能夠降解二噁烷的黃色桿菌d7及其應用的製作方法

2024-01-30 12:52:15

專利名稱：能夠降解二噁烷的黃色桿菌d7及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一株能夠降解二噁烷的新菌株一黃色桿菌D7及其應用。 背景技術：
二噁烷(l，4-DioXane)亦稱1，4-二氧六環、雙乙酐，是一種具有乙醚味的可燃性液體，毒性較大，被美國環保署列為B2級(可能的)人類致癌物。二噁烷作為一種重要的有機化工溶劑，在醫藥、化妝品、香料等特殊精細化學品製造以及科學研究中作為溶劑、反應介質、萃取劑使用。另外，許多表面活性劑也含有二噁烷，這些表面活性劑常被用於各種消費產品，如各種家用洗滌劑。二噁烷溶解能力強，而且相關研究表明，二噁烷是一種細胞色素酶P450的抑制劑，可通過呼吸道、消化道、皮膚進入機體。低濃度時對皮膚和黏膜有麻醉和刺激作用；並且會在體內蓄積。如接觸大量蒸氣將引起眼和上呼吸道刺激，且伴有頭暈、 頭痛、嗜睡、噁心、嘔吐等症狀。另外，二噁烷可致肝、皮膚損害，甚至發生尿毒症。二噁烷的廣泛應用使其對地下水及大氣的汙染日益嚴重，因此急需尋求一種有效的方法對其進行去除。二噁烷是含有兩個相對稱醚鍵的環狀有機化合物，這種化學結構使其具有高水溶性和高耐生物降解性，因而二噁烷曾一度被認為「不可生物降解」。隨著 Dmitreko等於1987年從反應器中分離到了能利用二噁烷的混合菌株ArthrcAacter sp.、 Pseudomonas sp.和Bacillus sp.，越來越多的研究者開始了生物法處理二噁烷的研究。 1993年，Sock等在連續流附著式反應器中，培養出以二噁烷為唯一碳源和能源的混合菌群。Roy研究表明，經過32天的適應期，活性汙泥填充反應器可完全降解150mg/L的二噁烷，但高濃度的二噁烷不能被完全降解，可能是由於有毒副產物的抑制作用。另外一些研究者已經證明了純菌可以降解二噁烷。Bernhardt和Diekman等學者分離的Rhodococcus sp.可礦化高濃度(880mg/L)的二噁烷，但能否持續生長卻不得而知。同時，他提出了二噁烷的生物降解途徑可能是先經過羥基化，而後再開環。1993年，Burtack和Perry分離出了具有降解二噁烷的MyccAacterium vaccae,但該菌株降解二噁烷的能力是有限的，且不能持續生長。1994 年，Parales 分離的 Nocardioform actinomycetes CB1190 可以二噁燒為唯一碳源和能源物質，並持續生長，最終將其礦化，其降解速率是0. 3;3mg/(mg蛋白· min)。 Nakamiya等分離出的真菌Cordyaps sinensis也能以二噁烷為唯一碳源和能源生長。目前國內對二噁烷的研究較少。浙江大學陳紅研究了厭氧條件下，鐵還原菌-Fe (III)-腐殖酸生物/非生物協同作用和在腐殖酸還原菌生物/非生物協同作用兩個體系下的二噁烷降解情況。研究表明，鐵還原菌-Fe(II)-腐殖酸生物非生物協同作用， 40天二噁烷去除率達到了 90. 47%，加入不同量的氧化鐵對二噁烷降解影響不大，但是增加溶解態狗(III)加入量卻對二噁烷的氧化降解效率有一定提高。而腐殖酸還原菌-腐殖酸-Fe (III)生物/非生物協同作用，40天內二噁烷基本降解完全。迄今尚未有黃色桿菌降解二噁烷的報導。
發明內容
本發明一株能夠降解二噁烷的新菌株——黃色桿菌D7及其應用。本發明採用的技術方案是能夠降解二噁烷的黃色桿菌(Xanthobacter sp. )D7，保藏於中國典型培養物保藏中心，地址中國武漢武漢大學，430072，保藏日期2010年09月09日，保藏編號CCTCC NO :M 2010225。本發明所提供的二噁烷降解菌D7來源於浙江某化工廠汙水處理池的活性汙泥， 經人工馴化、富集、分離得到。該菌是一株革蘭氏陰性菌，菌落特徵如下菌體呈短杆狀，大小為(0.5 0.7) μ mX (0.8 1.0) μ m，無芽孢；菌落呈小圓狀、黃色、形態飽滿、光滑溼潤，易挑起，菌苔沿劃線生長；氧化酶、檸檬酸鹽為陽性；接觸酶、V. P.反應、M.R.反應、吲哚反應為陰性；糖發酵實驗陰性，革蘭氏染色陰性。本發明還涉及所述的黃色桿菌D7在微生物降解二噁烷中的應用。可按照本領域常規方法，將黃色桿菌D7接種至含二噁烷的廢水中，或者將含二噁烷的廢氣通入黃色桿菌 D7菌液中，對廢水或廢氣進行處理。優選的，所述降解在pH 4. 0 10、25°C 40°C下進行。Xanthobacter sp. D7能利用二噁烷作為唯一碳源和能源生長繁殖，將二噁烷礦化成(X)2和H20。在純培養條件下，該菌在48h內能將無機鹽培養基中100mg/L的二噁烷完全降解。所述無機鹽培養基(BSM)每IOOOmL 含有Νει2ΗΡ04 · 12Η20 0· 1 6. Og/L、KH2PO4 0· 1 4. Og/L、(NH4)2SO4 0· 1 3. 0g/L、MgSO4 · 7Η20 0. 05 0. 6g/L、CaCl2 · 2H20 0. 01 0. lg/L，微量元素母液0. 5 5mL，二噁烷0. 01 5mM，pH 4. 0 10. 0。微量元素母液濃度組成=FeSO4 · 7H20 1. 0g/L、CuSO4 · 5Η200· 02g/L、H3BO3 0. 014g/L、MnSO4 · 4H20 0. 10g/L、 ZnSO4 · 7H20 0. 10g/L、Na2MoO4 · 2H20 0. 02g/L、CoCl2 · 6H20 0. 02g/L，溶劑為水。所述黃色桿菌D7降解二噁烷不需要經過誘導階段，即可穩定有效地降解二噁烷。本發明的有益效果主要體現在本發明提供了一株二噁烷的高效降解菌，該菌株為好氧非發酵型革蘭氏染色陰性菌，能夠以二噁烷為唯一碳源與能源生長同時高效降解該底物；並且該菌株不需要經過誘導階段，可穩定的降解底物二噁烷。本發明為生物法淨化含二噁烷廢水及廢氣的工程應用奠定了基礎。


圖1為黃色桿菌D7的透射電鏡照片；圖2上為黃色桿菌D7的菌體生長、二噁烷降解和有機碳含量曲線圖；圖3為不同pH下黃色桿菌D7對二噁烷降解率的影響；圖4為不同溫度下，黃色桿菌D7菌體生長和二噁烷濃度的變化情況；圖5為黃色桿菌D7經過不同培養基預培養後轉接入含二噁烷的新鮮BSM培養基中，菌體對二噁烷的降解情況；-■ -R2A/BSM表示在R2A溶液中預培養菌體接種至新鮮BSM 中的二噁烷降解情況；-· "BSM/BSM表示在BSM培養基上培養後收集菌體接種至新鮮BSM 中的二噁烷降解情況。具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但本發明的保護範圍並不僅限於此實施例1 Xanthobacter sp. D7 的分離與鑑定(1)樣品採集及馴化現場採集浙江某化工廠汙水處理池的活性汙泥，以二噁烷為唯一碳源和能源，進行馴化、富集。數月後，將活性汙泥接種到含50mL BSM培養基的250mL密封鹽水瓶中，以二噁烷作為唯一碳源和能源，繼續培養、富集。實驗需恆溫(30士 1°C)，並保持在好氧條件下進行。BSM 按如下組成配製:4. 5g Na2HPO4 · 12Η20、1· Og KH2PO4U. 5g NH4CUO. 2g MgSO4 · 7H20、0. 023g CaCl2, ImL 微量元素母液，水補足至 1000mL。微量元素母液濃度組成=FeSO4· 7H20 1. Og/L、CuSO4 · 5H20 0. 02g/L、H3BO3 0. 014g/L、MnSO4 ·4Η20 0. lOg/L, ZnSO4 · 7H20 0. lOg/L, Na2MoO4 · 2H20 0. 02g/L, CoCl2 · 6H20 0. 02g/L，溶劑為水。(2)菌株分離與鑑定將在鹽水瓶中經過多次傳代富集的混合菌液，進行稀釋塗布，依據菌體群落的差異性，挑取單菌落。對單菌落進行多次劃線分離後，再接至以二噁烷為唯一碳源和能源的 BSM中，測試降解活性。選擇具有二噁烷降解能力的純菌，進一步分離純化，獲得有二噁烷降解活性的菌株D7。菌株D7細胞呈短杆狀，大小為(0. 5 0. 7) μ mX (0. g 1· 0) μ m，無芽孢；菌落
呈小圓狀、黃色、形態飽滿、光滑溼潤，易挑起，菌苔沿劃線生長。D7的生理生化特徵為好氧，氧化酶反應為陽性，檸檬酸鹽為陽性；接觸酶、 V. P.反應、M.R.反應、吲哚反應為陰性；糖發酵實驗陰性，革蘭氏染色陰性。上述特徵與文獻(《常見細菌鑑定手冊》)編錄的黃色桿菌的生理生化性狀相吻合。該菌株經16S rDNA同源性分析，結合以上生理生化的菌學特徵，將其鑑定為黃色桿菌屬(Xanthobacter sp.)，保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏編號CCTCC NO =M 2010225。實施例2 :Xanthobacter sp. D7 (CCTCC NO :M 2010225)降解二噁燒的性能種子液製備D7接種於R2A斜面中培養3天，再從斜面接種至含100mg/L 二噁烷的BSM培養基中培養2天，1200rpm/min離心5min，棄去上清液，用生理鹽水潤洗菌體2次， 配成菌懸液，即為實驗的種子液。以二噁烷作為Xanthobacter sp. D7的唯一碳源，從種子液中接菌體至50mL BSM 培養基，使初始菌體濃度(以OD計)為0. 01 ；加入二噁烷使初始二噁烷濃度為100mg/L。 放入溫度為30°C、轉數為160r/min的搖床中培養，每隔一段時間取一次樣，結果見圖2。隨著時間的延長，菌體濃度逐漸增大，至4 時，菌體濃度達到0. 178 (以OD計)。本實施例說明降解菌Xanthobacter sp. D7可利用二噁烷作為唯一碳源和能源進行生長繁殖，並且具有穩定高效降解二噁烷的能力。用lmol/L NaOH或 HCl 溶液調節 BSM 培養基為不同 pH值(4. 0、4. 5、5. 0、5. 5、6. 0、 6. 5、7. 0、7. 5、8. 0、8. 5、9. 0、9. 5、10. 0)，在初始二噁烷濃度為100mg/L的條件下，接入種子液，使各平行樣中的初始菌體濃度(以OD計)為0.01。將樣品於3(TC、160r/min恆溫搖床裡振蕩培養，培養40h後取樣，測菌體及反應液中殘餘二噁烷的濃度。實驗過程中，設計 3個平行樣和一個空白對照(下同)，結果見圖3。可見，在pH4. 0 10. 0，微生物均能降解二噁烷並伴隨細胞濃度的增加；隨著pH 從4. 0增大到10. 0，菌體濃度及二噁烷降解率均先增大後減小，Xanthobacter sp. D7降解二噁烷的較適宜的PH值為7. 0。本研究表明菌株D7在pH4. 0 10. 0均能不同程度地降解二噁烷，為其在不同PH環境的應用提供了保證。在初始二噁烷濃度為100mg/L的BSM培養基中，接入種子液，使各平行樣中的初始菌體濃度為0. 01 (以OD計)。將各個樣品分別置於溫度為25°C、30°C、37°C、40°C搖床中恆溫振蕩培養(搖床轉數均為160r/min)，定時取樣，測菌體及反應液中殘餘二噁烷的濃度。 由圖4可知，在25°C 40°C溫度範圍內，Xanthobacter sp. D7均能生長，但溫度在37°C以上時，D7的生長明顯較低溫的緩慢。當溫度為37°C，細胞生長速率最快，3 即達穩定期， 菌體濃度(以OD計)達0. 180，體系中的二噁烷被完全降解，去除率達到100%。隨著溫度的進一步下降，菌株的生長和降解能力開始下降。將Xanthobacter sp. D7分別接種於R2A液體培養基和BSM培養基中進行預培養後收集菌體製成懸濁液作為種子液。於50mL BSM培養基中加入100mg/L底物二噁烷，分別接入Xanthobacter sp. D7種子液使初始濃度達到0. 4 (以OD計)，於30°C、160r/min的搖床中進行降解實驗。結果如圖2所示，在高濃度菌液下，經過R2A液體培養基預培養的 Xanthobacter sp. D7較BSM培養基稍慢，但在降解底物二噁烷的初期沒有明顯的停滯期。 可初步判定Xanthobacter sp. D7不需要經過誘導階段，即可達到降解二噁烷的目的。該研究有利於進一步擴大生產，使其應用於生物法淨化含二噁烷廢水及廢氣的工程。實施例3 =Xanthobacter sp. D7淨化二噁烷廢水在生物滴濾塔中接種Xanthobacter sp. D7菌液連續處理濃度為100mg/m3的二噁烷廢氣。經過25天的掛膜啟動後，生物滴濾塔二噁烷廢氣的淨化效率達93%以上，此後系統能一直穩定運行。
權利要求
1.能夠降解二噁烷的黃色桿菌(Xanthobactersp.)D7，保藏於中國典型培養物保藏中心，地址中國武漢武漢大學，430072，保藏日期2010年09月09日，保藏編號CCTCC NO: M 2010225。
2.如權利要求1所述的黃色桿菌D7，其特徵在於所述黃色桿菌D7菌落特徵如下菌體呈短杆狀，大小為(0.5 0.7) μ mX (0.8 1.0) μ m，無芽孢；菌落呈小圓狀、黃色、形態飽滿、光滑溼潤，易挑起，菌苔沿劃線生長；氧化酶、檸檬酸鹽為陽性；接觸酶、V. P.反應、 M.R.反應、吲哚反應為陰性；糖發酵實驗陰性，革蘭氏染色陰性。
3.如權利要求1或2所述的黃色桿菌D7在微生物降解二噁烷中的應用。
4.如權利要求3所述的應用，其特徵在於所述降解在pH4. 0 10、251 401下進行。
全文摘要
本發明提供了一株可降解二噁烷的新菌株一黃色桿菌D7及其在微生物分解處理二噁烷的應用。黃色桿菌(Xanthobacter sp.)D7，保藏於中國典型培養物保藏中心，地址中國武漢武漢大學，430072，保藏日期2010年9月9日，保藏編號CCTCC NOM 2010225。本發明提供的二噁烷降解菌為好氧非發酵型革蘭氏染色陰性菌，能利用二噁烷作為唯一碳源與能源繁殖並將該底物礦化成CO2和H2O；在純培養條件下，該菌於pH4.0～10、25℃～40℃範圍內均能將二噁烷降解；該菌株有較強的環境適應能力，可用於汙染環境的生物修復，為生物法淨化含二噁烷廢水及廢氣的工程應用奠定了基礎。
文檔編號B01D53/84GK102168038SQ20101057207
公開日2011年8月31日 申請日期2010年12月1日 優先權日2010年12月1日
發明者朱潤曄, 金小君, 陳東之, 陳建孟 申請人:浙江工業大學