一種含有NAD⁺或NADH的穩定的組合物的製作方法

2023-12-06 10:44:16 3

專利名稱：一種含有NAD+或NADH的穩定的組合物的製作方法
技術領域：
本發明屬生物技術領域，涉及了一種含有NAD+或NADH的穩定的組合物，以及增加NAD+或NADH穩定性的方法。
背景技術：
煙酸胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamideadenine dinucleotide,簡稱為 NAD),是一種轉遞電子的輔酶，它出現在細胞很多新陳代謝反應中。NADH是它的還原形式。NAD是脫氫酶的輔酶，如乙醇脫氫酶(ADH)，用於氧化乙醇。它在糖酵解、糖異生、三羧酸循環和呼吸鏈中發揮著不可替代的作用。中間產物會將脫下的氫遞給NAD，使之成為NADH。而NADH則會作為氫的載體，在呼吸鏈中通過化學滲透偶聯的方式，合成ATP。
在吸光方面，NADH在260nm和340nm處各有一吸收峰，而NAD則只有260nm —處吸收峰，這是區別兩者的重要屬性。這同時也是很多代謝試驗中，測量代謝率的物理依據。NAD在260nm的吸光係數為I. 78X IOL /(moI .cm)，而NADH在340nm的吸光係數為6. 2X IOL/(mo I · cm)。NAD在體外診斷試劑配方上有很多應用比如乳酸脫氫酶試劑、丙氨酸轉移酶試齊U、天冬氨酸氨基轉移酶試劑、尿素試劑盒、α-羥丁酸脫氫酶等。因此本保護劑有較廣泛的應用。NAD和NADH輔酶是不穩定的。NAD是鹼不穩定的分子，還原形式的NADH對酸不穩定，如差向異構化是已知的降解途徑。在現有技術中，穩定NAD和NADH的手段有(1)如CN200680027359. I所公開的(
公開日2008-07-30)，通過製備衍生物的方法使之穩定，或對儲存環境的特殊要求，如冷卻或者乾燥儲存增加其穩定性。(2)如CN200680027359. I所公開的(
公開日2008-07-30)，採用穩定劑，如海藻糖、聚乙烯吡咯烷酮和血清清蛋白形成聚合物網絡而增加NAD或NADH的穩定性。(3)如CN87100939所公開的(
公開日1987-11-04)，以鹼性水溶液環境、多羥基烷基溶劑(20-90%V/V)如丙二醇、硼酸增加其穩定性。(4)如CN200410043900. O所公開的(
公開日2005-05-18)，採用表面活性劑如O. I 2ml吐溫-20增加其穩定性。發明人注意到，即使在並不劇烈的條件下(比如含水溶液中)，輔酶NAD和NADH僅僅通過環境溼度進行水解也會導致測量結果不精確。因此，發明人意識到提高NAD+和NADH在體外溶解狀態時的穩定性將對提高測量結果的精確性具有重要作用。

發明內容
本發明的目的在於提供一種含有NAD+或NADH的穩定的組合物，本發明組合物可提高NAD+和NADH在體外溶解狀態時的穩定性。本發明的另一目的在於提供一種穩定NAD+或NADH的方法。本發明的另一目的在於提供一種包含海藻糖、甘油、緩衝液和表面活性劑的組合物及其用途，即用於增加NAD+或NADH的穩定性。
本發明的目的可通過以下技術方案實現通過使用將海藻糖、甘油、緩衝液、表面活性劑混合組成一定的溶液，然後再將NAD+和/或NADH溶解其中。上述物質組合在本發明中稱為穩定劑，通過研究發現能夠顯著提高溶解狀態的NAD+和/或NADH的穩定性。具體來說，本發明含有NAD+或NADH的穩定的組合物包括NAD+或NADH以及所述的穩定劑，所述穩定劑包括海藻糖、甘油、緩衝液和表面活性劑。NAD+或NADH在組合物中的含量為 3-40g/l。本發明通過使用穩定劑提高NAD+和/或NADH在溶解狀態的穩定性，穩定劑可以由以下物質按照不同比例組合
(I)海藻糖，含量為10g/l 60 g/Ι，進一步優選為30g/l 40 g/1。(2)甘油含量為5g/l 30g/l，進一步優選為15g/l 20g/l。 (3)緩衝液可為tris鹽緩衝液、goods鹽緩衝液、磷酸鹽緩鹽衝液、碳酸鹽緩衝液或這些緩衝液的組合。所述Tris緩衝液中，Tris的含量為50mmol/l 100mmol/l。所述磷酸鹽緩衝液中磷元素的含量為50mmol/l lmol/1。(4)表面活性劑可為吐溫20、吐溫80、聚氧乙烯月桂醚、聚乙二醇、SDS或者這幾種物質的混合物，其中，所述吐溫20含量為llg/Ι 10g/l，吐溫80含量為lg/Ι 10g/l，聚氧乙烯月桂醚含量為lg/Ι 10g/l。聚乙二醇含量為lOmmol/1 500mmol/l，SDS含量為 lg/Ι 10g/lo如上所述的穩定劑用於增加NAD+或NADH穩定性的用途。所述穩定劑可用於乳酸脫氫酶試劑、丙氨酸轉移酶試劑、天冬氨酸氨基轉移酶試劑、尿素試劑盒的配製。本發明進一步提供一種穩定NAD+或NADH的方法，包括將NAD+或NADH溶解於含有海藻糖、甘油、緩衝液、表面活性劑的溶液中。所述溶液中，海藻糖含量為10g/l 60 g/I，甘油含量為5g/l 30g/l，緩衝液可為tris鹽緩衝液、goods鹽緩衝液、磷酸鹽緩鹽衝液、碳酸鹽緩衝液或這些緩衝液的組合，所述Tris緩衝液中，Tris的含量為50mmol/l lOOmmol/1，所述磷酸鹽緩衝液中磷元素的含量為50mmol/l lmol/1 ;表面活性劑可為吐溫20、吐溫80、聚氧乙烯月桂醚、聚乙二醇、SDS或者這幾種物質的混合物，其中，所述吐溫20含量為llg/Ι 10g/l，吐溫80含量為lg/Ι 10g/l，聚氧乙烯月桂醚含量為lg/Ι 10g/l。聚乙二醇含量為 10mmol/l SOOmmol / I, SDS 含量為 lg/Ι 10g/l。本發明通過將海藻糖、甘油、緩衝液、表面活性劑應用於提高NAD+或NADH的穩定性，顯著提高了 NAD+和NADH在體外溶解狀態時的穩定性，在常規的儲存條件下保持期可達到十八個月。發明人通過對比實驗發現，未採用本穩定劑時，在相同儲存條件下保持期一般為十二個月。本發明可以應用到乳酸脫氫酶試劑、丙氨酸轉移酶試劑、天冬氨酸氨基轉移酶試齊U、尿素試劑盒、α -羥丁酸脫氫酶等試劑盒的配製過程，因此具有較廣的應用價值。以下結合具體實施例進一步說明本發明，應理解，具體實施方式
僅用於說明本發明，而非限制本發明。
具體實施例方式實施例I
本發明在乳酸脫氫酶試劑盒中的應用首先配製試劑盒試劑I :乳酸40mmol/l, 100mmol/l Tris溶液,使用lmol/1鹽酸或氫氧化鈉調節pH至9. 2。再配製試劑盒試劑2 :含有海藻糖10g/l，甘油lg/1，Tris O. lmol/1，吐溫20
O.lg/Ι的溶液,然後使用lmol/1鹽酸或氫氧化鈉將其pH調至7. O,再稱取若干NAD+溶解到IOml上述保護劑中，使其濃度達到20g/l，攪拌 均勻。上述試劑I和試劑2組成乳酸脫氫酶試劑盒，本試劑盒在2 8 °C保持期可達到十八個月。通過對比試驗，未加穩定劑的乳酸脫氫酶試劑盒在相同條件下僅可保持十二個月。實施例2
本發明在在α-羥丁酸脫氫酶試劑盒的應用
首先配製試劑盒試劑I :含有海藻糖5g/l，甘油10g/l ,Tris O. lmol/1，吐溫20 O. 5g/I的溶液，然後將其PH調至7. 0，再稱取IOmg NAD溶解到IOml上述保護劑中，攪拌均勻。再配製試劑盒試劑2 :硝酸50mmol/l溶液，α -氧絡丁酸3mmol/l。調節pH至
7.5。上述試劑I和試劑2組成α -羥丁酸脫氫酶試劑盒，本試劑盒在2 8°C保持期可達到十八個月。通過對比試驗，未加穩定劑的乳酸脫氫酶試劑盒在相同條件下僅可保持十二個月。
權利要求
1.含有NAD+或NADH的穩定的組合物，其特徵在於，含有NAD+或NADH以及穩定劑，所述穩定劑包括海藻糖、甘油、緩衝液、表面活性劑。
2.如權利要求I所述的含有NAD+或NADH的穩定的組合物，其特徵在於，所述海藻糖含量為 10g/l 60 g/1。
3.如權利要求I所述NAD+或NADH的穩定的組合物，其特徵在於，所述甘油含量為5g/I 30g/l。
4.如權利要求I所述NAD+或NADH的穩定的組合物，其特徵在於，所述緩衝液可為Tris緩衝液、goods鹽緩衝液、磷酸鹽緩鹽衝液、碳酸鹽緩衝液或這些緩衝液的組合。
5.如權利要求4所述的NAD+或NADH的穩定的組合物，其特徵在於，所述Tris緩衝液中，Tris 的含量為 SOmmol/ I 100mmol/l。
6.如權利要求4所述的NAD+或NADH的穩定的組合物，其特徵在於，所述磷酸鹽緩衝液中磷元素的含量為50mmol/l lmol/1。
7.如權利要求I所述的NAD+或NADH的穩定的組合物，其特徵在於，所述表面活性劑可為吐溫20、吐溫80、聚氧乙烯月桂醚、聚乙二醇、SDS或者這幾種物質的混合物，其中，所述吐溫20含量為llg/Ι 10g/l，吐溫80含量為lg/Ι 10g/l，聚氧乙烯月桂醚含量為Ig/I 10g/l，聚乙二醇含量為 10mmol/l SOOmmol/ I, SDS 含量為 lg/Ι 10g/l。
8.如權利要求I所述的NAD+或NADH的穩定的組合物，其特徵在於，所述pH值為5.0_7· O ο
9.如權利要求I所述的NAD+或NADH的穩定的組合物，其特徵在於，所述穩定劑包括海藻糖，含量為10g/l 60 g/Ι ;甘油，含量為5g/l 30g/l ；Tris鹽緩衝液，以Tris的含量計，為50mmol/l 100mmol/l ;吐溫20，含量為llg/Ι 10g/l。
10.如權利要求I至9任一所述的穩定劑的用途，其特徵在於，用於增加NAD+或NADH穩定性的用途。
11.如權利要求I至9任一所述的穩定劑的用途，其特徵在於，所述穩定劑用於乳酸脫氫酶試劑、丙氨酸轉移酶試劑、天冬氨酸氨基轉移酶試劑、尿素試劑盒的配製。
12.一種穩定NAD+或NADH的方法，其特徵在於，將NAD+或NADH溶解於含有海藻糖、甘油、緩衝液和表面活性劑的混合溶液中，混合溶液的PH為5. 0-7. O。
13.如權利要求12所述的方法，其特徵在於，所述溶液中，海藻糖含量為10g/l 60g/Ι，甘油含量為5g/l 30g/l，緩衝液可為Tris鹽緩衝液、goods鹽緩衝液、磷酸鹽緩鹽衝液、碳酸鹽緩衝液或這些緩衝液的組合，所述Tris緩衝液中，Tris的含量為50mmol/l lOOmmol/1，所述磷酸鹽緩衝液中磷元素的含量為50mmol/l lmol/1 ;表面活性劑可為吐溫20、吐溫80、聚氧乙烯月桂醚、聚乙二醇、SDS或者這幾種物質的混合物，其中，所述吐溫20含量為llg/Ι 10g/l，吐溫80含量為lg/Ι 10g/l，聚氧乙烯月桂醚含量為lg/Ι 10g/l，聚乙二醇含量為 10mmol / I SOOmmol / I , SDS 含量為 I g/Ι 10g/l。
全文摘要
本發明提供了一種含有NAD+或NADH的穩定的組合物，可使NAD+和NADH長期穩定保持其生物活性。本發明通過使用包括海藻糖、甘油、緩衝液、表面活性劑的穩定劑而提高NAD+和NADH溶解狀態穩定性。本發明還提供一種穩定NAD+或NADH的方法，以及提供海藻糖、甘油、緩衝液、表面活性劑和PH值調整劑組合物用於增加NAD+或NADH的穩定性的用途。本發明可用於乳酸脫氫酶試劑、丙氨酸轉移酶試劑、天冬氨酸氨基轉移酶試劑、尿素試劑盒等，具有廣泛的用途。
文檔編號C07H21/02GK102863495SQ201110188028
公開日2013年1月9日 申請日期2011年7月6日 優先權日2011年7月6日
發明者王輝, 王軍峰, 吳靜, 孟菲, 王宇飛 申請人:上海執誠生物科技股份有限公司