與乳腺癌有關的基因dree及其編碼的蛋白與應用的製作方法

2024-01-19 14:41:15 1

專利名稱：與乳腺癌有關的基因dree及其編碼的蛋白與應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及與乳腺癌有關的基因DREE(down-regulated by ER inendometrium)及其編碼的蛋白，該基因的表達載體，以及所述基因和蛋白在製備治療乳腺癌的藥物中的應用。
背景技術：
乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，嚴重地威脅著女性的生命安全。發現與乳腺癌有關的新基因及其表達的蛋白並由此獲得治療乳腺癌的新的方法因此具有重要意義。

發明內容
本發明發現了一種與乳腺癌等的癌細胞的生長和增殖有關的蛋白，克隆了編碼該蛋白的基因，構建了含有該基因的表達載體和含有該表達載體的宿主細胞，並且發現該蛋白可促進乳腺癌等腫瘤細胞的生長和增殖，基於以上發現，完成了本發明。
因此，本發明的一個目的是提供可促進腫瘤細胞的生長和增殖的蛋白，尤其重組蛋白，該蛋白具有序列表中序列2所示的胺基酸序列，或者通過所述胺基酸序列中的一個或多個胺基酸的缺失，取代或增加而得到的胺基酸序列。
本發明的另一個目的提供了編碼上述蛋白的基因，它是具有序列1所示的鹼基序列的DNA或者與所述DNA在嚴格條件下雜交的DNA。
本發明的又一個目的是提供含有上述基因或者編碼上述蛋白的基因的表達載體。
本發明的另一個目的是提供由上述表達載體轉化的宿主細胞。
本發明的再一個目的是提供生產本發明的重組蛋白的方法，該方法包括下列步驟培養上述轉化的宿主細胞，使轉化細胞產生本發明的重組蛋白；和從培養物中分離出重組蛋白。
本發明的另一個目的是提供針對上述蛋白的抗體，它是使用所述重組蛋白作為免疫原而產生的特異性抗體。它可以是單克隆或多克隆抗體。
本發明的還一個目的是提供檢測所述蛋白的試劑盒，它含有上述特異性抗體，可以進行抗原-抗體反應，用於檢測具有序列2所示的蛋白。
此外，本發明提供了用於檢測序列1所示的核苷酸序列的探針診斷試劑盒，它含有與核苷酸序列1中的部分核苷酸序列互補的核苷酸序列。
在一個實施方案中，本發明的探針具有如序列表中的序列3所示的核苷酸序列。
本發明還提供了用於PCR擴增的引物，該引物為
ups 5』-GGAATTCGCCACCATGTTTCCCCATCACTCGA-3』downs 5』-CGGGATCCCGCTACTCAGGAAGCCGAAATG-3』。
本發明還提供了上述基因、蛋白或抗體在製備治療腫瘤的藥物中的應用。
附圖簡述

圖1是組織表達譜(MTN，Clontech)，提示DREE基因含有2個轉錄本，分別為2.4kb和4.5kb左右。組織表達譜證實DREE基因具有明顯的組織特異性，在骨骼肌中表達最強，其次是心臟、胰腺和胎盤。
圖2是腫瘤表達譜(multi-tissue tumor profile，Clontech)，分析表明與正常組織相比，DREE基因在乳腺癌、胰腺癌等組織中的表達量降低；在子宮內膜癌、卵巢癌等組織中的表達量增加。
圖3是腫瘤表達譜(multi-tissue tumor profile，Clontech)，分析表明與正常組織相比，DREE基因在乳腺癌、胰腺癌等組織中的表達量降低；在子宮內膜癌、卵巢癌等組織中的表達量增加。
圖4是顯示DREE基因在多種腫瘤細胞系中表達的Northern blot結果圖，顯示DREE基因在多種腫瘤細胞系中表達。
圖5是顯示DREE基因在多種腫瘤細胞系中表達的RT-PCR結果圖，顯示DREE基因在多種腫瘤細胞系中表達。
圖6是pGEX-4T-3-DREE原核表達載體的電泳圖。
圖7是DREE蛋白在大腸桿菌BL21中表達的SDS-PAGE電泳圖。
圖8是pEGFP-C2-DREE真核表達載體的電泳圖。
圖9是顯示DREE蛋白在MCF-7細胞中定位的螢光顯微鏡圖，DREE蛋白主要定位於核膜。
圖10是pcDNA3.1(-)-c-myc-DREE真核表達載體的電泳圖。
圖11是顯示DREE蛋白對ECC-1細胞的增殖的影響的圖(P＜0.05)。
圖12是通過Clustal W program分析得到DREE的進化樹圖。
圖13是非變性總RNA的電泳圖。
本發明用雌二醇(E2)和Tamoxifen同時處理ECC-1和ISHIKAWA細胞(子宮內膜癌細胞)，基因晶片檢測顯示EST序列AI289489下調，利用該EST序列電子克隆得到一雌激素受體下調靶基因，全長1553bp序列，最長ORF為795bp。RACE和RT-PCR實驗證實該基因存在，符合預測結果。將其命名為DREE(down-regulatedby ER in endometrium)。ORF795bp。編碼265個胺基酸。ORF如序列1所示。編碼的胺基酸序列如序列2所示。
DREE基因生物信息學分析顯示，該基因定位於1q32.3，編碼227個胺基酸殘基。有三個外顯子，pI為8.0。蛋白質結構分析提示該基因含有多個PKC和CK2磷酸化位點，C端有CCR4結構域，可能與基因轉錄有關。此外還提示可能與RNA剪接有關。
在Unigene中同源比對分析得到其同源類似蛋白如下
A.thaliana pirT45678-T45678hypothetical protein29.47％/341aaF14P22.170-Arabidopsis thaliana(seeProtEST)C.eleganspirT33226-T33226 hypothetical protein W02G9.536.84％/223aa-Caenorhabditis elegans(seeProtEST)D.pirS71925-S71925 angel protein-fruit fly 39.45％/213aamelanogaster(seeProtEST)H.sapienspirT46340-T46340 hypothetical protein99.85％/673aaDKFZp434B0814.1-human(seeProtEST)M.musculusspO35710-NOCT MOUSE Nocturnin 27.66％/226aa(seeProtEST)R.norvegicussp:Q9ET55-NOCT RAT Nocturnin 29.85％/192aa(seeProtEST)S.cerevisiaespP31384-CCR4 YEAST Glucose-repressiblealcohol dehydrogenase transcriptional effector通過ClustalW program分析得到其進化樹，見圖12。
進行了MTN分析和腫瘤表達譜(multi-tissue tumor profile，Clontech)分析。組織表達譜證實DREE基因具有明顯的組織特異性，在骨骼肌中表達最強，其次是心臟、胰腺和胎盤。腫瘤表達譜(multi-tissue tumor profile，Clontech)分析表明與正常組織相比，DREE基因在乳腺癌、胰腺癌等組織中的表達量降低；在子宮內膜癌、卵巢癌等組織中的表達量增加。
構建了pGEX-4T-3-DREE質粒，pGEX-4T-3-DREE在大腸桿菌BL21菌株中30℃誘導表達GST-DREE的融合蛋白。SDS-PAGE電泳證實DREE基因在大腸桿菌BL21中表達。
構建pEGFP-C2-DREE真核表達載體，confocol證實DREE在MCF-7細胞中表達，主要定位於核膜。
MTT法檢測DREE過表達對乳腺癌細胞增殖的影響，結果發現DREE蛋白可以促進細胞增殖(P＜0.05)。
通過使用本發明的蛋白或者免疫學上等效的多肽，可以獲得其抗體，抗體用於所述蛋白的檢測和純化。可以利用本發明的蛋白或其部分胺基酸序列作為免疫原來產生抗體。可以通過將抗體接種給宿主動物並回收血清的常規方法產生多克隆抗體。還可以通過常規雜交瘤方法產生單克隆抗體。
通過抑制所述蛋白表達，或通過利用針對所述蛋白的抗體，可以抑制腫瘤細胞的生長和增殖，從而可以達到治療腫瘤的目的。
實施例1用RT-PCR方法從人乳腺癌MCF-7細胞中克隆DREE基因1)細胞總RNA的提取對數生長期的MCF-7細胞中加入Trizol Reagent試劑(Invitrogen)1ml，轉移至1.5ml EP管，室溫靜置5分鐘。加入氯仿0.2ml，劇烈搖晃EP管15秒。室溫靜置2-3分鐘，4℃，12,000rpm離心15分鐘。轉移上層水相至另一EP管中(約500-600μl)，加入0.5ml異丙醇，室溫靜置10分鐘，4℃，10,000rpm離心10分鐘。棄上清，用1ml 75％乙醇漂洗沉澱，4℃，7,500rpm離心5分鐘。棄掉75％乙醇液，儘量控幹，並於空氣中風乾少量剩餘乙醇，將RNA沉澱溶於20μl DEPC處理水中，於55℃-60℃水浴中孵育10分鐘。紫外分光光度計定量RNA以及確定所提RNA純度。以OD260/OD280≥1.8為符合要求。
2)反轉錄合成cDNA(Invitrogen kit)取所提取的RNA模板，用DEPC處理水配製成濃度為1μg/μl。製備20μl逆轉錄體系MgCl2(25mM)4μl，10x逆轉錄緩衝液2μl，dNTP(10mM)2μl，RNase抑制劑(40U/μl)0.5μl，AMV逆轉錄酶(20U/μl)0.75μl，Oligo(dT)(0.5μg/μl)1μl，RNA模板2μl，最後加DEPC處理水補足20μl體系。42℃水浴90分鐘。加熱樣品管至95℃，5分鐘，冰浴5分鐘，最後於-20℃保存。
3)PCR反應引物pEGFP-C2-DREEups 5』-GGAATTCGCCACCATGTTTCCCCATCACTCGA-3』downs 5』-CGGGATCCCGCTACTCAGGAAGCCGAAATG-3』。
採用25μl PCR反應體系擴增DREE基因取1.67μl cDNA做PCR模板，加10×PCR緩衝液2.5μl；2.5mM dNTP 2μl；上下遊引物(10μM)各0.5μl；Taq DNA聚合酶(1U/μl)0.2μl；加去離子水補足25μl體系(酶購自TAKARA公司)。
PCR條件為94℃預變性3分鐘；94℃變性30秒；54℃退火30秒；72℃延伸1分鐘，共30個循環。再72℃延伸10分鐘。取出儲存於-20℃。1％瓊脂糖凝膠電泳鑑定。
擴增產物用QIAGEN公司的試劑盒純化，用EcoRI及BamHI雙酶切後，克隆到相同酶切的pEGFP-C2真核表達載體中。DNA序列分析結果表明PCR產物的DNA序列與預期相符。
實施例2Northern blot雜交
1)細胞總RNA的提取(見RT-PCR)2)RNA甲醛凝膠變性電泳制膠50ml

樣品處理

電泳電泳槽中加入1×MOPS凝膠電泳緩衝液(沒過凝膠1-2mm)預電泳10min，上樣，穩壓40伏電泳，待溴酚藍走至膠長的三分之二時停止電泳，20×SSC含0.5μg溴化乙啶染色，紫外燈下觀察並照相。結果見圖13。圖中28S與18S的比值約為2∶1且5S幾乎看不到，說明所提取的RNA很少降解，可用於Northern blot分析。
3)變性RNA轉膜準備一大塑料飯盒，內置足夠厚濾紙築成平臺，剪三張比膠略大的濾紙和一張硝酸纖維素膜，用20×SSC浸溼濾紙和膜至少5min(膜先用去離子水自上而下浸透)，並用DEPC水浸泡凝膠數次，換成20×SSC浸泡2min。
向盒內加入20×SSC，在平臺上，自下而上依次鋪濾紙——凝膠——硝酸纖維素膜——濾紙，期間注意各步都儘量排除所有氣泡。封口膜圍繞凝膠四周預防短路，最後於最後一層濾紙上放置足夠高的吸水紙，上壓500g重物，持續轉膜18-24hr。
轉移結束後，6×SSC漂洗纖維素膜，微幹，夾於兩張乾燥濾紙間紫外交聯5s。膜可以直接用也可用保鮮膜及錫箔紙包好置4℃保存。
4)探針製備RT-PCR擴增DREE基因作為探針，方法同實施例1。引物ups 5』-GGAATTCGCCACCATGTTTCCCCATCACTCGA-3』；downs 5』-TCCAGTTGGGCGACAGAGTGAGACC-3』參照Amersham Biosciences的Ready-To-Go DNA LabellingBeads(-dCTP)kit說明書。25ng-1μg DNA溶於45μl水中，90-100℃2-3分鐘，迅速冰浴5分鐘，加5μl[α-32P]dCTP標記的Random Primersand Reaction Buffer Mix至50μL，37℃孵育20min。
5)預雜交用6×SSC浸透硝酸纖維素膜，放入雜交袋中，加入10ml(0.2ml/cm2)預雜交液，排除氣泡，封口，恆溫搖床輕搖，42℃預雜交3-4hr或過夜。
6)雜交探針95-100℃水浴5min，迅速冷卻，加入雜交液中，恆溫搖床輕搖42℃雜交24hr。
7)洗膜棄去雜交液，迅速洗膜不要使膜乾燥。
1×SSC/0.1％SDS20min×20.2×SSC/0.1％SDS68℃ 30min×2同位素監測直至在無DNA區域檢測不出放射信號為止。
0.1×SSC 室溫洗5min，然後取出，吸去多餘液體，保鮮膜包好。
8)放射自顯影-20℃曝光24-48hr。顯影，定影，照相分析結果。
實施例3、MTN分析和腫瘤表達譜(multi-tissue tumor profile，Clontech)分析雜交操作參照Clontech公司MTN分析和腫瘤表達譜(multi-tissuetumor profile，Clontech)分析試劑盒說明書。過程如下
(1)探針標記方法同實施例2。
(2)雜交68℃預熱雜交液，將吸附有核酸的尼龍膜放入含有雜交液的雜交瓶中，加入含有100μg/ml的鮭精DNA的雜交液0.1ml/cm2，68℃預雜交30min。20ng/ml探針混入雜交液，95℃2-5分鐘，冰浴5分鐘。加入雜交瓶，68℃雜交1小時。
(3)洗膜用Wash Buffer 1室溫洗膜30-40分鐘，用Wash Buffer 250℃洗膜40分鐘。
(4)顯色用鑷子取出膜，洗幹Wash Buffer 2，用保鮮膜覆蓋，-70℃曝光1-3天後顯影，定影。
組織表達譜(MTN，Clontech)及Northern blot結果(圖1、4)均提示DREE基因含有2個轉錄本，分別為2.4kb和4.5kb左右。組織表達譜證實DREE基因表達具有明顯的組織特異性，在骨骼肌中表達最強，其次是心臟、胰腺和胎盤(圖1)。
腫瘤表達譜(multi-tissue tumor profile，Clontech)分析表明與正常組織相比，DREE基因在乳腺癌、胰腺癌等組織中的表達量降低；在子宮內膜癌、卵巢癌等組織中的表達量增加(圖2、3)。
Northern blot(圖4)及RT-PCR(圖5)結果顯示DREE基因在多種腫瘤細胞系中表達。
實施例4DREE基因在原核細胞中的表達及純化構建pGEX-4T-3-DREE質粒RT-PCR獲取DREE目的基因，方法同實施例1。引物序列如下pGEX-4T-3-DREEups 5』-GGAATTCCATGTTTCCCCATCACTCGA-3』downs5』-AAGGAAAAAAGCGGCCGCTCTACTCAGGAAGCCGAAATG-3』1)Qiagen PCR純化試劑盒純化，EcoR I和Not I雙酶切(50ul體系10×EcoRI buffer 5ul、EcoR I酶2ul、Not I酶2ul，補水至50ul。37℃反應5hrs。試劑盒購自NEB公司)，Qiagen PCR純化試劑盒純化，同EcoR I和Not I雙酶切且純化後的pGEX-4T-3連接(10ul體系10×buffer 1ul、pGEX-4T-3100ng、DREE產物50ng、連接酶1ul，補水至10ul。15℃反應18hrs。試劑盒購自Promega公司)。連接後轉化、篩選測序。
2)pGEX-4T-3-DREE可以在大腸桿菌BL21菌株中30℃誘導表達GST-DREE的融合蛋白，首先製備BL21的感受態細胞挑取單克隆到適量培養基中，37℃ 250rpm培養至A6000.4-0.5，2500g離心15分鐘，備用。將1-50ng pGEX-4T-3-DREE轉化到上述製備的感受態細胞中，用Glutathione Sepharose 4B進行純化，純化步驟如下(1)取單克隆到2-3mL 2YTA培養基中培養4-5小時。轉接到100ml的錐形瓶中生長過夜。
(2)轉接到500ml的錐形瓶中培養3-5小時。
(3)加0.5mL 1M IPTG 30℃，培養3-6小時。
(4)3000rpm 10分鐘離心收集細胞。
(5)用25ml PBS重懸細胞。超聲10分鐘。
(6)加1.25ml20％Triton X-100，混勻1小時。
(7)1000rpm 10分鐘離心，加入0.5mL 50％slurry of GlutathioneSepharose 4B，室溫30分鐘。
(8)1000rpm 5分鐘離心，PBS洗三遍。
(9)用0.5ml洗脫Buffer洗脫，短暫離心後收集上清。
構建pGEX-4T-3-DREE原核表達載體如圖6所示，SDS-PAGE電泳證實DREE在大腸桿菌BL21中表達(圖7)。
實施例6DREE在細胞內的定位利用本實驗室保存的pEGFP-C1 C末端蛋白融合載體構建了pEGFP-C2-DREE載體(構建方法同pGEX-4T-3-DREE)，引物ups 5』-GGAATTCGCCACCATGTTTCCCCATCACTCGA-3』downs 5』-CGGGATCCCGCTACTCAGGAAGCCGAAATG-3』。
它可以在真核細胞內表達GFP-DREE的融合蛋白。
1)用LipofectinTM方法瞬時轉染該載體至MCF-7細胞於轉染前一天將MCF-7細胞接種於6孔板(已放置蓋玻片)中，接種密度為8×105個細胞/孔，每孔加入培養液2ml。24小時後，細胞長至覆蓋培養孔底面積約70-80％時，可準備轉染。在EP管中配製下述溶液溶液A4μg pEGFP-C2-DREE及對照表達質粒，分別溶於250ul無血清無雙抗DMEM培養液。溶液B將10μl脂質體溶液(lipofectamine 2000reagent)加入到250ml無血清無雙抗DMEM培養液中。室溫靜置5分鐘。然後將溶液A、B混合，室溫靜置20分鐘。用無血清和不含雙抗的DMEM培養液洗滌細胞。將上述溶液A、B的混合液中加入2ml無血清無雙抗的DMEM培養液，混勻後加至細胞表面。37℃，5％CO2條件下孵育4-6小時後，再用正常含10％胎牛血清的DMEM培養液取代前述培養液，繼續培養細胞至36小時。
2)DAPI染色36小時後，用PBS洗三遍，用4％多聚甲醛/PBS進行固定，室溫15分鐘，然後用PBS洗三遍。用0.1％Triton X-100/PBS透化15分鐘，然後用PBS洗三遍，加入200μL 2.5mg/ml的DAPI，室溫作用30分鐘，然後用PBS洗三遍，在螢光顯微鏡下分別用常規螢光波長和DAPI波長進行觀察，並進行拍照。
實施例7MTT法檢測DREE過表達對乳腺癌細胞增殖的影響利用本實驗室保存的pcDNA3.1(-)載體構建了pcDNA3.1-c-myc-DREE融合蛋白表達載體(構建方法同pGEX-4T-3-DREE構建)，引物ups 5』-GGAATTCGCCACCATGTTTCCCCATCACTCGA-3』downs 5』-CGGGATCCACAGGAAGCCGAAATGAGAGG-3』。
MTT(四甲基偶氮唑蘭)可被細胞攝取，並被活細胞內線粒體脫氫酶還原成一種不溶於水的藍紫色產物甲瓚，並沉澱於細胞中，而死細胞沒有這種功能。甲瓚可溶於二甲基亞碸(DMSO)，溶液在570nm處有最大吸收。故該波段處吸收值越大代表存活細胞量越多。MTT法廣泛應用於細胞毒性實驗、細胞生長測定等。本實驗利用MTT法觀察DREE蛋白對MCF-7生長的影響。
具體操作方法如下將培養到對數生長期的ECC-1細胞接種於96孔板中，每孔接種細胞數為1×105個。次日轉染100ng pcDNA3.1-c-myc-DREE及對照表達質粒(轉染方法同pEGFP-C2-DREE載體轉染)，重複6孔細胞，37℃，5％CO2進行培養。分別培養1d、2d、3d後，在每個細胞培養孔內加入50μl 1mg/ml的MTT溶液，同樣培養條件下作用4小時後取出，小心吸出每孔內液體，每孔加入二甲基亞楓150μl，輕微振蕩10分鐘，使藍紫色結晶充分溶解在二甲基亞楓中。用自動酶標儀測量96孔板中每孔在570nm處的吸光值。
DREE序~1SEQUENCE LISTING110北京大學120與乳腺癌有關的基因DREE及其編碼的蛋白與應用130
1603170PatentIn version 3.12101211795212DNA213人220
221CDS222(1)..(792)223
4001atg ttt ccc cat cac tcg agg agt ctg ggc aga gac tgg act aca ccg 48Met Phe Pro His His Ser Arg Ser Leu Gly Arg Asp Trp Thr Thr Pro1 5 10 15tgg gag aat ctg caa agg tgt tgc tgg aac aga cat att tct agt tgt 96Trp Glu Asn Leu Gln Arg Cys Cys Trp Asn Arg His Ile Ser Ser Cys20 25 30atg agg tgg cct gga cat tac tct cga gct cct tac cca tac ttc agt 144Met Arg Trp Pro Gly His Tyr Ser Arg Ala Pro Tyr Pro Tyr Phe Ser35 40 45agt agg cat ttt tca cta aat tgg aga cca ccc tgt ttg ttt gag tct 192Ser Arg His Phe Ser Leu Asn Trp Arg Pro Pro Cys Leu Phe Glu Ser50 55 60aga act cag ttc cag tac tgt aac tgg aga cct gac aac ctg agc cag 240Arg Thr Gln Phe Gln Tyr Cys Asn Trp Arg Pro Asp Asn Leu Ser Gln65 70 75 80aca tct ttg att cat ctc tct agt tac gtc atg aac gct gag gga gat 288Thr Ser Leu Ile His Leu Ser Ser Tyr Val Met Asn Ala Glu Gly Asp85 90 95gag cct tca tca aaa cga aga aaa cac caa ggt gtg ata aag cgg aat 336Glu Pro Ser Ser Lys Arg Arg Lys His Gln Gly Val Ile Lys Arg Asn100 105 110tgg gaa tat ata tgt agc cat gat aaa gaa aaa acg aag atc cta gga 384Trp Glu Tyr Ile Cys Ser His Asp Lys Glu Lys Thr Lys Ile Leu Gly115 120 125gac aaa aat gtt gat ccc aaa tgt gaa gac agt gag aac aag ttt gac 432
DREE序~1Asp Lys Asn Val Asp Pro Lys Cys Glu Asp Ser Glu Asn Lys Phe Asp130 135 140ttt tca gtg atg tcc tat aat ata ctt tca caa gat tta ctg gaa gat480Phe Ser Val Met Ser Tyr Asn Ile Leu Ser Gln Asp Leu Leu Glu Asp145 150 155 160aac tct cac ctt tat aga cat tgc cgg cgg cca gta tta cac tgg agt528Asn Ser His Leu Tyr Arg His Cys Arg Arg Pro Val Leu His Trp Ser165 170 175ttt agg ttt ccc aat att ctg aaa gaa att aaa cat ttt gat gca gac576Phe Arg Phe Pro Asn Ile Leu Lys Glu Ile Lys His Phe Asp Ala Asp180 185 190gta ctt tgt ttg caa gaa gtt caa gaa gat cat tat gga gca gag atc624Val Leu Cys Leu Gln Glu Val Gln Glu Asp His Tyr Gly Ala Glu Ile195 200 205agg cca agt ttg gaa tca ctg ggt aca atg caa ctt ttt ttt ttt ttt672Arg Pro Ser Leu Glu Ser Leu Gly Thr Met Gln Leu Phe Phe Phe Phe210 215 220ttt tct ttt ttg aga cag ggt ctc act ctg tcg ccc aac tgg agt gca720Phe Ser Phe Leu Arg Gln Gly Leu Thr Leu Ser Pro Asn Trp Ser Ala225 230 235 240gtg gca caa tca tgg ctc act aca gcc tca acc tac tgg gct caa gta768Val Ala Gln Ser Trp Leu Thr Thr Ala Ser Thr Tyr Trp Ala Gln Val245 250 255atc ctc tca ttt cgg ctt cct gag tag795Ile Leu Ser Phe Arg Leu Pro Glu2602102211264212PRT213人4002Met Phe Pro His His Ser Arg Ser Leu Gly Arg Asp Trp Thr Thr Pro1 5 10 15Trp Glu Asn Leu Gln Arg Cys Cys Trp Asn Arg His Ile Ser Ser Cys20 25 30Met Arg Trp Pro Gly His Tyr Ser Arg Ala Pro Tyr Pro Tyr Phe Ser35 40 45Ser Arg His Phe Ser Leu Asn Trp Arg Pro Pro Cys Leu Phe Glu Ser
DREE序~150 55 60Arg Thr Gln Phe Gln Tyr Cys Asn Trp Arg Pro Asp Asn Leu Ser Gln65 70 75 80Thr Ser Leu Ile His Leu Ser Ser Tyr Val Met Asn Ala Glu Gly Asp85 90 95Glu Pro Ser Ser Lys Arg Arg Lys His Gln Gly Val Ile Lys Arg Asn100 105 110Trp Glu Tyr Ile Cys Ser His Asp Lys Glu Lys Thr Lys Ile Leu Gly115 120 125Asp Lys Asn Val Asp Pro Lys Cys Glu Asp Ser Glu Asn Lys Phe Asp130 135 140Phe Ser Val Met Ser Tyr Asn Ile Leu Ser Gln Asp Leu Leu Glu Asp145 150 155 160Asn Ser His Leu Tyr Arg His Cys Arg Arg Pro Val Leu His Trp Ser165 170 175Phe Arg Phe Pro Asn Ile Leu Lys Glu Ile Lys His Phe Asp Ala Asp180 185 190Val Leu Cys Leu Gln Glu Val Gln Glu Asp His Tyr Gly Ala Glu Ile195 200 205Arg Pro Ser Leu Glu Ser Leu Gly Thr Met Gln Leu Phe Phe Phe Phe210 215 220Phe Ser Phe Leu Arg Gln Gly Leu Thr Leu Ser Pro Asn Trp Ser Ala225 230 235 240Val Ala Gln Ser Trp Leu Thr Thr Ala Ser Thr Tyr Trp Ala Gln Val245 250 255Ile Leu Ser Phe Arg Leu Pro Glu2602103
DREE序~1211715212DNA213人工合成4003atgtttcccc atcactcgag gagtctgggc agagactgga ctacaccgtg ggagaatctg 60caaaggtgtt gctggaacag acatatttct agttgtatga ggtggcctgg acattactct120cgagctcctt acccatactt cagtagtagg catttttcac taaattggag accaccctgt180ttgtttgagt ctagaactca gttccagtac tgtaactgga gacctgacaa cctgagccag240acatctttga ttcatctctc tagttacgtc atgaacgctg agggagatga gccttcatca300aaacgaagaa aacaccaagg tgtgataaag cggaattggg aatatatatg tagccatgat360aaagaaaaaa cgaagatcct aggagacaaa aatgttgatc ccaaatgtga agacagtgag420aacaagtttg acttttcagt gatgtcctat aatatacttt cacaagattt actggaagat480aactctcacc tttatagaca ttgccggcgg ccagtattac actggagttt taggtttccc540aatattctga aagaaattaa acattttgat gcagacgtac tttgtttgca agaagttcaa600gaagatcatt atggagcaga gatcaggcca agtttggaat cactgggtac aatgcaactt660tttttttttt ttttttcttt tttgagacag ggtctcactc tgtcgcccaa ctgga 71權利要求
1.可促進腫瘤細胞的生長和增殖的蛋白，尤其重組蛋白，該蛋白具有序列表中序列2所示的胺基酸序列，或者通過所述胺基酸序列中的一個或多個胺基酸的缺失，取代或增加而得到的胺基酸序列。
2.編碼權利要求1的蛋白的基因，它是具有序列1所示的鹼基序列的DNA或者與所述DNA在嚴格條件下雜交的DNA。
3.含有權利要求2的基因或者編碼權利要求1的蛋白的基因的表達載體。
4.由權利要求3的表達載體轉化的宿主細胞。
5.生產權利要求1的重組蛋白的方法，該方法包括下列步驟培養權利要求4的轉化的宿主細胞，使轉化細胞產生權利要求1的重組蛋白；和從培養物中分離出重組蛋白。
6.針對權利要求1的蛋白的抗體，它是使用所述重組蛋白作為免疫原而產生的特異性抗體。
7.檢測權利要求1的蛋白的試劑盒，它含有權利要求6的特異性抗體，可以進行抗原-抗體反應，用於檢測具有序列2所示的蛋白。
8.用於檢測序列1所示的核苷酸序列的探針診斷試劑盒，它含有與核苷酸序列1中的部分核苷酸序列互補的核苷酸序列。
9.權利要求1的蛋白在製備治療腫瘤的藥物中的應用。
10.權利要求2的基因在製備治療腫瘤的藥物中的應用。
全文摘要
本發明涉及與乳腺癌有關的基因DREE(down－regulated by ER inendometrium)及其編碼的蛋白，該基因的表達載體，以及所述基因和蛋白在製備治療乳腺癌的藥物中的應用。
文檔編號G01N33/68GK1807455SQ200510011199
公開日2006年7月26日 申請日期2005年1月18日 優先權日2005年1月18日
發明者尚永豐, 易霞, 孫曉靜 申請人:北京大學