一種fmr1基因5』端非編碼區cgg重複數目的pcr檢測方法

2024-01-19 10:35:15

專利名稱：一種fmr1基因5』端非編碼區cgg重複數目的pcr檢測方法
—種FMR1基因5，端非編碼區CGG重複數目的PCR檢測方
法發明所屬領域本發明涉及對X染色體FMRl基因異常所導致的幾種遺傳疾病的實驗室輔助診斷方法。該方法的建立旨在以分子生物學檢測方法作為臨床檢查的輔助手段，提高臨床診斷的正確率，並為相關遺傳病的產前篩查提供一種新的檢測手段。發明背景脆性X症候群，脆性X相關共濟失調綜合症和脆性X相關卵巢功能不足脆性X症候群(fragi 1 e χ syndrome，FXS)也被稱作脆性X染色體症候群或 Martin-Bell症候群，被首次報到於與20世紀60年代末，是一種X連鎖不完全顯性遺傳病。 患者從兒童期或少年期開始出現智力發育異常症狀和一系列異常外貌體徵。其主要症狀為1.智力低下，計算能力差，無數字的基本概念。抽象思維及推理能力方面均有明顯缺陷。 2.語言障礙，表現為會話和言語表達能力的發育嚴重遲緩，學語年齡延遲、詞彙量少、語言重複單調。3.行為障礙，表現為多動、注意力不集中。孤獨症也較常見。4.特殊面容包括頭圍增大、臉長、前額突出、虹膜顏色變淡、耳輪大、顎弓高、嘴大唇厚及下頃大而突出等。FXS的病因為X性染色體異常，具體地說是位於X染色體上的FMRl基因5』端非編碼區CGG重複序列的異常延長。已知正常人在此區段的CGG重複數目約為5-55個，臨床病人則多於200個(稱為『全突變型』)。此區段CGG重複數目在55-200個之間則被稱作『前突變』。男性只有一條X染色體，一旦發生異常則臨床症狀表現明顯。女性有兩條X染色體，當其中一條異常，另一條正常時可表現較輕的臨床症狀。兩條都異常時則症狀嚴重，但這種情況機率較低。因此，FXS的臨床發病率在男性中較在女性中為高。在男性中大約為人群的1200到2500分之一。在女性中大約為人群的1650到5000分之一。FXS約佔男性智力低下患者的4%到8%，是發病率僅次於唐氏症候群(Downsyndrome)的又一大類導致智力發育低下的遺傳病.近年研究發現，具有X染色體FMRl基因『前突變』的個體在年輕時雖可不表現任何臨床症狀。但有部分『前突變』攜帶者在老年期會發生類帕金森樣的震顫麻痺和共濟失調。其主要症狀為1.意向性震顫，即在注意力集中，伸手拿取物體或倒水時出現不可控的震顫。2.四肢肢端麻木。3.情緒不穩定，焦慮，易激惹，性格改變。4.短期記憶喪失，智力衰退。上述症狀將進行性發展，最終在發病後5-20年危及生命。這些症狀雖與帕金森氏症相似，但其發病機制與幹預、治療手段均有不同之處，故這部分病人應與帕金森氏症相區分而診斷為『脆性 X 相關共濟失調綜合症，(Fragile X-associated Tremor/Ataxia Syndrome, FXTAS)。由於對本病缺乏認識及缺乏簡便明確的實驗室檢查手段，這類病人目前在臨床上幾乎都被診斷為類帕金森氏症、阿爾茨海默氏病或老年痴呆而延誤治療。與FXS類似， FXTAS患者男性較女性為多且發病率隨年齡增長而升高，在50歲以上男性FMRl基因『前突變，攜帶者中FXTAS發病率為30%，70歲以上則達50%，80歲以上可達75%。據估算，在男性中約有1/500到1/800是『前突變』攜帶者，可見FXTAS在老年中樞神經系統退化性疾病中佔重要位置。
與男性不同，FMRl基因『前突變』女性攜帶者則可能受到另一種疾病的困擾，脆性 X 相關卵巢功能不足(Fragile X-Associated PrimaryOvarian Insufficiency, FXPOI) 其主要症狀為不孕和絕經期提前(早於40歲)。流行病學調查顯示約20-28%的FMRl基因『前突變』女性攜帶者會出現受孕困難。另有約23%的女性攜帶者會出現絕經期提前。 據估算，女性中『前突變』攜帶者可達1/130到1/250。可見FXPOI在原發性卵巢功能不足 (Primary Ovarian Insufficiency,POI)患者中佔有顯著比重。鑑於POI可有多種發病機制，相應的治療手段也各不相同。明確的病因學診斷將對治療效果發生決定性的影響。FXS, FXTAS和FXPOI的診斷與FMRl基因5，端非編碼區CGG重複數目的檢測目前，FXS的臨床診斷主要依賴症狀學鑑別。可提供診斷輔助的實驗室檢查方法為染色體核型檢查。其方法為從患者外周血中分離培養血細胞，在缺乏葉酸，加入咖啡因的培養基中培養72小時後進行染色體顯帶。然後人工在顯微鏡下尋找，計數具『脆性』X染色體(fra(X)染色體)的細胞。當fra(X)細胞佔細胞總數的一定百分比時則判斷為檢測陽性。染色體核型分析需細胞培養過程，技術複雜、昂貴、耗時。檢測結果受培養基成份、培養時間，和觀察者主管因素的影響，即使在最佳條件下檢測的正確率也達不到50%。染色體核型檢查對FXTAS和FXPOI則無能為力。分子生物學，特別是PCR技術的發展為脆性X相關疾病的實驗室輔助檢查帶來了新的方法。PCR檢測FMRl基因CGG重複數目的方法較精確可靠。但因目標序列幾乎全由C、 G鹼基組成，常規PCR反應效率低下，反應產物只能以Southern blot方法才能有效檢測。 Southern blot方法步驟較多，費時費力，對實驗設備和人員培訓要求較高。故該方法雖然長久以來已用於臨床基礎研究，但無法應用於臨床實驗室診斷。因此，發展一種簡便可靠的 FXS實驗室診斷方法一直是中外科研人員努力的目標。現有文獻表明，各方努力多集中於對 PCR方法的改進，以提高檢測靈敏度和可靠性。目前，雖在國外學術期刊和專利中可以找到相關文獻聲稱可用改進PCR方法檢測『全突變型』 FMRl基因的CGG重複數目。但在臨床實踐中，即使有些醫療機構開始了相關的嘗試，結果也多不理想。至今，在國內外臨床實驗室中對『全突變型』只能以PCR產物缺失這種陰性結果來推論樣本中CGG重複數目多於200。 這樣模糊不清的方法遠遠無法滿足臨床需要。對FXS的產前篩查採用羊水細胞、絨毛及胎血均可進行染色體核型檢查以對FXS進行產前篩查。但研究表明採用羊水細胞、絨毛方法檢測的陽性率較低，而經皮取胎血風險較大。故目前尚沒有一個滿意的方法對FXS進行產前篩查。

發明內容
本發明的目的是要提供一種可以PCR方法結合常規瓊脂糖凝膠電泳檢測人類 FMRl基因5』端非編碼區CGG重複數目的方法。其有效檢測的CGG重複數目可從5至1000。 本發明提供了實現上述目標的具體方法，包括亞硝酸鈉處理基因組DNA，PCR反應所需的引物序列，PCR反應混合物配方，PCR反應熱循環程序，PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳檢測和片段長度定量。本發明的第二個目的是通過這種方法為FXS，FXTAS和FXPOI的臨床診斷提供一種實驗室輔助方法。鑑於這些疾病與其它疾病，如唐氏綜合症，帕金森氏症和原發性卵巢功能不足在臨床症狀上的相似性，對這些疾病的確診需要在症狀學基礎上參考實驗室檢查所獲得的客觀結果才能做出最終判斷。明確、可靠的實驗室檢測方法對獲得正確的診斷結論至
關重要。本發明的第三個目的是為FXS的產前篩查提供一種敏感、可靠的方法。目前對FXS 尚無十分有效的治療手段，更無法根治。因此，產前篩查是優生優育，預防疾病的主要手段。 鑑於目前所應用的染色體核型檢查技術複雜、昂貴、耗時且結果穩定性差，對FXS的產前篩查尚無法普及。本發明提供了一種遠比染色體核型檢查技術簡單可靠的技術手段，使FXS 的產前篩查有望成為孕期常規檢查。本發明的第四個目的是為基礎與臨床科研，新藥研發等工作提供一種新的研究手段。如上所述，PCR結合Southern blot的方法是目前在學術科研實驗室中測定FMRl基因 5』端非編碼區CGG重複數目的標準方法。本發明所描述的方法更為簡便易行，對提高工作效率，降低研發成本有顯著意義。本發明所涉及的測定FMRl基因5』端非編碼區CGG重複數目的方法，主要包括以下步驟1.基因組DNA亞硝酸鈉處理。2.使用特異引物，以從1.獲得的DNA為模板進行PCR反應3.使用簡併引物以從1.獲得的DNA為模板進行PCR反應4.將從2.，3.獲得的PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳。將電泳中顯示的條帶與平行電泳的DNA分子量標準進行比對。進而推算出樣本中FMRl基因5』端非編碼區CGG的重
複數目。常規PCR用於檢測FMRl基因5』端非編碼區CGG重複數目的難點在於此區段G、C 含量過高，在PCR反應中模板雙鏈DNA解鏈困難，導致反應效率低下，而必須藉助敏感但複雜的Southern blot來檢測稀少的PCR產物。本發明中首先以亞硝酸鹽對模板DNA進行處理。藉助該化學物質與胞嘧啶(C)之間發生的脫氨基反應，將胞嘧啶轉化為尿嘧啶(U)。U 在DNA雙鏈中以兩個氫鍵互與其互補鹼基T配對，而處理前的C、G配對之間為三個氫鍵。 這樣，處理後的DNA其雙鏈解鏈所需自由能較處理前顯著降低。以經過處理的DNA作為模板進行PCR反應，在退火階段DNA雙鏈解鏈機率將顯著增高，PCR反應的效率也相應顯著增尚ο根據本發明方法的一個優選實施方案，特徵在於使用亞硝酸鈉與DNA中的胞嘧啶發生脫氨基反應。亞硝酸鈉在反應中的濃度為500mM。亞硝酸鈉對單鏈DNA中尿嘧啶脫的氨基作用比對雙鏈DNA強約3倍。故在亞硝酸鈉處理前，應在先70度下對DNA進行氫氧化鈉預處理，使雙鏈DNA解鏈為單鏈DNA。同時70度下氫氧化鈉處理也對胞嘧啶發生脫氨基形成尿嘧啶有一定作用。根據本發明方法的一個優選實施方案，特徵在於在PCR反應混合物中加入甜菜鹼。其在反應中的濃度為2M。甜菜鹼能減少長鏈DNA 二級結構的形成，提高PCR反應的效根據本發明的一個優選實施方案，特徵在於在PCR反應使用(CCT) 4和(CCG)4簡併引物。當CGG重複數目多於500時，前述亞硝酸鈉處理與甜菜鹼的使用仍不能保證產生足量的PCR產物供瓊脂糖凝膠電泳檢測。此時(CCT)4和(CCG)4簡併引物可在PCR反應中
5非特異地與FMRl基因5』端非編碼區CGG重複序列結合，與上遊配對引物相配合可生成一系列大小不等的PCR產物，這些PCR產物在瓊脂糖凝膠電泳中將呈現為一條抹帶。抹帶的出現以PCR陽性反應產物的形式提示過長CGG重複序列的存在。避免了既往檢測中以PCR 陰性結果推測CGG重複序列數目的不確定性。
具體實施例方式以下藉助實例進一步舉例描述本發明。本領域技術人員可以理解到，這些實施例並不以任何方式限制本發明待批權利要求的範圍。實例1.基因組DNA亞硝酸鈉處理的方法所需的試劑及緩衝液a)基因組DNA 5微克。b) IM NaOH 溶液c) 3M 醋酸鈉溶液(ρΗ5· 3)d)無水乙醇e)亞硝酸鈉緩衝液，其成份為亞硝酸鈉500mM，醋酸鈉沈福，醋酸52mM，氯化鈉 150mM實驗方法人基因組DNA中加入等體積lMNaOH。置於70°C水浴中1小時後立即置於冰上。然後加入等摩爾數HCL使反應體系中和。加入1/10體積3M醋酸鈉(pH5.5)穩定pH後，再加入兩倍體積無水乙醇。於臺式離心機12，000轉離心沉澱DNA。將DNA沉澱溶解於500ul 新鮮配製的亞硝酸鈉緩衝液。置50°C水浴中16小時後加入兩倍體積無水乙醇。於臺式離心機12，000轉離心沉澱DNA。將處理後的DNA溶解於50ull0mM Tris緩衝液中備用。實例2. PCR反應按北京康為世紀LAmp DNA Polymerase MasterMix說明書配製PCR反應體系， 其中包括2X LAmp DNA Polymerase MasterMix，從實例1中獲得的基因組DNA IOOng, MgCl2 1.5mM，上遊引物(序列 1) :TCAGGCGCTCAGCTCCGTTTCGGTTTCA 和下遊引物(序列 2) AAGCGCCATTGGAGCCCCGCACTTCC 各 luM。甜菜鹼 2M。PCR 反應熱循環程序為98 °C 5min ； 98°C 10s-64°C 30s-68°C 2min 35 個循環；68°C 4min。實例3. (CCT)4和(CCG)4簡併引物PCR反應按北京康為世紀LAmp DNA Polymerase MasterMix說明書配製PCR反應體系，其中包括2X LAmp DNA Polymerase MasterMix，從實例 1 中獲得的基因組 DNA IOOngjMgCl2 1. 5mM，上遊引物 TCAGGCGCTCAGCTCCGTTTCGGTTTCA (序列 1)，(CCT)4 引物 CCTCCTCCTCCT (序列3)和(CCG)4引物CCGCCGCCGCCG (序列4)各luM。甜菜鹼2M。PCR反應熱循環程序為 980C 5min ；98°C 10s_64°C 30s_68°C 2min 35 個循環；68°C 4min。實例4.瓊脂糖凝膠電泳檢測按常規方法製備1. 5%瓊脂糖凝膠。將5ul上述實例2.和3.中獲得的PCR產物於凝膠中進行電泳。電壓5V/cm。以50bp ladder為分子兩標準，比對PCR、產物的大小， 估算CGG重複數目。上述實例1至4的實驗結果顯示。當CGG重複數目在55個以下時，在溴乙錠染色的瓊脂糖凝膠上，100%樣本在與相應分子量標準對應處均可見清晰單一條帶。當DNA樣本中CGG重複數目在55-200時，有95%的樣本可獲得單一條帶。最佳情況下，可從CGG重複數目達1000的樣本中獲得清晰單一條帶。但是，當CGG重複數目在200-1000時，約有20% 的DNA樣本無法產生單一條帶。此時，100%的DNA樣本均可產生抹帶。這樣，雖無法精確確定CGG重複數目，但抹帶的產生這一 PCR陽性結果明確提示『全突變』的存在。這些實驗結果表明，本發明中所使用的方法能夠對各類人群FMRl基因5』端非編碼區CGG重複數目進行有效檢測，從而達到輔助臨床診斷的目的。
權利要求
1.一種可以PCR方法結合常規瓊脂糖凝膠電泳檢測人類FMRl基因5』端非編碼區CGG 重複數目的方法。其有效檢測的CGG重複數目可從5至1000。包括實現上述目標的具體方法熱強鹼及亞硝酸鹽處理基因組DNA，PCR反應所需的引物序列，PCR反應混合物配方， PCR反應熱循環程序，PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳檢測和片段長度定量。
2.根據權利要求1的方法，其中作為提供鹼性條件的試劑包括但不限於氫氧化鈉、氫氧化鉀、碳酸鈉、碳酸鉀等無機物和有機物。
3.根據權利要求1的方法，其中用於處理基因組DNA的試劑包括但不限於可以引起 DNA分子中鹼基脫氨基作用的亞硫酸氫鹽、亞硝酸鹽等無機物和有機物。
4.按權利要求1的方法對處理後的基因組DNA的提取與純化的方法，包括但不限於 DNA的乙醇沉澱、異丙醇沉澱、聚乙二醇沉澱及用吸附柱的沉澱方法等。
5.按權利要求1的方法在PCR反應中所用的引物序列。
6.按權利要求1的方法在臨床與科研中對人的FMRl基因5』非編碼區中CGG重複序列的數量的檢測，包括但不限於正常人、脆性X染色體綜合症前突變和脆性X染色體綜合症患者的檢測。
7.按權利要求1的方法應用於產前診斷。
8.按權利要求1的方法應用於目的在於鑑別與FMRl基因前突變相關的疾病的檢測。
9.按權利要求1的方法應用於所有高GC含量的DNA、RNA的PCR檢測。
全文摘要
本發明涉及對X染色體FMR1基因異常所導致的幾種遺傳疾病的實驗室輔助診斷方法。該方法的建立旨在以分子生物學檢測方法作為臨床檢查的輔助手段，提高臨床診斷的正確率，並為相關遺傳病的產前篩查提供一種新的檢測手段。
文檔編號C12Q1/68GK102242187SQ201010168309
公開日2011年11月16日 申請日期2010年5月11日 優先權日2010年5月11日
發明者任軍, 任黎明, 王春香, 高建恩 申請人:北京康為世紀生物科技有限公司