微生物交叉抗原的篩選與鑑定方法
2024-02-12 03:03:15
專利名稱：微生物交叉抗原的篩選與鑑定方法
技術領域：
本發明涉及一種高通量篩選和鑑定微生物交叉抗原的方法。
背景技術：
業已證明，採用疫苗接種是預防微生物性疾病的有效途徑。由於病原菌較多，對所有病原菌逐一進行接種具有一定困難。這在養殖動物微生物性疾病的預防上，表現得極為突出。因為在實際生產中，如針對養殖動物的所有常見致病菌逐一進行免疫在經濟上和操作上是不可能的。因此，研製新型疫苗，以控制有關疾病，特別是養殖動物病害是一項緊迫任務。有學者發現不同細菌間的脂多糖(LPS)和核心抗原具有交叉保護作用。新近，我們發現嗜水氣單胞菌和溫和氣單胞菌之間具有明顯的交叉保護作用，並採用蛋白質組學結合免疫保護攻毒技術從嗜水氣單胞菌的外膜蛋白質中發現了2個多價疫苗靶位。這些結果說明，細菌間存在交叉中和原性基因。因此，研製基因工程多價疫苗將成為今後疫苗發展的最重要方面。多價疫苗靶位來自具有交叉反應的免疫原，但採用常規方法從全部微生物蛋白質中鑑定所有具有交叉免疫原性的蛋白質十分困難。目前對交叉免疫原的發現往往是從一種偶然觀察到的交叉免疫現象中認定，或者是對單個基因的確定，因此，效率不高。蛋白質組學(proteomics)是一種高通量篩選的技術，是功能基因組研究的重要平臺，通過由蛋白質組學與免疫印跡(Western blotting)技術相結合而發展起來的免疫蛋白質組學(immunoproteomics)技術，已在患者血清中鑑定了白色鏈球菌(Candida albicans)和砂眼衣原體(Chlamydia trachomatis)的免疫原性蛋白質。這些免疫性抗原可作為監測疾病進展的一種指標，將成為研製新疫苗的對象，有助於擺脫傳統疫苗研製的束縛，加快新疫苗的研製。但現有的免疫蛋白質組學技術僅能確定具有免疫原性的蛋白質，而無法確定該蛋白質是否具有交叉免疫原性。
發明內容
本發明旨在提供一種高通量篩選和鑑定微生物交叉抗原的方法，其技術方案是利用雙向電泳(2-DE)技術使微生物蛋白質展示在一個平面上，再採用多種抗血清(同種抗血清和異種抗血清)的免疫蛋白質組學技術，確定具有交叉免疫原性的蛋白質，最後採用質譜技術分析和鑑定這些免疫原。
本發明所說的微生物交叉抗原的篩選和鑑定方法的具體步驟如下
1)用雙向電泳法分離微生物蛋白質將微生物收集後，按質量比微生物∶超聲緩衝液＝1∶2～4加入超聲緩衝液，超聲波破碎，然後進行雙向電泳。
2)雙向電泳後，進行免疫轉印，分別採用多種抗血清作為第一抗體，酶標抗體為第二抗體，用聯苯二胺(DAB)或電化學發光試劑(ECL)顯色，當作為第一抗體的抗血清有2種以上為陽性時，該點即為具有交叉免疫原性的蛋白質。
3)再分析這些免疫原的交叉程度和範圍，陽性抗血清越多，交叉反應範圍越大；陽性顯色越強，交叉反應程度越好。
4)免疫原的定性取出具有交叉免疫原性的全部蛋白質，按常規質譜樣品處理方法進行樣品製備，然後進行質譜和生物信息分析，以確定抗原的蛋白質種類。
所說的微生物為細菌，真菌，病毒。
所說的超聲緩衝液可選用Tris-HCl或乙二胺四醋酸鹽(EDTA)等。
超聲破碎時所採用的輸出功率、時間、次數和時間間隔等可按研究對象進行調整，一般可採用每次10～20秒，間隔20～40秒，超聲2～4次。
所說的多種抗血清選用抗同種微生物和異種微生物的特異性抗血清。
本發明先利用雙向電泳技術使細菌或病毒蛋白質展示在一個平面上，再採用同種和異種血清的Western blotting以確定具有免疫原性的蛋白質，最後利用質譜技術和生物信息分析確定這些交叉免疫原性蛋白質的種類。從而建立了一種採用多種抗血清作為第一抗體的免疫蛋白質組學技術，用於高通量篩選具有交叉免疫原性的蛋白質以作為多價疫苗的候選靶位。根據免疫原的交叉程度和範圍，可以確定其作為交叉免疫原的可能性及其作用範圍。本發明可迅速確定某種微生物的具有交叉免疫原性的全部蛋白質，從而達到高效、快速、經濟、實用的優選交叉免疫原的目的。本發明能夠高通量篩選具有交叉原性的疫苗候選位點，為確定作為多價疫苗靶位的基因奠定了紮實基礎，提高了製備多價疫苗靶點的效率。由於所有微生物作為抗原免疫動物後，機體均會產生針對其抗原的特異性抗體，這些抗體均可以作為第一抗體進行Western blotting試驗，用於篩選交叉免疫原。故本發明的原理與方法具有普遍性，不僅可以用於細菌，而且還可以用於真菌和病毒等微生物交叉抗原的鑑定。
本發明進一步發展了免疫蛋白質組學技術，即建立一種採用多種抗血清作為第一抗體的免疫蛋白質組學技術，從而可以確定與一種以上抗血清發生免疫反應的蛋白質。由於這一設計是基於高通量篩選的蛋白質組學技術，故不僅可以快速確定某種微生物中所具有的交叉免疫原，而且可以得知這些免疫原的交叉範圍。根據這些免疫原的交叉程度和範圍，可以確定作為多價疫苗靶位的可能性和作用範圍。
圖1為副溶血弧菌的雙向電泳及其自身和異種抗血清的免疫轉印結果。其中，A、副溶血弧菌外膜蛋白質的2-DE圖譜；B、副溶血弧菌抗血清與副溶血弧菌外膜蛋白質的2-DEWestern-blot結果；C、嗜水氣單胞菌抗血清與副溶血弧菌外膜蛋白質的2-DEWestern-blot結果；D、河弧菌抗血清與副溶血弧菌外膜蛋白質的2-DE Western-blot結果；E、溶藻弧菌抗血清與副溶血弧菌外膜的2-DE Western-blot結果。
圖2為大腸桿菌的2-DE及其自身和異種抗血清的Western blotting結果。其中，A、大腸桿菌外膜蛋白質的2-DE圖譜；B、溫和氣單胞菌抗血清與大腸桿菌外膜蛋白質的2-DEWestern-blot結果；C、大腸桿菌抗血清與大腸桿菌外膜蛋白質的2-DE Western-blot結果；D、副溶血弧菌抗血清與大腸桿菌外膜蛋白質的2-DE Western-blot結果；E、河弧菌抗血清與大腸桿菌外膜蛋白質的2-DE Western-blot結果。
具體實施例方式
以下實施例將結合附圖對本發明的工藝步驟及其突出效果作進一步說明。
實施例11、細菌培養、計數、收集和破碎微生物採用副溶血弧菌，為本室保存菌種。將副溶血弧菌接種於LB培養基，28℃搖床培養18h，作為種子菌。而後以1∶50(菌液∶培養基)(體積比)比例接種於上述同種培養基，28℃搖床培養18h。培養結束後，取2mL菌液進行平板菌落計數。其餘培養液於4000rpm離心10min，收集菌體，用生理鹽水洗滌菌體3次，稱菌體重，再用以1∶3(質量比)的比例加入超聲破碎緩衝液(50mmol/L Tris-HCl，1mmol/LEDTA)。用超聲細胞破碎儀超聲破碎。超聲破碎採用輸出功率40％，每次10～20秒，間隔20～40秒，超聲2～4次。
2、抗病原菌抗血清的製備培養18h的副溶血弧菌、溶藻酸弧菌、嗜水氣單胞菌、河弧菌，4000rpm離心10min；用0.65％生理鹽水懸浮，血球計數板計數，將菌液稀釋至1×108個/mL；分別注射小鼠，每隻0.1mL，對照組注射生理鹽水；每隔1周注射1次；第3周免疫後的第10天處死小鼠取血，靜置；4000rpm離心10min，取出血清，分裝，-20℃保存。
3、外膜蛋白的提取超聲破碎後的副溶血弧菌液，2500g，4℃離心10min，收集上清。上清液100，000g，4℃離心40min。棄上清，沉澱用2％月桂醯基氨酸鈉(配於50mmol/LTris-HCl，pH7.4)洗滌，室溫放置20min。100,000g，4℃離心40min。沉澱溶於一定體積超聲緩衝液中。用Bradford法測定樣品中蛋白質濃度。
4、雙向電泳法操作步驟第一向預電泳200V 15min，300V 30min，400V 2h，上樣(樣品為副溶血弧菌液)後電壓400V，18h等電聚焦後迅速取出膠條，平衡後移至10％十二烷基磺酸納一聚丙稀醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)膠上繼續電泳，其一端外側加上標準蛋白質，1％瓊脂糖封固。電泳結束後用考馬斯亮藍R-250染色，掃描，輸出照片。參見圖1-A，結果顯示，比較清楚的蛋白點40餘個。
5、Western-blotting操作步驟雙向電泳結束後，進行電轉，恆壓40V電轉過夜；電轉結束後，用麗春紅染色檢測電轉的效果；洗去麗春紅，加封閉液(脫脂奶粉用TTBS配製為5％終濃度)封閉，室溫孵育1h；三羥甲基氨基甲烷-鹽酸-吐溫20緩衝液(TTBS)洗膜，3次，每次5min；分別加入鼠抗副溶血弧菌、溶藻酸弧菌、嗜水氣單胞菌、河弧菌抗血清(用封閉液配製)，室溫孵育1h；取出膜，TTBS洗膜3次，每次10min；加入辣根過氧標記的山羊抗鼠抗體(用封閉液配製)，室溫孵育1h；取出膜，TTBS洗膜3次，每次10min；50mmol/LpH7.4 Tris-HCl洗膜5min；DAB顯色；終止反應，掃描，封好膜，保存。Western-blotting分析，結果有8個抗原出現明顯的交叉結合反應(見圖1-B～E)，分別編號為1～8。
6、質譜樣品的製備用一乾淨解剖刀切下目的蛋白點，從無蛋白質汙染區切下一塊大致相同的膠塊為對照，把膠塊切成約1mm3大小，置於0.5ml試管中，接著按以下步驟進行用50％乙腈(ACN)洗膠塊以脫掉考馬斯亮藍(2～3次×15min)，棄50％ACN；100％ACN覆蓋膠塊至白色，棄ACN；接著用0.1mol/L NH4HCO3泡脹，然後反覆用ACN/0.1mol/LNH4HCO3洗至無色，真空離心乾燥。用10mmol/L二硫蘇糖醇(DTT)/0.1mol/L NH4HCO3於56℃還原45min後，再用新鮮配置的55mmol/L碘乙醯胺/0.1mol/LNH4HCO3烷基化，避光30min。重複上述步驟至脫色乾淨。真空離心乾燥後加入胰酶(Trypsin)(12.5μg/mL)冰上孵育45min，吸掉多餘酶液後加入無酶消化液，37℃過夜。依次用5％三氟乙酸(TFA)和50％ACN/2.5％TFA反覆抽提1～2次，合併上清液，真空離心乾燥。點樣前加1～2μL 0.1％TFA溶解樣品。
7、肽質量指紋圖譜樣品的分析和資料庫查詢質譜樣品使用德國BRUKER公司的基質輔助雷射解析電離(ReFlexTMIII MALDI-TOF)質譜儀進行分析，反射模式，離子源加速電壓1為20kv，加速電壓2為23kv，N2雷射波長337nm，脈衝寬度為3ns，離子延遲提取2000ns，真空度1.4×10-7Torr，質譜信號單次掃描累加50次，並用標準蛋白分子峰作為外標校正質譜峰，正離子譜測定，獲得肽質量指紋圖譜。
通過Mascot(http//www.matrixscience.com.)資料庫選擇NCBI，種屬選擇otherproteobacteria.Peptident(http//www.expasy.org/tools/peptident.htmL).資料庫選擇Swiss-prot，種屬選擇其它細菌(other bacteria).用ExPASy Molecular Biology Server網站提供的Peptident軟體(http//www.expasy.org/tools/peptident.html)進行查詢。查詢條件肽質量指紋圖譜中的肽片段質量控制在800～3500，表觀分子量的誤差範圍為±20％，對表觀pI值未作要求，肽片段分子量最大容許誤差範圍為±0.5Da，每個肽允許有2個不完全裂解位點，物種來源選擇細菌，離子選擇[M+H]+(資料庫中的選項，無中文名)和單一同位素(monoisotopic)，最少匹配肽片段數規定為4，半胱胺酸為碘乙醯胺處理。鑑定結果見表1。
表1副溶血弧菌與自身和異種抗血清的交叉反應蛋白質的MALDI-TOF/MS鑑定
實施例2 除細菌改為大腸桿菌外，其餘均與實施例1相同。結果如下1、大腸桿菌細胞外膜的2-DE圖譜採用2-DE技術，對大腸桿菌的細胞外膜進行分析，結果發現約40個蛋白點，見圖2-A。
2、免疫原性蛋白確定採用Western blotting技術，分別以鼠抗溫和氣單胞菌、大腸桿菌、副溶血弧菌、河弧菌抗血清和HRP-兔抗小鼠為第一和第二抗體，按試驗程序進行Western blotting分析，結果有6個抗原出現明顯的結合反應，分別編號為1～6。大腸桿菌細胞外膜的Western blotting的結果見圖2-B～E。
3、MALDI-TOF肽質量指紋譜分析採用生物質譜對6個具有交叉免疫原性的蛋白點進行分析，分別得到各自的肽質量指紋圖譜。
根據獲得的肽指紋譜數據和分子量範圍及其他一些參數，通過Peptident軟體查詢SWISS-PROT資料庫中與之匹配的蛋白質，搜索結果如表2所示。
表2.大腸桿菌與自身和異種抗血清的交叉反應蛋白質的MALDI-TOF/MS鑑定
權利要求
1.微生物交叉抗原的篩選與鑑定方法，其特徵在於其步驟如下1)用雙向電泳法分離微生物蛋白質將微生物收集後，按質量比微生物∶超聲緩衝液＝1∶2～4加入超聲緩衝液，超聲波破碎，然後進行雙向電泳；2)雙向電泳後，進行免疫轉印，分別採用多種抗血清作為第一抗體，酶標抗體為第二抗體，用聯苯二胺或電化學發光試劑顯色，當作為第一抗體的抗血清有2種以上為陽性時，該點即為具有交叉免疫原性的蛋白質；3)再分析這些免疫原的交叉程度和範圍，陽性抗血清越多，交叉反應範圍越大；陽性顯色越強，交叉反應程度越好；4)免疫原的定性取出具有交叉免疫原性的全部蛋白質，按常規質譜樣品處理方法進行樣品製備，然後進行質譜和生物信息分析，以確定抗原的蛋白質種類。
2.如權利要求1所述的微生物交叉抗原的篩選與鑑定方法，其特徵在於所說的微生物為細菌，真菌，病毒。
3.如權利要求1所述的微生物交叉抗原的篩選與鑑定方法，其特徵在於所說的超聲緩衝液選用Tris-HCl或乙二胺四醋酸鹽。
4.如權利要求1所述的微生物交叉抗原的篩選與鑑定方法，其特徵在於超聲破碎時每次10～20秒，間隔20～40秒，超聲2～4次。
5.如權利要求1所述的微生物交叉抗原的篩選與鑑定方法，其特徵在於所說的多種抗血清選用抗同種微生物和異種微生物的特異性抗血清。
全文摘要
微生物交叉抗原的篩選與鑑定方法，涉及一種高通量篩選和鑑定微生物交叉抗原的方法。用雙向電泳法分離微生物蛋白質，再免疫轉印，多種抗血清作為第一抗體，酶標抗體為第二抗體，顯色後檢查其陽性；分析免疫原的交叉程度和範圍；免疫原的定性，確定抗原的蛋白質種類。建立了一種採用多種抗血清作為第一抗體的免疫蛋白質組學技術，用於高通量篩選具有交叉免疫原性的蛋白質以作為多價疫苗的候選靶位。根據免疫原的交叉程度和範圍，可以確定其作為交叉免疫原的可能性及其作用範圍。可迅速確定某種微生物的具有交叉免疫原性的全部蛋白質，高效、快速、經濟、實用。其方法具有普遍性，不僅可用於細菌，而且還可用於真菌和病毒等微生物交叉抗原的鑑定。
文檔編號G01N33/544GK1563982SQ20041003328
公開日2005年1月12日 申請日期2004年4月14日 優先權日2004年4月14日
發明者彭宣憲, 徐常新, 彭博, 王三英 申請人:廈門大學