Rank1,來自與疾病抗性相關的水稻的含錨蛋白重複序列的肽的製作方法
2024-02-26 08:09:15
專利名稱：Rank1,來自與疾病抗性相關的水稻的含錨蛋白重複序列的肽的製作方法
技術領域：
在農作物中，真菌，細菌和病毒疾病導致產量和產品質量下降，並且造成農民的實際損失。例如，估計稻瘟病，發生在世界範圍內大多數水稻生長地區的常見破壞性疾病，每年使農民損失50億美元(Moffat，1994)。該疾病特別是在中度洪澇和熱帶乾旱的水稻生態系統中明顯降低水稻產量。利用抗性栽培品種是最經濟和有效的控制該疾病的方法。在過去的十年中，關於對稻瘟病真菌的抗性的遺傳學已經研究了許多。已經鑑定並且在育種工程中廣泛利用了許多主要的抗性基因。但是，對這一致病原的寄主抗性的分子機制幾乎還是未知。
當植物受到致病原如稻瘟病真菌的攻擊時，大多數情況中，它通過增強一連串防禦應答抵抗感染(Lindsay等人，1993)。植物防禦功能的活化發生在致病原識別基礎上，導致致病原侵入停止。系統獲得性抗性(SAR)是植物用於保護自身抵抗致病原的複雜系統一個重要成分(Ryals等人，1996)。對無毒性致病原的局部超敏應答(HR)可以引發SAR，這給予植物的未感染部分對各種正常毒性致病原的抗性。SAR是植物致病原應答的特別重要的方面，因為它是抗廣譜致病原的致病原可誘導的系統抗性。
在解讀SAR的分子學方面，最近已經取得了明顯的進步。利用基於圖譜的方案已經克隆了擬南芥基因NPR1/NIM1(Cao等人，1997；Ryals等人，1997)。在NPRI/NIM1含有缺陷的突變體不能應答各種誘導SAR的處理，致病原相關(PR)基因很少表達和展示出對感染的敏感性增強。該基因編碼含有錨蛋白重複序列的新蛋白質並且展示了與哺乳動物信號轉導因子IkB亞類a的同源性，表明RPN1/NIM1可以與NF-kB相關轉錄因子相互作用誘導SAR基因表達和引發疾病抗性(Ryals等人，1997)。
錨蛋白重複序列是存在於許多多樣功能的蛋白質包括轉錄因子，細胞分化分子，和結構蛋白質中的33個胺基酸的基序(Bennet，1993)。錨蛋白基序共有序列含有下面的胺基酸序列-D----G-TPLH-AA-------V--L--GA-(LaMarco，1991)。已經顯示，這一基序介導了蛋白質的相互反應，並且存在於4個到7個拷貝的串聯排列中(Michaely和Bennett，1993)。已經顯示含有錨蛋白重複序列的蛋白質具有各種功能並且參與蛋白質—蛋白質的相互反應。在哺乳動物中的這些蛋白質的一些是轉錄調節蛋白質，如NF-kB，抑制因子IkB(Baldwin，A.1996；Whiteside等人，1997)。在哺乳動物和果蠅中，NF-kB/IKβ信號轉導途徑是保守的。刺激劑如IL-1處理或細菌接種導致了信號轉導途徑的活化，因為Ikβ或其他的同源物降解和釋放NF-kB轉導因子到核刺激轉錄(Baeuerie和Baltimore，1996；Baldwin，1996)。在擬南芥中，與NF-kB抑制因子IkB同源的NPR1/NIM1控制了SAR的啟動。NPR1/NIM1靶擊的轉錄因子的作用是SAR基因表達的阻遏物和直接或間接作用的疾病抗性(Ryals等人，1997)。
SAR是抵抗感染性致病原的重要的植物防禦機制。例如，證據表明SAR可以保護植物抵抗稻瘟病。發現SAR誘導物苯並-(1，2，3)-噻二唑-7-硫代羥酸-S-甲基酯(「BHT」)在田間條件下控制稻瘟病是有效的。
發明概要從稻瘟病抗性植物已經分離了編碼含有錨蛋白重複序列的新蛋白質的基因。命名為RANK1的水稻錨蛋白重複序列基因與擬南芥基因NPR1/NIM1和哺乳動物信號轉導因子抑制劑I-kB具有明顯的同源性。RANK1基因編碼確信在防禦稻瘟病致病原感染以及通過SAR應答的其它疾病的水稻防禦能力中起重要作用的蛋白質。因為RPN1/NIM1和RANK1基因編碼錨蛋白重複序列，確信這些重複可能負責對植物疾病特別是稻瘟病的SAR誘導的抗性。
因此，在本發明的一個實施方案中，提供了具有含有SEQ IDNO1的序列的分離的核酸。
在另一個實施方案中，本發明提供了含有包括SEQ ID NO1的核酸d在植物細胞中起作用的重組DNA表達載體。
第三個實施方案是利用具有SEQ ID NO1的序列的核酸穩定轉化的植物細胞。
另一個實施方案提供了用具有包括SEQ ID NO1的序列的核酸轉化的轉基因植物。
本發明進一步提供了在單子葉植物中賦予疾病抗性的方法，包括將具有編碼包括錨蛋白基序序列的蛋白質的序列的核酸穩定地整合進入所述的植物的基因組。
本發明的另一個實施方案提供了在單子葉植物中賦予稻瘟病抗性的方法，包括在所述的植物的基因組中穩定地整合具有編碼包括錨蛋白基序序列的蛋白質的序列的核酸。
附圖的簡要說明
圖1顯示了RANK1的推測的胺基酸序列與含有錨蛋白重複序列的IKβ-E，Ikβ-α，Cactus和NPR1蛋白質的序列比較。
圖2是顯示在接種後稻瘟病抗性植物積累的NPR1 RNA的瓊脂糖凝膠電泳。利用RANK1特異引物擴增從抗性(C101A51)和敏感(CO39)植物分離的cDNA。
圖3顯示了RANK1部分cDNA和基因組DNA序列的比較。
圖4顯示了含有RANK1基因的抗性(C101A51)和敏感(Co39)植物的Southern分析。
圖5顯示了含有RANK1基因的抗性(C101A51)和敏感(Co39)植物的Northern分析。
本發明的詳細說明本發明涉及賦予稻瘟病抗性的分離的核酸。該核酸編碼推測為具有錨蛋白重複序列的蛋白質。該核酸有利地具有SEQ ID NO1的核苷酸序列。但是，應認識到的是正如仍然編碼同樣蛋白質的遺傳密碼的簡併性允許的，該核苷酸序列可以變化。利用核酸插入的植物優先的密碼子取代SEQ ID NO1顯示的一個或多個密碼子可以增強基因在植物中的表達。
利用常規重組DNA技術可以在植物或細菌細胞中摻入該核酸。通常，這樣的技術包括在DNA表達載體中插入該核酸。這樣的載體有利地含有插入蛋白質編碼序列的轉錄和翻譯必要的元件和簡化轉化細胞或植物的選擇的一個或多個標記序列。
許多植物活化啟動子是本領域已知的，並且可以用於本文公開的核酸序列的有效表達。適當的啟動子包括例如nos啟動子，小亞基葉綠素A/B結合多肽，花椰菜花葉病毒的35S啟動子，和從植物基因分離的啟動子。從待轉化的植物類型可以分離啟動子。35S或肌動蛋白啟動子也可以用於分離的cDNA克隆。這些也可用於測試該基因的過度表達。
一旦已經將本發明的核酸克隆進入表達載體，就容易轉化進入植物細胞。術語植物細胞包括任何起源於植物的細胞；這包括未分化的組織如愈傷組織和懸浮培養物，以及植物種子，花粉或植物胚。適於轉化的植物組織包括葉組織，根組織，分生組織，原生質體，下胚軸子葉，盾片，莖尖，根，不成熟的胚，花粉和花葯。
利用本發明的賦予疾病抗性的核酸轉化植物的一項技術是通過將含有本發明的核酸的載體轉化的細菌的接種物接觸這樣的植物的組織。通常，這一方法包括利用細菌的懸浮液接種植物組織並且在25-28℃在沒有抗生素的再生培養基上溫育組織48到72小時。
可以利用土壤桿菌屬的細菌轉化植物細胞。這樣的細菌的適當種類包括根癌土壤桿菌和髮根土壤桿菌。因為它已知的轉化植物的能力，根癌土壤桿菌(例如，菌株LBA4404或EHA105)特別有用。
利用本發明的核酸轉化植物細胞的另一個途徑包括在植物細胞中推進惰性或生物活性顆粒。在授予Sanford等人的美國專利號4,945,050,5,036,006和5,100,792中公開了這一技術，這些專利引入本文作為參考。通常，這一方法包括在有效地滲透細胞的外表面和待摻入其內部的條件下在細胞中推進惰性或生物活性顆粒。當利用惰性顆粒時，通過利用含有賦予疾病抗性的核酸的載體包被顆粒可以在細胞中導入載體。也可以推進生物活性顆粒(例如，乾燥的酵母細胞，乾燥的細菌或噬菌體，每個含有待導入的DNA)到植物細胞組織中。
轉化植物細胞的另一個方法是電穿孔方法。這一方法包括將原生質體和需要的核酸混合，並且通過電脈衝在細胞膜上形成孔以致在細胞中導入DNA，從而轉化細胞。這一方法目前具有高再生性，在單子葉植物特別是水稻植物中通過這一方法已經導入各種基因(Toriyama等人，(1988)；Shimamoto等人，(1989)，Rhodes等人，(1988))。
與電穿孔方法相同的方法是混合需要的基因和原生質體並且利用PEG處理混合物因此將基因導入原生質體的方法。這一方法不同於電穿孔方法，該方法利用聚乙二醇(「PEG」)而不是電脈衝。(Zhang W.等人，(1988)，Datta等人(1990)，Christou等人，(1991))。
其它方法包括1)與核酸一起培養種子或胚胎(Topfer R.等人，(1989)；Ledoux等人，(1974))；2)處理花粉管(Luo等人(1988))；3)，脂質體方法(Caboche(1990))；Gad等人(1990)；和4)微注射方法(Neuhaus等人(1987)。
從轉化植物細胞再生植物的已知方法可以用於製備本發明的轉基因植物。通常，可以將外植體，愈傷組織或懸浮培養物與適當的化學環境接觸(例如，細胞激動素和植物生長素)以致新生長細胞可以分化，並且產生胚，然後再生成根和莖。
可以利用本發明的核酸序列賦予單子葉植物對稻瘟病的抗性和其它SAR調節的疾病的抗性。這樣的植物包括但不限於水稻，小麥，燕麥，玉米和天門冬。
通過下面的實施例進一步說明了本發明，這些實施例打算用於說明不用於限制。
實施例材料和方法水稻和稻瘟病接種將攜帶Pi-2基因的抗性等基因系C101A51和敏感的栽培品種CO39用於實驗中。利用分離物PO6-6接種三星期大的水稻植物，在26℃，在潮溼的室中保持24小時。在接種後0，4，8，12，24，48，72小時，從兩個栽培品種收集葉組織。
RNA分離和RT-PCR從150-200毫克水稻葉組織利用Rneasy mini kit(Qiagen，美國)分離總RNA。在逆轉錄介導的聚合酶鏈式反應(RT-PCR)中利用10聚體隨機引物(Operon技術公司)，利用從Qiagen Oligotex Spin柱，從總RNA分流的聚(A)+RNA作為模板。根據製造商提供的方案進行RT-PCR(GIBCO-BRL，美國)。然後，在4.5％測序凝膠中分離擴增的cDNA。
克隆和DNA測序特異譜帶克隆在pGEM-T載體中(普洛美格，美國)。利用ABIPRISM 377DNA測序儀(Perkin-Elmer，CA，美國)測序克隆。利用軟體DNAstar和Sequencer 3.0分析序列。
結果在抗性植物中強烈誘導了RANK1已經利用28個隨機引物從C101A51和CO39擴增cDNA。當在RT-PCR反應中利用引物OPF-1(ACGGATCCTG)時，只在接種的抗性植物中觀察到特異譜帶(約600bp)。它是在早至接種後4小時被強烈誘導的。從測序膠裂解這一譜帶，利用相同的引物再擴增，並且克隆進入pGEM-T載體。在SEQ ID NO1中提供了這一cDNA克隆的DNA序列。將它與已知基因的資料庫比較尋找與已知基因的同源性。檢索表明這一基因(RANK1)編碼的蛋白質的推測的胺基酸序列與含有錨蛋白重複序列的包括擬南芥基因RPN1/NIM1和哺乳動物基因家族IkB(圖1)的那些蛋白質明顯同源。
設計RANK1特異引物對，並且用於擴增從第二個接種實驗分離的cDNA。在瓊脂糖凝膠上電泳擴增的cDNA。僅在抗性植物中觀察到600bp的片段(圖2)。
如圖4和5所示進行了抗性(C101A5)和敏感(Co39)植物的Southern和Northern分析。
從細菌人工染色體(BAC)文庫分離RANK1基因組克隆利用RANK1部分cDNA克隆作為探針篩選從指標栽培品種IR64製備的BAC文庫。鑑定了6個陽性BAC克隆，小量製備以便進一步亞克隆。發現2.0kb亞克隆的序列存在600bp cDNA片段跨越的區域中的內含子，命名為RANK1基因。SEQ ID NO2中闡述了RANK1基因組克隆的序列。
序列表序列描述SEQ ID NO1TTGAAGTGTG CCCAAGTACT TCTTGAGGCG GGTGCTGCAG TGGATGCTTTGGACAAGAAC AAGAACACTC CGCTGCATTA CGCCGCTGGC TATGGTATGAAGGGGTGCGT GGATCTTCTG CTGAAGAACG GAGCCGCTGTCACCCTCGAA AACATGGATG GCAAGACGCC CATTGACGTT GCGAAGCTCAACAACCAGGA TGAGGTTCTC AAGTTGCTGG AAAAGGATGC CTTCCTGTAGATCGCCTTTG TTATTCTCAT GGGCGCATGA ACAGTTTGGC TCCAGGATCCGTATACGGATCCT GCTGCACTGA TAAAGTACTG GAATGACCCA GAAACATTTCGAAAGATCAG CCAGGCAATG GGGCCTTTAG GCGGCCCTGA TTTTGCTGAACCTTCTGGAA CTGAAGGAAC AGAGGAAGAA GGTGAATATG AAGATGAATCTATCGTCCAT CACACTGCCA GTGTTGGTGA TGATGAGGGTCTGAAGAA GGCTTTAGAT GGTGGAGCAG ACAAAGACGA AGAAGACTTGGAGGGCAGAA GGGCCTTACA CTTTGTATGT GGATACGGGG AGSEQ ID NO2TTTACTTTGT TGAAGCTAAA ACTTTGTTAG TTTTTCTGGG GCAGTTCATTGATGATAATC CAGACCTCAC AGGTCAACCA ACAGTCCTCG GTTTCAAAAAAAAAAAAAAA TCCCACAGTA ACCTGTCCCG TTGAACATTG CACAAACTTGTCAGATCTGG TGCACCTCTC GTCTAGCTAT AATAGTATCG AACTATGAGTTTCCATAACC CCGCTGTTTG TATAATTGCA GTTGGTGTGC AATGCTAGAGCACAAAAGTT AATGAACGAC AAACTACCTT TTGATTCATT CTCTTGTGGATCTAGAATGT GGTGTGAGAC TTTTTTTTTG GGAGCTGCAT CTGCTCCTTGTTCACTGACT AATCAGGATT TGGGTTAAAC TTTTGTTTTT CAGTTGAAGTGTGCCCAAGT ACTTCTTGAG GCGGGTGCTG CAGTGGATGC TTTGGACAAGAACAAGAACA CTCCGCTGCA TTACGCCGCT GGCTATGGTA TGAAGGGGTGCGTGGATCTT TTGCTGAAGA ACGGAGCCGC TGTGTAAGTT AAACCTGCTCGCTTTGCTAG TTGCGATCAC ATCATTTTTT TTGCATTATA TTATTTGACTGTCTCGAATT GCATCGCAGC ACCCTCGAAA ACATGGATGG CAAGACGCCCATTGACGTTG CGA-GCTCAA CA-CCAGGATGACCCAGAAA CATTTCGAAA GATCAGCCAG GCAATGGGGC CTTTAGGCGGCCCTGATTTT GCTGAACCTT CTGGAACTGA AGGAACAGAG GAAGAAGGTGAATATGAAGA TGAATCTATC GTCCATCACA CTGCCAGTGT CGGTGATGATGAGGTAAGGG GGCAGAGTGC TAAGTAGTAC AGCTAAGGAT TTGAAATTATTACTTCCTCC GTTTCATATT ATAACACTTC CTAGCATTGC CCACATTCATATACATGTTA ATGAATCTAG ACATATATGT GCGCCTAGAT TCATTAATATCTATATGAAT ATGGGCAATG CTAGAAAGTC TTATAACCTGA AACGGAGGTAGTATTGATA TTACTATTTA GTCTCGAGCT TGAGAGTTTG TATATGTTTCTATGTCTTGT TGGTGTGTAA TGTATAATTT ACTAGAGAAG TGTCCATTCGTGTGTGTGTG TATGGTTATA TAATATCTTC AATTACAGTA ATATGCCTCTCCGTTTTGGT TTTGCTCTGA ACAACATGTA TAGGTTTTCG CACAAATTGTGATCTCGATG GCCTTTTCTG TTTCATTGTC AATTCAGCTT GCCTTTCTTTACAAGTTTAA GTCATCTAAT AGGGTCTGAA GAAAGCTTTA GATGGTGGAGCAGACAAAGA CGAACAACAC TTGGAGGGCA GAAGGGCCTT ACACTTTGTATGTGGATATG GGGAGGTATG CAAGTCTGCT TAACTAAACC CAATGACAATTGAAACCTGT GCAAGTAGAA AATGCCGAAT AAATACTACT CCCTCCGTTTCATAATGTAA GTCATTCTAG CATTTTTCAT ATTCATATTG ATGTTTATGAATCTAGAAAG ACATCAATAT GAATGTGGGA AATGCTAGAA TGACTTACATTGTGAAACGG AAGAAGTACT ATTACCTATT TGTTGTTATT GCAAATGACAAGGTTAGCAA CTATAAAAAC ATCTCGTTGC GAATCCTGTG CAAAACGGATTGCATGTATG CGTGACTAGT CTTCAGAAAA TTGCATGTAT GCAATGTGACAGTTCATTAT GCAAAACGGT GAACCTACTG TTGCCATCAG TATCCCCGATACTAATTGAA GTTCTCCTAA TGTTTTCTTT TTTCCTTTTT GGTAATCAGCTAGCGTTGAA TTCAGCTTAG TTGGGGGCTA ACTGTCTTTT TGCATTCTATGATGAGTTTT GACAAATTTA TTAATTTTAT CTTTTTTTTT TTTTGCTTTTAACACACTTC AAGATATTTT TGGTAGATGG AAAGGTGCAG AGCTTGCTGG文獻Baeuerie(1996)細胞8713-20。
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權利要求
1.具有SEQ ID NO1的序列的分離的核酸。
2.具有編碼由SEQ ID NO1的核苷酸序列編碼的蛋白質的序列的分離的核酸。
3.根據權利要求1所述的分離的核酸，可操作地與植物中活化的啟動子連接。
4.根據權利要求3所述的分離的核酸，其中植物是單子葉植物。
5.根據權利要求3所述的分離的核酸，其中植物選自水稻，燕麥，玉米，小麥和天門冬。
6.在植物細胞中起作用的含有權利要求1所述的核酸的重組DNA表達載體。
7.根據權利要求6所述的重組DNA表達載體，其中所述的植物是單子葉植物。
8.根據權利要求5所述的重組DNA表達載體，其中所述的植物選自水稻，燕麥，玉米，小麥和天門冬。
9.製備轉基因單子葉植物的方法，所述的方法包括在單子葉植物的基因組中穩定地整合含有SEQ ID NO1的核酸，其中所述的序列在所述的植物中表達。
10.賦予單子葉植物疾病抗性的方法，包括在單子葉植物的基因組中穩定轉化含有SEQ ID NO1的核酸。
11.賦予水稻稻瘟病抗性的方法，包括在單子葉植物的基因組中穩定轉化含有SEQ ID NO1的核酸。
12.根據權利要求9，10，和11的任何一項所述的方法，其中所述的單子葉植物是選自水稻，燕麥，玉米，小麥和天門冬的植物。
13.利用含有SEQ ID NO1的核酸序列的核苷酸序列穩定地轉化的植物細胞。
14.轉基因植物，包括在植物基因組中穩定地整合的包括含有SEQ ID NO1的核苷酸序列的核酸；和可操作地連接該核酸序列以表達該序列的植物啟動子。
15.根據權利要求14所述的轉基因植物，其中所述的植物是單子葉植物。
16.根據權利要求14所述的轉基因植物，其中所述的單子葉植物選自水稻，燕麥，玉米，小麥和天門冬。
17.賦予單子葉植物疾病抗性的方法，包括在所述的植物的基因組中穩定地整合具有編碼包括錨蛋白基序共有序列的蛋白質的序列的核酸。
18.根據權利要求17所述的方法，其中所述的單子葉植物選自水稻，燕麥，玉米，小麥和天門冬。
19.賦予單子葉植物稻瘟病抗性的方法，包括在所述的植物的基因組中穩定地整合具有編碼包括錨蛋白基序共有序列的蛋白質的序列的核酸。
20.根據權利要求19所述的方法，其中所述的單子葉植物選自水稻，燕麥，玉米，小麥和天門冬。
21.具有SEQ ID NO2的序列的分離的核酸序列。
全文摘要
本發明涉及具有包括SEQ ID NO:1的序列的分離的核酸,所述核酸編碼植物中的疾病抗性。轉化的植物細胞可以隨即導入植物以再生疾病抗性植物。
文檔編號C12N15/82GK1268182SQ9718237
公開日2000年9月27日 申請日期1997年9月15日 優先權日1997年9月15日
發明者何朝族, 王國梁 申請人:分子農業生物學院