羅氏沼蝦雙順反子病毒的lamp檢測試劑盒及檢測方法
2024-02-26 23:49:15
專利名稱：羅氏沼蝦雙順反子病毒的lamp檢測試劑盒及檢測方法
技術領域：
本發明屬於靶DNA片斷的檢測技術領域，具體涉及一種利用環介導等溫擴增 (Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)技術快速檢測羅氏沼蝦雙順反子病毒所用的試劑盒及檢測方法。
背景技術：
羅氏沼蟲下雙順反子病毒 Ofecro^racAi腫 rosenbergii dicistrovirus, MRDV)是引起羅氏沼蝦幼體綜合症(ifecro^racAi腫rosenbergii larval Syndrome, MRLS)的主要病原，對羅氏沼蝦育苗產業危害極大。MRDV為單正鏈RNA病毒，歸為雙順反子病毒科。該病毒在國內外文獻上未有報導，其基因組序列僅公開了 900個鹼基。該病毒於2009年和2010 年引起我國羅氏沼蝦幼體的疾病，造成羅氏沼蝦在幼體期出現大量死亡，特別是在幼體6-9 日齡死亡尤為嚴重，死亡率一般為80-90%，嚴重的達到100%，近2年造成的經濟損失無法估量。被發現以來，因缺少檢測方法，嚴重阻礙了該病毒引起疾病的預防工作，因此該病毒檢測試劑盒的開發和檢測技術的研究顯得尤為重要。RT-LAMP是一種新型的核酸等溫擴增技術，該技術針對靶基因的6個區域設計6條特異引物，利用AMV逆轉錄酶和DNA聚合酶同時作用，使得病毒cDNA合成和核酸擴增同時進行，並且DNA聚合酶是一種鏈置換DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在恆溫條件下即可完成核酸擴增反應，擴增出LAMP特徵性梯狀條帶。RT-LAMP技術在保持PCR技術優點的基礎上，進一步增強了反應的特異性並縮短了檢測時間；特別是它不需使用昂貴的熱循環儀， 在等溫條件下就能使反轉錄和核酸擴增同時完成反應，且擴增產物用肉眼能觀察，可用於病原微生物的現場快速檢測。
發明內容
針對現有技術存在的問題，本發明的目的在於設計提供羅氏沼蝦雙順反子病毒的 RT-LAMP檢測試劑盒和檢測方法的技術方案，該試劑盒特異性強，敏感性高，該方法方便、靈敏、準確、快速，為羅氏沼蝦幼體綜合症的預防奠定基礎。所述的羅氏沼蝦雙順反子病毒的LAMP檢測試劑盒，其特徵在於包括RNA提取試劑和RT-LAMP反應試劑，
所述的RNA提取試劑含有Trizol試劑、氯仿、異丙醇、無RNase的70%乙醇和DEPC水； 所述的RT-LAMP反應試劑含有
1)RT-LAMP 預反應液20 25mM pH 為 8. 2 9. 0 的 Tris-HCl、6 IOmM硫酸鎂、10 12mM 氯化鉀、8 12mM 硫酸銨、0. 1 0. 2% Triton X-100 或 Tween 20、1 1. 6 mM dNTP、 0.6 1.0 M 甜菜鹼、1. 5 2. 2μΜ 引物 MRDV-FIP、1. 5 2. 2μΜ 引物 MRDV-BIP、0. 15 0. 3 μ M 引物 MRDV-F3、0. 15 0. 3 μ M 引物 MRDV-B3， 引物MRDV-FIP核苷酸序列如SEQ No. 1所示， 引物MRDV-BIP核苷酸序列如SEQ No. 2所示，引物MRDV-F3核苷酸序列如SEQ No. 3所示， 引物MRDV-B3核苷酸序列如SEQ No. 4所示；
2)逆轉錄酶每微升含10個活性單位的AMV逆轉錄酶；
3)聚合酶每微升含8個活性單位的BstDNA聚合酶；
4)RT-LAMP反應穩定液由礦物油或液體石蠟油組成；
5)RT-LAMP反應顯色液含有10 % SYBR Green I的螢光染料。所述的羅氏沼蝦雙順反子病毒的LAMP檢測試劑盒，其特徵在於所述的RT-LAMP預反應液含有21 MmM pH為8. 2 9. 0的iTris-HClJ 9mM硫酸鎂、11 12mM氯化鉀、 9 IlmM 硫酸銨、0. 1 0. 2% Triton X-100 或 Tween 20、1. 2 1. 4 mM dNTP、0. 7 0. 9 M 甜菜鹼、1. 6 2. ΟμΜ 引物MRDV-FIP、1. 6 2. 0 μ M 引物 MRDV_BIP、0. 2 0. 25 μ M 引物 MRDV-F3、0. 2 0. 25 μ M 引物 MRDV-B3。所述的羅氏沼蝦雙順反子病毒的LAMP檢測試劑盒，其特徵在於所述的RT-LAMP預反應液中還含有0. 6 1. 2 μ M引物MRDV-LB和0. 6 1. 2 μ M引物MRDV-LF，
引物MRDV -LF核苷酸序列如SEQ No. 5所示， 引物MRDV -LB核苷酸序列如SEQ No. 6所示。所述的羅氏沼蝦雙順反子病毒的LAMP檢測試劑盒，其特徵在於檢測試劑盒還具有陽性對照試樣和陰性對照試樣，所述陽性對照試樣為羅氏沼蝦雙順反子病毒基因組RNA， 所述的陰性對照試樣為無核酸去離子水。所述的羅氏沼蝦雙順反子病毒的LAMP檢測試劑盒，其特徵在於所述的RT-LAMP預反應液中還含有0. 8 1. 0 μ M引物MRDV-LB和0. 8 1. 2 μ M引物MRDV-LF。所述的羅氏沼蝦雙順反子病毒的LAMP檢測方法，其特徵在於包括以下步驟
1)羅氏沼蝦RNA抽提利用RNA提取試劑抽提羅氏沼蝦RNA；
2)羅氏沼蝦雙順反子病毒的RT-LAMP擴增
a)根據待檢測樣品的數目，設置所需RT-LAMP反應管數N，N=樣品數+2，其中1管為陽性對照，1管為陰性對照；
b)吸取RT-LAMP預反應液的體積為NX22.5 μ L，加入1. 5mL離心管中，然後加入N μ L Bst DNA聚合酶和Ν/2 μ L AMV逆轉錄酶，混合均勻，1500 2000轉/分鐘離心10秒，取上清的混合液；
c)向上述設定的N個反應管中分別加入Mu L步驟b)所得的混合液，並向N個反應管內按順序依次分別加入陰性對照、待檢模板RNA和陽性對照RNA各1 μ L ；
d)在每個反應管中再分別加入30u L RT-LAMP反應穩定液，蓋緊管蓋並做好標記， 2000轉/分鐘離心5秒；
e).在61°C 67°C下恆溫反應40 70分鐘；
3)顯色檢測
取出RT-LAMP反應管，冷卻至室溫，2000轉/分鐘離心5秒，按照陰性對照、待檢樣品和陽性對照的順序依次分別加入1 μ L RT-LAMP反應顯色液，輕輕混勻，直接用肉眼觀察顏色變化。所述的羅氏沼蝦雙順反子病毒的LAMP檢測方法，其特徵在於所述的步驟1)羅氏沼蝦RNA提取包括以下步驟取羅氏沼蝦幼體頭胸部或是成蝦鰓組織0. 1 0. 2g，於冰上用研磨棒研磨，加300 μ L Trizol後，繼續研磨充分後加Trizol至lmL，旋渦震蕩1分鐘，室溫5分鐘，加入200 μ L氯仿，旋渦震蕩30秒，室溫靜置3分鐘，12000g離心10分鐘；取上層水相於新的EP管中，加入500 μ L異丙醇，室溫放置10分鐘後，12000g離心IOmin ；移去上清，沉澱用70%乙醇洗滌2次，室溫乾燥5 IOmin後以DEPC處理的去離子水重懸，得到待測羅氏沼蝦RNA。本發明所述的引物是根據在線軟體I^rimerExplorer V4(http:// primerexplorer. jp/e/)設計和手工修改而得，這六條引物能特異識別靶序列的八個不同位點，增加了擴增的特異性，並在反應中產生莖環結構。本發明中引物MRDV-FIP 核苷酸序列(SEQ No. 1)為TCACGCAACACAAATTCTCGCTTTT TTCCACCTCCTTATCGCTCT ；
引物 MRDV-BIP 核苷酸序列(SEQ No. 2)為 GGTTGCTCCATTGGCCAAGAACATTTTGCAACAACGC TTCCTGTG ；
引物 MRDV-F3 核苷酸序列(SEQ No. 3)為 CTGATGAAACAAAGAGTGGGTC ； 引物 MRDV-B3 核苷酸序列(SEQ No. 4)為 TTCAAACGAAGCAATCCGTG ； 引物 MRDV -LF 核苷酸序列(SEQ No. 5)為 TTAGAAACGACACTTCAGACAA ； 引物 MRDV -LB 核苷酸序列(SEQ No. 6)為 CGATTGAAGATATGTGTATGTGG。與現有技術相比，本發明具有如下優點
(1)本發明根據靶基因序列設計了羅氏沼蝦雙順反子病毒檢測用引物組，該靶基因序列如SEQ No. 7所示。本發明中設計的引物組能特異性識別靶序列上的八個獨立區域，在 BstDNA聚合酶的作用下啟動循環鏈置換反應，在靶標cDNA區啟動互補鏈合成，在同一鏈上互補序列周而復始形成有很多環的花椰菜結構的莖一環DNA混合物，由於LAMP技術只有在四條引物完全識別靶序列六個結合區的情況下才能順利進行，所以本發明的引物組在很大程度上減少了擴增反應的背景影響，大大增強了羅氏沼蝦雙順反子病毒檢測的特異性；
(2)採用本發明的引物組對羅氏沼蝦雙順反子病毒進行檢測，因為特異性高，所以可以根據是否擴增就能判斷目標基因的存在與否；
(3)本發明的快速診斷試劑盒是利用反轉錄環介導等溫擴增技術快速檢測羅氏沼蝦雙順反子病毒，檢測靈敏度高，擴增模板僅需20拷貝；
(4)本發明的快速診斷試劑盒不但反應條件溫和，且所需儀器簡單，也不需要特殊試劑，克服了傳統PCR固有的檢測時間長、容易汙染及檢測成本高等缺點；
(5)本發明的快速診斷試劑盒擴增快速且高效，在不到Ih即可完成擴增，且產率高；
(6)本發明的快速診斷試劑盒鑑定簡便，從dNTP析出的焦磷酸根離子與反應溶液中的 Mg2+結合，產生副產物——焦磷酸鎂沉澱，可通過肉眼觀察鑑定，並且加入顯色液後，陰陽性結果顯色差異顯著，驗證率高，更加明顯可靠；
(7)本發明的快速診斷試劑盒操作簡單，對檢測人員的技術素質要求較低，可建立成本低廉的快速篩選體系，實現現場高通量快速檢測；
(8)本發明的快速診斷試劑盒建立了一套經過優化的反轉錄環介導等溫擴增反應體系，不但使得羅氏沼蝦雙順反子病毒定性檢測更加簡便快速、特異性高、靈敏度高，而且該試劑盒是檢測羅氏沼蝦雙順反子病毒的第一個試劑盒，填補了羅氏沼蝦雙順反子病毒無檢測方法的缺口，具有很高的科研和經濟價值。
圖1引物特異性測試M. IOObp DNA Marker ； 1.羅氏沼蝦雙順反子病毒；2.羅氏沼蝦諾達病毒(MRNV)； 3.對蝦白斑綜合症病毒(WSSV) ； 4.對蝦傳染性皮下及造血組織壞死病毒(IHHNV)； 5.陰性對照。圖2靈敏性檢測M. IOObp DNA Marker ； 1. 1. 5X IO5 copies ；2. 1. 5X IO4 copies ；3. 1. 5X IO3 copies ；4. 1. 5X IO2 copies ；5. 1. 5X IO1 copies ；6. 1. 5 copies ；7.陰性對照。
具體實施例方式以下結合具體實施例來進一步說明本發明。實施例1
1)用RNA提取試劑抽提RNA (RNA提取試劑為現有技術中的常規試劑，其含有Trizol 試劑、氯仿、異丙醇、無RNase的70%乙醇和DEPC水)
取羅氏沼蝦幼體頭胸部或是成蝦鰓組織0. 1,0. 15或0. 2g，於冰上用研磨棒研磨，加 300 μ L Trizol後，繼續研磨充分後加Trizol至lmL，旋渦震蕩1分鐘，室溫5分鐘，加入 200 μ L氯仿，旋渦震蕩30秒，室溫靜置3分鐘，12000g離心10分鐘，取上層水相於新的EP 管中，加入500 μ L異丙醇，室溫放置10分鐘後，12000g離心IOmin ；移去上清，沉澱用70% 乙醇洗滌2次，室溫乾燥5、8或IOmin後以DEPC處理的去離子水重懸，分裝，得到提羅氏沼蝦RNA，置-80°C保存。2)反轉錄環介導等溫擴增羅氏沼蝦雙順反子病毒特異基因區
a)根據待檢測樣品的數目，設置所需RT-LAMP反應管數N(N大於等於1)，N=樣品數 +1管陽性對照+1管陰性對照；
b)吸取RT-LAMP預反應液(RT-LAMP預反應液含有20 25mMpH為8. 2 9. 0的 iTris-HClj IOmM硫酸鎂、10 12mM氯化鉀、8 12mM硫酸銨、0. 1 0. 2% Triton X-100 或 Tween 20、1 1.6 mM dNTP、0. 6 1. 0 M 甜菜鹼、1.5 2. 2 μ M 引物 MRDV-FIP、1. 5 2.2 口] 引物1 0￥-81卩、0.15 0.3 μ M 引物 MRDV_F3、0. 15 0. 3 口] 引物1 0￥-83，引物MRDV-FIP核苷酸序列如SEQ No. 1所示，引物MRDV-BIP核苷酸序列如SEQ No. 2所示，引物MRDV-F3核苷酸序列如SEQ No. 3所示，引物MRDV-B3核苷酸序列如SEQ No. 4所示)的體積為NX22.5 PL，加入一潔淨的1. 5mL離心管中，然後加入N μ L Bst DNA聚合酶(每微升含8個活性單位的Bst DNA聚合酶)和Ν/2 μ L AMV逆轉錄酶(每微升含10個活性單位的AMV逆轉錄酶)，混合均勻，1500、1800或2000轉/分鐘離心10秒，取上清之混合液；
c)向設定的N個反應管中分別加入MyL上述混合液，再向上述N個PCR反應管內按順序依次分別加入陰性對照(無核酸去離子水)、待檢模板RNA和陽性對照(羅氏沼蝦雙順反子病毒基因組RNA)各1 μ L ；
d)然後在上述每個反應管中再分別加入30μ L PT-LAMP反應穩定液(由礦物油或液體石蠟油組成)，2000轉/分鐘離心5秒，蓋緊管蓋並做好標記；
6)在611、631、651或671下恆溫反應40、50、60或70分鐘，然後在80°C滅活5min。
3)取出RT-LAMP反應管，冷卻至室溫，2000轉/分鐘離心5秒，按照陰性對照、待檢樣品和陽性對照的順序依次分別加入1 μ LPT-LAMP反應顯色液(含有10 % SYBR Green I的螢光染料)，輕輕混勻，直接用肉眼觀察顏色變化或用1.5%瓊脂糖凝膠進行電泳後用溴化乙錠染色。RT-LAMP預反應液電泳結果在紫外分析儀下觀察，可發現階梯狀的擴增特徵條帶， 說明樣品中有羅氏沼蝦雙順反子病毒。實施例1中RT-LAMP預反應液也可以採用21 MmM ρΗ為8. 2 9. 0的Tris-HCl、 7 9mM硫酸鎂、11 12mM氯化鉀、9 IlmM硫酸銨、0. 1 0. 2% Triton X-100或Tween 20、1.2 1.4 mM dNTP、0. 7 0. 9 M 甜菜鹼、1. 6 2. 0 μ M 引物 MRDV-FIP、1. 6 2. 0 μ M 引物 MRDV-BIP、0. 2 0. 25 μ M 引物 MRDV_F3、0. 2 0. 25 μ M 引物 MRDV-B3 ；
或採用20 25mM ρΗ為8. 2 9. 0的Tris_HCl、6 IOmM硫酸鎂、10 12mM氯化鉀、 8 12mM 硫酸銨、0. 1 0. 2% Triton X-100 或 Tween 20、1 1. 6 mM dNTP、0. 6 1. 0 M 甜菜鹼、1. 5 2. 2 μΜ 引物 MRDV-FIP、1. 5 2. 2 μ M 引物 MRDV_BIP、0. 15 0. 3μ M 引物 MRDV-F3、。· 15 0. 3 μ M 引物 MRDV_B3、0. 6 1. 2 μ M 引物 MRDV-LB 和 0. 6 1. 2 μ M 引物 MRDV-LF，引物MRDV-LF核苷酸序列如SEQ No. 5所示，引物MRDV -LB核苷酸序列如SEQ No. 6 所示。採用上述快速診斷試劑盒和方法進行RT-LAMP檢測羅氏沼蝦雙順反子病毒特異性和靈敏性試驗結果如附圖1和2所示。圖1引物種特異性測試圖，如1圖所示，僅羅氏沼蝦雙順反子病毒能擴增出階梯狀的擴增特徵條帶，其它病毒無階梯狀的擴增特徵條帶，表明對其它病毒無交叉擴增性。圖2羅氏沼蝦雙順反子病毒靈敏性檢測圖，如圖所示，經Real-time PCR定量後的羅氏沼蝦雙順反子病毒RNA系列稀釋的擴增特徵條帶顯示，當反應體系中加入15個病毒拷貝的RNA，就能擴增出特徵條帶。本發明利用反轉錄環介導等溫擴增技術快速檢測羅氏沼蝦雙順反子病毒的檢測方法，在已試驗的4種不同種的病毒進行了檢測，結果都能達到與實施例1相同的技術效果。
權利要求
1.羅氏沼蝦雙順反子病毒的LAMP檢測試劑盒，其特徵在於包括RNA提取試劑和 RT-LAMP反應試劑，所述的RNA提取試劑含有Trizol、氯仿、異丙醇、無RNase的70%乙醇和DEPC水；所述的RT-LAMP反應試劑含有URT-LAMP 預反應液20 25mM pH 為 8. 2 9. O 的 Tris-HCl、6 IOmM硫酸鎂、10 12mM 氯化鉀、8 12mM 硫酸銨、0. 1 0. 2% Triton X-100 或 Tween 20、1 1.6 mM dNTP、 0. 6 1. 0 M 甜菜鹼、1. 5 2. 2 μ M 引物 MRDV-FIP、1. 5 2. 2 μ M 引物 MRDV_BIP、0. 15 0. 3 μ M 引物 MRDV-F3、0. 15 0. 3 μ M 引物 MRDV-B3，引物MRDV-FIP核苷酸序列如SEQ No. 1所示，引物MRDV-BIP核苷酸序列如SEQ No. 2所示，引物MRDV-F3核苷酸序列如SEQ No. 3所示，引物MRDV-B3核苷酸序列如SEQ No. 4所示；2)逆轉錄酶每微升含10個活性單位的AMV逆轉錄酶；3)聚合酶每微升含8個活性單位的BstDNA聚合酶；4)RT-LAMP反應穩定液由礦物油或液體石蠟油組成；5)RT-LAMP反應顯色液含有10 % SYBR Green I的螢光染料。
2.如權利要求1所述的羅氏沼蝦雙順反子病毒的LAMP檢測試劑盒，其特徵在於所述的RT-LAMP預反應液含有21 MmM pH為8. 2 9. 0的Tris_HCl、7 9mM硫酸鎂、11 12mM氯化鉀、9 IlmM硫酸銨、0. 1 0. 2% Triton X-100或Tween 20、1.2 1.4 mM dNTP、 0. 7 0. 9 M 甜菜鹼、1. 6 2. 0 μ M 引物 MRDV-FIPU. 6 2. 0 μ M 引物 MRDV_BIP、0. 2 0.25 口] 引物1 0￥-卩3、0.2 0.25 口1引物1 0乂-83。
3.如權利要求1所述的羅氏沼蝦雙順反子病毒的LAMP檢測試劑盒，其特徵在於所述的 RT-LAMP預反應液中還含有0. 6 1. 2 μ M引物MRDV-LB和0. 6 1. 2 μ M弓丨物MRDV-LF，引物MRDV -LF核苷酸序列如SEQ No. 5所示，引物MRDV -LB核苷酸序列如SEQ No. 6所示。
4.如權利要求1或2或3所述的羅氏沼蝦雙順反子病毒的LAMP檢測試劑盒，其特徵在於檢測試劑盒還具有陽性對照試樣和陰性對照試樣，所述陽性對照試樣為羅氏沼蝦雙順反子病毒基因組RNA，所述的陰性對照試樣為無核酸去離子水。
5.如權利要求3所述的羅氏沼蝦雙順反子病毒的LAMP檢測試劑盒，其特徵在於所述的 RT-LAMP預反應液中還含有0. 8 1. 0 μ M引物MRDV-LB和0. 8 1. 2 μ M引物MRDV-LF。
6.羅氏沼蝦雙順反子病毒的LAMP檢測方法，其特徵在於包括以下步驟1)羅氏沼蝦RNA抽提利用RNA提取試劑抽提羅氏沼蝦RNA；2)羅氏沼蝦雙順反子病毒的RT-LAMP擴增a)根據待檢測樣品的數目，設置所需RT-LAMP反應管數N，N=樣品數+2，其中1管為陽性對照，1管為陰性對照；b)吸取RT-LAMP預反應液的體積為NX22. 5 μ L，加入1. 5mL離心管中，然後加入NyL Bst DNA聚合酶和Ν/2 μ L AMV逆轉錄酶，混合均勻，1500 2000轉/分鐘離心10秒，取上清的混合液；c)向上述設定的N個反應管中分別加入MuL步驟b)所得的混合液，並向N個反應管內按順序依次分別加入陰性對照、待檢模板RNA和陽性對照RNA各1 μ L ；d)在每個反應管中再分別加入30u L RT-LAMP反應穩定液，蓋緊管蓋並做好標記， 2000轉/分鐘離心5秒；e).在61°C 67°C下恆溫反應40 70分鐘； 3)顯色檢測取出RT-LAMP反應管，冷卻至室溫，2000轉/分鐘離心5秒，按照陰性對照、待檢樣品和陽性對照的順序依次分別加入1 μ L RT-LAMP反應顯色液，輕輕混勻，直接用肉眼觀察顏色變化。
7.如權利要求6所述的羅氏沼蝦雙順反子病毒的LAMP檢測方法，其特徵在於所述的步驟1)羅氏沼蝦RNA提取包括以下步驟取羅氏沼蝦幼體頭胸部或是成蝦鰓組織0. 1 0. 2g，於冰上用研磨棒研磨，加300 μ L Trizol後，繼續研磨充分後加Trizol至lmL，旋渦震蕩1分鐘，室溫5分鐘，加入200 μ L氯仿，旋渦震蕩30秒，室溫靜置3分鐘，12000g離心 10分鐘；取上層水相於新的EP管中，加入500 μ L異丙醇，室溫放置10分鐘後，12000g離心 IOmin ；移去上清，沉澱用70%乙醇洗滌2次，室溫乾燥5 IOmin後以DEPC處理的去離子水重懸，得到待測羅氏沼蝦RNA。
全文摘要
羅氏沼蝦雙順反子病毒的LAMP檢測試劑盒及檢測方法，屬於靶DNA片斷的檢測技術領域。該檢測試劑盒包括RNA提取試劑和RT-LAMP反應試劑，該檢測方法包括1)羅氏沼蝦RNA抽提；2)羅氏沼蝦雙順反子病毒的RT-LAMP擴增3)顯色檢測。該檢測試劑盒特異性強，敏感性高，該檢測方法方便、靈敏、準確、快速，為羅氏沼蝦幼體綜合症的預防奠定基礎。
文檔編號C12Q1/70GK102277453SQ20111023977
公開日2011年12月14日 申請日期2011年8月19日 優先權日2011年8月19日
發明者姚嘉贇, 尹文林, 徐洋, 曹錚, 沈錦玉, 潘曉藝, 郝貴傑 申請人:浙江省淡水水產研究所