賴氨酸脫羧酶抗原表位、抗賴氨酸脫羧酶抗體及其用途的製作方法

2024-02-03 22:25:15

專利名稱：賴氨酸脫羧酶抗原表位、抗賴氨酸脫羧酶抗體及其用途的製作方法
技術領域：
本發明屬於分子生物學和免疫學領域。具體地，涉及一種賴氨酸脫羧酶抗原表位、 抗賴氨酸脫羧酶抗體。本發明還涉及分別含有所述抗原表位或抗體的組合物、以及所述抗體在檢測賴氨酸脫羧酶中的用途。
背景技術：
賴氨酸脫羧酶(英文名稱為lysine decarboxylase,酶分類號EC :EC4. 1. 1. 18)， 據cDNA序列推譯的水稻賴氨酸脫羧酶蛋白(putative lysine decarboxylase-like protein, Pldclp)基因位於水稻基因組的第4條染色體上，由0s04g0518800基因編碼，其 cDNA全長為1109bp，其中參與編碼賴氨酸脫羧酶胺基酸的鹼基有750bp，編碼250個胺基酸殘基，分子量為27493. 85Da。賴氨酸脫羧酶家族具有保守結構域PGGxGTxxE。Sioshi Kikuchi等(Science 301,376(2003))最早克隆測序了秈稻日本種群的cDNA，在據cDNA推譯的胺基酸序列中發現有賴氨酸脫羧酶家族的保守結構域，從而推測此基因可能是賴氨酸脫羧酶家族成員之一。水稻(Oryza sativa L.)是世界上最重要的糧食作物之一，也是植物生長發育、逆境反應等基礎研究的模式植物，因為相對於其它禾本科植物，它的基因組相對較小 (430Mb)。水稻基因組測序成果極大地推動了水稻相關研究的進展，帶動了水稻轉錄組學的研究，也推動了蛋白質組學的研究，利用2DE-MASS技術對水稻發育、逆境、愈傷組織分化等進行蛋白質組學分析，鑑定了一系列的差異表達蛋白質，同時，隨著水稻功能基因組學工作的開展，對水稻蛋白質功能的驗證和比較研究也日益增加，蛋白質印跡(Western blotting,WB)技術因具有靈敏度高、特異性好、操作簡便、結果直觀等優點而被廣泛應用於檢測水稻蛋白質在不同組織中的表達水平。隨著水稻基因組計劃的完成，蛋白質研究已成為後基因組研究的重要任務。抗體是研究蛋白質必不可少的工具之一，在一種新的cDNA被克隆以後，由此推譯出的胺基酸序列人工合成多肽並與載體偶聯，免疫製備其抗體，是一種快速而有效的手段。水稻賴氨酸脫羧酶蛋白主要定位於質膜上，在植物的耐寒、解毒等抗逆生理中發揮作用。賴氨酸脫羧酶的主要生物學功能是催化L-賴氨酸脫羧生成屍胺(1，5_戊二胺)， 屍胺有刺激性氣味，它是生物體內廣泛存在的具有生理活性的含氮鹼，在腐爛的屍體和精液中都可分離得到。屍胺可以作為第二信使調控植物衰老進程、促進雌雄蕊的發育，外源施用屍胺可以改善坐果和促進果實發育，在增加果實產量和研究植物生長中有重要利用價值。賴氨酸脫羧酶在大腸桿菌中有大量的研究，並且在大腸桿菌體內發現多種賴氨酸脫羧酶，但在水稻中的作用研究較少，在水稻中的具體生理功能還不清楚。然而，迄今為止，水稻賴氨酸脫羧酶仍屬於高度有待鑑定的蛋白，該蛋白在轉錄水平上的活動是其存在的證據。並且在現有技術中，通常製備的多克隆抗體特異性不高，用於檢測目標物質會存在準確性不足的問題。另一方面，如果用賴氨酸脫羧酶製備抗原的話，如果是用化學合成的方法，全長的胺基酸序列有1996個胺基酸，蛋白質空間結構的重建是一個很困難的工作，再現與生物體內相同的空間構象仍然是現階段蛋白質學研究的難點。一般來說抗原表位合成簡易，準確性高，成本低廉，空間構象容易再現，因此有必要開發一種具有代表賴氨酸脫羧酶本身的抗原表位(antigenic determinant, AD)(又稱抗原決定簇， 是指抗原分子中決定抗原特異性的特殊化學基團)來代替全長蛋白。儘管目前已經有用於預測抗原表位的軟體，例如ΒΕΡΙΤ0ΡΕ軟體，但是預測得到的抗原表位中會有30%左右的非有效抗原表位，即不能特異性地代表抗原的抗原表位， 或者不能引發免疫應答(Chang HT, Liu CH, Pai Tff. Estimation and extraction of B-cell linear epitopes predicted by mathematical morphology approaches. J Mol Recognit. 2008 Nov-Dec ；21 (6) :431-41)。

發明內容
為了解決上述問題，本發明人在通過BEPIT0PE軟體預測得到多個抗原表位序列的基礎上，進行了大量的實驗和不懈的努力，結果發現在預測的M個抗原表位中有一個抗原表位序列SSQGKKKSYQDAA(SEQID NO 3)是最有效的抗原表位，並且其具有良好的抗原特異性，並且製備了能與該蛋白酶特異免疫結合的抗體，該抗體具有足夠的靈敏性和準確性。 由此提供了下述發明本發明的一個方面涉及一種賴氨酸脫羧酶抗原表位，其胺基酸序列如SEQ ID NO 3所示。在本發明的一個實施方案中，為了增加與載體的交聯性，在上述抗原表位的C末端添加了一個半胱氨酸(半胱氨酸提供二硫鍵與載體交聯)，得到序列為 SSQGKKKSYQDAAC(SEQ ID NO 4)的抗原表位。半胱氨酸也可以加在多肽的N末端，得到序列為CSSQGKKKSYQDAA(SEQ ID NO 5) 的抗原表位。末端加1個半胱氨酸就可以了。如果在同一端加多個半胱氨酸，導致成本上升，並且二硫鍵密度太大，而實際上也不需要這麼多二硫鍵。另外不宜在N末端和C末端都加半胱氨酸，因為一個抗原表位和一個載體結合，如果在兩端分別加1個半胱氨酸，半胱氨酸與載體結合後，抗原表位少了游離端，反而不利於產生抗體。本發明的抗原表位可以通過常規的肽合成技術化學合成得到，也可以在適當的宿主中表達得到；優選的是化學合成。本發明的還一方面涉及一種組合物，其包含SEQ ID NO :3或SEQID NO :4或SEQ ID NO :5所示的賴氨酸脫羧酶抗原表位，任選地，可以含有免疫佐劑，例如氫氧化鋁、弗氏完全佐劑、或者弗氏不完全佐劑等。本發明的還一方面涉及一種賴氨酸脫羧酶抗原表位-載體複合物；其中，所述賴氨酸脫羧酶抗原表位為SEQ ID NO :3或SEQ ID NO :4或SEQ ID NO :5所示的賴氨酸脫羧酶抗原表位，所述載體可以是鑰孔戚血藍素(KLH)、BSA、或酪蛋白等。本發明的還一方面涉及一種抗賴氨酸脫羧酶抗體，所述抗賴氨酸脫羧酶抗體能夠特異性地結合SEQ ID NO :3或SEQ ID NO :4或SEQID NO :5所示的賴氨酸脫羧酶抗原表位。 所述抗賴氨酸脫羧酶抗體可以是單克隆抗體，也可以是多克隆抗體。本發明的抗賴氨酸脫羧酶多克隆抗體可以得自各種常規製備多克隆抗體的動物，例如山羊，兔子，大鼠，小鼠等。對本領域技術人員而言，可以根據SEQ ID NO :3或SEQ ID NO :4或SEQ ID NO: 5所示的賴氨酸脫羧酶抗原表位製備單克隆抗體，具體操作可以參見本領域的技術手冊，也可以參考文獻例如 Nature 1975Kohler & Milstein Vol256，p495。本發明的還一方面涉及一種含有抗賴氨酸脫羧酶多克隆抗體的血清(簡稱多抗血清)，其通過使用SEQ ID NO 3或SEQ ID NO 4或SEQ ID NO 5所示的抗原表位免疫動物製得。本發明的還一方面涉及一種抗賴氨酸脫羧酶多克隆抗體製備方法，包括將SEQ ID NO :3或SEQ ID NO :4或SEQ ID NO :5所示的賴氨酸脫羧酶抗原表位作為抗原免疫動物的步驟。任選地，所述免疫步驟可以加入佐劑，例如氫氧化鋁、弗氏完全佐劑、或者弗氏不完全佐劑，等等。本發明的一個實施方案中，所述抗賴氨酸脫羧酶多克隆抗體製備方法，包括如下步驟1)將SEQ ID NO :3或SEQ ID NO 4或SEQ ID NO 5所示的賴氨酸脫羧酶抗原表位作為抗原免疫動物；2)取血，離心收集多抗血清；和3)純化步驟2、中的多抗血清，得到抗賴氨酸脫羧酶多克隆抗體。本發明的還一方面涉及一種組合物，其包含本發明的抗賴氨酸脫羧酶多克隆抗體。本發明的還一方面涉及一種賴氨酸脫羧酶檢測劑，其包含本發明的抗賴氨酸脫羧酶多克隆抗體。其中賴氨酸脫羧酶的序列(SEQ ID NO 1)如下MMDTDHTE11KEGEAVVEAMALLQSRFRRICVFC G|S S QGKKKS YQDA A丨V ELGKELVARNIDLVYG
GGSVGLMGLVSQAVYNGGRHVIGVIPKTLMPREITGETVGEVKAVADMHQRKAEMARQSDAFIALPGGYGTLEELLE VIAWAQLGIHDKPVGLLNVDGYYNSLLSFIDKAVEEEFISPSARHIIVLAPTPKELLEKLEAYSPRHDKVVPKMQWE MEKMSYCKSCEIPGLKEGNKATIQAQRGSML(SEQ ID NO 1)其中，加邊框的序列為SEQ ID NO :3。本發明的還一方面涉及本發明的抗賴氨酸脫羧酶多克隆抗體在製備檢測賴氨酸脫羧酶的藥物中的用途。本發明的還一方面涉及一種檢測賴氨酸脫羧酶的方法，所述方法包括使用本發明的抗賴氨酸脫羧酶多克隆抗體的步驟。具體地，包括如下步驟1)將待測樣品與本發明的抗賴氨酸脫羧酶多克隆抗體孵育，使所述的抗賴氨酸脫羧酶多克隆抗體與待測樣品中的賴氨酸脫羧酶特異性結合，由此形成免疫複合物；和2)檢測是否存在免疫複合物。上述檢測賴氨酸脫羧酶的方法可以檢測賴氨酸脫羧酶的有無、對其進行半定量 (例如western blot方法)；在有賴氨酸脫羧酶標準品的情況下，還可以通過ELISA方法對賴氨酸脫羧酶進行定量檢測。在本發明的一個實施方案中，所述賴氨酸脫羧酶為水稻的賴氨酸脫羧酶。具體的， 所述水稻為水稻93-11。
發明的有益效果1)本發明提供的多克隆抗體，特異性高；2)本發明提供的賴氨酸脫羧酶抗原合成簡易，準確性高。本發明提供的抗原表位是經軟體預測選出的抗原表位片段後化學合成的，片段短小，容易合成，空間構象再現容
易ο3)本發明提供的多克隆抗體可用於所有檢測賴氨酸脫羧酶存在與否的試劑。4)賴氨酸脫羧酶在水稻中的作用研究較少，在水稻各組織的定位，以及在水稻各組織中的具體生理功能尚不清楚。本發明製備Pldclp蛋白的抗體為研究Pldclp蛋白的功能及作用機制獲得重要的實驗工具，也為後續功能相關的研究，如免疫印跡、蛋白質定量、 免疫共沉澱、蛋白晶片、蛋白質-蛋白質相互作用、免疫組化及其它基於抗原抗體反應的應用，以及在抗病、抗逆反應中Pldclp蛋白質的表達研究提供了重要的實驗工具。隨著水稻基因組序列信息的闡釋和轉錄譜數據的積累，基於抗體的蛋白質組學研究將成為現實。


圖1 使用抗賴氨酸脫羧酶多克隆抗體對賴氨酸脫羧酶在水稻不同組織的免疫印跡檢測結果。
具體實施例方式下面將結合實施例對本發明的實施方案進行詳細描述。本領域技術人員將會理解，下面的實施例僅用於說明本發明，而不應視為限定本發明的範圍。實施例中未註明具體技術或條件者，按照本領域內的文獻所描述的技術或條件(例如參考J.薩姆布魯克等著， 黃培堂等譯的《分子克隆實驗指南》，第三版，科學出版社)或者按照產品說明書進行。所用試劑或儀器未註明生產廠商者，均為可以通過市購獲得的常規產品。實施例1 候選抗原表位的預測水稻賴氨酸脫羧酶對應的基因在GenBank中的基因ID是NP_0010533^。讀碼框序列如下ATGATGGATACAGATCACACTGAGATAATTAAGGAGGGAGAGGCAGTAGTGGAAGCCATGGCTCTACTC CAGTCTCGGTTCAGGAGGATATGCGTCTTCTGCGGGAGCAGCCAGGGCAAGAAGAAGAGCTACCAGGACGCAGCCGT TGAGCTTGGCAAGGAGCTGGTAGCAAGGAACATTGATCTAGTGTATGGTGGAGGAAGTGTGGGGCTCATGGGCCTGG TCTCTCAAGCTGTCTACAATGGAGGGAGGCATGTTATTGGGGTGATTCCCAAGACTCTTATGCCTAGAGAGATTACG GGTGAGACAGTAGGGGAGGTGAAAGCAGTGGCAGATATGCATCAGAGGAAGGCTGAGATGGCCAGGCAATCTGATGC GTTCATAGCACTGCCTGGTGGGTATGGAACACTTGAAGAGCTCCTGGAAGTAATTGCCTGGGCTCAGCTCGGCATTC ACGACAAGCCGGTTGGCCTGCTAAATGTGGACGGCTACTACAACTCTCTGCTGTCGTTCATCGATAAAGCTGTGGAG GAAGAGTTCATCAGCCCCTCTGCGCGCCATATCATCGTGTTAGCTCCAACACCAAAAGAACTTCTCGAGAAGCTAG AGGCGTACTCCCCTCGGCATGACAAGGTCGTGCCGAAGATGCAGTGGGAGATGGAGAAGATGAGCTACTGCAAGAG CTGCGAGATCCCTGGCCTGAAAGAAGGCAACAAGGCGACCATCCAAGCACAGCGAGGAAGCATGCTCTGA(SEQ ID NO 2)所編碼的水稻賴氨酸脫羧酶全長序列如下MMDTDHTE11KEGEAVVEAMALLQSRFRRICVFC G|SSQGKKKSYQDAAV ELGKELVARNIDLVYGGGSVGLMGLVSQAVYNGGRHVIGVIPKTLMPREITGETVGEVKAVADMHQRKAEMARQSDAFIALPGGYGTLEELLE VIAWAQLGIHDKPVGLLNVDGYYNSLLSFIDKAVEEEFISPSARHIIVLAPTPKELLEKLEAYSPRHDKVVPKMQWE MEKMSYCKSCEIPGLKEGNKATIQAQRGSML (SEQ ID NO :1，其中第 36 48 位胺基酸即加框的序列為 SEQ IDNO 3)然後根據SEQ ID NO :3，用ΒΕΡΙΤ0ΡΕ軟體對水稻賴氨酸脫羧酶基因編碼的蛋白質進行抗原表位的預測。本實施例中使用了 ΒΕΡΙΤ0ΡΕ軟體提供的五種方法Mandard、 KarpIus> Emini> Amphiphi> Pellequer,以及這五禾中方法的綜合方法 cons_Sta_Kar_Emi_ Amp_Pel，所有參數選擇默認。具體方法可以參考Odorico M, Pellequer J L. BEPITOPE predicting the location of continuous epitopes and patterns in proteins[J]. JMol Recognit，2003，16(1) :20-22。根據抗原指數(Antigenic Index)、親水性結構(Hydrophi licity Plot)、柔韌區(Flexible Regions)及表面概率結構(Surface Probability Plot)4個參數及特異性、合成難易程度等方面綜合分析胺基酸序列的特點， 用BLASTP對水稻蛋白質庫進行唯一性檢測後，最終確定欲合成的肽序列。在這項技術中， 選擇一個有效的抗原表位至關重要。一般認為，親水性強且具有穩定構象的線性表位對維持抗原的免疫反應性極其重要。利用ΒΕΡΙΤ0ΡΕ軟體一共預測得到了 M個候選的抗原表位，選出抗原表位峰值較高的片段 SSQGKKKSYQDAA (SEQ ID NO 3)。然後該片段在水稻蛋白質庫(RAP-DB資料庫，網址http//rapdb. dna. affrc. go.jp/)進行唯一性檢索(蛋白序列比對)，確定了該片段在水稻蛋白質庫中的唯一性。實施例2 抗原表位的化學合成實施例1中得到的候選抗原表位的兩端沒有半胱氨酸，為了實現與載體的交聯， 合成的序列需加入半胱氨酸，因此要合成的多肽序列為SSQGKKKSYQDAAC(SEQ ID NO :4)。對SEQ ID NO 4所示的多肽序列進行化學合成(由吉爾生化公司合成)，得到賴氨酸脫羧酶的抗原表位。實施例3 抗原表位-KLH複合物的製備採用戊二醛連接法，將實施例2中合成的抗原表位的C端與交聯載體蛋白-鑰孔戚血藍素(KLH)交聯，得到抗原表位-KLH複合物。具體實施步驟如下將5mg合成多肽加入7mg KLH中，邊震蕩邊緩慢加入新鮮配製的3g/L戊二醛溶液 lml，室溫孵育池。以pH8. 5的硼酸緩衝液透析Mh，得到抗原表位-KLH複合物，KLH作為多肽抗原的載體蛋白。實施例4 多抗血清的製備取l-2mg實施例3中製備的抗原表位-KLH複合物，取合成肽-KLH偶聯物與等量的完全福氏佐劑充分乳化後，於兔頸部和背部皮下多點注射，每點約ΙΟΟμ g。4周後加強免疫，劑量同前，用不完全福氏佐劑充分乳化後，於兔背部皮下多點注射；以後隔2周加強免疫1次；從第2次加強免疫開始，每次免疫後7d，經耳中央動脈採血測定抗體的效價，經過 4次加強免疫後符合要求時，立即頸動脈採血，分離血清後，無菌分裝保存於-80°C備用。同時按照相同的步驟，用抗原表位(SEQ ID NO 4)作為對照。其中，耳靜脈取血進行效價檢測(ELISA法)的步驟如下
將Pldclp合成肽稀釋至lmg/L包被ELISA酶標板，100 μ 1/孔，10g/L BSA 37°C封閉 2h。PBS-T(PBS+0. 5mL/L Tween-20)洗滌 3 次後，加入不同稀釋度(1 104，1 105， 1 5X 105,1 106)的免疫前後兔血清，100μ 1/孔，37°C孵育2h。徹底洗滌後加入HRP 標記的羊抗兔二抗(1 5000)，37°C孵育Ih後洗滌，加入TMB底物室溫避光顯色15min，加入2mol/L H2S04終止反應，當KLH > 51200和裸肽> 25600時確定為抗體陽性。經過4次加強免疫後，效價檢測的結果如下多抗血清(抗原表位-KLH複合物免疫)> 51200 (抗原表位-KLH複合物有免疫原性的最大稀釋倍數是51200)；裸肽免疫(抗原表位，SEQ ID NO 4)得到的多抗血清> 25600 (僅僅由抗原表位組成的裸肽具有免疫原性的最大稀釋倍數是25600)。上述結果已經符合要求，遂於末次加強免疫7天後頸動脈放血，收集血樣。將收集的血樣在3-4°C下靜置3-4小時，然後5000rpm離心10分鐘，收集血清，得到多抗血清(耳靜脈檢測效價符合要求後，頸動脈取的血樣不必再檢測效價)。無菌分裝保存於-80°C備用。實施例5 抗賴氨酸脫羧酶多克隆抗體(多抗)的製備將實施例4中製備的多抗血清進行純化，製得多克隆抗體(多抗)。將抗原表位SSQGKKKSYQDAA(SEQ ID NO 4)多肽與溴化氰活化的kpharose 4B偶聯，製備多肽親和層析柱。將製備的多抗血清加入到以上製備的層析柱中，放置於4°C孵育過夜後，洗脫抗體，即得到抗賴氨酸脫羧酶多克隆抗體(多抗)。實施例6 多抗1對賴氨酸脫羧酶的特異性檢驗選取新鮮的水稻93-11 (Oryza sativa L. ssp. Indica，獲自國家雜交水稻工程技術中心)苗期地上部、分櫱期葉片、孕穗期劍葉、開花期劍葉、成熟期劍葉、苗期地下部、分櫱期莖、開花期穗子、成熟期種子(共9個部位)，分別提取總蛋白質。福氏佐劑為Sigma公司產品。Western Blot Marker為北京全式金生物技術有限公司產品。羊抗兔IgG-HRP為北京中杉金橋生物技術公司產品。總蛋白質樣品的製備在水稻材料93-11 (Oryza sativa L. ssp. Indica)苗期(地上部、地下部)、分櫱期(莖、葉)、孕穗期(劍葉)、開花期(劍葉、穗子)、成熟期(劍葉、穗子)共5個時期9個部位分別取材；用液氮研磨新鮮水稻組織至粉末狀，每300 μ 1粉末加入 800μ 1 蛋白質裂解液(62. 5mmol/L ρΗ7· 4 Tris-HCl，10%甘油，2% SDS，20mmol/L NaF， 2mmol/L EDTA，lmmol/L PMSF,5% β -巰基乙醇)，冰水混合物中孵育lOmin，期間震蕩混勻 4 5次，4°C，12000r/min離心15min，取上清，轉移到新的1. 5mL離心管中，_70°C保存備用。Western 印記分別取5g水稻93-11不同發育階段和不同部位的組織提取的總蛋白液體加入等體積2 X SDS加樣緩衝液，於100°C加熱5min後，進行常規SDS-PAGE電泳，SDS-PAGE分離膠濃度為15%，160V電壓電泳70分鐘，電泳結束後，電轉至PVDF膜上，用50g/L脫脂奶粉室溫下封閉Ih;然後加入1 1000稀釋的兔抗水稻Pldclp合成肽N端多肽多抗檢測水稻蛋白質表達，室溫下孵育 3h，TTBS (2mmol/LTris-HCl pH7. 6,13. 6mmol/L NaCl，0· 1 % Tween-20)洗膜3次，加入羊抗兔IgG-HRP抗體(1 5000稀釋)，室溫下孵育lh，TTBS洗膜3次，每次5min，ECL法顯色。水稻各組織的多克隆抗體Wfestern blot顯示在27KD附近有單一的條帶(結果見圖1)，和理論值接近，苗期的根、分櫱期的莖及開花期的穗子沒有檢測到條帶，其餘苗期的葉、分櫱期的葉、孕穗期的葉、開花期的葉、成熟期的葉以及成熟期的穗子中都檢測到單一條帶，在成熟期的葉片中表達量最大，Westernblot檢測結果表明製備的多克隆抗體具有很好的特異性和靈敏度。需要說明的是，儘管水稻全蛋白中可能有很多分子量與其相似的蛋白，但是與多抗特異性結合的就只有賴氨酸脫羧酶一個。關於特異性的預測SEQ ID N0:4經過http:// rice, ρlantbiology· msu. edu/blast. shtml (與實施例 1 中的 http://rapdb. dna. affrc. go. jp/作用相同，目的是再次檢驗唯一性)的檢查，確定此多肽序列特異，該序列在水稻總蛋白中唯一確定賴氨酸脫羧酶。儘管本發明的具體實施方式
已經得到詳細的描述，本領域技術人員將會理解。根據已經公開的所有教導，可以對那些細節進行各種修改和替換，這些改變均在本發明的保護範圍之內。本發明的全部範圍由所附權利要求及其任何等同物給出。
權利要求
1.一種賴氨酸脫羧酶抗原表位，其由SEQ ID NO :3或SEQ ID NO :4或SEQ ID N0:5所示的胺基酸序列組成。
2.一種組合物，其中含有權利要求1所述的賴氨酸脫羧酶抗原表位，任選地，還含有用於免疫的佐劑。
3.一種賴氨酸脫羧酶抗原表位-載體複合物，其中，所述賴氨酸脫羧酶抗原表位為權利要求1所述的賴氨酸脫羧酶抗原表位，所述載體選自鑰孔戚血藍素、BSA、以及酪蛋白。
4.一種抗賴氨酸脫羧酶抗體的製備方法，包括使用權利要求1的賴氨酸脫羧酶抗原表位或者權利要求2的組合物或者權利要求3的複合物的步驟；任選地，所述抗賴氨酸脫羧酶抗體是單克隆抗體或者多克隆抗體；具體地，所述製備方法包括如下步驟1)將權利要求1所述的賴氨酸脫羧酶抗原表位或者權利要求2的組合物或者權利要求 3的複合物免疫動物得到的血樣進行離心，得到多抗血清；和2)純化步驟1)中的多抗血清，得到抗賴氨酸脫羧酶多克隆抗體。
5.一種多抗血清，其由權利要求1的賴氨酸脫羧酶抗原表位或者權利要求2的組合物或者權利要求3的複合物免疫動物製得。
6.一種抗賴氨酸脫羧酶抗體，其能夠特異地結合權利要求1所述的賴氨酸脫羧酶抗原表位，任選地，其為多克隆抗體或者單克隆抗體。
7.一種組合物，其包含權利要求6所述的抗賴氨酸脫羧酶抗體。
8.一種賴氨酸脫羧酶檢測劑，其包含權利要求6所述的抗賴氨酸脫羧酶抗體。
9.權利要求6所述的抗體在製備檢測賴氨酸脫羧酶的藥物中的用途。
10.一種檢測賴氨酸脫羧酶的方法，所述方法包括使用權利要求6所述的抗賴氨酸脫羧酶多克隆抗體的步驟；具體地，所述賴氨酸脫羧酶為水稻的賴氨酸脫羧酶。
全文摘要
本發明屬於分子生物學和免疫學領域，涉及賴氨酸脫羧酶抗原表位、抗賴氨酸脫羧酶抗體及其用途。具體地，所述賴氨酸脫羧酶抗原表位具有SEQ ID NO3或SEQ ID NO4或SEQ ID NO5所示的序列。本發明還涉及一種抗賴氨酸脫羧酶多克隆抗體，所述多克隆抗體與上述抗原表位特異性結合。所述多克隆抗體具有高的特異性和效價。本發明還涉及所述多克隆抗體的製備方法和用途、含有該多克隆抗體的組合物、以及檢測賴氨酸脫羧酶的方法。
文檔編號G01N33/577GK102206254SQ201010520338
公開日2011年10月5日 申請日期2010年10月25日 優先權日2010年10月25日
發明者劉佳, 吳 琳, 張軍, 曾海攀, 王銀竹 申請人:深圳華大基因科技有限公司