一種山羊速激肽tac1基因多態性檢測試劑盒及檢測方法
2024-01-19 12:08:15 3
一種山羊速激肽tac1基因多態性檢測試劑盒及檢測方法
【專利摘要】本發明公開了一種山羊速激肽TAC1基因多態性檢測試劑盒及檢測方法，屬於生物【技術領域】。該方法以山羊基因組DNA為模板，設計引物擴增速激肽TAC1基因，擴增產物純化測序，獲得速激肽TAC1基因非編碼區第二內含子突變鹼基（C160–T160），針對此突變位點設計HaeIII酶切引物，擴增TAC1基因非編碼區第二內含子，擴增片段（129bp）酶切後電泳判斷TAC1基因突變位點的基因型。結果發現，山羊速激肽TAC1基因具有多態性，存在三種基因型，即AA、AB、BB基因型，基因型頻率依次為0.2、0.08和0.72。其中，BB型基因頻率高於AB型和AA型，等位基因B頻率顯著高於A，AB基因型產羔率顯著高於其他基因型，可作為標記輔助選擇進行選種育種。
【專利說明】-種山羊速激肽TAC1基因多態性檢測試劑盒及檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發明具體涉及一種山羊速激肽TACl基因多態性檢測試劑盒，以及山羊速激肽 TACl基因多態性檢測方法，屬於生物【技術領域】。
【背景技術】
[0002] 速激肽（Tachykinins，TKs)是一種激肽類家族，由一組羧基末端為苯丙氨 酸-X-甘氨酸-亮氨酸-蛋氨酸-NH 2序列的肽類組成。現已知在哺乳動物中存在速激 肽類物質，包括P物質（substance P，SP)、神經激肽A (neurokinin Α,ΝΚΑ)、神經激肽B (neurokinin Β,ΝΚΒ)及血細胞激肽（hemokinin_l，HK)。研究表明，速激肽（Tachykinins, TKs)通過下丘腦-垂體-性腺軸在人、鼠等哺乳動物繁殖功能調節方面發揮重要作用。速 激肽通過下丘腦神經元影響GnRH釋放，並通過垂體前葉影響促性腺素釋放（Lasaga M等， 2011 ;T〇pal〇glu AK等，2010)，而雌性動物卵母細胞發育及排卵受下丘腦促性腺激素調控， 通過垂體前葉促進或抑制FSH/LH的釋放，進而影響動物生殖器官生長發育及生殖細胞生 長分化。由此可知，速激肽與哺乳動物生殖性狀關係密切，已成為近年來繁殖領域研究熱 點。
【發明內容】
[0003] 本發明的目的是提供一種山羊速激肽TACl基因多態性檢測試劑盒。
[0004] 同時，本發明還提供一種山羊速激肽TACl基因多態性檢測方法。
[0005] 為了實現以上目的，本發明所採用的技術方案是：
[0006] 一種山羊速激肽TACl基因多態性檢測試劑盒，主要包括酶切引物P :
[0007] 上遊引物 PS :5' -GCTCTATGAGCAGAGATTTC-3'（如 SEQ ID NO. 3 所示），
[0008] 下遊引物 PAS :5' -GATTCCTGTTCTTGGTGG-3'（如 SEQ ID NO. 4 所示）。
[0009] 具體的，山羊速激肽TACl基因多態性檢測試劑盒，還可以包括：Taq DNA Polymerase、dNTP Mixture、Hae III及緩衝液等。緩衝液又可以包括10XPCR Buffer (Mg2+Plus) UOXM Buffer (IOOmM Tris-HCl pH7.5,l〇〇mM MgCl2, IOmM Dithiothreitol,500mM NaCl)>10XLoading Buffer0
[0010] 所述的檢測試劑盒中各組分的濃度和量可調，適用於一次操作或多次操作。
[0011] 更具體的，山羊速激肽TACl基因多態性檢測試劑盒，包括：酶切引物P20yL、 Taq DNAPolymerase (5U/μ L) 50 μ L、10 X PCR Buffer (Mg2+Plus) ImUdNTP Mixture (各 2.5mM) 500 μ L、超純水 ImUHae III (IOU/μ L) 1000U、10 XM Buffer (IOOmM Tris-HCl pH7. 5,IOOmM MgCl2,IOmM Dithiothreitol,500mM NaCl)lmL>10XLoading BufferlmL。
[0012] 一種山羊速激肽TACl基因多態性檢測方法，包括以下步驟：
[0013] (1)以包含速激肽TACl基因的山羊基因組DNA為模板，用酶切引物P PCR擴增 TACl基因非編碼區第二內含子，得到擴增片段；
[0014] (2)取擴增片段進行HaeIII酶切，酶切產物電泳後根據電泳結果判斷TACl基因突 變位點的基因型。
[0015] 所述步驟（1)中山羊基因組DNA採用酚/氯仿法提取。
[0016] 所述步驟（1)中酶切引物P為：
[0017] 上遊引物 PS :5' -GCTCTATGAGCAGAGATTTC-3'，
[0018] 下遊引物 PAS :5' -GATTCCTGTTCTTGGTGG-3'。
[0019] 所述步驟（1)中 PCR 擴增反應體系為：10XPCR Buffer2y L、2. 5mol/L dNTPO. 8 μ L、5U/ μ L Taq聚合酶0· 3 μ L、上遊引物PSO. 7 μ L、下遊引物PASO. 7 μ L、基因組 DNAL 25 μ L、ddH2014. 25 μ L，總計 20 μ L。
[0020] 所述步驟（I)中PCR擴增反應程序為：94°C預變性4min ;94°C變性30s，50°C退火 3〇8,721：延伸3〇8,36個循環；最後721：延伸1〇1^11，反應結束。
[0021] 所述步驟（2)中HaeIII酶切體系為：1〇υ/μ L Hae III200U、ddH205 y L、擴增片段 4uL、10XM Bufferl μ L。
[0022] 所述步驟（2)中HaeIII酶切反應條件為：37°C酶切12h。
[0023] 所述步驟（2)中TACl基因突變位點為非編碼區第二內含子160bp處鹼基，由C突 變為T。
[0024] 所述步驟（2)中判斷TACl基因突變位點的基因型為：AA基因型表現為1條條帶， AB基因型表現為3條條帶，BB基因型表現為2條條帶。
[0025] 由於HaeIII酶切引物P特異性地區分TACl基因非編碼區第二內含子160bp處的 C/T鹼基突變，當該位點鹼基為C時可以切開，片段大小分別為58bp和71bp ;為T時切不 開，片段大小為129bp。其中，AA基因型完全沒有切開，AB基因型部分切開，BB基因型全部 切開。
[0026] 所述步驟（2)中TACl基因突變位點的檢測方法包括以下步驟：以包含速激肽TACl 基因的山羊基因組DNA為模板，用引物對TAC PCR擴增得擴增產物；取擴增產物電泳得預期 目標片段，測序判斷TACl基因突變位點。
[0027] 所述的引物對TAC為：
[0028] 上遊引物 TACS :5' -AATCGCTCGGAGACCCAAG-3'（如 SEQ ID NO. 1 所示），
[0029] 下遊引物 TACAS :5' -TTGTGAGAAAGCTGGCCATG-3'（如 SEQ ID NO. 2 所示）。
[0030] 所述的上遊引物TACS和下遊引物TACAS分別在TACl基因第3和第5外顯子上， 橫跨第3和第4內含子（450bp和472bp)，擴增產物預期目標片段長度為1050bp。
[0031] 所述的用引物對TAC PCR擴增的反應體系為：10XPCR Buffer2y L、2. 5mol/L dNTPO. 8 μ L、5U/ μ L Taq 聚合酶(λ 3 μ L、上遊引物 TACS0. 7 μ L、下遊引物 TACAS0. 7 μ L、基 因組 DNAL 25 μ L、ddH2014. 25 μ L，總計 20 μ L。
[0032] 所述的用引物對TAC PCR擴增的反應程序為：94°C預變性4min ;94°C變性30s， 60°C退火30s，72°C延伸lmin，36個循環；最後72°C延伸10min，反應結束。
[0033] 本發明的有益效果：
[0034] 本發明以山羊基因組DNA為模板，設計引物擴增速激肽TACl基因，擴增產物純化 測序，獲得速激肽TACl基因非編碼區第二內含子突變鹼基（C160 - T160)，由於突變發生在 內含子上，沒有引起胺基酸的改變，針對此突變位點設計HaeIII酶切引物，擴增TACl基因 非編碼區第二內含子，擴增片段（129bp)酶切後電泳判斷TACl基因突變位點的基因型。結 果發現，山羊速激肽TACl基因具有多態性，在TACl基因突變位點存在三種基因型，即AA、 AB、BB基因型，基因型頻率依次為0. 2、0. 08和0. 72。其中，BB型基因頻率高於AB型和AA 型，等位基因 B頻率顯著高於A，AB基因型產羔率顯著高於其他基因型，即AB基因型個體具 有高繁性，可作為標記輔助選擇進行選種育種。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0035] 圖1為本發明實施例2中PCR擴增片段酶切後的電泳圖譜。
【具體實施方式】
[0036] 下述實施例僅對本發明作進一步詳細說明，但不構成對本發明的任何限制。
[0037] 實施例1
[0038] 本實施例中山羊速激肽TACl基因多態性檢測試劑盒，包括酶切引物P (包 括上遊引物和下遊引物）20yL、Taq DNA Polymerase(5U/yL)50yl、10XPCR BufTer(Mg2+Plus) lmL、dNTP Mixture (各 2. 5mM) 500 μ L、超純水 lmL、Hae III (IOU/ uDlOOOUUOXM BufferdOOmM Tris-HCl pH7. 5, IOOmM MgCl2, IOmM Dithiothreitol, 500mM NaCl)lmL、10X Loading BufferlmL。
[0039] 所述的酶切引物P為：
[0040] 上遊引物 PS : 5，-GCTCTATGAGCAGAGATTTC-3，，
[0041] 下遊引物 PAS :5' -GATTCCTGTTCTTGGTGG-3'。
[0042] 實施例2
[0043] 本實施例中山羊速激肽TACl基因多態性檢測方法，包括以下步驟：
[0044] 1、山羊血液基因組DNA的提取(河南奶山羊血液樣本190個）：
[0045] 採用酚/氯仿法提取基因組DNA :
[0046] (1)取若干潔淨的EP管，用籤字筆在EP管(管壁和蓋子兩處標記）上標著所要提 取DNA的血樣編號，按順序擺放待用；
[0047] (2)將凍存血樣解凍後，用移液槍移取500 μ L血液於對應編號EP管內，再分別加 入800 μ L的TBP Buffer，用ImL的Tip頭輕輕吹打使其徹底混勻，放入離心機(對稱放置， 防止失衡影響試驗）以4000rpm離心3min (使紅細胞破裂)，棄上清，（先加 TBP Buffer，再 加對應編號血樣，直接吹打，以節省Tip槍頭）；
[0048] (3)重複上述步驟一次，直至沉澱為無色(或淡紅色，血樣仍顯紅色則重複上述步 驟)，而後加入200 μ L TE懸浮即可；
[0049] (4)在準備好的200 μ L樣品中加入500 μ L TBM Buffer，混勻，加入4 μ L Proteinase Κ，再次混勻，放入水浴鍋中，在37°C條件下溫浴12(隔夜即可)，並經常搖動（以 助於白細胞破裂，蛋白質消化酶解）；
[0050] (5)將反應液冷卻至室溫，加500 μ L酚/氯仿/異戊醇（25:24:1 )，緩慢顛倒IOmin 混勻；
[0051] (6)以IOOOOrpm離心10min，用移液槍轉移上層水相於新EP管中（將Tip頭尖部 剪成斜面可防止抽提時吸入油脂，必要時重複酚抽提，以保證所提取DNA純度）；
[0052] (7)向步驟（6)轉移的水相中加入450yL氯仿/異戊醇（24:1)，混勻後以 IOOOOrpm離心lOmin，用移液槍轉移上層水相於新EP管中；
[0053] (8)再加入1/10體積（45 μ L)3mol/L NaAc和2. 5倍體積（1125 μ L)無水冰乙醇， 而後用手輕輕晃動，使絲狀物聚集成團，置於_20°C冰箱Ih ;
[0054] (9)以IOOOOrpm離心lOmin，用移液槍抽提上清液(注意觀察，不要把絲狀物抽提 出去）；
[0055] (10)用70%冷乙醇（500 μ L)洗漆2次（IOOOOrpm離心IOmin)，真空抽乾(或自然 風乾，DNA沉澱應完全乾燥，否則不利於PCR擴增，也不宜過度乾燥，否則極難溶解，可採用 加熱法促進其溶解）；
[0056] (11)在紫外燈下觀察上樣液（4 μ L DNA樣品與3 μ L溴酚藍的混合液）在0. 8%瓊 脂糖凝膠中電泳的結果，檢測基因組DNA純度(鑑於該步驟中凝膠有毒性，操作時戴一次性 手套，並在特定的區域內操作，觀察拍照後及時處理凝膠，防止汙染實驗臺）；
[0057] (12)檢測不純時，加4mol/L NaAc和無水冰乙醇，重複（9)、（10)步驟；
[0058] (13)向盛風乾絲狀物的EP管中，加入IOOyL TE (pH=8.0)，搖晃，使其充分溶解， 置於-20°C保存。
[0059] 2、TACl基因突變位點的檢測：
[0060] (1)引物設計：
[0061] 以牛tachykinin基因 mRNA序列為模板設計引物對TAC，所述引物對TAC為：
[0062] 上遊引物 TACS : 5 ' -AATCGCTCGGAGACCCAAG-3 '，
[0063] 下遊引物 TACAS : 5，-TTGTGAGAAAGCTGGCCATG-3，；
[0064] (2) PCR 擴增：
[0065] PCR 擴增的反應體系為：10XPCR Buffer2yL、2.5mol/L dNTP0.8yL、5U/yL Taq聚合酶0· 3 μ L、上遊引物TACSO. 7 μ L、下遊引物TACASO. 7 μ L、基因組DNAL 25 μ L、 ddH2014. 25 μ L，總計 20μ L ;
[0066] PCR擴增的反應程序為：94°C預變性4min ;94°C變性30s，60°C退火30s，72°C延伸 lmin，36個循環；最後72°C延伸lOmin，反應結束；
[0067] (3 )檢測PCR擴增產物：
[0068] 取4 μ L PCR擴增產物，經1. 2%瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下觀察電泳結果，得到 預期目標片段，由於上遊引物TACS和下遊引物TACAS分別在TACl基因第3和第5外顯子 上，橫跨第3和第4內含子（450bp和472bp)，擴增產物預期目標片段長度為1050bp ;
[0069] (4) PCR擴增產物測序：
[0070] 將各管PCR產物混合到I. 5ml的離心管中，混合物多於150 μ L，將上下遊引物各 20 μ L分裝到兩個離心管並標號，冷凍保存後進行雙向測序；
[0071] (5) TACl基因突變位點的確定：
[0072] 經過對山羊速激肽TACl基因序列分析發現，山羊速激肽TACl基因非編碼區第二 內含子160bp處的突變鹼基，由C突變為Τ。
[0073] 3、山羊速激肽TACl基因多態性檢測：
[0074] (1)酶切引物設計：
[0075] 針對上述突變位點（GACTCTGG[C/T] CCTCACCT)，設計HaeIII酶切引物P :
[0076] 上遊引物 PS : 5，-GCTCTATGAGCAGAGATTTC-3，，
[0077] 下遊引物 PAS :5' -GATTCCTGTTCTTGGTGG-3' ；
[0078] (2) PCR 擴增：
[0079] 取 PCR 小管 10 只，分別加入 10XPCR Buffer2 μ L、2. 5mol/L dNTPO. 8 μ L、5U/ μ L Taq聚合酶0· 3 μ L、上遊引物PSO. 7 μ L、下遊引物PASO. 7 μ L、基因組DNAL 25 μ L、 ddH2014. 25 μ L，總計20 μ L，放入PCR儀中，設計反應程序，94°C預變性4min ;94°C變性30s， 50°〇退火3〇8,721：延伸3〇8,36個循環；最後721：延伸1〇1^11，反應結束，擴增出目標片段 129bp，其核苷酸序列如下所示：
[0080] GCTCTATGAG CAGAGATTTC CACTCTAAAA GGGTATATCT CCTGGGGCGC GACTCTGG[C/T]C 60
[0081] CTCACCTCAC TAACACACAT GTGCCCACGG AGGGAGGGAG ATCCATCTGA GCCACCAAGA 120
[0082] ACAGGAATC 129
[0083] 當TACl基因非編碼區第二內含子160bp處存在C/T鹼基突變，擴增片段的核苷酸 序列如SEQ ID NO. 5所示，不存在突變時擴增片段的核苷酸序列如SEQ ID NO. 6所示；
[0084] (3) HaeIII酶切及電泳分析：
[0085] 採用10μ L HaeIII酶切反應體系，將5μ L (ΗΗ20、4μ L PCR擴增產物混合均勻，再 加入IyLlOXM Buffer，最後加入Hae III限制性內切酶200U，將混合後的PCR產物置於 37°C水浴鍋中酶切12h(隔夜即可)，進行30%的非變性聚丙烯醯胺凝膠電泳，電壓為5V/cm， 電泳結束後通過銀染觀察條帶數及片段大小（圖1)，並判斷不同基因型，其中，AA基因型表 現為1條條帶，AB基因型表現為3條條帶，BB基因型表現為2條條帶。
[0086] 圖1為PCR擴增片段酶切後的電泳圖譜(泳道從左到右標號MU-Il及M，其中1-11 為不同樣本酶切產物，兩側M為IOOObp DNA Marker)。從圖中可以看出，山羊速激肽TACl 基因突變位點存在三種基因型，分別命名為AA、AB和BB。其中，1、4、6為AA型；5、7為AB 型；2、3、8、9、10、11為BB型。190個樣本共測出172個樣的基因型，另18個樣本由於DNA 提取的問題沒有提出合格的基因組DNA，導致沒有擴增產物，統計結果見表1。
[0087] 從表1可以看出，BB型基因頻率最高，高於AB型和AA型。等位基因 B頻率顯著 高於A。經過最小二乘與方差分析，AA基因型群體羊產羔率1. 65, AB基因型產羔率2. 07， BB基因型產羔率為1. 55,由此可見，河南奶山羊TACl基因突變位點上AB基因型個體具有 高繁性，可以作為標記輔助選擇進行選種育種。
[0088] 表1河南奶山羊基因型頻率和等位基因頻率
【權利要求】
1. 一種山羊速激肽TAC1基因多態性檢測試劑盒，其特徵在於：主要包括酶切引物P : 上遊引物 PS :5' -GCTCTATGAGCAGAGATTTC-3'， 下遊引物 PAS :5' -GATTCCTGTTCTTGGTGG-3'。
2. 根據權利要求1所述的山羊速激肽TAC1基因多態性檢測試劑盒，其特徵在於：還包 括 Taq DNA Polymerase、dNTP Mixture、Hae III 及緩衝液。
3. -種山羊速激肽TAC1基因多態性檢測方法，其特徵在於：包括以下步驟： (1) 以包含速激肽TAC1基因的山羊基因組DNA為模板，用酶切引物P PCR擴增TAC1基 因非編碼區第二內含子，得到擴增片段； (2) 取擴增片段進行Haelll酶切，酶切產物電泳後根據電泳結果判斷TAC1基因突變位 點的基因型； 所述步驟（1)中酶切引物P為： 上遊引物 PS :5' -GCTCTATGAGCAGAGATTTC-3'， 下遊引物 PAS :5' -GATTCCTGTTCTTGGTGG-3'。
4. 根據權利要求3所述的山羊速激肽TAC1基因多態性檢測方法，其特徵在於：所 述步驟（1)中 PCR 擴增反應體系為：10XPCR Buffer2yL、2.5mol/L dNTP0.8yL、5U/ μ L Taq聚合酶0· 3 μ L、上遊引物PSO. 7 μ L、下遊引物PASO. 7 μ L、基因組DNA1. 25 μ L、 ddH2014. 25 μ L，總計 20μ L。
5. 根據權利要求4所述的山羊速激肽TAC1基因多態性檢測方法，其特徵在於：所述 步驟（1)中PCR擴增反應程序為：94°C預變性4min ;94°C變性30s，50°C退火30s，72°C延伸 30s，36個循環；最後72°C延伸lOmin，反應結束。
6. 根據權利要求3所述的山羊速激肽TAC1基因多態性檢測方法，其特徵在於：所述步 驟（2)中 Haelll 酶切體系為：Hae III200U、ddH205 yL、擴增片段 4yL、10XM BufferlyL。
7. 根據權利要求3所述的山羊速激肽TAC1基因多態性檢測方法，其特徵在於：所述步 驟（2)中判斷TAC1基因突變位點的基因型為：AA基因型表現為1條條帶，AB基因型表現為 3條條帶，BB基因型表現為2條條帶。
8. 根據權利要求3所述的山羊速激肽TAC1基因多態性檢測方法，其特徵在於：所述步 驟（2)中TAC1基因突變位點的檢測方法包括以下步驟：以包含速激肽TAC1基因的山羊基 因組DNA為模板，用引物對TAC PCR擴增得擴增產物；取擴增產物電泳得預期目標片段，測 序判斷TAC1基因突變位點； 所述的引物對TAC為： 上遊引物 TACS :5' -AATCGCTCGGAGACCCAAG-3'， 下遊引物 TACAS :5' -TTGTGAGAAAGCTGGCCATG-3'。
9. 根據權利要求8所述的山羊速激肽TAC1基因多態性檢測方法，其特徵在於：所述 的用引物對 TAC PCR 擴增的反應體系為：10XPCR Buffer2yL、2.5mol/L dNTP0.8yL、5U/ μ L Taq聚合酶0· 3μ L、上遊引物TACS0. 7μ L、下遊引物TACAS0. 7μ L、基因組DNA1. 25μ L、 ddH2014. 25 μ L，總計 20μ L。
10. 根據權利要求9所述的山羊速激肽TAC1基因多態性檢測方法，其特徵在於：所述 的用引物對TAC PCR擴增的反應程序為：94°C預變性4min ;94°C變性30s，60°C退火30s， 72°C延伸lmin，36個循環；最後72°C延伸lOmin，反應結束。
【文檔編號】C12Q1/68GK104293902SQ201410058064
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年2月20日 優先權日:2014年2月20日
【發明者】王玉琴, 張小輝, 劉梅, 韓文靜, 楊芳, 李元曉, 王建平, 吳秋珏, 白俊豔 申請人:河南科技大學