一種篩選酸性浸礦體系中新基因的宏基因組晶片及其篩選方法
2024-02-27 02:28:15
專利名稱：一種篩選酸性浸礦體系中新基因的宏基因組晶片及其篩選方法
技術領域：
本發明涉及從酸性浸礦微生物群落中快速篩選新穎基因的宏基因組晶片及篩選方法。
背景技術：
酸性浸礦體系中，浸礦微生物群落通過氧化分解礦物使金屬離子進入溶液。了解浸礦微生物群落的代謝調控與浸出過程的關係，發掘關鍵代謝途徑相關的新穎基因有助於提高微生物冶金的效率。利用傳統方法研究微生物的代謝調控或者功能基因，必須先分離純化微生物，然後通過形態觀察或生理生化檢測分析其代謝調控方式。新基因的研究，則要通過體外表達和酶學測定確定其功能特性。然而，極端酸性浸礦體系中的大部分微生物難以分離純化培養，利用傳統的方法難以開展代謝調控和基因功能的研究。
發明內容
本發明的目的在於通過構建酸性浸礦微生物群落宏基因組大片段文庫，提供一種宏基因組基因晶片，以及利用該晶片快速篩選宏基因組文庫中的新穎目標基因的方法，從而獲得不能分離純化培養的微生物的遺傳基因信息，解決傳統方法無法分析未分離純化培養微生物遺傳和代謝調控特性的難題。一種篩選酸性浸礦體系中新基因的宏基因組晶片，是由以下方式構建的:利用德興酸性礦坑廢水中微生物群落的總DNA構建大片段的宏基因組文庫，以宏基因組文庫中提取的7776個fosmid質粒為探針，將探針通過基因晶片點樣儀列印在玻片表面，列印後的宏基因組晶片在室溫下乾燥過夜，最後使用紫外交聯儀照射下進行交聯即可。具體包括以下步驟:採用0.2 iim的尼龍膜過濾酸性浸礦體系中的酸性浸出液，得到生物質富集物，液氮研磨法提取微生物群落總DNA，然後利用200 ill的小槍頭進行切割，將總DNA修剪成40-50Kb的隨機的大片段；通過DNA的末端修飾使其末端成為兩條鏈平齊的鈍末端，利用DNA快速連接酶將DNA大片段與CopyControl pCClFOS Vector質粒(Epicentre)連接起來構建重組的fosmid質粒；然後將重組的fosmid質粒轉化到EPI300_T1K Plating大腸桿菌感受態細胞(Epicentre);將轉化後的大腸桿菌細胞液均勻地塗布在含有氯黴素的LB培養基上，過夜培養，挑取陽性克隆子構成含有7776個克隆子的宏基因組文庫；每個克隆子中都含有一段40-50Kb的插入DNA片段，利用誘導劑誘導宏 基因組文庫中的克隆子，使重組fosmid質粒在細胞中的拷貝數達到至少50個，然後提取宏基因組文庫中每個克隆子的fosmid質粒，用紫外吸收法測定質粒的濃度，調節濃度為50ng/ u I儲存；將10 ill的fosmid DNA與40%的二甲基亞碸按體積1:1的比例混合，用晶片點樣儀，在相對溼度為50-55%的條件下將fosmid DNA樣品列印在矽化玻片表面；樣品點之間的距離為250 ym，列印好的晶片室溫乾燥過夜後紫外照射使核酸分子與玻片交聯固定。將探針在晶片上排列成18行36列的亞矩陣，共排列26個亞矩陣，每個探針在晶片上有2個陣列重複。所述的酸性浸礦體系為江西德興銅礦的酸性浸礦體系。利用上述的宏基因組晶片篩選浸礦體系微生物群落中的新基因的方法，包括以下步驟:PCR擴增待篩選目標基因並進行螢光標記:將經標記後的PCR產物與宏基因組晶片雜交，獲取陽性雜交信號數據，通過PCR驗證，然後通過測序對應宏基因組文庫中的克隆子得到目標基因的完整序列信息。與傳統方法相比，本發明晶片及方法能夠快速的篩選目標基因，提高了基因文庫的利用效率，避免了重複建庫篩選文庫利用率低的弊端。同時，這種方法不要求微生物必須是純培養物，所以可以有效地篩選到未分離純化微生物的新穎基因。
圖1為16sRNA基因宏基因組雜交結果；圖2為宏基因組晶片質粒濃度與信號關係；圖3為SAOR基因PCR擴增電泳圖；圖4為SAOR不同基因型在群落中所佔比例；圖5為SAOR基因宏 基因組晶片掃描圖；圖6為德興銅礦浸礦水中的細菌微生物SAOR基因的系統發育樹。
具體實施例方式以下結合實施例旨在進一步說明本發明，而非限制本發明。實施例1宏基因組文庫的製備尼龍膜(0.2 Pm)過濾江西德興銅礦酸性浸礦體系中的酸性浸出液，得到生物質富集物，液氮研磨法提取微生物群落總DNA，然後利用200 u I的小槍頭進行切割，將總DNA修剪成40-50Kb的隨機的大片段。通過DNA的末端修飾使其末端成為兩條鏈平齊的鈍末端，利用DNA連接酶將DNA大片段與CopyControl pCClFOS Vector質粒連接起來。然後將重組的fosmid質粒轉化到EPI300-T1k Plating大腸桿菌感受態細胞。將轉化後的大腸桿菌細胞液均勻地塗布在含有氯黴素的LB培養基上，過夜培養，挑取陽性克隆子構成含有7776個克隆子的宏基因組文庫。每個克隆子中都含有一段40Kb左右的插入DNA片段，所以宏基因組文庫中所有序列信息可以達到240Mb。這樣的一個數據量可以對酸性浸礦體系微生物群落中各種豐度的微生物達到一個比較好的覆蓋，有利於新穎基因的篩選。宏基因組晶片的製備利用誘導劑誘導宏基因組文庫中的克隆子，使重組fosmid質粒在細胞中的拷貝數達到較高水平(至少50個以上)，然後提取宏基因組文庫中每個克隆子的fosmid質粒，用紫外吸收法測定質粒的濃度，調節濃度為50ng/iil儲存。將IOiU的fosmid DNA與40%的二甲基亞碸按1:1的比例混合，用晶片點樣儀，在相對溼度為50-55%的條件下將fosmidDNA樣品列印在矽化玻片表面。樣品點之間的距離為250 iim，所有7776個樣品在晶片上排布成26個18行36列的亞陣列，每個樣品點在晶片上兩個重複，其餘為空白對照樣。列印好的晶片室溫乾燥過夜後紫外照射使核酸分子與玻片交聯固定。晶片雜交以前，先將其浸A 95°C熱水2分鐘中對DNA變性處理，在95%的酒精中浸洗5次，室溫下空氣乾燥，貯存在室溫及黑暗條件下備用。PCR擴增目標基因與螢光標記通過生物信息學分析感興趣的目標基因序列的保守區域，設計通用引物，採用下列反應體系進行 PCR 擴增:1 倍 Taq 酶緩衝液(IOmM Tris-Cl [pH=9.9] ；1.5mM MgCl2 ；50mMKCl 以及 0.l%TritonX-100)；20mM dNTPs ；IOOpmol 引物，Ing 提取的微生物群落總 DNA。PCR反應程序為:94°C變性4分種；接著是在下列條件下進行32循環的放大:94°C變性45秒，55°C退火45秒，72°C延伸I分鐘；最後，在72°C延伸10分鐘，4°C恆溫保存。用瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙啶染色檢測PCR產物的大小及專一性。將PCR產物提純。當對PCR產物進行螢光標記時，500ng的DNA與1.5 y g六聚體鹼基隨機引物混合(25iiL)，在95°C下變性2min，迅速在冰上冷卻。變性的DNA溶液與15 y L標記反應液混合，標記反應液的成分如下:5mmol/L dATP, dTTP, dGTP 和 2.5mmol/L dCTP;lmmol/LCy3-dCTP (螢光綠，激發波長520nm ;發射波長55(T600nm)或者Cy5_dCTP (螢光紅，激發波長647nm ;發射波長660 705鹽)；2.5mmol/L 二硫蘇糖醇(DIT) ；10U Klenow大片斷DNA聚合酶I (Invitrogen, Calsbad, CA)。反應混合物(40 y L)在37°C下孵化2h，在100°C加熱板上變性3min，置於冰上迅速冷卻。隨後將標記的DNA用QIAquick PCR純化柱進行純化，純化液於40°C下濃縮lh，用適量的dH20將濃縮的標記DNA重新溶解。宏基因組晶片雜交與 圖像和數據處理標記好的DNA中加入晶片雜交溶液，成分如下:20ii I標記DNA，65ii 150%的甲醯胺，19.5iU20XSSC，3.9iU10%的十二烷基磺酸鈉，9.1iil的未標記的青魚精子DNA，
1.1 ill的DTT。配製好的雜交液98°C溫浴3分鐘，然後置於65°C備用。利用HS4800Pro雜交工作站進行晶片雜交，雜交溫度48°C。雜交後的宏基因組晶片在解析度5 下對基因晶片進行掃描。激發光源為綠色HeNe或紅色HeNe (分別確定於所使用的螢光素Cy3或Cy5)，螢光素所發射的螢光由光電倍增管(PMT)在 570nm(Cy3)或 670nm(Cy5)進行探測。對掃描獲得的圖像中的每一個雜交點的光素密度(或強度)進行定量分析。將一個用來定義陣列中每一個DNA雜交點的圓圈疊加在圖像上，用以確定每一個被定量分析的螢光點。將每一螢光點所獲得的平均螢光強度作為其信號強度值，局部背景信號被自動地從每一單獨的螢光點雜交信號中減去；同時，從每一個雜交信號值中減去所有人類基因(陰性對照)螢光強度的平均值，作為雜交強度最後的定量值。軟體識別並標記質量不好的螢光點。根據下列公式計算信號幹擾率(Signal-to-Noise Ratio, SNR):SNR=(信號強度值-背景信號值)/背景標準偏差，通常將SNR=3定為信號強度最小閾值，並將小於最小閾值的雜交點從數據集中去掉。對於SNR值大於3的雜交點認定為陽性雜交點，利用PCR檢驗後，進行DNA測序，從而得到目標基因完整的序列信息。通過生物信息學分析，在40Kb的DNA大片段上定位目標基因序列和與其相鄰的基因序列，並注釋生物學信息，推斷目標基因可能的系統發育學位置。實施例2宏基因組晶片雜交特異性和靈敏度探索設計16s RNA 通用引物(正向引物 27F5' -AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3';反向引物1492R5' -GGYTACCTTGTTACGACTT-3')，以德興樣品總DNA為模板PCR擴增，擴增產物分別用Cy3或Cy5螢光染料標記，與宏基因組晶片在雜交儀中雜交。雜交之前，晶片放入95°C去離子水中煮2分鐘，然後迅速拿出並放入無水乙醇中反覆拿出5次，晾乾，備用。雜交溫度為48°C，探針濃度50ng時，雜交點飽滿圓潤，信噪比及特異性效果良好，結果見圖1。探針濃度為50ng — 250ng/iil時，信噪比與探針濃度成正相關。結果如圖2所示。實施例3宏基因組晶片篩選新功能基因的應用利用宏基因組晶片來獲取一些感興趣且未培養細菌的基因。挑選亞硫酸鹽受體氧化還原酶(SAOR)基因的YedY亞基，從資料庫中下載同源序列，比對後設計通用引物(正向引物 5' -CTACAACAACTTCTACGAATTC-3';反向引物 5' -CACGTTGGAATAGAAGCC-3')，然後將德興銅礦中獲得的總DNA進行擴增，產物片段約為500bp (圖3)。為驗證樣品中細菌含有的SAOR基因類型，構建其克隆文庫並進行RFLP分析，發現8種不同的基因型，各基因型的比例各不相同，以Acidiphilium-1ike為最多高達59%，其次是 Azotobacter-1ike 和 chromobacterium-like,分別佔 13% 和 10% (圖 4)。將SAOR基因的PC R產物純化後螢光標記，與晶片雜交，獲得陽性信號點(圖5)。挑選圓潤光滑、信號清晰，信噪比5以上的6個雜交點:2295，2478，5046，5378，7040和2800分析。取出相應的保存質粒，擴增後測序得知其中的四種為Acidiphilium菌屬,而2800則為一未知菌屬。將其序列做系統發育樹分析(圖6)，發現其基因大致分為三個組，第一組在總樣品中含量較少，只佔21%比例，他們與Deinococcus菌屬相近，但其相似度也只有75%左右，而第二組則與Acidiphilium相近，且相似度極高，達95%以上，可初步斷定就是為Acidiphilium。而且其所佔比例也高達59%。第三組出現的比例為20%，且與其他菌屬的相似度不高，不到70%。通過454焦磷酸測序，獲得未知菌屬2800克隆子fosmid的完整序列，其中SAOR基因的完整胺基酸序列如下:MTTRIPRIAPSEITPPETYFNRRAFLSAALAAGAGAAVVPAAAGAPLQYRYDAADSVAALVHAPDQDETPNTffEQ I THYNNFYEFGTGKGDPARYAGELQTRPWNLTVAGEAEVTGSFPLEKFLNPYALEERIYRFRCVEAWSMVIPWVGFPLAALLKQFKPTSRAKYVTFETLYRPSQMPGQRVPILKWPYLEGLRIDEAMNPLAFMVVGLYGRVLPNQNGAPLRLIVPWKYGFKSIKSIVRIAFTEQQPETTWSLAAPNEYGFYANVNPQVPHPRWSQASERRIGASLFHERQATLMFNGYAHEVAYLYKGMNLHKYF
權利要求
1.一種篩選酸性浸礦體系中新基因的宏基因組晶片，其特徵在於，是由以下方式構建的: 利用德興酸性礦坑廢水中微生物群落的總DNA構建大片段的宏基因組文庫，以宏基因組文庫中提取的7776個fosmid質粒為探針，將探針通過基因晶片點樣儀列印在玻片表面，列印後的宏基因組晶片在室溫下乾燥過夜，最後使用紫外交聯儀照射下進行交聯即可。
2.如權利要求1所述的宏基因組晶片，其特徵在於:構建具體包括以下步驟: 採用0.2pm的尼龍膜過濾酸性浸礦體系中的酸性浸出液，得到生物質富集物，液氮研磨法提取微生物群落總DNA，然後利用200 u I的小槍頭進行切割，將總DNA修剪成40_50Kb的隨機的大片段；通過DNA的末端修飾使其末端成為兩條鏈平齊的鈍末端，利用DNA快速連接酶將DNA大片段與CopyControl pCClFOS Vector質粒連接起來構建重組的fosmid質粒；然後將重組的fosmid質粒轉化到 EPI300-T1k Plating大腸桿菌感受態細胞；將轉化後的大腸桿菌細胞液均勻地塗布在含有氯黴素的LB培養基上，過夜培養，挑取陽性克隆子構成含有7776個克隆子的宏基因組文庫；每個克隆子中都含有一段40-50Kb的插入DNA片段； 利用誘導劑誘導宏基因組文庫中的克隆子，使重組fosmid質粒在細胞中的拷貝數達到至少50個，然後提取宏基因組文庫中每個克隆子的fosmid質粒，測定質粒的濃度，調節其濃度為50ng/ u I儲存；將10 ill的fosmid DNA與40%的二甲基亞碸按體積1:1的比例混合，用晶片點樣儀，在相對溼度為50-55%的條件下將fosmid DNA樣品列印在矽化玻片表面；樣品點之間的距離為250 ym，列印好的晶片室溫乾燥過夜後紫外照射使核酸分子與玻片交聯固定。
3.如權利要求2所述的宏基因組晶片，其特徵在於:將探針在晶片上排列成18行36列的亞矩陣，共排列26個亞矩陣，每個探針在晶片上有2個陣列重複。
4.如權利要求1所述的宏基因組晶片，其特徵在於:所述的酸性浸礦體系為江西德興銅礦的酸性浸礦體系。
5.利用權利要求1-4任一項所述的宏基因組晶片篩選浸礦體系微生物群落中的新基因的方法，其特徵在於，包括以下步驟=PCR擴增待篩選目標基因並進行螢光標記:將經標記後的PCR產物與宏基因組晶片雜交，獲取陽性雜交信號數據，通過PCR驗證，然後通過測序對應宏基因組文庫中的克隆子得到目標基因的完整序列信息。
全文摘要
本發明公開了一種篩選酸性浸礦體系中新基因的宏基因組晶片及其篩選方法。該方法構建了由7776個含有浸礦體系微生物群落DNA大片段的fosmid質粒組成的基因晶片，通過晶片與待篩選目標基因PCR產物雜交，篩選到未分離純化培養的微生物的功能基因。與基於功能表達篩選基因的傳統方法相比，本發明極大地提高了克隆文庫的利用效率。同時，這一新方法也為研究利用未分離純化培養的微生物遺傳和代謝提供了一條可行的途徑。
文檔編號C40B50/14GK103103272SQ201310028300
公開日2013年5月15日 申請日期2013年1月25日 優先權日2013年1月25日
發明者劉學端, 邱冠周, 覃文慶, 梁伊麗, 尹華群, 郭雪, 申麗, 劉新星 申請人:中南大學