快速檢測單增李斯特菌的磁性免疫層析方法及檢測試紙條的製備的製作方法
2024-01-27 23:41:15 2
專利名稱：快速檢測單增李斯特菌的磁性免疫層析方法及檢測試紙條的製備的製作方法
技術領域：
本方法屬於生物檢測技術，特別是一種快速檢測單增李斯特菌的磁性免疫層析方法及檢測試紙條的製備，適用於食源性致病菌單增李斯特菌的檢測方法。
背景技術：
單核細胞增生李斯特氏菌(Listeria Monocytogenes，簡稱單增李斯特菌)是一種人畜共患的食源性病原菌，簡稱單增李斯特氏菌。單增李斯特氏菌是一種革蘭氏陽性短桿菌，不產芽孢，臨床主要表現為敗血症、腦膜炎等，尤其易感染孕婦、新生兒、老年人等免疫力低下的人群和免疫缺陷病人，孕婦感染後可引發菌血症導致早產、死嬰等，因而在食品安全領域受到重視。單增李斯特菌廣泛地存在於環境中，且該菌傳染途徑繁多。人能夠通過自身傳播李斯特菌病，尤其是在醫院或人口密集的地方，據有關研究報導，大約有5 %-10 %的健康人群攜帶有李斯特菌。通過直接或間接接觸動物，人也可能感染李斯特菌病。食物在生產銷售鏈中任何一個環節都可能受到單增李斯特菌的汙染，包括從原產地到工廠的加工過程， 進入分銷環節，直至到消費者手中。近年來，在奶和奶製品、肉製品、水產品、蔬菜、水果、沙拉等多種食品中曾多次發現單增李斯特氏菌感染案例。頻頻爆發的大規模李斯特菌病感染事件已經引起了世界各國的重視。WHO將其列為20世紀90年代四大食源性致病菌之一， 並在2000年建立了全球監測網，在世界範圍內開展與食源性致病菌相關疾病的監測。世界
各國也紛紛制訂了一些新的食品安全法規，並把單核細胞增生性李斯特菌納入法定強檢項目。目前，食品中單增李斯特菌的檢測主要有三大技術手段，分別是傳統的富集分離和純化鑑定技術、分子生物學檢測技術和免疫學檢測技術。傳統檢驗方法首先對樣品進行前增菌處理後，分離純化出可疑微生物，進一步對可疑菌落做生化反應實驗、溶血實驗、協同溶血實驗(CAMP)、動物實驗及典型運動等鑑定，被確定為李斯特菌後進一步進行血清分型。傳統檢驗方法中，前增菌處理是不可或缺的實驗步驟，目前國際常用的增菌法主要有國際乳業聯盟(IDF)、美國食品藥品管理局(FDA)及美國農業部(USDA)的增菌法。我國檢測單增李斯特菌方法主要有國標GB/T4789. 30-2008和行業標準SN-TO184. 1-2005。這些增菌方法耗時不一，但至少都需要20h，且後續鑑定程序複雜，不能夠適應當今社會快速、準確、 靈敏、特異檢測微生物的要求。分子生物學檢測方法主要包括PCR法和DNA探針法，與傳統方法相比，分子生物學檢測技術能大大減少工作量，具有靈敏度度高、特異性強等特點，因此在一定程度上滿足了靈敏、快速、特異的檢測需求。但是分子生物學法仍需對樣品進行前處理，且樣品前處理的好壞很大程度上會影響PCR檢測結果。此外，PCR和探針雜交等方法都無法排除死菌。儘管通過增菌可使死菌比例減少，相對地減少了假陽性，但並不能完全杜絕死菌的檢測，因此存在假陽性反應。
免疫學方法是基於抗原抗體特異性反應而建立的一種檢測方法，具有快速，敏感， 特異，簡便，結果易於判斷等特點。目前，單增李斯特菌的免疫學檢測法有ELISA、酶聯螢光免疫檢測系統等，通常可在M小時內得到檢測結果。其中應用最為廣泛的是ELISA法， 該法曾被國標GB/T4789. 30-2008列為可供選擇的檢測方法之一，具有操作簡便、通量高等特點，但其操作過程需要專用的實驗室和專業人員進行檢測，操作步驟複雜，且檢測時間較長，一般需18 Mh。LFIA技術是ELISA技術原理的擴展應用，一般使用乳膠顆粒、膠體硒、 膠體金、脂質體及上轉磷等作為著色標記物。在層析時，標記物與待測物之間形成的複合物可被相應的配體所捕獲而聚集於硝化纖維膜上的檢測線並呈現出標記物所帶有的顏色，因此可以通過纖維膜上顯色條的有無、顏色深淺和反射光線等從而實現檢測目的，由於一般不需要特殊大型設備，從而具有操作簡便、快速靈敏的優點。是一種適用於現場的快速檢測方法，在目前公開的報導中，大都以膠體金顆粒作為標記物，因此又被稱為膠體金免疫層析法。磁性免疫層析技術以超順磁性顆粒代替傳統的標記物來進行免疫層析，通過檢測結合在超順磁性納米顆粒上的目標物來提供對生物樣本的定量檢測數據，再利用被磁顆粒標記抗體所捕獲的免疫複合物與磁信號之間的線性關係即可實現對生物樣本的快速定量檢測目的，磁性免疫層析技術具有靈敏度高、穩定性強、線性範圍寬、操作簡便、快速等優
點ο
發明內容
本發明的目的針對現有檢測技術不能快速、簡便地檢測單增李斯特菌的不足和缺陷，提供一種以免疫磁珠為標記物的快速檢測單增李斯特菌的磁性免疫層析方法及磁珠標記層析試紙條的製備。從而實現快速、簡便檢測單增李斯特菌目的。1、本發明提出的快速檢測單增李斯特菌的磁性免疫層析方法，其特徵在於用雜交瘤技術製備篩選所得的單增李斯特菌的特異性反應鼠系單克隆抗體作為磁珠標記抗體， 通過化學結合方式將篩選所得單克隆抗體偶聯到磁性納米材料的表面製備成免疫磁珠；將由樣品墊、經免疫磁珠標記的結合墊、預包被有選自紐西蘭大白兔的抗血清的單增李斯特菌兔抗血清的檢測線τ和山羊抗小鼠IgG的控制線C的層析膜、吸水墊組建成一種基於雙抗夾心檢測原理的單增李斯特菌的磁性免疫層析試紙條；檢測時在樣品墊上加入樣品液， 室溫下放置20min，依據免疫磁珠磁性納米材料的顏色在檢測線T區域和控制線C區域處形成的肉眼可見的顯色條帶的判讀，從而實現單增李斯特菌的快速定性檢測；或將已使用試紙條放入磁信號檢測儀上，對免疫層析後形成的檢測線T區域和控制線C區域進行檢測獲取定量反應數據，從而實現單增李斯特菌的定量檢測。其中所述的抗單增李斯特菌特異性單抗是採用雜交瘤技術製備篩選所得，所述的抗單增李斯特菌特異性多抗是通過免疫紐西蘭大白兔製備所得，兩種抗體對單增李斯特菌具有特異性反應。本發明所述的磁性免疫層析方法所用檢測試紙條的製備步驟如下A.抗體的製備與純化以紫外滅活處理的單增李斯特菌體作為抗原免疫BALB/C小鼠，按常規的雜交瘤技術和極限稀釋法製備和篩選單抗細胞株，然後將抗單增李斯特菌的特異性抗體細胞株增殖培養，注射到BALB/C小鼠中製備腹水，製備所得腹水經50 %重量/體積比的硫銨濃縮後， 採用商業化的Protein-G親和層析柱進行抗體的純化；具體進行親和層析純化處理時，按照所附產品操作說明書進行。以紫外滅活處理的單增李斯特菌體作為抗原免疫紐西蘭白兔，所得抗血清經50% 重量/體積比的硫銨濃縮後，採用商業化的脫鹽柱按照產品操作說明書進行脫鹽處理，所得溶液保存於-80度待用。B.免疫磁珠的製備選用直徑為50-200nm的磁珠，使用碳二甲胺和琥珀醯亞胺共價交聯的方式將抗單增李斯特菌單抗標記在磁珠上形成免疫磁珠；C.結合墊的處理將製備好的免疫磁珠懸浮液噴點在結合墊上以形成免疫磁珠標記結合墊；噴點時也可以採用人工手動噴液或定量噴液裝置來進行。D.層析膜的包被用自動噴膜儀，以0. 8 μ L/cm的速度，將選定濃度的抗血清、山羊抗小鼠IgG分別噴點在層析膜的T線和C線處，噴點時線與線間的間隔距離為0. 5-1. Ocm ；包被後的層析膜於37°C的乾燥箱中烘乾4-6小時，置於乾燥器中保存備用；E.試紙條的組裝與製備將樣品墊、結合了免疫磁珠的結合墊、包被膜、吸水墊依次相互交錯約Imm粘貼在襯板上，然後在上層覆蓋透明塑料密封膜；根據要求寬度切割即可得到磁性免疫層析試紙
^^ ο免疫磁珠的製備方法如下1)吸取 2mg 羧基磁珠於離心管中，用 500 μ L 0. OlM 含 0. 5% (v/v) Tween-20, pH 為5. 0的MES溶液作為活化緩衝溶液清洗磁珠，將離心管置於磁分離架上使得磁珠與活化溶液分離，重複清洗幾次，最後重懸磁珠；2)將新鮮配製的EDC和NHS加入磁珠懸液中活化羧基30min，反應結束後先用 MEST緩衝液洗滌磁珠，再用0. 005M硼酸鹽吐溫溶液(簡稱BST)作為偶聯緩衝液洗滌磁珠 2遍；3)加入150 μ g單增李斯特菌的特異性鼠系單克隆抗體，在旋轉混合器上反應3小時；4)加入1 % (w/v) BSA溶液室溫下反應30min ；5)用BST溶液洗滌免疫磁珠4次，將磁珠重懸，4°C保存備用。本發明與現有技術相比具有如下優點將超順磁性納米材料、免疫層析技術和磁性檢測儀相結合，通過構建以免疫磁珠為標記物的免疫層析試紙條，既可滿足定性檢測需求，又能實現定量檢測目的，具有靈敏度高、耗時短、方便易用等特點。
圖1為本發明的檢測試紙條的組成結構的側面示意圖；圖2為採用所述磁性免疫層析試紙條對單增李斯特菌陰性樣品的檢測結果示意圖；圖3為採用所述磁性免疫層析試紙條對單增李斯特菌的陽性檢測結果示意圖；圖4為採用所述磁性免疫層析試紙條對單增李斯特菌的檢測無效的結果示意圖；圖5為採用所述磁性免疫層析試紙條檢測單增李斯特菌的定性檢測結果示意圖。圖中1-樣品墊2-結合墊3-T線4-C線5_襯板6_吸收墊7_層析膜(硝酸纖維素膜)8-免疫磁珠(納米探針)9-樣品。
具體實施例方式本發明提出的這種快速檢測單增李斯特菌的磁性免疫層析方法如下用雜交瘤技術製備篩選所得的單增李斯特菌的特異性反應鼠系單克隆抗體作為磁珠標記抗體，通過化學結合方式將篩選所得單克隆抗體偶聯到磁性納米材料的表面製備成免疫磁珠；將由樣品墊、經免疫磁珠標記的結合墊、預包被有選自紐西蘭大白兔的抗血清的單增李斯特菌兔抗血清的檢測線T和山羊抗小鼠IgG的控制線C的層析膜、吸水墊組建成一種基於雙抗夾心檢測原理的單增李斯特菌的磁性免疫層析試紙條；檢測時在樣品墊上加入樣品液，室溫下放置20min，依據免疫磁珠磁性納米材料的顏色在檢測線T區域和控制線C區域處形成的肉眼可見的顯色條帶的判讀，從而實現單增李斯特菌的快速定性檢測； 或將已使用試紙條放入磁信號檢測儀上，對免疫層析後形成的檢測線T區域和控制線C區域進行檢測獲取定量反應數據，從而實現單增李斯特菌的定量檢測。其中所述的抗單增李斯特菌特異性單抗是採用雜交瘤技術製備篩選所得，所述的抗單增李斯特菌特異性多抗是通過免疫紐西蘭大白兔製備所得，兩種抗體對單增李斯特菌具有特異性反應。本發明所述的磁性免疫層析方法所用檢測試紙條的製備步驟如下A.抗體的製備與純化以紫外滅活處理的單增李斯特菌體作為抗原免疫BALB/C小鼠，按常規的雜交瘤技術和極限稀釋法製備和篩選單抗細胞株，然後將抗單增李斯特菌的特異性抗體細胞株增殖培養，注射到BALB/C小鼠中製備腹水，製備所得腹水經50 %重量/體積比的硫銨濃縮後， 採用商業化的Protein-G親和層析柱進行抗體的純化；具體進行親和層析純化處理時，按照所附產品操作說明書進行。以紫外滅活處理的單增李斯特菌體作為抗原免疫紐西蘭白兔，所得抗血清經50% 重量/體積比的硫銨濃縮後，採用商業化的脫鹽柱按照產品操作說明書進行脫鹽處理，所得溶液保存於-80度待用。B.免疫磁珠的製備選用直徑為50-200nm的磁珠，使用碳二甲胺和琥珀醯亞胺共價交聯的方式將抗單增李斯特菌單抗標記在磁珠上形成免疫磁珠；C.結合墊的處理將製備好的免疫磁珠懸浮液噴點在結合墊上以形成免疫磁珠標記結合墊；噴點時也可以採用人工手動噴液或定量噴液裝置來進行。D.層析膜的包被用自動噴膜儀，以0. 8 μ L/cm的速度，將選定濃度的抗血清、山羊抗小鼠IgG分別噴點在層析膜的T線和C線處，噴點時線與線間的間隔距離為0. 5-1. Ocm ；包被後的層析膜於37°C的乾燥箱中烘乾4-6小時，置於乾燥器中保存備用；E.試紙條的組裝與製備將樣品墊、結合了免疫磁珠的結合墊、包被膜、吸水墊依次相互交錯約Imm粘貼在襯板上，然後在上層覆蓋透明塑料密封膜；根據要求寬度切割即可得到磁性免疫層析試紙免疫磁珠的製備方法如下1)吸取 2mg 羧基磁珠於離心管中，用 500 μ L 0. OlM 含 0. 5% (v/v) Tween-20, pH 為5. 0的MES溶液作為活化緩衝溶液清洗磁珠，將離心管置於磁分離架上使得磁珠與活化溶液分離，重複清洗幾次，最後重懸磁珠；2)將新鮮配製的EDC和NHS加入磁珠懸液中活化羧基30min，反應結束後先用 MEST緩衝液洗滌磁珠，再用0. 005M硼酸鹽吐溫溶液(簡稱BST)作為偶聯緩衝液洗滌磁珠 2遍；3)加入150 μ g單增李斯特菌的特異性鼠系單克隆抗體，在旋轉混合器上反應3小時；4)加入1 % (w/v) BSA溶液室溫下反應30min ；5)用BST溶液洗滌免疫磁珠4次，將磁珠重懸，4°C保存備用。實施案例1單增李斯特菌的磁性檢測試紙條的製備(1)單增李斯特菌的特異性免疫磁珠的製備EDC/NHS 偶聯將單增李斯特菌特異性鼠系單克隆抗體與羧基修飾的納米磁珠(粒徑為200nm) 進行偶聯，製備單增李斯特菌的特異性免疫磁珠，即磁標抗體。以PH5. 0的MEST溶液 (0. 05 % Tween-20)作為活化緩衝溶液，取^iig羧基磁珠於2mL離心管中，加入500 μ L活化緩衝液，在漩渦振蕩器上混合均勻，再將離心管放置於磁分離架上，待磁珠完全被吸附，用微型臺式真空泵抽提上清液；用500 μ L活化緩衝液重新洗滌磁珠兩遍後，EDC與NHS溶液， 用活化緩衝液調整體積至500 μ L，在漩渦振蕩器上混合均勻，室溫活化30min。活化後，用活化緩衝液洗滌磁珠兩遍，以除去未反應的活化劑。以PH9. 0的硼酸鹽吐溫緩衝液(0. 05% Tween-20)溶液作偶聯緩衝液，以偶聯緩衝液洗滌磁珠兩遍；然後加入150 μ g已純化的單克隆抗體，使磁珠表面活化的羧基與抗體的氨基室溫反應池，將抗體偶聯於磁珠表面，得到免疫磁珠。偶聯完成後，加入500μ L的BSA(w/v)室溫下封閉反應30min。最後，用偶聯緩衝液洗滌封閉後的磁珠四遍後，保存於500 μ L保存液中。(2)磁性檢測試紙條的製備以兔系抗血清作為檢測抗體，用點膜儀以0. 8 μ L/cm的速度將2mg/mL紐西蘭大白兔的抗血清固定在硝酸纖維素膜上的T線區域，在距離T線0. 8cm處，靠近吸水紙端為C線， 用點膜儀將lmg/ml的山羊抗小鼠IgG固定在硝酸纖維素膜上的C線區域。參見圖1，將樣品墊、結合墊、包埋有T線和C線的硝酸纖維素膜、吸水墊依次銜接在襯板上，各部件之讓均有Imm的重疊部分，然後剪裁成0. 5cm寬的磁性免疫層析檢測試紙條。然後將4°C保存的製備好的磁標抗體用磁珠懸浮液兩倍體積重懸，取5μ L點於結合墊上。
實施案例2樣品的定性檢測在試紙條的樣品墊處添加100μ L樣品，室溫反應20min後，肉眼觀察檢測結果。參見圖2，陽性結果呈現兩條明顯的條帶或者T線的條帶淺於C線條帶，而陰性結果僅C線處出現一條條帶，T線處無條帶。檢測時若C線處無條帶，則試紙條體系有問題，其檢測結果視為無效。實施案例3樣品的定量檢測把試紙條裝入專用的試紙條卡槽，插入磁性分析儀的專用卡槽處讀取試紙條T線和C線處的磁信號，以陽線樣本與陰性樣本在T線處的定量信號間的比值對檢測結果進行評價，值彡2的樣品其結果視視為陽性，1^/1^值< 2的樣品其結果視為陰性。磁性免疫層析試紙條對單增李斯特菌檢測結果示意圖的說明如下圖2為採用所述磁性免疫層析試紙條對單增李斯特菌陰性樣品的檢測結果示意圖；即檢測線T處無顯色條帶，控制線C處有顯色條帶。圖3為採用所述磁性免疫層析試紙條對單增李斯特菌的陽性檢測結果示意圖；即檢測線T處和控制線C處均有顯色條帶。圖4為採用所述磁性免疫層析試紙條對單增李斯特菌的檢測無效的結果示意圖；即檢測線T處有顯色條帶，而控制線C處無顯色條帶。圖5為採用所述磁性免疫層析試紙條檢測單增李斯特菌的定性檢測結果示意圖。即檢測線T和控制線C處均無顯色條帶。表 權利要求
1.一種快速檢測單增李斯特菌的磁性免疫層析方法，其特徵在於將採用雜交瘤技術製備篩選所得的單增李斯特菌的特異性反應鼠系單克隆抗體作為磁珠標記抗體，通過化學結合方式將篩選所得單克隆抗體偶聯到磁性納米材料的表面製備成免疫磁珠；將由樣品墊、經免疫磁珠標記的結合墊、預包被有選自紐西蘭大白兔的抗血清的單增李斯特菌兔抗血清的檢測線τ和山羊抗小鼠IgG的控制線C的層析膜、吸水墊組建成一種基於雙抗夾心檢測原理的單增李斯特菌的磁性免疫層析試紙條；檢測時在樣品墊上加入樣品液，室溫下放置20min，依據免疫磁珠表面磁性納米材料的顏色在檢測線T區域和控制線C區域處形成的肉眼可見的顯色條帶的判讀，從而實現單增李斯特菌的快速定性檢測；或將已使用試紙條放入磁信號檢測儀上，對免疫層析後形成的檢測線T區域和控制線C區域進行檢測獲取定量反應數據，從而實現單增李斯特菌的定量檢測。
2.如權利要求1所述的快速檢測單增李斯特菌的磁性免疫層析方法，其特徵在於所述的磁性免疫層析試紙條的製備方法如下A.抗體的製備與純化以紫外滅活處理的單增李斯特菌體作為抗原免疫BALB/C小鼠，按常規的雜交瘤技術和極限稀釋法製備和篩選單抗細胞株，然後將抗單增李斯特菌的特異性抗體細胞株增殖培養，注射到BALB/C小鼠中製備腹水，製備所得腹水經50% (w/v)硫銨濃縮後，採用商業化的 Protein-G親和層析柱進行抗體的純化；以紫外滅活處理的單增李斯特菌體作為抗原免疫紐西蘭白兔，所得抗血清經50% (w/ ν)硫銨濃縮後，採用商業化的脫鹽柱進行脫鹽處理，所得溶液保存於-80度待用；B.免疫磁珠的製備選用直徑為50-200nm的磁珠，使用碳二甲胺(EDC)和琥珀醯亞胺(NHS)共價交聯的方式將抗單增李斯特菌單抗標記在磁珠上形成免疫磁珠；C.結合墊的處理將製備好的免疫磁珠懸浮液噴點在結合墊上以形成免疫磁珠標記結合墊；D.層析膜的包被用自動噴膜儀，以0. 8 μ L/cm的速度，將選定濃度的抗血清、山羊抗小鼠IgG分別噴點在層析膜的T線和C線處，噴點時線與線間的間隔距離為0. 5-1. Ocm ；包被後的層析膜於 37°C的乾燥箱中烘乾4-6小時，置於乾燥器中保存備用；E.試紙條的組裝與製備將樣品墊、結合了免疫磁珠的結合墊、包被膜、吸水墊依次相互交錯約Imm粘貼在襯板上，然後在上層覆蓋透明塑料密封膜；根據要求寬度切割即可得到磁性免疫層析試紙條。
3.如權利要求1所述的快速檢測單增李斯特菌的磁性免疫層析方法，其特徵在於所述的特異性免疫磁珠的具體製備方法為1)吸取2mg羧基磁珠於離心管中，用500μ L 0. OlM含0. 5%體積比的Tween-20，PH為5. 0的MES溶液作為活化緩衝溶液清洗磁珠，將離心管置於磁分離架上使得磁珠與活化溶液分離，重複清洗幾次，最後重懸磁珠；2)將新鮮配製的EDC和NHS加入磁珠懸液中活化羧基30min，反應結束後先用MEST緩衝液洗滌磁珠，再用0. 005M硼酸鹽吐溫溶液作為偶聯緩衝液洗滌磁珠2遍；3)加入150yg單增李斯特菌的特異性鼠系單克隆抗體，在旋轉混合器上反應3小時；4)加入(w/v)BSA溶液室溫下反應30min ；5)用BST溶液洗滌免疫磁珠4次，將磁珠重懸，4°C保存備用。
4.如權利要求3所述的快速檢測單增李斯特菌的磁性免疫層析方法，其特徵在於所述的磁性納米材料為表面修飾有羧基的超順磁性納米顆粒，粒徑為50 200nm。
5.如權利要求1所述快速檢測單增李斯特菌的磁性免疫層析方法，其特徵在於所述的磁性免疫層析方法的檢測試紙條包括襯板(5)、樣品墊(1)、點有免疫磁珠結合墊O)、 包被有單增李斯特菌的多克隆抗體和質控抗體的硝酸纖維素膜(7)、吸收墊(6)；將樣品墊 (1)、點有免疫磁珠結合墊( 、包被有單增李斯特菌的多克隆抗體和質控抗體的硝酸纖維素膜(7)、吸收墊(6)相互交錯約Imm依次粘貼在襯板(6)上。
全文摘要
一種快速檢測單增李斯特菌的磁性免疫層析方法，將採用雜交瘤技術製備篩選所得的單增李斯特菌的特異性反應鼠系單克隆抗體作為磁珠標記抗體，通過化學結合方式將單克隆抗體偶聯到磁性納米材料的表面製備成免疫磁珠；將由樣品墊、磁珠標記的結合墊、預包被有單增李斯特菌兔抗血清的檢測線T和山羊抗小鼠IgG的控制線C的層析膜、吸水墊組建成磁性免疫層析試紙條；檢測時依據免疫磁珠表面磁性納米材料的顏色在檢測線T區域和控制線C區域處形成的肉眼可見的顯色條帶的判讀，或將已使用試紙條放入磁信號檢測儀上，對免疫層析後形成的檢測線T區域和控制線C區域進行檢測獲取定量反應數據，從而實現單增李斯特菌的塊速定性或定量檢測。
文檔編號G01N33/558GK102393462SQ20111029839
公開日2012年3月28日 申請日期2011年9月29日 優先權日2011年9月29日
發明者盧瑛, 林婷婷, 潘迎捷 申請人:上海海洋大學