精-鳥二肽合成方法
2024-01-19 11:17:15
專利名稱：精-鳥二肽合成方法
技術領域：
本發明涉及一種精-鳥二肽合成方法，屬於肽類合成領域。
背景技術：
肽類由於其在生物體內具有良好的吸收性，吸收效率比胺基酸和蛋白質都高，具有獨特的生理調節功能，因此，肽類化合物特別是短肽類化合物的開發得到了廣泛關注。精氨酸、鳥氨酸均是人體必需的胺基酸，在生物體代謝中起重要作用。精氨酸(Arginine，Arg)最初由khlus於1886年從植物羽扇豆苗中分離提取得到，1895年Hedin發現精氨酸存在於哺乳動物的蛋白質中。精氨酸是幼齡哺乳動物的必需胺基酸，是組織蛋白中最豐富的氮載體。精氨酸是鹼性胺基酸，在動物體內具備重要的生理生化功能，它不僅是細胞質、核酸蛋白的主要成分，還是向天門冬氨酸、穀氨酸、脯氨酸、羥脯氨酸、聚胺(腐胺、精脒、精胺)等轉換為高能磷酸化合物肌酸磷酸的中間體，是肌酐酸唯一的氨來源；還作為尿素循環的中間體，通過尿素循環解除氨中毒，避免由於氨過量造成的代謝紊亂。在機體的勻質代謝方面起著重要的作用，可用於多種代謝途徑，包括精氨酸酶、 一氧化氮合酶、精氨酸/甘氨酸胍基轉移酶、精氨醯-tRNA合成酶等。在體內，精氨酸是最豐富的氮運輸者，並通過多種代謝途徑加以利用。L-鳥氨酸學名為α， δ -二氨基戊酸，分子式為C5H12n2O2,結構式為 nh2-ch2-ch2-ch2-chnh2-cooh。l-鳥氨酸存在於生物體多種組織和細胞中，在生物體代謝中起到重要作用，是尿素生成的中間產物，精氨酸、瓜氨酸等多種胺基酸代謝的前體物質，主要參與產尿素的鳥氨酸循環，對體內集聚的氨具有解毒作用，因而鳥氨酸對人體肝臟細胞具有重大意義。在近代醫藥行業中，L-鳥氨酸除用於製備保肝、護肝、治療肝病、抗疲勞、抗虛弱等各種複方胺基酸輸液外，還常和精氨酸一起用於配製恢復疲勞的發泡飲料。近幾年研究發現鳥氨酸還可刺激腦垂體分泌生長激素，促進蛋白質合成及糖與脂肪的分解代謝， 在結合運動情況下攝食鳥氨酸可減少體內脂肪堆積，增強肌肉和體力，起到減肥保健的作用；此外，鳥氨酸能增加聚乙烯胺的合成，促進細胞增殖，在提高免疫功能和抗癌功能上有一定作用；L-鳥氨酸添加在運動員保健品支鏈胺基酸中，具有脫苦作用。在歐洲，鳥氨酸液作為膳食藥物來銷售；日本將L-鳥氨酸與L-肉鹼、穀氨酸等作為食品調料來看待。L-鳥氨酸因其多功能的保健作用而引起世人的特別關注。二肽是由兩個胺基酸殘基通過肽鍵連接形成的肽，在體內二肽可被二肽酶水解而成兩個游離胺基酸。在體內腸黏膜細胞上存在著吸收二肽的耗能主動運轉體系，因此二肽比胺基酸更易於被吸收。由於以肽形式吸收時，吸收率高，並且具有一定的生理功能，二肽的研究受到了廣泛關注，例如丙谷二肽、甘氨醯脯氨酸二肽、穀氨醯胺二肽、賴氨酸穀氨酸二肽等已被開發成為藥物或藥物前體。但目前還尚未有文獻報導關於精-鳥二肽的製備。
發明內容
本發明的目的在於提供一種能大批量生產，經濟合理，操作簡單且產品收率和純度均高的新的二肽化合物精-鳥二肽(Arg-Orn)的合成方法。本發明提供的精-鳥二肽合成方法的具體步驟
1) N端保護的鳥氨酸與N-羥基琥珀醯亞胺在有機溶劑中反應30 miiTlO h，反應溫度-5 30 V，反應結束後，水洗，分離有機溶劑層，旋蒸，真空乾燥，形成N端保護的鳥氨酸活潑酯；其中N端保護鳥氨酸與N-羥基琥珀醯亞胺的摩爾比為0. 7(Γ2. 50。2)將1)步中得到的N端保護的鳥氨酸活潑酯與胍基保護的精氨酸，在有機溶劑中反應10 mirTl5 h，反應溫度-5 30 °C，形成醯胺鍵，反應結束後，水洗，分離有機溶劑層， 旋蒸，真空乾燥，得到N端及胍基保護的精-鳥二肽；其中N端保護的鳥氨酸活潑酯與胍基保護的精氨酸摩爾比為0. 8(Γ3. O。3)將2)步中得到的N端及胍基保護的精-鳥二肽溶於有機溶劑中，加入無機酸， 反應溫度10飛0 0C，反應廣5 h，脫除胍基保護基，用乙醚沉澱，過濾得到N端保護的精-鳥二肽；其中N端及胍基保護的精-鳥二肽與無機酸的摩爾比為0. 5 10。4)將3)步中得到的N端保護的精-鳥二肽溶於有機溶劑中，加入有機鹼，室溫，反應20 mirTl2 h，反應溫度-5 30 °C，反應液水洗，分離有機層，旋蒸，乾燥，乙醚研磨，過濾， 得到精-鳥二肽，產率為30、5% ；其中N端精-鳥二肽與有機鹼的摩爾比為0. 5^3. O。其中，
(I)所述的有機溶劑選自二氯甲烷、甲醇、四氫呋喃、二氧六環、乙腈、N，N-二甲基甲醯胺、1，2_ 二氯乙烷、二甲基亞碸或氯仿中的一種。(II)步驟1)中所述的N端保護的鳥氨酸為Fmoc-Orn-OH或Fmoc-Orn(Boc)-0H。(III)步驟1)中所述的N端保護鳥氨酸與N-羥基琥珀醯亞胺的反應優選時間範圍為廣6 h，優選反應溫度-5 10 °C。(IV)步驟2)中所述的N端保護的鳥氨酸活潑酯與胍基保護的精氨酸反應的優選時間範圍為;Γ7 h，優選反應溫度-5 10 °C。( V)步驟3)中所述的N端及胍基保護的精-鳥二肽與無機酸反應的優選時間範圍為2 3 h,優選反應溫度為2(T40 °C。(VI)步驟4)中所述的N端精-鳥二肽與有機鹼的反應優選時間為1.5飛1!，優選反應溫度為-5 10 °c。(ΥΠ)步驟3)中所述的無機酸選自鹽酸、三氟乙酸、含氯化氫的冰乙酸溶液、含溴化氫的冰乙酸溶液、含氯化氫的二氧六環溶液或含溴化氫的二氧六環溶液中的一種。(VDI)步驟4)中所述的有機鹼選自六氫吡啶、三乙胺、乙二胺、甲胺、乙胺、二甲胺、 三甲胺、三乙胺或異丙胺中的一種。本發明的優點及有益效果
本發明首次採用化學合成方法得到精鳥二肽，並且該工藝合成路線短，生產工藝合理， 成本低，有良好的應用價值。
圖1是精-鳥二肽的液相分析及質譜，
(A)液相分析，分析條件乙腈水=8515 ；流速1 mL/min ；檢測波長:254nm
(B)質譜正離子模式[M+H]+= 288. 90， [M+Na]+= 310. 80(C)質譜負離子模式[Μ-ΗΓ = 286.75。
具體實施例方式以下結合實施例對本發明作進一步的說明。實施例1
1、Fmoc-Orn (boc)-OH 50 mmol 用 20 mL 二氯甲烷溶解，加入 NHS 35 mmol,室溫反應1小時，反應結束後，水洗，析出固體，過濾，得白色固體Fmoc-Orn (boc)-NHS。產率95%。2、將Arg(Pbf)-OH 20 mmol,Fmoc-OrnCboc)-NHS 16 mmol 溶於 30mL氯仿，於 10°C 反應過夜，反應結束後，水洗，收集有機相，旋蒸，得淡黃色泡狀固體Fmoc-Orn (boc)-Arg (Pbf)-0H。產率 80%。3、將 Fmoc-Orn (boc)-Arg(Pbf)-OH 7 mmol 溶於 20 mL 二氧六環，滴力口 3 mL 三氟乙酸，室溫反應2小時，反應結束後加入乙醚，析出白色固體，抽濾，得到Fmoc-Orn-Arg-OH。 產率65%。4、將 Rnoc-Orn-Arg-OH 5 mmol 溶於 15 ml 甲醇中，滴加 7. 5 mL 哌啶，_5°C下反應5小時，反應結束後，加入乙醚，析出白色固體，抽濾，得到精-鳥二肽Orn-Arg。產率50%。實施例2
1、Fmoc-Orn (boc) -OH 40 mmol 用 40 mL 乙酸乙酯溶解，加入 NHS 65 mmol, 20°C反應2. 5 h，反應結束後，水沉，析出固體，過濾，得白色固體Fmoc-Orn (boc)-NHS。產率85%。2、將 Arg (Pbf) -OH 20 mmol, Fmoc-Orn (boc) -NHS 32 mmol 溶於 50 mLl，2_ 二氯乙烷，30°C反應4 h，反應結束後，水洗，收集有機相，旋蒸，得淡黃色泡狀固體Fmoc-Orn (boc) -Arg (Pbf)-0H。產率 70%。3、將 Fmoc-Orn (boc) -Arg (Pbf) -OH 15 mmol 溶於 40mL 乙腈，滴力口 10 mL 溴化氫/冰乙酸溶液，室溫反應3 h，反應結束後加入乙醚，析出白色固體，抽濾，得到 Fmoc-Orn-Arg-OH。產率 75%。4、將 Fmoc-Orn-Arg-OH 10 mmol 溶於 35 mL N，N-二甲基甲醯胺(或二甲基亞碸)中，滴加15 mL環己胺，室溫反應4 h，反應結束後，加入乙醚，析出白色固體，抽濾，得到精-鳥二肽Orn-Arg。產率60%。實施例3
UFmoc-Orn-OH 60 mmol 用 100 mL 二氧六環溶解，加入 NHS 129 mmol,室溫反應 2 h, 反應結束後，水沉，析出固體，過濾，得白色固體Fmoc-Orn (boc)-NHS0產率95%。2Arg (Pbf)-OH 40 mmol,Fmoc-Orn (boc)-NHS 106 mmol 溶於 50 mL 乙腈，室溫反應過夜，反應結束後，水洗，收集有機相，旋蒸，得淡黃色泡狀固體Fmoc-Orn (boc)-Arg (Pbf)-0H。產率 75%。3、將 Fmoc-Orn (boc) -Arg (Pbf) -OH 15 mmol 溶於 40mL 甲醇中，滴力口 60 mL 氯化氫/ 二氧六環溶液，室溫反應過夜，反應結束後加入乙醚，析出白色固體，抽濾，得到 Fmoc-Orn-Arg-OH。產率 65%。4、將 Fmoc-Orn-Arg-OH 20 mmol 溶於 30 mL 中二氯甲燒，滴加 40 mL 甲胺， 室溫反應1 h，反應結束後加入乙醚，析出白色固體，抽濾，得到精-鳥二肽Orn-Arg (1HNMR(DMSo), 400MHz) δ 2. 93 (2Η, t, J=7. 302), 1. 32 (2H, tt, J=7. 302, J=6. 960),
51. 39 (2H, tt, J=7. 365, J=6. 960), 1. 82 (2H, tt, J=7. 434, J=7. 427), 2. 73 (2H, t,
J=7.427), 1.67 (2H, dt,
1. 87 (2H, dt, J=7. 517, J=7. 434);
J=7. 567, J=7. 365):
3. 45 (1H, t, J=7. 567)，4. 22 (1H, t, J=7. 517), 10. 83 (1H, s)。產率 50%。產品液相分析及質譜見附圖。
權利要求
1.精-鳥二肽合成方法，其特徵在於該方法的步驟為1)N端保護的鳥氨酸與N-羥基琥珀醯亞胺在有機溶劑中反應30 miiTlO h，反應溫度-5 30 V，反應結束後，水洗，分離有機溶劑層，旋蒸，真空乾燥，形成N端保護的鳥氨酸活潑酯；其中N端保護鳥氨酸與N-羥基琥珀醯亞胺的摩爾比為0. 7(Γ2. 50 ；2)將1)步中得到的N端保護的鳥氨酸活潑酯與胍基保護的精氨酸，在有機溶劑中反應10 mirTl5 h，反應溫度-5 30 °C，形成醯胺鍵，反應結束後，水洗，分離有機溶劑層，旋蒸，真空乾燥，得到N端及胍基保護的精-鳥二肽；其中N端保護的鳥氨酸活潑酯與胍基保護的精氨酸摩爾比為0. 80 3· O ；3)將2)步中得到的N端及胍基保護的精-鳥二肽溶於有機溶劑中，加入無機酸，反應溫度1(T60 °C，反應廣5 h，脫除胍基保護基，用乙醚沉澱，過濾得到N端保護的精-鳥二肽； 其中N端及胍基保護的精-鳥二肽與無機酸的摩爾比為0. 5^10 ；4)將3)步中得到的N端保護的精-鳥二肽溶於有機溶劑中，加入有機鹼，室溫，反應 20 mirTl2 h，反應溫度-5 30 °C，反應液水洗，分離有機層，旋蒸，乾燥，乙醚研磨，過濾，得到精-鳥二肽，產率為3(Γ85% ；其中N端精-鳥二肽與有機鹼的摩爾比為0. 5^3. O。
2.如權利要求1所述的精-鳥二肽合成方法，其特徵在於所述的有機溶劑選自二氯甲烷、甲醇、四氫呋喃、二氧六環、乙腈、N，N-二甲基甲醯胺、1，2_ 二氯乙烷、二甲基亞碸或氯仿中的一種。
3.如權利要求1所述的精-鳥二肽合成方法，其特徵在於步驟1)中所述的N端保護的鳥氨酸為 Fmoc-Orn-OH 或 Fmoc-Orn (Boc) -0H。
4.如權利要求1所述的精-鳥二肽合成方法，其特徵在於步驟1)中所述的N端保護鳥氨酸與N-羥基琥珀醯亞胺的反應優選時間範圍為廣6 h，優選反應溫度-5 10 °C。
5.如權利要求1所述的精-鳥二肽合成方法，其特徵在於步驟2)中所述的N端保護的鳥氨酸活潑酯與胍基保護的精氨酸反應的優選時間範圍為;Γ7 h，優選反應溫度-5 10 "C。
6.如權利要求1所述的精-鳥二肽合成方法，其特徵在於步驟3)中所述的N端及胍基保護的精-鳥二肽與無機酸反應的優選時間範圍為纊3 h,優選反應溫度為2(T40 °C。
7.如權利要求1所述的精-鳥二肽合成方法，其特徵在於步驟4)中所述的N端精-鳥二肽與有機鹼的反應優選時間為1.5飛h，優選反應溫度為-5 10 °C。
8.如權利要求1所述的精-鳥二肽合成方法，其特徵在於步驟3)中所述的無機酸選自鹽酸、三氟乙酸、含氯化氫的冰乙酸溶液、含溴化氫的冰乙酸溶液、含氯化氫的二氧六環溶液或含溴化氫的二氧六環溶液中的一種。
9.如權利要求1所述的精-鳥二肽合成方法，其特徵在於步驟4)中所述的有機鹼選自六氫吡啶、三乙胺、乙二胺、甲胺、乙胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺或異丙胺中的一種。
全文摘要
精-鳥二肽合成方法，涉及一種含胺基酸的二肽合成方法。合成步驟為N端保護的鳥氨酸在N-羥基琥珀醯亞胺作用下生成活性酯；活性酯與胍基保護的精氨酸在鹼作用下反應形成肽鍵；隨後分別用酸、鹼脫去保護基團得到精-鳥二肽。本發明首次提供了一種合成工藝和設備簡單、成本低、產率高、產物容易分離提純的精-鳥二肽合成方法，該方法具有良好的應用價值。
文檔編號C07K5/068GK102190705SQ201110073099
公開日2011年9月21日 申請日期2011年3月25日 優先權日2011年3月25日
發明者侯潔, 高智慧 申請人:天津啟仁醫藥科技有限公司