一種篩選山羊免疫相關基因DQA1Exon2-(A-C)等位基因型的方法
2024-01-19 12:35:15 1
一種篩選山羊免疫相關基因DQA1 Exon 2-(A-C)等位基因型的方法
【專利摘要】本發明公開了一種篩選山羊免疫相關基因DQA1Exon2-(A-C)等位基因型的方法，根據DQA1基因外顯子2的序列設計引物，以白山羊的基因組DNA為模板，進行PCR擴增，對PCR產物進行純化測序，初步篩選DQA1基因的外顯子2的多態性位點，以白山羊基因組DNA為模板，PCR擴增目的片段，用變性劑處理PCR產物，對變性後的擴增片段進行聚丙烯醯胺凝膠電泳檢測，應用銀染法染膠，並根據聚丙烯醯胺凝膠電泳結果判定貴州白山羊DQA1基因外顯子2的部分等位基因型。本發明為不同品種山羊DQA1基因外顯子2多態性的PCR-SSCP篩選及判型提供一種方便、快捷、準確的方法，能夠檢測山羊免疫性狀相關的DQA1基因第二外顯子的部分等位基因，解決了目前PCR-SSCP技術對於呈高度多態性基因判型困難的問題。
【專利說明】—種篩選山羊免疫相關基因DQA1 Exon 2-(A-C)等位基因型的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及動物生物【技術領域】中的山羊分子標記輔助育種技術，具體設計到一種篩選山羊免疫相關基因DQAl Exon 2-(A-C)等位基因型的方法。
【背景技術】
[0002]貴州白山羊是貴州省的優良地方山羊品種，具有適應性強、耐粗飼、繁殖力高、育肥性能好、肉質好、板皮質優等特點，宜於在山地丘陵等地勢放牧飼養。但國內對於貴州白山羊免疫性狀的研究還鮮見報導，所以如何利用分子生物學的技術快速高效的篩選培育出具有較高抗病能力的貴州白山羊成為改良我國優良地方山羊品種的重中之重。
[0003]MHC (主要組織相容性複合體，major histocompatibility complex),是脊椎動物中一個與免疫相關的多基因家族，具有共顯性、連鎖不平衡等遺傳特性，其主要功能是編碼細胞表面的轉膜蛋白，通過傳遞抗原給T淋巴細胞參與調節免疫反應。MHC決定著動物的免疫排斥反應，同時也與動物的抗病能力有較強的相關性。山羊的MHC基因(即GoLA)分為I類、II類和III類，MHC Class II區域分子在免疫應答中起重要的調控作用，Class II類抗原有很多基因，但只有DR和DQ基因在蛋白質水平上表達，DRB和DQB兩個基因位點所編碼的MHC抗原在其免疫系統中發揮重要的作用，其第二外顯子所編碼抗原的功能區具有豐富的多態性。MHC是第一個被發現的與疾病有密切相關的遺傳系統，現有大量研究表明羊MHC與抗病性有關聯。DQAl基因位於MHC的CLASS II區，其第二外顯子呈高度的多態性。
[0004]單核苷酸多態性(SNP)指基因組DNA序列中由於單個核苷酸(A/T/C/G)的替換而引起的多態性，主要由單個鹼基的轉換或者顛換所引起。單核苷酸多態性具有數量多，分布廣和穩定遺傳等特點，是一種進行分子遺傳育種的優良手段。現在人們發展了許多用於探尋分子遺傳標記的方法，最常見的有單鏈構象多態技術(SSCP)、PCR-RFLP和直接測序技術等，SSCP它可以發現靶DNA片段中未知位置的鹼基突變。該方法具有簡單、快速、靈敏，操作簡單等優點。但對於像DQAl基因外顯子2這種呈高度多態性的基因，基因型的判定成為難點。
【發明內容】
[0005]本發明要解決的技術問題是:提供一種篩選山羊免疫相關基因DQAl Exon2- (A-C)等位基因型方法，為不同品種山羊DQAl基因外顯子2多態性的PCR-SSCP篩選及判型提供一種方便、快捷、準確的方法，能夠檢測山羊免疫性狀相關的DQAl基因第二外顯子的部分等位基因型，以解決目前PCR-SSCP技術對於呈高度多態性基因判型困難的問題。
[0006]本發明技術方案:
一種篩選山羊免疫相關基因DQAl Exon 2-(A-C)等位基因型的方法:
A、同時將待檢測基因組 DNA，DQAl Exon 2_A、DQA1 Exon 2-B 和 DQAl Exon 2-C 的 DNA標準樣1.5 μ L/50ng分別與試劑I混合，按PCR反應條件進行目的片段的擴增； B、取3μ L PCR產物經1%瓊脂糖凝膠檢測，產物片段大小為406bp ；
C、向步驟B中剩餘的PCR產物中各加入10μ L上樣變性緩衝液，98°C水浴15min，冰浴15min ；
D、將試劑II與540μ L 10%過硫酸銨，30 μ L TEMED混勻，制電泳膠；
Ε、將步驟C中的樣品，採用步驟D中製取的電泳膠按PCR-SSCP檢測方法進行檢測；
F、步驟 E 中檢測到的帶型與 DQAl Exon 2_A、DQA1 Exon 2-B 和 DQAl Exon 2-C 的 DNA標準樣一致的即為已知等位基因型個體；
所述試劑I總體積13.5yL，其中2XEs Taq MasterMix為7.5 μ L，上下遊引物各0.75 μ L，餘量為ddH20 ;其中上遊引物為5』 -GAAGCCCACAATGTTTGATAG-3』，下遊引物:5』 -TCATACCAGCTTCACTCCCT-3』 ；
所述試劑II為12%聚丙烯醯胺凝膠，其中Arc:Bis=29:1，成分包括5 X TBE 15mL, 30%丙烯醯胺 30mL, ddH20 30 mL ；
所述DQAl Exon 2_A的DNA標準樣的核苷酸序列為:
gaagcccaca atgtttgata gtcaatttct tctttcactg cttaatgagg atcttttctc60
tgtttttccc tttcttgctc ctcactccga ctcagctgac cacattgccg cctatggcat120
aaacgtctac cactcatatg gtccctctgg ccactatacc catgaatttg atggagatga180
agagttctac gtcgacctgg aaaagaagga gactgtctgg cgcctgcctg agtttagtaa240
atttgtaggt tttgaccctc agggtgcact gagaaacatg gcttcaggga aacggacttt300
ggagatcatg attcaaaggt ccaactctac tgctgctacc aacagtaagt gttcgccatt360
ctgcctctct ttattaatct tccccttcat accagcttca ctccct406
所述DQAl Exon 2-B的DNA標準樣的核苷酸序列為:
gaagcccaca atgtttgata gtcaatttct tctttcactg cttaatgaag atcttttctc60
tatttttccc tttctggctc ctcaccctga ctcagctgac cacattggca cctatggcat 120 aagcatctac caaacatatg gtccctctgg ctactatacc catgaatttg atggagatga 180 agagttctac gtggacctgg aaaagaggga gactgtctgg cgtctgcctg agtttagtaa 240 atttgcaagt tttgaccctc agggtgcact gagaaacata gccacgataa aacataattt 300 ggaggtcttg attcaaaggt ccaactctac tgctgctacc aacagtatgt gttcaccatt 360 ctgcctctct ttattaatct tccccttcat accagcttca ctccct406
所述DQAl Exon 2-C的DNA標準樣的核苷酸序列為:
gaagcccaca atgtttgata gtcaatttct tctttcactg cttaatgaag atcttttctc60
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[0007]所述上樣變性緩衝液包括98%去離子甲醯胺，0.025%溴酚藍，0.025% 二甲苯青，100 μ L 5mol/L EDTA (PH=8.0)。
[0008]PCR反應條件為:在15μL總體系中，2XEs Taq MasterMix為7.5 μ L，上下遊引物各0.75μ L，DQA模板2μ L，餘量為ddH20 ;PCR反應程序:95°C預變性3min ;95°C變性30s、61.5°C退火30s、72°C延伸lmin,30個循環；72°C終延伸5min，4°C保存。
[0009]SSCP實驗步驟為:取8μ LPCR產物加入10 μ L的上樣變性緩衝液，98 °C變性15min，立即冰浴15min ; 12%非變性聚丙烯醯胺凝膠，250V電壓下預電泳30min ;點樣後，在4°C下，250V電泳10min，180v電泳19h，銀染法顯色並拍照。
[0010]本發明有益效果:
本發明利用PCR-SSCP對健康狀態良好的不同性別的成年羊的DQAl基因的第2外顯子進行了多態性的分析，並對群體內變異產生的不同等位基因序列進行測序分析，確定了貴州白山羊DQAl基因外顯子2中三種不同的等位基因型DQAl Exon 2_A、DQAl Exon 2-B和DQAl Exon 2-C，可為山羊品種DQAl基因外顯子2多態性的分析，及等位基因的篩選提供指導。本發明通過對試樣用貴州白山羊DQAl基因外顯子2的SSCP分析，發現了 3個(DQA1Exon 2-A、DQAl Exon 2-B 和 DQAl Exon 2-C)等位基因型。
[0011]本發明對山羊DQAl基因外顯子2的多態性分析具有操作簡單，反應靈敏，特異性強，靈敏度高，成本低等優點，特別適用於各級畜牧獸醫教學科研單位，獸用生物製品廠以及各大、中型山羊養殖企業的山羊免疫相關性狀的研究與篩選。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0012]圖1是貴州白山羊DQAl基因外顯子2引物的PCR-SSCP檢測凝膠圖；
其中，附圖標記
1DQAl Exon 2-A
2DQAl Exon 2-B
3DQAl Exon 2-C。
【具體實施方式】
[0013]下面結合具體實施方案對本發明的原理和特徵進行描述，所舉實施方案只用於解釋本發明，並非用於限定本發明的範圍。下面以貴州白山羊免疫性狀相關基因DQAl基因外顯子2的多態性分析為例，對本發明的內容進行詳細說明。
[0014]本發明所用到的檢測試劑、引物、DNA標準樣等為:試劑1、試劑II DQAl Exon2-A、DQAl Exon 2_B和DQAl Exon 2_C的DNA標準樣、上樣變性緩衝液、上遊引物、下遊引物。
[0015]其中試劑I總體積13.5μ L，其中2XEs Taq MasterMix為7.5 μ L，上下遊引物各0.75 μ L,餘量為ddH20 ;其中上遊引物為5，-GAAGCCCACAATGTTTGATAG-3』，下遊引物:5』 -TCATACCAGCTTCACTCCCT-3』 ；
試劑II為12%聚丙烯醯胺凝膠，其中Arc:Bis=29:1，成分包括5 X TBE 15mL, 30%丙烯醯胺 30mL, ddH20 30 mL ；
電泳膠通過試劑II與540 μ L 10%過硫酸銨，30 μ L TEMED混勻製得；
DQAl Exon 2-Α的DNA標準樣的核苷酸序列為:
gaagcccaca atgtttgata gtcaatttct tctttcactg cttaatgagg atcttttctc60
tgtttttccc tttcttgctc ctcactccga ctcagctgac cacattgccg cctatggcat 120 aaacgtctac cactcatatg gtccctctgg ccactatacc catgaatttg atggagatga180
agagttctac gtcgacctgg aaaagaagga gactgtctgg cgcctgcctg agtttagtaa240
atttgtaggt tttgaccctc agggtgcact gagaaacatg gcttcaggga aacggacttt300
ggagatcatg attcaaaggt ccaactctac tgctgctacc aacagtaagt gttcgccatt360
ctgcctctct ttattaatct tccccttcat accagcttca ctccct406 DQAl Exon 2-B的DNA標準樣的核苷酸序列為:
gaagcccaca atgtttgata gtcaatttct tctttcactg cttaatgaag atcttttctc60
tatttttccc tttctggctc ctcaccctga ctcagctgac cacattggca cctatggcat120
aagcatctac caaacatatg gtccctctgg ctactatacc catgaatttg atggagatga180
agagttctac gtggacctgg aaaagaggga gactgtctgg cgtctgcctg agtttagtaa240
atttgcaagt tttgaccctc agggtgcact gagaaacata gccacgataa aacataattt300
ggaggtcttg attcaaaggt ccaactctac tgctgctacc aacagtatgt gttcaccatt360
ctgcctctct ttattaatct tccccttcat accagcttca ctccct406 所述DQAl Exon 2-C的DNA標準樣的核苷酸序列為:
gaagcccaca atgtttgata gtcaatttct tctttcactg cttaatgaag atcttttctc60
tattttttcc tttcttgctc ctcactccga ctcagctgac cacattgccg cctatggcat120
aaacgtctac cactcatatg gtccctctgg ccactatacc catgaatttg atggagatga180
agagttctac gtcgacctgg aaaagaagga gactgtctgg cgcctgcctg agtttagtaa240
atttgtaggt tttgaccctc agggtgcact gagaaacatg gcgtctggga aacagacttt300
ggagatcatg attcaaagct ccaactctac tgctgctacc aacagtaagt gttcaccatt360
ctgcctctct ttattaatct tccccttcat accagcttca ctccct406。
[0016]試驗材料
貴州白山羊基因組DNA採自貴州省銅仁市習水縣貴州白山羊中心產區，其中成年羊個體38份。用真空採血管進行頸靜脈採血8mL，冰盒帶回實驗室後-20°C保存，
基因組DNA的提取
應用血液基因組提取試劑盒(上海生工生物)提取基因組DNA。
[0017]試驗方法:
1、引物的設計與PCR擴增
將將待檢測基因組 DNA，DQAl Exon 2_A、DQA1 Exon 2-B 和 DQAl Exon 2-C 的 DNA 標準樣1.5 μ L/50ng分別與試劑I混合，按PCR反應條件進行目的片段的擴增；PCR反應總體系為 15yL，其中 2XEs Taq MasterMix 為 7.5 μ L，上下遊引物各 0.75 μ L，DQA 模板 2 μ L，ddH20補充體積至15yL;PCR反應程序:95°C預變性3min ;95°C變性30s、61.5°C退火30s、72°C延伸Imin，30個循環；72°C終延伸5min，4°C保存。
[0018]取3 μ L PCR產物經1%瓊脂糖凝膠檢測，產物片段大小為406bp。
[0019]2、SSCP 檢測
取PCR產物8 μ L，加入10 μ L的上樣變性緩衝液，98°C變性15min，立即冰浴15min ;採用電泳膠在250V電壓下預電泳30min ;點樣後，在4°C下，250V電泳1min, 180v電泳19h，銀染法顯色並拍照。
[0020]3、不同等位基因型的克隆測序經SSCP檢測後，利用瓊脂糖凝膠純化試劑盒回收不同等位基因的PCR產物，回收後的片段用載體連接並構建重組質粒，轉化大腸桿菌DH5 α菌株，菌落PCR鑑定後送英俊生物有限公司進行測序。
[0021]4、結果分析
將PCR-SSCP檢測到的等位基因送測序公司進行雙向測序，確定DQAl Exon 2_A、DQAlExon 2-Β和DQAl Exon 2-C三個等位基因型的核苷酸序列。DQAl Exon 2-Α等位基因型的核昔酸序列為:gaagcccacaatgtttgatagtcaatttcttctttcactgcttaatgaggatcttttctctgtttttccctttcttgctcctcactccgactcagctgaccacattgccgcctatggcataaacgtctaccactcatatggtccctctggccactatacccatgaatttgatggagatgaagagttctacgtcgacctggaaaagaaggagactgtctggcgcctgcctgagtttagtaaatttgtaggttttgaccctcagggtgcactgagaaacatggcttcagggaaacggactttggagatcatgattcaaaggtccaactctactgctgctaccaacagtaagtgttcgccattctgcctctctttattaatcttccccttcataccagcttcactccct ；DQA1 Exon 2-B 等位基因型的核苷酸序列為:gaagcccacaatgtttgatagtcaatttcttctttcactgcttaatgaggatcttttctctatttttccctttctggctcctcaccctgactcagctgaccacattggcacctatggcataagcatctaccaaacatatggtccctctggctactatacccatgaatttgatggagatgaagagttctacgtggacctggaaaagagggagactgtctggcgtctgcctgagtttagtaaatttgcaagttttgaccctcagggtgcactgagaaacatagccacgataaaacataatttggaggtcttgattcaaaggtccaactctactgctgctaccaacagtatgtgttcaccattctgcctctctttattaatcttccccttcataccagcttcactccct ； DQAl Exon 2-C等位基因型的核苷酸序列為:gaagcccacaatgtttgatagtcaatttcttctttcactgcttaatgaagatcttttctctattttttcctttcttgctcctcactccgactcagctgaccacattgccgcctatggcataaacgtctaccactcatatggtccctctggccactatacccatgaatttgatggagatgaagagttctacgtcgacctggaaaagaaggagactgtctggcgcctgcctgagtttagtaaatttgtaggttttgaccctcagggtgcactgagaaacatggcgtctgggaaacagactttggagatcatgattcaaagctccaactctactgctgctaccaacagtaagtgttcaccattctgcctctctttattaatcttccccttcataccagcttcactc
CCto
[0022]以上所述的僅為本發明的較佳實施方案，並不用以限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內，所做的任何修改、等同替換，改進等，均應包含在本發明的保護範圍之內。
【權利要求】
1.一種篩選山羊免疫相關基因DQAl Exon 2-(A-C)等位基因型的方法，其特徵在於: A、同時將待檢測基因組DNA，DQAl Exon 2_A、DQA1 Exon 2-B 和 DQAl Exon 2-C 的 DNA標準樣1.5 μ L/50ng分別與試劑I混合，按PCR反應條件進行目的片段的擴增； B、取3μ L PCR產物經1%瓊脂糖凝膠檢測，產物片段大小為406bp ； C、向步驟B中剩餘的PCR產物中各加入10μ L上樣變性緩衝液，98°C水浴15min，冰浴15min ； D、將試劑II與540μ L 10%過硫酸銨，30 μ L TEMED混勻，制電泳膠； Ε、將步驟C中的樣品，採用步驟D中製取的電泳膠按PCR-SSCP檢測方法進行檢測； F、步驟 E 中檢測到的帶型與 DQAl Exon 2_A、DQA1 Exon 2-B 和 DQAl Exon 2-C 的 DNA標準樣一致的即為已知等位基因型個體； 所述試劑I總體積13.5yL，其中2XEs Taq MasterMix為7.5 μ L，上下遊引物各0.75 μ L，餘量為ddH20 ;其中上遊引物為5』 -GAAGCCCACAATGTTTGATAG-3』，下遊引物:5』 -TCATACCAGCTTCACTCCCT-3』 ； 所述試劑II為12%聚丙烯醯胺凝膠，其中Arc:Bis=29:1，成分包括5 X TBE 15mL, 30%丙烯醯胺 30mL, ddH20 30 mL ； 所述DQAl Exon 2_A的DNA標準樣的核苷酸序列為: gaagcccaca atgtttgata gtcaatttct tctttcactg cttaatgagg atcttttctc60 tgtttttccc tttcttgctc ctcactccga ctcagctgac cacattgccg cctatggcat120 aaacgtctac cactcatatg gtccctctgg ccactatacc catgaatttg atggagatga 180 agagttctac gtcgacctgg aaaagaagga gactgtctgg cgcctgcctg agtttagtaa 240 atttgtaggt tttgaccctc agggtgcact gagaaacatg gcttcaggga aacggacttt 300 ggagatcatg attcaaaggt ccaactctac tgctgctacc aacagtaagt gttcgccatt360 ctgcctctct ttattaatct tccccttcat accagcttca ctccct406 所述DQAl Exon 2-B的DNA標準樣的核苷酸序列為: gaagcccaca atgtttgata gtcaatttct tctttcactg cttaatgaag atcttttctc60 tatttttccc tttctggctc ctcaccctga ctcagctgac cacattggca cctatggcat120 aagcatctac caaacatatg gtccctctgg ctactatacc catgaatttg atggagatga180 agagttctac gtggacctgg aaaagaggga gactgtctgg cgtctgcctg agtttagtaa240 atttgcaagt tttgaccctc agggtgcact gagaaacata gccacgataa aacataattt300 ggaggtcttg attcaaaggt ccaactctac tgctgctacc aacagtatgt gttcaccatt360 ctgcctctct ttattaatct tccccttcat accagcttca ctccct406 所述DQAl Exon 2-C的DNA標準樣的核苷酸序列為: gaagcccaca atgtttgata gtcaatttct tctttcactg cttaatgaag atcttttctc60 tattttttcc tttcttgctc ctcactccga ctcagctgac cacattgccg cctatggcatI20 aaacgtctac cactcatatg gtccctctgg ccactatacc catgaatttg atggagatga180 agagttctac gtcgacctgg aaaagaagga gactgtctgg cgcctgcctg agtttagtaa240 atttgtaggt tttgaccctc agggtgcact gagaaacatg gcgtctggga aacagacttt300 ggagatcatg attcaaagct ccaactctac tgctgctacc aacagtaagt gttcaccatt360 ctgcctctct ttattaatct tccccttcat accagcttca ctccct406。
2.根據權利要求1所述的一種篩選山羊免疫相關基因DQAlExon 2-(A-C)等位基因型的方法，其特徵在於:所述上樣變性緩衝液包括98%去離子甲醯胺，0.025%溴酚藍，0.025%二甲苯青，100 μ L 5mol/L EDTA (ΡΗ=8.0)。
3.根據權利要求1所述的一種篩選山羊免疫相關基因DQAlExon 2-(A-C)等位基因型的方法，其特徵在於=PCR反應條件為:在15μL總體系中，2XEs Taq MasterMix為7.5 μ L，上下遊引物各0.75 μ L，DQA模板2μ L，餘量為ddH20 ;PCR反應程序:95°C預變性3min ;95°C變性 30s,61.5°C退火 30s、72°C延伸 lmin,30 個循環；72°C終延伸 5min，4°C保存。
4.根據權利要求1所述的一種篩選山羊免疫相關基因DQAlExon 2-(A-C)等位基因型的方法，其特徵在於=SSCP實驗步驟為:取8 μ LPCR產物加入10 μ L的上樣變性緩衝液，98°C變性15min，立即冰浴15min ; 12%非變性聚丙烯醯胺凝膠，250V電壓下預電泳30min ；點樣後，在4°C下，250V電泳lOmin，180v電泳19h，銀染法顯色並拍照。
【文檔編號】C12Q1/68GK104313137SQ201410527534
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年10月9日 優先權日:2014年10月9日
【發明者】羅衛星, 劉彬, 蔡慧芬, 康建兵, 孫巖巖, 錢成 申請人:貴州大學