該DNA區段和標誌物以其它方式描述，例如通過核苷酸序列描述。Rf4基因的顯性等位基因控制CMS_C/Rf4系統中的能育性恢復。在實施方案中，Rf4 基因測定為選自下組的基因:GRMZM2G122853(SEQ ID NO: 198) ;AC187051.4_FG005 (SEQ ID NO: 199) ;GRMZM2G122851 (SEQ ID NO:200) ;GRMZM2G122850 (SEQID NO:201) ;GRMZM2G582028 (SEQ ID NO:2 O 2) ;GRMZM2GO 2 I 276 (SEQID NO:203) ;GRMZM2G38 1376 (SEQ ID NO:204) ;GRMZM2G081 1 27 (SEQ IDNO: 205) ;GRMZM2G085 I I I (SEQ ID NO:206) ;GRMZM2 GO 85038 (SEQ IDNO: 207) ;GRMZM2G3I 7468 (SEQ ID NO:208) ;GRMZM2G328030 (SEQ IDNO:209) ;GRMZM2G029450 (SEQ ID NO:210);和 GRMZM2G077212 (SEQ ID N0:211)。在具體的實施方案中，Rf4基因是Rf4-bHLH (SEQ ID NO:203) 例如，Rf4_bHLH基因通過SEQ IDNO:220 提供。在一些實施方案中，本發明還包括與Rf4_bHLH基本上相同的那些核苷酸序列。例如，在一些實施方案中，核酸分子是與Rf 4-bHLH至少約85%相同的Rf4同系物。Rf4同系物可以與 Rf 4-bHLH 是 86%; 87%; 88%; 89%; 90% ;91%; 92%; 93%; 94%; 95%; 96%; 97%; 98%; 99% 或99.5%相同的。此類Rf4同系物可以容易地鑑定，並且對於多種生物體從本領域技術人員容易地可用的任何完全或部分基因組分離。一些實施方案還包括Rf4基因的功能性變體。Rf4的功能性變體包括例如包含一處或多處核苷酸取代、缺失、或插入的Rf4-bHLH序列，其中功能性變體對CMS-C玉米恢復雄性能育性，如可以通過本領域普通技術人員公知的常規技術測量的。例如，Rf4基因的特定變體對CMS-C玉米恢復雄性能育性的能力可以如下測定，即將突變或片段常規引入不育rf4等位基因純合的植物中，接著對植物常規觀察雄性不育。Rf4基因的功能性變體可以通過定點誘變、誘導突變來創建，或者它們可以作為等位變體(多態性，例如SNP)發生。在具體的例子中，Rf4的功能性變體是如下的Rf4-bHLH序列，其包含一處或多處核苷酸取代、缺失、或插入，使得該變體編碼包含bHLH域內Y186的疏水性胺基酸取代(例如Phe)的Rf4-bHLH 多肽。因此，在一些實施方案中，Rf4基因的功能性變體可以是Rf4的突變，或者保留Rf4基因的雄性不育控制特性且比Rf4的整個序列小的片段。因此，認為此類突變和片段在本發明的範圍內。鑑於本公開內容，本領域普通技術人員可以容易地確定本文中列出的Rf4序列的突變或片段是否保留Rf4基因的特性。在一些實施方案中，本發明還包括Rf4-bHLH多肽(例如，SEQ ID N0:225)和與Rf4-bHLH基本上相同的多肽。例如，在一些實施方案中，與Rf4-bHLH基本上相同的多肽可以與Rf 4-bHLH至少約25%相同，並且在與SEQ ID NO: 225的F187對應的位置處具有疏水性胺基酸殘基(例如Phe)，如通過序列比對測定的。在一些實施方案中，與Rf4-bHLH基本上相同的多肽可以與 Rf 4-bHLH 是 86%; 87%; 88%; 89%; 90% ;91%; 92%; 93%; 94%; 95%; 96%; 97%; 98%;99%或99.5%相同的。與Rf 4-bHLH基本上相同的此類多肽可以容易地鑑定，並且對於多種生物體從本領域技術人員容易可用的完整或部分基因組或cDNA文庫推導。IV.使用Rf4基因·的方法可以以本領域技術人員已知的多種方式之一使用本文中所描述的Rf4基因來操作基因以引起期望的效應。例如但不限於，可以使用Rf4基因來:將突變體Rf4序列導入植物中以引起不育；將突變引入天然Rf4序列中；將靶向Rf4DNA或RNA的反義核酸分子導入植物中以影響能育性；使用髮夾形成；或連接Rf4序列與其它核酸序列以控制Rf4基因產物的表達。例如，在一些實施方案中，可以使用測定為選自下組的Rf4基因來促進與影響玉米雄性能育性的其它基因或突變體一起利用CMS-C/Rf 4雄性能育性系統:GRMZM2G122853(SEQ ID NO:198);AC187051.4_FG005(SEQ ID NO:199);GRMZM2G122851 (SEQID NO:200) ;GRMZM2G 1 22850 (SEQ ID NO:20 I) ;GRMZM2G582028 (SEQID NO: 202) ;GRMZM2G02I 276 (SEQ ID NO:203) ;GRMZM2G38 I 376 ( SE QID N0:204) ;GRMZM2G081 127 (SEQ ID NO:20 5) ;GRMZM2G0851 1 1 (SEQ IDNO:206) ;GRMZM2G085038 (SEQ ID NO:207) ;GRMZM2G3 I 7468 (SEQ IDNO:208) ;GRMZM2G328030 (SEQ ID NO:209) ;GRMZM2G029450 (SEQ ID N0:210);和GRMZM2G077212(SEQ ID N0:211)。例如，在具體的實施方案中，可以使用Rf 4-bHLH基因來促進與影響玉米雄性能育性的其它基因或突變體一起利用CMS-C/Rf4雄性能育性系統。在一些實施方案中，可以將Rf4基因導入玉米植物中，所述玉米植物適合於用於與CMS-C/Rf4雄性能育性系統不同的雄性能育性系統。或者，可以將與Rf4不同的基因或突變體基因導入適合於在CMS-C/Rf4雄性能育性系統中使用的玉米植物，使得可以使用導入的基因或突變體基因來提供額外的或互補的能育性控制。玉米中其它雄性能育性基因和突變的具體例子包括:CMS-T/Rf I; CMS-T/Rf 2; CMS-S/Rf 3; ms I (Singletonand Jones(1930)J.Hered.21:266-8);ms2 和 ms3(Eyster(1931)J.Hered.22:99-102) ;ms5,ms7,ms8,ms9,msl0,msll,msl2,msl3,和 msl4 (Beadle (1932) Geneticsl7:413-31) ;ms 17(Emerson(1932)Science75:566);ms20(Eyster(1934)BibliographiaGeneticall:187-392);ms23 和 ms24(ffest and Albertsen(1985)MNL59:87);ms25 和ms26(Loukides 等(1995)Am.J.Bot.82:1017-23);ms27 和 ms38(Albertsen 等(1996)MNL70:30-1) ;ms28(Golubovskaya(1979)MNL53:66-70);ms29 和 ms31(Trimnell 等(1998)MNL72:37-38);ms30(Albertsen 等(1999)MNL73:48);ms32, ms36 和 ms37(Trimnell 等(1999)MNL73:48-50);ms33 和 ms34(Patterson(1995)MNL69:126-8);ms43(Golubovskaya(1979)Int.Rev.Cytol.58:247-90);ms45(Albertsen 等(1993)Proc.Annu.Corn SorghumInd.Res.Conf.48:224-33;及 ms48, ms49,和 ms50(Trimnell 等(2002)MNL76:38-9)。在將核酸序列(例如Rf4) 「導入」生物體，諸如植物中時，用於導入包含特定序列的核酸分子的技術或方法對於本發明不是至關重要的，並且可以通過本領域技術人員已知的任何技術或方法來發生。例如，可以通過直接轉化方法，諸如土壤桿菌(Agrobacterium)介導的對植物組織的轉化；微粒轟擊；電穿孔；等等導入核酸分子。或者，可以通過將具有特定核苷酸序列的植物與另一植物雜交，使得後代具有摻入其基因組中的核苷酸序列來導入核酸分子。此類育種技術是本領域技術人員公知的。如本文中公開的，標誌物輔助育種技術可以極大地促進經由此類雜交摻入Rf4。在將Rf4基因導入生物體的實施方案中，可以期望以如下的方式導入Rf4基因，使得Rf4基因與一種或多種調節序列可操作連接，例如，經由使用包含與期望的調節序列可操作連接的Rf4基因的質粒導入。可用於表達異源核酸序列的調節序列是本領域中公知的，並且包括例如但不限於:啟動子(例如，組成性啟動子；組織特異性啟動子；和發育階段特異性啟動子)；終止序列；增強子序列；亞細胞靶向序列；穩定化或前導序列；和內含子。在一些實施方案中，可以與一種或多種其它期望的核酸序列(例如，基因)一起將Rf4基因導入生物體。其它期望的核酸序列可以包括例如:編碼外來蛋白質的基因；農藝學基因；植物疾病抗性基因；賦予對植物有害生物的抗性的基因；賦予對除草劑的抗性的基因；和賦予或促成增值性狀(例如，經修飾的脂肪酸代謝；降低的肌醇六磷酸含量；和經修飾的碳水化合物組成)的基因。所有前述核酸序列的例子是本領域技術人員已知的。也可以與一種或多種與調節元件(例如啟動子)可操作連接的標誌物基因一起將Rf4基因導入生物體，所述標誌物基因容許含有標誌物的經轉化的細胞通過負選擇(即，抑制不含選擇標誌物基因的細胞生長)或者通過正選擇(即，篩選由遺傳標誌物編碼的產物)回收。供轉化用的許多選擇標誌物基因是轉化領域中公知的，並且包括例如編碼使可以為抗 生素或除草劑的選擇性化學劑在代謝上解毒的酶的基因，或編碼可以對抑制劑不敏感的經改變的靶物的基因。少數正選擇方法也是本領域中已知的。適合於在植物細胞中使用的標誌物基因的例子可以包括例如但不限於:新黴素磷酸轉移酶IKnptII)基因(Fraley 等(1983)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA80:4803);潮黴素磷酸轉移酶基因(Vanden Elzen等(1985)Plant Mol.Biol.5:299);慶大黴素乙醯轉移酶、鏈黴素磷酸轉移酶、氨基糖苷-3』 -腺苷醯轉移酶、和博來黴素抗性決定子(見例如Hayford等(1988)Plant Physiol.86:1216;Jones 等(1987)Mol.Gen.Genet.210:86);Svab 等(1990)Plant Mol.Biol.14:197;及 Hille 等(1986)Plant Mol.Biol.7:171);賦予對除草劑諸如草甘膦(glyphosate)、草銨膦(glufosinate)或溴苯腈(bromoxynil)的抗性的選擇標誌物基因(見例如 Comai 等(1985)Nature317:741-744;Gordon-Kamm 等(1990)Plant Cell2:603-618;及 Stalker 等(1988) Science242:419-423);小鼠二氫葉酸還原酶(Eichholtz 等(1987) Somatic Cell Mol.Genet.13:67);植物 5_ 烯醇丙酮酸莽草酸(enolpyruvylshikimate)-3-憐酸合酶(Shah 等(1986) Science233:478);植物乙酸乳酸合酶(Charest 等(1990)Plant Cell Rep.8:643)。另一類適合於植物轉化的標誌物基因採用篩選據推測經轉化的植物細胞，而不對經轉化的細胞直接遺傳選擇對毒性物質諸如抗生素的抗性。這些基因特別可用於量化或顯現基因在特定組織中表達的空間樣式，並且通常稱為「報告基因」，因為它們可以與基因或基因調節序列融合以調查基因表達。通常用於篩選經轉化的細胞的基因包括葡糖醛酸糖苷酶(GUS)、β-半乳糖苷酶、螢光素酶和氯黴素乙醯轉移酶。見例如Jefferson(1987)Plant Mol.Biol.Rep.5:387;Teeri 等(1989)EMBO J.8:343;Koncz 等(1987)Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.84:131;及 DeBlock 等(1984)EMBO J.3:1681。最近，已經可用用於顯現⑶S活性的體內方法，其不需要破壞植物組織。MolecularProbes publication2908, Imagene Green.TM.,第 1-4 頁，1993;及 Naleway 等(1991)J.Cell Biol.115:151a。此外，已經利用編碼螢光蛋白(例如，GFP，EGFP，EBFP，ECFP，和YFP)的基因作為原核和真核細胞中基因表達的標誌物。見Chalfie等(1994)Science263:802o可以使用螢光蛋白和螢光蛋白的突變作為可篩選標誌物。在一些實施方案中 ，可以使用本文中公開的玉米Rf4基因和玉米Rf4基因的片段或區段來鑑定來自與玉米不同的生物體的同源Rf4序列(例如，通過序列比較來進行)。來自與玉米不同的生物體且與玉米Rf4基因同源的序列可以依照公知的技術，例如基於其與Rf4-bHLH的序列同源性來鑑定並分離。例如，依照常規技術可以使用整個或部分的Rf4-bHLH編碼序列作為探針，該探針與存在於來自生物體的克隆基因組DNA片段群體(SP，基因組文庫)中的其它序列特異性雜交。如此，在一些實施方案中，本發明包括與Rf 4-bHLH序列(例如SEQ ID NO:220)特異性雜交的那些核苷酸序列。或者，可以通過序列比較鑑定並分離來自與玉米不同的生物體且與玉米Rf4基因同源的序列。例如，可以依照常規技術用玉米Rf 4-bHLH序列(例如SEQ ID N0:220)搜索生物體的完全或部分測序的基因組以鑑定生物體基因組內與玉米Rf4共享高度序列同一性，並且因此可能是Rf4同源物的基因。例如，可以使用整個或部分玉米Rf4序列(例如SEQ ID NO:220)作為「參照序列」。一般地，與參照序列比較的核酸序列(例如，基因組文庫的克隆或基因組DNA片段)包含「比較窗」，其是核酸序列的特定連續區段。比較窗與參照序列(其不包含添加或缺失)相比可以包含添加或缺失(即，缺口)以實現兩個序列的最佳比對。通常，比較窗的長度為至少20個連續核苷酸，但是長度可以是30，40，50，100，或200個核苷酸，或更長。為了避免由於多核苷酸序列比較窗中包含缺失而與參照序列的高度相似性，可以引入「缺口罰分」以從核苷酸匹配數目扣除。比對比較序列的方法是本領域中公知的。可以使用可用的數學算法來實現任何兩種序列間百分比序列同一性的測定。此類數學算法的非限制性例子是Myers andMiller (1988), CAB10S4:11-7 的算法；Smith 等(1981) Adv.Appl.Math.2:482 的局部比對算法；Needleman 和 Wunsch (1970), J.Mol.Biol.48:443-53 的全局比對算法；Pearsonand Lipman (1988), Proc.Natl.Acad.Sc1.USA85:2444-8 的搜索局部比對法；Karlin 和Altschul(1990), Proc.Natl.Acad.Sc1.USA87:2264,及 Karlin 和 Altschul (1993)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA90:5873-7 的算法。本領域普通技術人員可以在計算機上實現這些數學算法以比較序列，從而測定序列同一性，或依照與參照序列的共享序列同一性搜索包含多個序列的資料庫(例如，生物體基因組資料庫)。此類實現包括但不限於PC/Gene程序(Intelligenetics, MountainView, CA)中的 CLUSTAL ；和 GCG Wisconsin 遺傳學軟體包，ν.10 (Accelrys Inc., SanDiego, CA)中的 ALIGN 程序和 GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA、和 TFASTA。使用這些程序的序列比對可以使用其預設參數實施。或者，可以期望在一些搜索中修改預設參數(例如，改變缺口罰分的數值)。選擇數學算法的特定計算機實現以計算序列同一性，以及選擇在選定的算法中使用的參數數值在本領域技術人員的判斷內。在一些實施方案中，可以將用於雜種種子生成的CMS_C/Rf4系統工程化改造入缺乏功能性Rf4恢復系基因的玉米品種或與玉米不同的植物物種中，其例如通過將Rf4基因導入此類玉米品種或植物物種來進行。

如此，依照一些實施方案，可以在生成雜種種子的方法中使用本文中所描述的Rf4基因。用於生成雜種種子的方法可以包括獲得包含玉米Rf 4-bHLH序列(例如SEQ IDNO: 220)，或與玉米Rf 4-bHLH序列特異性雜交的核苷酸序列的核酸分子。然後，可以將所述核酸分子導入植物細胞或植物組織中，其中自其獲得植物細胞或植物組織的植物可以是玉蜀黍，或不同植物物種。隨後，可以從已經接受所述核酸分子導入的植物細胞或植物組織生成經轉化的全植物。然後，通過經轉化的全植物使細胞質雄性不育植物受精。然後，可以從已經通過經轉化的全植物受精的細胞質雄性不育植物獲得生成能育植物的種子。在具體的實施方案中，可以在生成雜種種子的方法中使用玉米Rf4_bHLH基因的玉米Rf4-bHLH功能性變體或同源物替換玉米Rf4-bHLH序列(例如SEQ ID NO: 220)，或與玉米Rf 4-bHLH序列特異性雜交的核苷酸序列。例如通過上文所描述的方法生成的經轉化的全植物可以能夠生成種子。然而，此類種子可以能夠或不能生成為能育植物。因而，用於生成雜種種子的方法的一些實施方案牽涉植物組織培養技術。此類技術是對於本領域普通技術是常規的且公知的。在用於雜種種子生成的CMS_C/Rf4系統工程化改造入與玉米不同的植物物種中的實施方案中，可能有必要還將包含一種或多種牽涉CMS-C雄性不育系統的核酸序列的核酸分子導入所述植物物種中。例如，可以導入隱性rf4-bHLH等位基因以替換所述植物物種中的Rf 4-bHLH直向同系物,從而生成雄性不育rf4/rf4植物,可以對該雄性不育rf4/rf4植物導入Rf 4-bHLH基因以將用於雜種種子生成的CMS-C/Rf4系統工程化改造入所述物種中。在一些實施方案中，可以在用於生成雜種種子的方法中使用本文中所描述的Rf4基因，所述方法包括用來自包含Rf4基因的雄性植物的花粉使具有CMS-C型雄性不育性狀的雌性植物受精。在這些和其它實施方案中，可以使用玉米Rf4-bHLH序列(例如SEQ IDN0:220)、與玉米Rf4-bHLH序列特異性雜交的核苷酸序列、或玉米Rf4_bHLH序列的功能性變體或同系物。在一些實施方案中，用於生成雜種種子的方法包括通過例如回交；誘變；轉化；或同源重組生成包含Rf4的第一植物。然後，可以通過例如回交；誘變；或同源重組獲得或生成具有CMS-C型雄性不育性狀的第二植物。然後，可以將第二植物與第一植物雜交以從第二植物獲得能育雜種種子。在實施方案中，第一植物可以是雄性植物，而第二植物可以是雌性植物。在用於生成雜種種子的方法的具體例子中，植物可以是玉米植物。在其它例子中，可以使用與玉米不同的植物。依照本發明的用於生成雜種種子的方法的實施方案可適用於任何植物，諸如有性繁殖植物，包括農藝學價值的植物，例如但不限於:玉米；大豆；苜蓿；小麥；油菜籽；稻；高粱；甜菜；短柄草屬；單子葉植物；雙子葉植物；各種蔬菜，包括黃瓜、番茄、胡椒等；各種樹，包括蘋果樹、梨樹、桃樹、櫻桃樹、紅杉、松、橡樹等等；和各種開花觀賞植物。V.使用Rf4分子標誌物的方法使用與Rf4基因連鎖或駐留於Rf4基因內的核酸分子標誌物來鑑定具有C型CMS的功能性恢復系基因的植物的方法可以導致植物發育者成本節約，因為此類方法可以消除對雜交包含功能性恢復系基因的植物與CMS植物系，然後對雜交後代測定表型的需要。

可以將其它標誌物鑑定為與本文中命名的任何例示性標誌物(例如SEQ IDNO: 1-197和多態性ID N0.1_106(表3))的等同物，其例如通過測定別的標誌物和例示性命名標誌物之間的重組頻率進行。此類測定可以利用基於Mather (1931)，The Measurementof Linkage in Heredity, Methuen&C0., London方法的改善的正交比較方法,接著是測定重組頻率的最大概率的測試。AlIard (1956) Hilgardia24:235-78。若重組頻率的數值在任何玉米栽培種中小於或等於0.10(即10%)，則為了在目前公開的方法中使用。認為別的標誌物等同於特定的參照標誌物。用於對CMS-C玉米恢復能育性的手段可以包括來自植物的核酸序列，該核酸的檢測至少提供如下的強烈指示，即包含該核酸序列的植物包含CMS-C基因的功能性恢復系。在一些例子中，用於對CMS-C玉米恢復能育性的手段是與Rf 4-bHLH基因連鎖(例如，連鎖；緊密連鎖；極端緊密連鎖)的或駐留於Rf 4-bHLH基因內的標誌物。用於鑑定攜帶對CMS-C玉米恢復能育性的基因的玉米植物的手段可以是在對自攜帶對CMS-C玉米恢復能育性的基因的植物獲得的樣品添加時呈現可檢出信號的分子。核酸的特異性雜交是可檢出信號，因此，與CMS-C恢復系基因特異性雜交的核酸探針，或作為功能性CMS-C恢復系基因存在的指標的不同基因組核酸序列可以是用於鑑定攜帶對CMS-C玉米恢復能育性的基因的玉米植物的手段。在一些例子中，用於鑑定攜帶對CMS-C玉米恢復能育性的基因的植物的手段是與標誌物特異性雜交的探針，所述標誌物與玉米Rf4-bHLH基因連鎖(例如，連鎖；緊密連鎖；或極端緊密連鎖)或駐留於玉米Rf 4-bHLH基因內。
在一些實施方案中，可以使用在Rf4基因側翼的標誌物來轉移明確含有Rf4基因的供體親本DNA區段。在具體的實施方案中，標誌物選自下組:包含SEQ ID N0:l_197和多態性ID N0.1-106(表3)的標誌物，或與選自下組的標誌物等同的標誌物:包含SEQ IDNO: 1-197和多態性ID N0.1-106(表3)的標誌物。在一些實施方案中，使用在Rf4基因側翼的標誌物來轉移明確含有Rf4基因的供體親本DNA區段的方法可以包括用與同Rf4基因連鎖(例如，連鎖；緊密連鎖；或極端緊密連鎖)的標誌物特異性可雜交的探針分析兩個親本植物的基因組DNA;有性雜交兩個親本植物基因型以獲得後代群體，並對那些後代分析與Rf4基因連鎖(例如，連鎖；緊密連鎖；或極端緊密連鎖)的標誌物的存在；將含有與Rf4基因連鎖(例如，連鎖；緊密連鎖；或極端緊密連鎖)的標誌物的後代與受體基因型回交以生成第一回交群體，然後，繼續進行回交程序，直到獲得包含由親本基因型和Rf4基因展現的任何期望性狀的最終後代。在具體的實施方案中，通過在每個世代的Rf4標誌物分析選擇在每個雜交和回交步驟中獲得的個體後代。在一些實施方案中，用與同Rf4基因連鎖(例如，連鎖；緊密連鎖；或極端緊密連鎖)的標誌物特異性可雜交的探針分析兩個親本植物的基因組DNA包括與探針特異性雜交的較少連鎖標誌物,或與探針特異性雜交的無一連鎖標誌物。在一些實施方案中，可以使用與玉米Rf4_bHLH基因連鎖(例如，連鎖；緊密連鎖；或極端緊密連鎖)或駐留於玉米Rf 4-bHLH基因內的標誌物，或玉米Rf 4-bHLH基因序列自身通過遺傳轉化將玉米Rf4基因導入玉米植物中。在具體的實施方案中，標誌物選自下組:包含SEQ ID NO: 1-197和多態性ID N0.1-106(表3)的標誌物，或與選自下組的標誌物等同的標誌物:包含SEQ ID NO: 1-197和多態性ID N0.1-106(表3)的標誌物。在一些實施方案中，通過遺傳轉化將玉米Rf4基因導入玉米植物中的方法可以包括用與同Rf4基因連鎖(例如，連鎖；緊密連鎖；或極端緊密連鎖)的標誌物或Rf4基因自身特異性可雜交的探針分析植物(例如玉米植物)的基因組DNA以鑑定植物中的Rf4基因 ；例如通過提取基因組DNA並用一種或多種酶限制性內切核酸酶消化基因組DNA來分離包含Rf4基因的植物基因組DNA區段；任選地，擴增分離的DNA區段；將分離的DNA區段導入宿主玉米植物的細胞或組織中；並用與同Rf4基因連鎖(例如，連鎖；緊密連鎖；或極端緊密連鎖)的標誌物或Rf4基因自身特異性可雜交的探針分析宿主玉米植物DNA以鑑定宿主玉米植物中的Rf4基因。在具體的實施方案中，可以將分離的DNA區段導入宿主玉米植物中，使得它穩定整合入宿主玉米植物的基因組中。在一些實施方案中，可以使用與玉米Rf4_bHLH基因連鎖(例如，連鎖；緊密連鎖；或極端緊密連鎖)或駐留於玉米Rf 4-bHLH基因內的標誌物，或玉米Rf 4-bHLH基因序列自身來將玉米Rf4基因導入其它生物體(例如植物)中。在具體的實施方案中，標誌物選自下組:包含SEQ ID NO: 1-197和多態性ID N0.1-106(表3)的標誌物，或與選自下組的標誌物等同的標誌物:包含SEQ ID NO: 1-197和多態性ID N0.1-106(表3)的標誌物。在一些實施方案中，用於將玉米Rf4基因導入與玉米不同的生物體中的方法可以包括用與同Rf4基因連鎖(例如，連鎖；緊密連鎖；或極端緊密連鎖)的標誌物或Rf4基因自身特異性可雜交的探針分析植物(例如玉米植物)基因組DNA以鑑定植物中的Rf4基因；例如通過提取基因組DNA並用一種或多種酶限制性內切核酸酶消化基因組DNA來分離包含Rf4基因的植物基因組DNA區段；任選地，擴增分離的DNA區段；將分離的DNA區段導入與玉米不同的生物體中；並用與同Rf4基因連鎖(例如，連鎖；緊密連鎖；或極端緊密連鎖)的標誌物或Rf4基因自身特異性可雜交的探針分析與玉米不同的生物體的DNA以鑑定生物體中的Rf4基因。在具體的實施方案中，可以將分離的DNA區段導入生物體中，使得它穩定整合入生物體的基因組中。在一些實施方案中，可以使用與Rf4基因連鎖(例如，連鎖；緊密連鎖；或極端緊密連鎖)或駐留於Rf4基因內的標誌物，或Rf4基因序列自身來鑑定具有CMS-C雄性不育功能性恢復系基因的植物。在具體的實施方案中，植物是玉米植物。在一些實施方案中，可以從植物提取核酸分子(例如，基因組DNA或mRNA)。然後，可以使提取的核酸分子與一種或多種探針接觸，所述探針與同Rf4基因連鎖(例如，連鎖；緊密連鎖；或極端緊密連鎖)的標誌物或Rf4基因自身特異性可雜交。一種或多種探針與提取的核酸分子的特異性雜交指示植物中存在CMS-C雄性不育功能性恢復系基因。在一些實施方案中，可以使用與Rf4基因連鎖(例如，連鎖；緊密連鎖；或極端緊密連鎖)或駐留於Rf4基因內的標誌物，或Rf4基因序列自身來生成雜種種子。依照此類方法的雜種種子生成由於消除手動或機械去雄而可以導致成本節約，而且可以進一步提高種子產量。在具體的實施方案中，所述方法可以包括將包含與Rf4基因連鎖(例如，連鎖；緊密連鎖；或極端緊密連鎖)或駐留於Rf4基因內的核酸分子標誌物的雄性植物和具有C型CMS雄性不育表型的雌性植物雜交。V1.包含Rf4 基因的生物體本發明的一些實施方案還提供了包含含有Rf 4-bHLH序列(例如SEQ ID NO: 220),與Rf4-bHLH序列特異性可雜交的核酸序列、或Rf4-bHLH序列的功能性變體的核酸分子的生物體。合適的生物體可以是任何合適的植物、酵母、或細菌。作為非限制性例子，包含前述序列的植物可以是農藝學價值的植物，例如但不限於:玉米；大豆；苜蓿；小麥；油菜籽；稻；高粱；甜菜；短柄草屬(Brachypodium);單子葉植物；雙子葉植物；各種蔬菜，包括黃瓜、番茄、胡椒等；各種樹，包括蘋果樹、梨樹、桃樹、櫻桃樹、紅杉、松、橡樹等等；和各種開花觀賞植物。在具體的實施方案中，生物體可以是有性繁殖植物。包含特定核酸序列的攜帶種子的植物可以生成包含核酸序列的種子。可以將包含Rf 4-bHLH序列(例如SEQ ID NO: 220)、與Rf4_bHLH序列特異性可雜交的核酸序列、或Rf4-bHLH序列的功能性變體的植物細胞培養，並作為植物組織培養細胞保持，或者可以將本領域中已知的某些植物激素添加至培養基，由此引起植物組織培養細胞分化並形成新的植物品種，該新的植物品種可以是能育或不育的。可用於這些和其它實施方案的此類植物培養方法是本領域中常規且公知的。本發明的一些實施方案提供了包含Rf 4-bHLH序列(例如SEQ ID N0:220)、與Rf4-bHLH序列特異性可雜交的核酸序列、或Rf4-bHLH序列的功能性變體的病毒(例如，噬菌體或植物病毒)。提供以下實施例以例示某些具體的特徵和/或實施方案。實施例不應解釋為將公開內容限制於例示的具體特徵或實施方案。
實施例實施例1:材料和方法
確認群體。使用CMS-C型的雄性不育系BE4207和響應CMS-C型的雄性不育恢復系品系XJH58作為親本以生成匕後代。然後，將F1後代自交以生成&群體。使用F2群體(其由500個個體組成)來鑑定Rf4基因和與Rf4基因連鎖(例如，連鎖；緊密連鎖；或極端緊密連鎖)的標誌物。精細定位BE4207/XJH58F3 群體在威斯康星州阿靈頓(Arlington, Wisconsin)在2010年夏季苗圃中種植總共5465個種子，所述種子選自染色體8頂部的4.2Mb區內的不同片段方面分離的確認F2群體的15個雜合F2家族。從5104個萌發的幼苗收集葉樣品以基因型分型。能育性分類。根據從雄穗脫落的花粉將此&群體中的500個植物在表型上分類。將脫落花粉的植物分類為能育的。將不脫落花粉的植物分類為不育的。此群體中的Rf4恢復是完全的；沒有觀察到部分能育的植物。DNA提取和量化。從F2群體的每個植物收集葉組織的8個衝孔,並通過使用Biocel 1800 (AgilentInc.，Santa Clara, CA)提取DNA。使用的DNA提取方法是:(I)將I個約.32cm直徑鎢合金珠添加至每個管；(2)將300 μ L RLT裂解緩衝液(Qiagen Inc., Germantown, MD)添加至每個管；(3)加帽，並在 SPEX2000 Geno/GlinderK (OPS Diagnostics, LLC, Lebanon, NJ)
中以1500擊/分鐘研磨6分鐘；(4)以6000rpm將樣品向下旋轉5分鐘；(5)使管脫帽；在扮00611￥1800·上實施下列步驟:(6)將200yL上清液轉移至1.1mL含有IOyL
MagAttract"懸浮液G珠(Qiagen Inc.)的正方形孔圓底測定板；(7)溫育2分鐘；(8)以
1200rpm搖動40秒；(9)溫育2分鐘；(10)將測定板放置到磁體架上，並容許珠分離40秒；(11)除去上清液；(12)第一次清洗:添加190 μ L與RNA酶和異丙醇預混合的RPW 清洗緩衝液，並以1200rpm搖動40秒；(13)將測定板放置到磁體架上，並容許珠分離20秒；(14)除去上清液；(15)第二次清洗:添加190μ L100%乙醇清洗緩衝液，並以1200rpm搖動40秒；(16)將測定板放置到磁體架上，並容許珠分離20秒；(17)第三次清洗:添加190 μ L100%乙醇清洗緩衝液；(18)以1200rpm搖動40秒；(19)將測定板放置到磁體架上，並容許珠分離20秒；(20)除去上清液；(21)於室溫將板溫育5分鐘；(22)添加100 μ L ΑΕ 洗脫緩衝液(Qiagen Inc.) ； (23)搖動2分鐘；(24)將測定板放置到磁體架上，並容許珠分離30秒；並(25)將上清液轉移至清潔的、標記的板，並密封。將DNA於4° C貯存。通過使用PicoGreen (Invitrogen Inc., Carlsbad, CA)量化 DNA,並相對於 5_6ng/ μ L 標準化濃度以用於 KASPar 基因型分型系統(KBioscience Inc.，Hoddesdon, UK)。KASPar SNP基因型分型系統。競爭性等位基因特異性PCR基因型分型系統(KASPar )是一種SNP檢測系統，其使用基於等位基因特異性寡聚物延伸和螢光共振能量轉移(FRET)的技術來產生信號。KASPar 測定法中的每種SNP標誌物僅需要兩種組分:測定混合物(三種未標記的引物的混合物:兩種等位基因特異性寡聚物，和一種共同反向基因座特異性寡聚物)；和反應混合物(PCR需要的其它組分，包括通用螢光報告系統和Taq聚合酶)。
使用Kbioscience實驗室信息管理系統(KLIMS ) (KBioscience Inc.)設計引物，並且寡核苷酸由Integrated DNA Technology (CoralviIle, IA)合成。依照製造商的推薦實施KASPar 反應。PCR以於94° C變性15分鐘開始，接著是於94° C變性10秒，於57° C退火5秒，然後於72° C延伸10秒的20個循環，這20個循環繼之以於94° C變性10秒，於57° C退火20秒，然後於72° C延伸40秒的22個循環。在螢光分光光度計(Tecan GENios , Mannedorf, Switzerland)中以 485nm 的激發波長，和 535nm 的發射波長(對於FAM突光團)；以及525nm的激發波長,和560nm的發射波長(對於VIC突光團)閱讀完成KASPar 反應後的突光信號。使用Klustercaller 軟體(KBiosciences Inc.)分析數據以測定群體中每種SNP標誌物的基因型。RNA 提取和實時 PCR(RT-PCR)在溫室中培養親本和Rf4區方面分離的F3植物。從5周、7周、和9周齡植物收集葉組織。還收集具有形成的花葯/花粉和脫落的花粉(在能育植物中)的雄穗組織。使用RNeasy 植物迷你試劑盒(Qiagen Inc.)提取總RNA。使用QuantiTect 反轉錄試劑盒(Qiagen Inc.)合成cDNA。對於RT-PCR，Rf4基因特異性引物、玉米轉化酶對照引物、和用FAM或VIC和小溝結合非螢光淬滅劑 I (MGBNFQ)染料雙重標記的探針由Applied Biosystems (Foster City, CA)合成。使用 TaqMan 基因型分型主混合物(AppliedBiosystems)來建立 10 μ IPCR 反應，並在 LightCycler 480 (Roche)上實施 PCR。PCR 程序包括:於95 ° C活化10分鐘，接著95 ° C持續10秒和58 ° C持續38秒的50個循環。在每個循環結束時記錄螢光信號。使用轉化酶作為對照使用Delta CT法計算相對表達水平。實施例2 =Rf4基因的定位能育性分離分析。F2群體中能育性分離的比率是3:1。表I。結果表明CMS-C/Rf4系統中的能育性恢復受到一種顯性恢復系基因Rf4控制。表1:來自確認群體的表型數據。
權利要求
1.一種用於鑑定包含玉米C型細胞質雄性不育的功能性恢復系基因的植物的方法，該方法包括: 自植物分離核酸分子；和 對分尚的核酸分子篩選如下的核酸分子，該核酸分子包含選自由SEQ ID N0:l_197組成的組的核苷酸序列和表3中稱為多態性ID N0.1-106的標誌物，或其等同物，其中包含選自由SEQ ID NO: 1-197組成的組的核苷酸序列和表3中稱為多態性ID N0.1-106的標誌物，或其等同物的核苷酸序列的至少一種核酸分子的存在指示玉米C型細胞質雄性不育的功能性恢復系基因。
2.依照權利要求1的方法，其中所述分離的核酸分子包含如下的核酸分子，該核酸分子包含選自由SEQ ID NO: 1-197組成的組的核苷酸序列和染色體8上在表3中稱為多態性ID N0.1-106的標誌物。
3.依照權利要求1的方法，其中所述分離的核酸分子是基因組DNA。
4.依照權利要求1的方法，其中使用競爭性等位基因特異性聚合酶鏈式反應實施對所述分尚的核酸分子篩選如下的核酸分子，該核酸分子包含選自由SEQ ID ΝΟ:1_197組成的組的核苷酸序列和表3中稱為多態性ID N0.1-106的標誌物，或其等同物。
5.依照權利要求1的方法，其中所述核苷酸序列選自下組:SEQID NO:6-9; SEQID NO:105;SEQ ID NO:109;SEQ ID NO:111;SEQ ID NO:115;SEQ ID NOs:118-120;SEQID NO:123;SEQ ID NO:126;SEQ ID NO:134;SEQ ID NO:135;SEQ ID NO:137;SEQID NO:138;SEQ ID NO:144;SEQ ID NO:149;SEQ ID NO:151;SEQ ID NO:160;SEQ IDNO:163;SEQ ID NO:164;SEQ ID NO:167;SEQ ID NO:173;SEQ ID NO:177;SEQ IDNO: 178; SEQ ID NO: 183; SEQ ID NO: 189-191; SEQ ID NO: 197;及表 3 中稱為多態性 IDN0.1-106的標誌物。
6.依照權利要求5的方法，其中所述核苷酸序列選自由SEQID NO:8和DAS-CMS1-34組成的組。
7.依照權利要求5的方法，其中所述核苷酸序列選自下組:SEQID NO: 105, SEQID NO:109, SEQ ID NO:111，SEQ ID NO:115，SEQ ID NO:118，SEQ ID NO:119，SEQ IDNO: 120, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 126,和 SEQ ID NO: 134，以及表 3 中稱為多態性 IDN0.1-106的標誌物。
8.依照權利要求1的方法,進一步包括表3中稱為多態性IDN0.1-106的每種標誌物測定所述植物的基因型。
9.通過依照權利要求1的方法鑑定的植物。
10.依照權利要求9的植物，其中所述植物在與具有響應玉米C型細胞質雄性不育性狀的植物雜交時沒有生成大量半能育植物。
11.一種用於分離玉米中的Rf4基因的方法，該方法包括: 將具有C型細胞質雄性不育性狀的雄性不育玉米植物與具有響應C型細胞質雄性不育性狀的雄性不育恢復系玉米植物雜交以生成F1玉米植物； 將所述F1玉米植物自交以生成F2玉米植物； 將多個所述F2玉米植物的能育性表型分類； 測定與自所述多個F2 玉米植物之每個分離的基因組DNA的染色體8的位置86247到位置98188對應的區域的至少一部分的核苷酸序列； 鑑定與染色體8的位置86247到位置98188對應的區域內與恢復的能育性表型具有最高連鎖頻率的編碼序列，其中鑑定的編碼序列是玉米中的Rf4基因。
12.依照權利要求11的方法，其中所述具有C型細胞質雄性不育性狀的雄性不育玉米植物是BE4207。
13.依照權利要求11的方法，其中所述具有響應C型細胞質雄性不育性狀的雄性不育恢復系玉米植物是XJH58。
14.依照權利要求11的方法，其中所述具有C型細胞質雄性不育性狀的雄性不育玉米植物是BE4207，且其中所述具有響應C型細胞質雄性不育性狀的雄性不育恢復系玉米植物是 XJH58。
15.依照權利要求11的方法，其中所述Rf4基因是螺旋-環-螺旋轉錄因子GRMZM2G021276(Rf4-bHLH)。
16.依照權利要求11的方法，其中所述多個F2玉米植物包含至少500個玉米植物。
17.依照權利要求11的方法，其中所述多個F3玉米植物包含至少5000個玉米植物。
18.—種在玉米中恢復細胞質雄性不育的方法，所述方法包括: 將具有C型細胞質雄性不育性狀的雌性不育玉米植物與具有響應C型細胞質雄性不育性狀的雄性不育恢復系玉米植物雜交以生成F1玉米植物； 使用標誌物輔助選擇來鑑定包含核酸分子的F1玉米植物，所述核酸分子包含選自由SEQ ID NO: 1-197組成的組的核苷酸序列和表3中稱為多態性ID N0.1-106的標誌物；並 繁殖鑑定的F1玉米植物，由此在玉米中恢復雄性不育。
19.依照權利要求18的方法，其中所述核苷酸序列選自下組:SEQID NO:6-9; SEQID NO:105;SEQ ID NO:109;SEQ ID NO:lll;SEQ ID NO:115;SEQ ID NOs:118-120;SEQID NO:123;SEQ ID NO:126;SEQ ID NO:134;SEQ ID NO:135;SEQ ID NO:137;SEQID NO:138;SEQ ID NO:144;SEQ ID NO:149;SEQ ID NO:151;SEQ ID NO:160;SEQ IDNO:163;SEQ ID NO:164;SEQ ID NO:167;SEQ ID NO:173;SEQ ID NO:177;SEQ IDNO: 178; SEQ ID NO: 183; SEQ ID NOs: 189-191; SEQ ID NO: 197;及表 3 中稱為多態性 IDN0.1-106的標誌物。
20.依照權利要求18的方法，其中所述核苷酸序列選自下組:SEQID NO: 105, SEQID NO:109, SEQ ID NO:111, SEQ ID NO:115, SEQ ID NO:118, SEQ ID NO:119, SEQ IDNO: 120，SEQ ID NO: 123，SEQ ID NO: 126，SEQ ID NO: 134，及表3 中稱為多態性 ID N0.1-106的標誌物。
21.—種在玉米中恢復能育性的方法，該方法包括將權利要求15的分離的Rf4-bHLH基因導入具有C型細胞質雄性不育性狀的雌性玉米植物中。
22.依照權利要求21的方法，其中通過與包含所述Rf4-bHLH基因的雄性不育恢復系玉米植物雜交將所述Rf4-bHLH基因導入所述具有C型細胞質雄性不育性狀的雌性玉米植物中。
23.一種用於生成雜種玉米種子的方法，該方法包括: 用來自包含Rf4-bHLH基因的雄性玉米植物的花粉使具有CMS-C型雄性不育性狀的雌性玉米植物受精 ；並自所述雌性玉米植物獲得雜種玉米種子。
24.一種用於生成雜種玉米種子的方法，該方法包括: 提供具有C型細胞質雄性不育性狀的雌性玉米植物； 用來自權利要求15的包含Rf4-bHLH基因的雄性玉米植物的花粉使所述雌性玉米植物受精；並 收穫所述雌性玉米植物上形成的雜種玉米種子。
25.—種用於生成雜種種子的方法,該方法包括: 獲得如下的核酸分子，其包含SEQ ID N0:220的玉米Rf4-bHLH序列，或與SEQ IDNO: 220的玉米Rf 4-bHLH序列特異性雜交的核苷酸分子； 將所述核酸分子導入期望物種的植物細胞或植物組織中以生成所述期望物種的經轉化的植物細胞或植物組織； 從已經導入所述核酸分子的所述植物細胞或植物組織生成所述期望物種的經轉化的全植物； 用來自所述期望物種的經轉化的全植物的花粉使所述期望物種的細胞質雄性不育雌性植物受粉；並 自受粉的細胞質雄性不育雌性植物獲得雜種種子。
26.權利要求25的方法，其中所述期望的物種選自下組:玉米；大豆；苜蓿；小麥；油菜籽；稻；高粱；甜菜；短柄·草屬(Brachypodium);單子葉植物；雙子葉植物；黃瓜；番爺；胡椒；蘋果樹；梨樹；桃樹；樓桃樹；紅杉(redwood);松；橡樹；和開花觀賞植物。
27.一種分離的玉米Rf 4-bHLH基因，其包含與以SEQ ID NO: 220列出的核苷酸序列基本上同源的核苷酸序列。
28.權利要求27的玉米Rf4-bHLH基因的功能性變體。
29.權利要求27的玉米Rf4-bHLH基因的同源物，其中所述同源物是來自與玉蜀黍不同的植物的天然基因。
30.一種分離的核酸分子，其編碼包含與SEQ ID NO:225基本上同源的胺基酸序列的多肽。
31.一種包含權利要求30的核酸分子的植物，其中所述植物不是玉蜀黍。
32.—種生成遺傳工程化生物體的方法，包括將權利要求30的核酸分子導入該生物體中。
33.一種從植物分離Rf4同源物的方法，該方法包括: 從植物獲得基因組DNA ； 使所述基因組DNA與同權利要求30的核酸分子特異性雜交的核苷酸序列接觸；並分離與所述核苷酸序列特異性雜交的DNA的一個或多個基因組序列，所述核苷酸序列與權利要求30的核酸分子特異性雜交，其中所述基因組DNA的一個或多個序列是Rf 4-bHLH同源物。
34.一種在玉米中恢復細胞質雄性不育的方法，該方法包括: 將具有C型細胞質雄性不育性狀的雌性不育玉米植物與包含對CMS-C玉米恢復能育性的手段的雄性不育恢復系玉米植物雜交以生成F1玉米植物； 鑑定包含對CMS-C玉米恢復能育性的手段的F1玉米植物；並繁殖鑑定的F1玉米植物，由此在玉米中恢復雄性不育。
35.一種用於鑑定包含玉米C型細胞質雄性不育的功能性恢復系基因的植物的方法，該方法包括: 從植物分離核酸分子；並 使分離的核酸分子與用於鑑定攜帶對CMS-C玉米恢復能育性的基因的玉米植物的手段接觸以產生可檢測信號，該可檢測信號指示所述植物中玉米C型細胞質雄性不育的功能性恢復系基因的存在。
36.一種用於轉移玉米Rf4基因的方法，該方法包括: (a)用與至少一種與Rf4基因連鎖的標誌物特異性可雜交的探針分析具有供體基因型的第一植物的基因組DNA和具有受體基因型的第二植物的DNA ； (b)將兩種親本植物基因型有性雜交以獲得後代群體； (c)對所述後代群體分析所述至少一種與Rf4基因連鎖的標誌物的存在； (d)將來自包含所述至少一種與Rf4基因連鎖的標誌物的所述後代群體的個體與所述受體基因型回交以生成下一代群體； (e)測定所述下一代群體的成員是否包含來自所述受體基因型的期望性狀和所述Rf4基因；並 (f)若所述下一代群體的成員沒有包含來自所述受體基因型的期望性狀和所述Rf4基因，則重複步驟(d)和(e)，直到鑑定出包含來自所述受體基因型的期望性狀和所述Rf4基因的個體。
37.權利要求35的方法，其中在每個世代通過Rf4標誌物分析選擇在每個雜交和回交步驟中獲得的個體後代。
38.一種通過遺傳轉化將玉米Rf 4-bHLH基因導入宿主生物體中的方法，該方法包括: 用與同Rf4基因連鎖的標誌物特異性可雜交的探針分析植物的基因組DNA以鑑定所述植物中的所述Rf4基因； 分離所述植物的所述基因組DNA中與探針特異性雜交的區段，所述探針與同所述Rf4基因連鎖的標誌物特異性可雜交； 將基因組DNA的分離的區段導入所述宿主生物體中；並 用與同所述Rf4基因連鎖的標誌物特異性可雜交的探針分析所述宿主生物體的所述DNA以鑑定所述宿主生物體中的所述Rf4基因。
39.依照權利要求38的方法，其中DNA的所述分離的區段穩定整合入所述宿主生物體的基因組中。
40.依照權利要求38的方法，其中所述宿主生物體是開花植物。
41.依照權利要求40的方法，其中所述宿主生物體是玉蜀黍。
42.權利要求30的分離的核酸分子，其中所述多肽包含以SEQID NO:225列出的胺基酸序列中的突變，其選自下組: 在與SEQ ID NO:225中第103位對應的位置處天冬醯胺至組氨酸； 在與SEQ ID NO:225中第130位對應的位置處丙氨酸的缺失； 在與SEQ ID NO:225中第187位對應的位置處苯丙氨酸至酪氨酸； 及在與SEQ ID NO:225中第267位對應的位置處亮氨酸至脯氨酸。
43.權利要求42的分離的核酸分子，其中所述多肽在與SEQ ID NO:225中第187位對應的位置處包含酪氨酸 。
全文摘要
本發明內容關注Rf4的高解析度定位和候選基因克隆、對C型細胞質雄性不育恢復能育性的能育性基因玉米恢復系。公開內容還涉及與Rf4基因緊密連鎖，或駐留於Rf4基因內的分子標誌物。在一些實施方案中，提供了可以從包含與Rf4基因連鎖或駐留於Rf4基因內的核酸分子標誌物的雄性植物和攜帶C型CMS的雌性植物雜交生成雜種種子的方法。
文檔編號C12N15/82GK103249845SQ201180058697
公開日2013年8月14日 申請日期2011年9月26日 優先權日2010年10月6日
發明者R.任, B.A.內格爾, S.P.昆帕特拉, P.鄭, G.L.庫特, T.W.格雷恩, S.A.湯姆森 申請人:陶氏益農公司